KR101282406B1 - 벼 유래의 ｒｍｔ１ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 벼 (Oryza sativa) 유래의 환경 스트레스 내성 관련 RMT1 (RING finger protein with microtubule-targeting domain 1) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 벼 유래의 RMT1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법, 벼 유래의 RMT1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 벼 유래의 RMT1 유전자를 포함하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물에 관한 것이다.

Description

벼 유래의 ＲＭＴ１ 유전자 및 이의 용도 {RMT1 gene from Oryza sativa and uses thereof}
본 발명은 벼 유래의 RMT1 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 (Oryza sativa) 유래의 환경 스트레스 내성 관련 RMT1 (RING finger protein with microtubule-targeting domain 1) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 벼 유래의 RMT1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법, 벼 유래의 RMT1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 벼 유래의 RMT1 유전자를 포함하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물에 관한 것이다.
토양 내의 높은 농도의 염은 벼 종자 발아, 생장, 수량 등에 부정적인 영향을 끼친다. 세계 경작지의 6% 이상이 염에 의한 피해를 보고 있으며, 벼는 곡물 중 가장 염해에 취약한 작물이다 (Munns and Tester, Annu Rev Plant Biol 59, 651-681, 2008). 이러한 염에 열악한 토양에서 생존과 생장이 증진된 벼를 생산하기 위해 식물의 염해 저항성 유전자의 발굴 및 개발이 절실히 요구된다.
단백질 가수분해의 조절은 생물학적 또는 무생물학적 스트레스에 대한 식물 방어 메카니즘에 있어 중요한 역할을 담당하고 있다 (Vierstra, Trends Plant Sci 8, 135-142, 2003). 유비퀴틴 26S 프로테아좀 시스템은 진핵생물에 있어 단백질 가수분해를 담당하는 핵심적인 시스템이며, 최근의 연구들로 유비퀴틴이 부착된 타겟 단백질들을 26S 프로테오좀이 인지하여 타겟 단백질의 양과 활성을 감소시키는 방법으로 조절하는 것이 동물에 이어 식물에서도 밝혀졌다 (Vierstra, Trends Plant Sci 8, 135-142, 2003). 일반적으로 유비퀴틴 분자들은 E1 (Ubiquitin-activating enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), E3 (Ubiquitin-ligase) 효소들의 순차적인 활동에 의해 타겟 단백질에 부착된다 (Vierstra, Nat Rev Mol Cell Bio 10, 385-397, 2009). 모델식물인 애기장대 전체 게놈의 약 5% 이상의 유전자들이 유비퀴틴 26S 프로테아좀 시스템과 관련되어 있는 것으로 보고되었으며, 그 중 가장 많은 비중을 차지하는 것은 E3 리가제로서 약 1,300점 이상의 유전자들이 존재하고 있다 (Smalle and Vierstra, Annu Rev Plant Biol 55, 555-590, 2004).
고등식물에서 E3 리가제는 크게 HECT (homologus to E6-AP C-terminus)와 RING/U-box 도메인을 포함하고 있는 두 그룹으로 분류된다 (Smalle and Vierstra, Annu Rev Plant Biol 55, 555-590, 2004). 그 중 RING (REALLY INTERESTING NEW GENE) 도메인을 포함하는 E3 리가제는 애기장대와 벼에서 각 470점, 425점이 존재하는 것으로 보고되었다 (Lim et al, Plant Molecular Biology 72, 369-380, 2010). RING E3 리가제는 다양한 식물 호르몬과 무생물적 스트레스 관련 메카니즘에 있어 핵심 역할을 수행하고 있다. 예를 들어 애기장대에서 ABA 시그널링의 핵심 조절자로서의 역할을 수행하는 ABI3 (ABSCISIC ACID-INSENSITIVE 3) 단백질은 RING E3 리가제인 AIP2 (ABI3-ITNERACTING PROTEIN 2)에 의해, ABI5는 KEEP ON GOING E3 리가제에 의해 유비퀴틴화 (Ubiquitylation) 된 후 26S 프로테오좀에 의해 가수분해되어 그 단백질 양이 조절된다 (Zhang et al, Plant Cell 19, 1912-1929, 2007). 또한, 한발 스트레스에 대한 경우, 한발해에 반응하는 많은 하위 유전자의 발현을 조절하는 애기장대의 전사인자인 DREB2A (DEHYDRATION-RESPONSIVE ELEMENT BINDING PROTEIN2A)는 RING E3 리가제인 DRIP1와 DRIP2 (DREB2A-INTERACTING PROTEIN 1, 2)에 의해 단백질 양이 조절된다 (Qin et al, Plant cell 20, 1693-1707, 2008). 추가적으로 고추의 Rma1H1 (MEMBRANE ANCHOR E3 UBIQUITIN LIGASE HOMOLOG) 단백질은 아쿠아포린 단백질인 PIP2;1 단백질을 조절함으로써 한발해에 저항성을 수여하는 것이 보고되었다 (Lee et al,Plant Cell 21, 622-641, 2009). 하지만 아직 벼의 RING E3 리가제를 코딩하는 유전자들의 분자 생물학적 분석은 미비한 실정이다.
