KR101618266B1 - 벼 유래 ＯｓＰＰ２ＣＴＳ 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 과발현 벡터로 형질전환된 형질전환체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 OsPP2CTS 유전자를 과발현하는 형질전환체에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 벼에서 분리한 OsPP2CTS유전자를 포함하는 재조합벡터를 과발현하는 형질전환 벼는 간장, 수장 및 수수가 증가하였으므로, 상기 유전자를 생장이 증대된 분자 육종 소재로 이용가능하며, 그로 인한 바이오매스 증진의 효과가 있다.

Description

벼 유래 ＯｓＰＰ２ＣＴＳ 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 과발현 벡터로 형질전환된 형질전환체{Rice derived OsPP2CTS gene and transformant using OsPP2CTS-overexpression vector}

탈인산화 효소를 암호화하는 OsPP2CTS 유전자를 과발현하는 벡터 및 이를 이용하여 생장이 증진된 형질전환식물벼를 제작하는 기술에 관한 것이다.

식물은 생장과 발달을 조절함으로써 여러 환경 변화에 대처, 적응하는 체계를 갖추고 있다. 종자의 발아에서부터 개화에 이르는 전체 생활환경에 걸쳐 환경 자극과 식물의 발달 프로그램은 끊임없는 상호작용을 통해 식물의 생존 적합성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 그러한 환경 자극에 따른 식물의 발달 조절은 주로 외부 환경과 식물의 내재적 발달 프로그램과의 상호 작용을 통해 일어나는 것으로 알려져 있다.

벼는 종자 생산이 목적인 세계적으로 가장 중요한 작물 중의 하나로 최근 몇 년간 전체 유전자 서열이 밝혀짐으로써 유용유전자를 대량으로 확보하고 이를 선점하고자 하는 많은 노력이 행해지고 있다. 종래 종자의 크기나 생육을 향상시키기 위한 기술로서, 식물 세포 내의 세포주기 제어 단백질(cell cycle control protein)의 농도나 촉매 활성을 변성하여 식물 세포 성장을 조절하는 방법(미국등록특허 6,087,175)이나 합성 징크핑거 단백질(a synthetic zinc finger protein)을 코딩하는 뉴클레오티드를 증진시키고자 목표 유전자에 결합시킨 발현벡터를 식물 세포에 도입시켜 식물 세포 내에서 목표 유전자의 발현 정도를 조절하는 방법(미국등록특허 7,151,201) 등이 개시되어 있다. 또한 애기장대 유래의 시토크롬 P450 단백질의 유전자를 식물 세포에 형질전환시켜 식물종자의 크기를 증가시키는 기술(한국등록특허 10-0794395) 등이 있다.

식물의 줄기, 잎 등 측생기관의 형태와 크기는 바이오매스를 증대시키고 농업생산성에 영향을 주는 중요한 요인이다. 최근 벼, 옥수수, 밀, 기장 등 주요 곡물의 줄기형성 기작 연구가 활성화 단계에 있다. 옥수수 육종을 가능하게 했던 줄기생성 억제 유전자인 teosinte branched 1 (tb1)이 규명된 이래, zfl (FLORICAULA/LEAFY), bif (barren inflorescence2), pin (pinoid) 등 줄기와 화기분화에 관련된 유전자 규명이 가속화되고 있는 단계이다 (Lukens and Doebley 2001, Barazesh and McSteen 2008). 옥수수에서 처음 알려진 