본 발명의 OsRMT1 (RING finger protein with microtubule-targeting domain 1) 단백질은 벼의 RING-H2 그룹 중 하나로써 옥수수, 수수를 제외한 다른 동˙식물에서 상동체 (homolog)가 존재하지 않으며, 모델식물인 애기장대에 형질전환시켜 과발현시켰을 때 염해 조건에서 종자 발아율과 생장률이 크게 증진되었다. 이러한 관점에서 OsRMT1 유전자의 분리는 염해 내성 식물체의 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
현재, 한국등록특허 제0742193호에서는 보리로부터 신규한 환경 스트레스 저항성 전사인자를 분리하고 상기 전사인자를 식물체에 도입하여 환경 스트레스 저항성 식물체를 제조한 내용이 기재되어 있고, 한국등록특허 제0742194호에서는 애기장대 유래의 환경 스트레스 저항성 조절 유전자인 AIA 유전자를 포함하는 벡터를 식물체에 도입하여 과발현시킴으로써 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법이 기재되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 동안벼의 잎에서 분리한 OsRMT1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대가 염 또는 ABA의 환경 스트레스 조건 하에서 강한 저항성을 보이는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 (Oryza sativa) 유래의 환경 스트레스 내성 관련 RMT1 (RING finger protein with microtubule-targeting domain 1) 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래의 RMT1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래의 RMT1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래의 RMT1 유전자를 포함하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 RING E3 리가제인 OsRMT1 유전자는 염 스트레스에 강하게 발현되는 8개의 유전자들과 단백질 상호결합을 하여 타겟 단백질 양을 긍정적으로 조절함으로써 식물체에 염해 저항성을 수여하기에 이를 이용하면 간척지를 비롯한 한계경작지에 적합한 염해 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체를 개발하는데 유용할 것으로 사료된다.
도 1은 벼 유래 OsRMT1 유전자의 염기서열로부터 추론한 아미노산 서열을 NCBI　nrBlastP를 이용하여 동·식물에서 상동체를 찾은 후 ClustalW를 이용해 상동체 (벼, 수수, 옥수수)의 아미노산 서열과 비교한 도면이다.
도 2는 벼 유래 OsRMT1 유전자를 pGEX-5x-1 벡터에 삽입하여 GST-OsRMT1 융합 단백질을 시험관 내에서 발현시킨 후 SDS-PAGE를 수행하여 OsRMT1 단백질의 분자량을 확인한 도면이다.
도 3은 벼 유래 OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질이 E3 리가제로서 역할을 수행하는지 여부를 확인하기 위해 시험관 내 유비퀴틴화 분석을 실시한 도면이다.
도 4는 형광 단백질을 이용하여 타겟 단백질의 세포내 위치를 확인하기 위한 식물용 pBIN35S::EGFP-C1(A), pBIN35S::EYFP-C1(B), pBIN35S::DsRed(C) 벡터를 제작한 도면이다.
도 5는 벼 유래 OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질이 유비퀴틴 26S 프로테아좀에 의해 단백질 가수분해되는 것을 확인한 도면이다.
도 6은 벼 유래 OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질의 세포 내 위치를 EGFP, EYFP 형광 단백질을 이용하여 확인한 도면이다.
도 7은 벼 유래 OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질이 상호결합하는 단백질을 탐색하기 위해 벼의 cDNA 라이브러리와 Yeast Two Hybrid 스크리닝을 실시한 도면이다.
도 8은 벼 유래 OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질과 상호결합하는 15개의 후보자 유전자들 Yeast Two Hybrid 실험을 실시한 도면이다.
도 9는 벼 유래 OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질과 강하게 상호결합하는 8개의 유전자를 대상으로 Bimolecular Fluorescence Complementation assay를 실시한 도면이다.
도 10은 벼 유래 OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질과 상호결합하는 8개의 단백질들이 서로 결합했을 때 세포내 미세소관에 위치함을 보여주는 도면이다.
도 11은 벼 유래 OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질과 상호결합하는 8개의 단백질들의 세포내 위치를 보여주는 도면이다.
도 12는 벼 유래 OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질이 미세소관 타겟팅 도메인을 포함하는 것을 확인한 도면이다.
도 13은 벼 유래 OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질이 호모다이머 (homodimer)를 이루며 서로 상호결합하는 것을 확인한 도면이다.
도 14는 벼 유래 OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질과 상호결합하는 단백질인 OsEDA16을 BiFC 실시하여 접종 5일째 확인한 도면이다.
도 15는 벼 유래 OsRMT1 유전자와 상호결합하는 8개 유전자의 염해 스트레스 상태에서의 발현량을 보여주는 도면이다. OsSalT(Os01g24710), OsCPA1(N-carbamoylputrescine amidase 1, Os02g33080), OsbZIP60(Basic Leucine Zipper Domain containing protein 60, Os07g44950), OsFKBP12(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, FKBP-type, Os02g52290), OsEDA16(embryo sac development arrest 16, Os08g08220), OsDH1(Dehydrogenase, Os08g43190), OsPUB53(Protein kinase/U-box containing protein 53, Os10g40060.2), OsPB1(Phox and Bem1p domain containing protein, Os11g25780)
도 16은 벼 유래 OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질과 상호결합하는 단백질들을 함께 배양하여 시간에 따른 단백질의 양을 확인한 도면이다.
도 17은 벼 유래 OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질이 상호결합하는 단백질들을 유비퀴틴 26S 프로테아좀에 의해 조절하는 것을 확인한 도면이다.
도 18은 벼 유래 OsRMT1 유전자를 모델식물인 애기장대에 형질전환하여 과발현시킨 후 NaCl이 포함된 배지에서 발아율과 생장을 확인한 도면이다. 라인 #16, #20 및 #25는 OsRMT1 유전자의 형질전환체를 나타낸다.
도 19는 벼 유래 OsRMT1 유전자를 모델식물인 애기장대에 형질전환하여 과발현시킨 후 ABA가 포함된 배지에서 발아률과 생장을 확인한 도면이다. 라인 #16, #20 및 #25는 OsRMT1 유전자의 형질전환체를 나타낸다.
도 20은 벼 유래 OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질이 염해 스트레스에 발현량이 증가되며 단백질 상호결합하는 8개의 유전자들을 세포내 미세소관을 통하여 유비퀴틴 26S 프로테오좀에 의해 조절함으로써 염해에 저항성을 수여하는 가설을 나타낸 도면이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 벼 (Oryza sativa) 유래의 환경 스트레스 내성 관련 RMT1 (RING finger protein with microtubule-targeting domain 1) 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 RMT1 단백질의 범위는 벼로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 환경 스트레스 내성을 의미한다.
본 발명은 또한 RMT1 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 RMT1 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.
서열번호 2로 표시되는 성숙(mature) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드(및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.
용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체, 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안(alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 RMT1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 RMT1 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열 및 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 가지는 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 스트린전트 조건하에 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, "스트린전트 조건"은 (1) 0.2 × SSC, 0.1% SDS, 60℃와 같은 더 낮은 이온강도 및 더 높은 온도하에서의 혼성화 및 세척; 또는 (2) 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소혈청/0.1% Ficoll 및 42℃ 등과 같은 변성제의 존재하에 혼성화; 또는 (3) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 단지 2개의 서열 사이에서 발생하는 혼성화를 말한다. 게다가, 혼성화가 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성은 서열번호 2 표시되는 성숙 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성과 동일하다.
본 발명의 구현예에 따라, RMT1 유전자는 바람직하게는 벼 유래라는 것을 이해해야 한다. 그러나, 본 발명의 구현예는 벼 RMT1 유전자와 높은 상동성 (예를 들면, 60% 이상, 즉 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 심지어 98%의 서열 동일성)을 갖고 다른 식물로부터 유래한 다른 유전자를 또한 포함한다. 서열정렬 방법, 및 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 수단(예를 들면, BLAST)은 당업계에 주지되어 있다.
본 발명은 또한, 상기 RMT1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 재조합 식물 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 A. tumefaciens의 Ti 플라스미드와 함께 존재 시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(바이너리) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci.,87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
또한, 본 발명은 벼 (Oryza sativa) 유래의 RMT1 (RING finger protein with microtubule-targeting domain 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 "환경 스트레스"란 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말하며 크게 생물학적 스트레스(biotic stress)와 비생물학적 스트레스(abiotic stress)로 대별된다. 생물학적 스트레스로는 대표적으로 병원균을 들 수 있으며, 비생물학적 스트레스로는 고농도의 염, 건조, 저온, 고온 및 산화 스트레스 등이 포함된다. "환경 스트레스 내성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 OsRMT1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 염 또는 ABA (Abscisic acid) 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 벼 (Oryza sativa) 유래의 RMT1 (RING finger protein with microtubule-targeting domain 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 OsRMT1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 염 또는 ABA (Abscisic acid) 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
바람직하게는, 상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대이다.
상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 벼 (Oryza sativa) 유래의 RMT1 (RING finger protein with microtubule-targeting domain 1) 유전자를 포함하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsRMT1 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 벼 유전자의 클로닝 , 염기서열 분석 및 유연관계 분석
4주된 무처리 벼 (Oryza sativa cv. Donganbyeo)와 스트레스 처리 벼 (200mM NaCl, 12h 건조, 42℃ 고온 및 4℃ 냉해)의 잎, 줄기, 뿌리에서 TRIzol (Invitrogen사)을 이용하여 총 RNA를 추출하여 동일한 비율로 섞은 후 1st cDNA(Takara사)를 제작하였다. MSU Rice genome annotation database 6.1 (http://rice.plantbiology.msu.edu/)와 NCBI database (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)에서 OsRMT1 (LOC_Os04g51400) 유전자의 코딩 시퀀스 정보를 얻은 후 정방향 (5'-GAGAggatccATGGATGATCACATGGGAAGACG-3' : 서열번호 3)과 역방향 (5'-GA GAggtaccGTTGGTATTCAGAGCGACGGAT-3' : 서열번호 4) 프라이머를 제작하여 Pfu Turbo DNA polymerase(Stratagene사)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 시퀀싱 진행 후 분석한 결과는 데이터베이스에서 얻은 정보와 동일했다.
OsRMT1 유전자의 CDS (coding sequence)는 1,104개의 뉴클레오타이드로 구성되어 있으며 367개의 아미노산 잔기로 구성되어 있음을 확인하였다 (도 1). 또한 GST-OsRMT1 융합 단백질을 발현 후 SDS-PAGE 전기영동 결과, 이 단백질을 구성하는 367개의 아미노산이 약 41kDa의 분자량을 가짐을 확인하였다 (도 2). 또한 OsRMT1 유전자의 코딩영역을 블라스트 (BlastP)로 조사하였을 때 상동성을 보인 유전자는 벼에서 1점 (Os08g14320), 수수에서 2점 (Sb06g027620, Sb07g007520), 옥수수에서 3점(GRMZM2G053909, GRMZM2G140924, GRMZM2G138997)이 발견되었으며 다른 종에서는 발견되지 않았다. 벼의 OsRMT1의 추정되는 단백질의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 보이는 벼, 옥수수, 수수의 식물 종의 유전자들의 유연관계를 ClstalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)을 이용하여 조사한 결과, 도 1에서 보이는 것과 같이 모든 유전자는 C-말단에 RING-H2 도메인이 존재하며, N-말단 부위와 C-말단 부위 아미노산 서열이 높은 수준으로 일치하는 것을 확인하였으며, RING-H2 도메인이 포함되어 있으므로 E3 리가제로서 역할을 할 것이라 추정할 수 있었다.
실시예 2. OsRMT1 의 E3 리가제 활성
OsRMT1 단백질이 E3 리가제로서 그 기능을 수행하는지를 확인하기 위해 시험관 내에서 유비퀴틴화 분석을 실행하였다. OsRMT1 단백질은 GST tag을, E2 conjugating enzyme은 애기장대 atUBC10을 Histidin tag을 이용하여 정제하여 사용하였으며, 이스트 E1 activating 엔자임은 Calbiochem사에서 구입하여 사용하였다. 이스트 E1, His-UBC10, GST-OsRMT1을 유비퀴틴화 버퍼 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl2, 0.05mM ZnCl2, 1mM ATP, 0.2mM DTT, 10mM phosphocreatine, 및 0.1 unit creatine kinase)와 함께 30℃에서 3시간 배양 후 12% SDS-PAGE에 전기영동 후 유비퀴틴 항체와 GST 항체를 이용하여 단백질 블럿팅 하였다. 그 결과 E1, E2, GST-OsRMT1이 모두 포함되어 있는 5번째 라인에서만 높은 분자량의 유비퀴틴 폴리체인이 형성되어 있음을 확인하였으며, 이 결과는 RING-H2 도메인을 포함하는 OsRMT1 단백질이 E3 리가제 활성을 갖는 것을 보여준다 (도 3).
실시예 3. 유비퀴틴 26S 프로테아좀에 의한 OsRMT1 의 조절 및 세포내 위치 분석
OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질의 세포내 위치를 확인하기 위해 본 발명자는 CaMV 35S 프로모터가 탑재된 식물용 EGFP (ENHANCED GREEN FLUORESCENCE PROTEIN), EYFP 벡터를 제작하였다 (도 4의 A, B). 제작된 벡터의 EGFP 앞부위에 OsRMT1 유전자를 정방향(5'-GAGAggatccATGGATGATCACATG GGAAGACG-3' : 서열번호 5)과 역방향 5'-GAGAggta ccGTTGGTATTCAGAGCGACGGAT-3' : 서열번호 6) 프라이머를 이용하여 클로닝한 후 담배 잎에 아그로박테리아를 이용하여 침투시켰다. 그 후 3일부터 5일 사이에 공초점 레이저 현미경을 통해 형광 단백질 확인하였으나 시그널을 관찰할 수 없었다. 앞선 보고에서 RING 도메인을 포함하고 있는 단백질들이 스스로 유비퀴틴화 되어 가수분해되는 사례가 있었으며 (Liu and Stone, Plant Cell 22, 2630-2641, 2010), OsRMT1 단백질의 형광 시그널 역시 이와 동일한 경우일 것이라 판단하고 이를 증명하기 위해 HA-OsRMT1을 담배 잎에서 과발현시킨 후 유비퀴틴 26S 프로테아좀의 기능을 억제하는 MG132를 2일 후에 처리하여 HA 항체를 이용하여 확인하였다 (도 5). 도 5와 같이, OsRMT1 단백질은 마이크로솜 막에 위치하며 유비퀴틴 26S 프로테아좀에 의해 그 양이 감소함을 확인하였다. 이와 같은 결과를 기반으로 OsRMT1 단백질의 세포내 위치를 확인하기 위해 OsRMT-EGFP 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 담배 잎에 침투시킨 후 2일 후에 MG132를 처리하여 공초점 레이져 현미경으로 시그널을 확인하였으며, 도 6의 (A)에서 보이는 것과 같이 골지체에 위치함을 확인하였다. 또한 OsRMT1-EGFP의 골지체 시그널을 재확인하기 위해 OsRMT1-EYFP와 골지막에 위치하는 애기장대의 ERD2b 유전자 (Li et al, Proc Natl Acad Sci U S A 106, 15973-15978, 2009)를 DsRed2 벡터 (도 4의 C)에 클로닝하여 동시에 담배 잎에 접종하여 서로의 형광 시그널이 겹쳐지는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과들은 OsRMT1 단백질이 유비퀴틴 26S 프로테아좀에 의해 그 양이 조절되며 골지막에 위치하고 있음을 증명한다.
실시예 4. Yeast Two Hybrid 스크리닝을 통한 OsRMT1 과 상호결합하는 단백질 발굴
OsRMT1 유전자가 코딩하는 단백질과 상호결합하는 단백질들을 탐색하기 위해, OsRMT1 유전자를 이스트 GAL4 DNA 바인딩 도메인에, 벼의 cDNA 라이브러리는 이스트 GAL4 activation 도메인에 클로닝한 후, OsRMT1은 Y2H GOLD 스트레인에, cDNA 라이브러리는 Y187 스트레인에 형질전환하였다. 두 번 반복된 스크리닝 과정으로 48개의 클론들이 얻어졌으며 이 클론들에서 벡터를 추출 후 시퀀싱하였다. MSU Rice genome annotation database 6.1에서 BalstX 검색을 이용하여 각 유전자들의 정보를 확인하였다 (도 7). 확인된 48개의 후보 유전자들 중 α-gal 활성이 가장 높은 15개의 유전자들을 클로닝하여 pGADT7-AD 벡터에 클로닝하여 pGBKT7-OsRMT1과 동시에 Y2H 스트레인에 형질전환시켰다. 15개의 후보 유전자들 중 8개의 유전자가 강한 결합을 보였다 (도 8).
실시예 5. BiFC ( Bimolecular Fluorescence Complementation ) 분석을 통한 OsRMT1와 상호결합하는 8개의 유전자들과 이들의 세포내 위치 분석
Yeast Two Hybrid 스크리닝을 통해 발굴된 8개의 유전자들의 상호결합을 식물 세포 내에서 확인하기 위해 BiFC 분석을 실시하였다. OsRMT1 유전자는 SPYNE(R) 벡터에 8개의 상호결합 유전자들 (OsSalT , OsCPA1 , OsbZIP60 , OsFKBP12 , OsEDA16 , OsDH1, OsPUB53 , OsPB1)은 SPYCE(M) 벡터에 클로닝하여 아그로박테리움에 각각 형질전환 하였다. 8개의 상호결합 유전자들과 OsRMT1 유전자를 각각 담배 잎에 침투시켜 3일 후에 형광 시그널을 공초점 레이져 현미경으로 관찰하였다. 도 9에서 보이듯 강한 시그널이 확인되어 OsRMT1 유전자와 8개의 유전자들 모두 상호결합 하는 것을 확인하였고, 두 단백질이 상호결합할 때 형광 시그널이 세포골격에서 나타나는 것을 확인하였다. 이 형광 시그널이 단백질 미세소관에 위치하는 것을 확인하기 위해 액틴 섬유를 해중합하는 시약인 Latrucullin B, 미세소관을 해중합하는 시약인 APM, Oryzalin을 처리하였다. 그 결과 미세소관에서 OsRMT1과 8개의 단백질이 상호 결합함을 확인하였다 (도 10). 이러한 미세소관에서의 결합이 골지체에 위치하고 있는 OsRMT1 유전자에 의한 현상인지 또는 8개의 상호결합 유전자에 의해 나타나는 현상인지를 확인하기 위해 8개의 상호결합 유전자들을 식물용 pBin35S-DsRed 벡터에 클로닝하여 담배 잎에서 위치를 확인하였다 (도 11). 8개의 상호결합 유전자들은 세포질과 핵과 같이 서로 다른 위치에서 형광 시그널이 관찰되었으며, 이 결과는 OsRMT1 유전자가 8개의 서로 다른 유전자들을 상호결합하여 미세소관으로 타겟할 수 있는 가능성을 확인하였다.
이전의 실험들로 인해 본 발명자는 OsRMT1에 상호결합하는 단백질들을 미세소관으로 타겟할 수 있게 하는 도메인이 있을 것이라 예측하고, 도 12의 (A)와 같이, OsRMT1 단백질을 4개의 조각으로 잘라 EYFP 벡터에 클로닝하였다. 클로닝한 구조물들은 아그로박테리움에 형질전환시킨 후 담배 잎에 침투하여 그 위치를 확인하였다. OsRMT1 단백질의 첫 번째 아미노산부터 123번째까지 발현시켰을 때 미세소관 시그널이 강하게 나타났으며, 첫 번째 아미노산부터 246번째까지 발현시켰을 때는 미세소관과 핵에 나타났다. 나머지 두 개의 구조물 (124-367 아미노산, 247-367 아미노산)에서는 미세소관 시그널이 나타나지 않았다 (도 12의 B). 이 결과를 통해 OsRMT1 단백질이 미세소관 타겟팅 도메인을 N-말단 지역 (1-123 번째 아미노산)에 포함하고 있음을 발견하였다.
실시예 6. OsRMT1 단백질과 OsRMT1 단백질간 상호 결합 및 상호결합 단백질들의 세포내 위치 변화 분석
OsRMT1 단백질간의 상호결합을 확인하기 위해 전체길이의 OsRMT1과 DEL1 (1-123 아미노산), DEL2 (124-246 아미노산), DEL3 (247-367 아미노산)을 pGBKT7 벡터와 pGADT7 벡터에 각각 클로닝하여 Yeast Two Hybrid 실험을 실시하였다. 도 13의 (A)에서 보이듯이, 이스트에서 전체길이의 OsRMT1이 호모다이머를 이루며 서로 상호 결합함을 확인하였다.
앞선 실험에서 OsRMT1-EGFP, -EYFP 시그널이 MG132를 처리하였을 때 골지막에서 위치하였으며, MG132를 처리하지 않았을때는 시그널이 관찰되지 않았다. 이 결과와 Yeat Two Hybrid 실험을 통해 호모다이머를 이룰 것이라 예상했을 때, 유비퀴틴 26S 프로테아좀에 의해 OsRMT1이 셀프 유비퀴틴화 되어 가수분해되는 것으로 사료된다. 또한 OsRMT1의 호모다이머를 이루는 것을 BiFC 실험을 통해 확인하였다(도 13의 B). 흥미롭게도 접종 후 3일째 되는 날에는 형광 시그널이 OsRMT1과 상호결합하는 8개의 단백질들과 마찬가지로 미세소관에 나타났으며, 5일째 되는 날에는 미세소관에 위치한 형광 시그널들이 사라지며 핵으로 위치가 바뀌는 것을 확인하였다. 이 결과는 OsRMT1이 포함하고 있는 미세소관 타겟팅 도메인이 OsRMT1 뿐 아니라 상호결합하는 단백질들을 미세소관을 통해 핵으로 위치를 변화시키거나 또는 핵에서 미세소관을 통해 세포질로 위치를 변화시키는 기능을 담당하고 있음을 알 수 있다 (도 9의 E, 도 14).
실시예 7. OsRMT1 이 염 스트레스 발현 상호결합 단백질들을 유비퀴틴 26S 프로테아좀을 통해 조절
본 발명자들은 OsRMT1 유전자와 상호결합하는 8개의 유전자들을 발굴하였으며, 그 중 OsSalT 유전자의 경우 염해 스트레스에 그 발현량이 매우 증가하는 유전자로 이미 보고되어 있다 (Claes et al, Plant Cell 2, 19-27, 1990). OsRMT1와 단백질 상호결합하는 OsSalT 유전자를 포함하는 8개 유전자들이 염 스트레스에 그 메카니즘을 갖고 있을 것이라 사료된다. 이 가설을 증명하기 위해 8개의 유전자들의 염 스트레스 하에서 발현량을 분석하였다. OsSalT 유전자를 포함한 8개의 유전자 모두 무처리 식물체에 비해 250mM NaCl을 처리시 발현량이 적게는 두 배에서 120배 이상 증가함을 확인하였다 (도 15).
염 스트레스 조건하에 발현량이 현저히 증가되는 8개의 유전자들이 코딩하는 단백질들과 OsRMT1이 상호결합하는 것을 위의 실험들을 통해 증명하였으며, 이러한 단백질 상호결합이 OsRMT1 단백질이 염 스트레스 발현 단백질들을 조절한다고 사료되어 단백질 가수분해 실험을 실시하였다. 담배잎에 OsRMT1 유전자와 4개의 상호결합 유전자들을 침투시켜 과발현 한 후 총 단백질을 추출하였다. 이렇게 추출한 각각의 총 단백질들에 OsRMT1 단백질을 혼합한 샘플과 혼합하지 않은 샘플을 대조군으로하여 0시간부터 2시간까지 샘플링하였다. DsRed2 항체를 이용하여 단백질 블럿팅 실험을 수행하여 OsRMT1과 상호결합하는 유전자들의 양을 확인하였다 (도 16). 실험에 사용된 OsSalT-DsRed2, OsCPA1-DsRed2, OsFKBP12-DsRed2, OsDH1-DsRed2를 단독으로 2시간 동안 배양한 샘플에서는 그 양의 변화가 없었으나, OsRMT1을 과발현시킨 총 단백질과 함께 2시간 동안 배양한 샘플에서는 그 양이 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 이 결과로 OsRMT1 단백질이 상호결합 단백질들을 가수분해시키는 역할을 수행하는 E3 리가제인 것을 확인하였다. 이 상호결합 단백질들의 가수분해 현상이 유비퀴틴 26S 프로테아좀에 의한 것인지를 확인하기 위해 MG132를 처리하였다. MG132를 처리한 2시간 배양한 시료에서 OsSalT, OsCPA1, OsFKBP12, OsDH1 단백질들이 가수분해되지 않은 것으로 OsRMT1 단백질이 유비퀴틴 26S 프로테아좀 시스템에 의해 상호결합하는 유전자들이 코딩하는 단백질들을 가수분해함을 확인하였다.
실시예 8. OsRMT1 형질전환 애기장대의 염 및 ABA 스트레스에 대한 내성 분성
일련의 실험들을 통해 벼의 OsRMT1 유전자가 염 스트레스에 기능을 담당함을 유추할 수 있었으며, OsRMT1이 식물의 염 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 것을 확인하기 위해 형질전환 애기장대를 제작하였다. 제작된 독립적인 T3 계통을 RT-PCR을 통해 OsRMT1이 발현되고 있음을 확인하였으며, 이 계통을 염과 ABA가 포함된 MS 배지에서 발아율, 생장, 뿌리길이를 측정하였다. OsRMT1 유전자가 과발현된 애기장대는 대조군과 비교했을 때 염 및 ABA에 대한 내성이 현저히 증가했음을 알 수 있다 (도 18a, 도 18b 및 도 19).
종합적으로 OsRMT1 유전자는 염 스트레스에 발현양이 증가되는 8점의 유전자가 코딩하는 단백질을 유비퀴틴 26S 프로테아좀을 통해 조절함으로써 식물 염 스트레스 저항성을 증진시킨다. OsRMT1 유전자는 일반적인 환경에서는 셀프 유비퀴틴화 되어 골지막에서 미세소관을 통해 핵으로 위치가 바뀌어 가수분해되며, 염 스트레스에서 셀프 유비퀴틴화가 중지되어 염 관련 중요 유전자인 OsSalT , OsCPA1 , OsFKBF12, OsbZIP60 , OsEDA1 , OsDH1 , OsPUB53 , OsPB1을 유비퀴틴 26S 프로테아좀에의해 긍정적으로 조절함으로써 염 스트레스 저항성을 증진 시킨다 (도 20). 이 기작에서 OsRMT1 유전자가 포함하고 있는 미세소관 타겟 도메인이 세포 내 서로 다른 위치에 있는 상호결합 단백질들을 표적할 수 있도록 주며, 핵에 위치한 단백질은 미세소관을 통해 세포질로, 세포질에 위치한 단백질은 미세소관을 통해 핵으로 이동시키는 두 가지 기능을 동시에 수행하고 있다. OsRMT1에 대한 분자생물학적 분석과 과발현 형질전환체의 염 스트레스 저항성 증가 현상은 염 스트레스에 대한 기본 방어 기작이라 사료되며, OsRMT1 유전자를 이용하여 간척지를 비롯한 한계 경작지에 적합한 염 스트레스 내성 식물체를 개발하는데 유용할 것으로 사료된다. 또한 OsRMT1 유전자가 포함하고 있는 미세소관 타겟 도메인의 경우 동·식물에서 최초로 보고되는 도메인으로 이 도메인을 이용하여 특정 단백질의 세포내 위치 조절이 가능하리라 생각된다.
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Claims (16)

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  6. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 (Oryza sativa) 유래의 RMT1 (RING finger protein with microtubule-targeting domain 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 염 또는 ABA(abisisic acid) 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 OsRMT1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
  9. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 (Oryza sativa) 유래의 RMT1 (RING finger protein with microtubule-targeting domain 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 염 또는 ABA(abisisic acid) 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 OsRMT1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 삭제
  12. 제9항의 방법에 의해 제조된 염 또는 ABA(abisisic acid) 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  15. 제12항에 따른 식물체의 종자.
  16. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 벼 (Oryza sativa) 유래의 RMT1 (RING finger protein with microtubule-targeting domain 1) 유전자를 포함하는, 식물체의 염 또는 ABA(abisisic acid) 스트레스 내성 증진용 조성물.
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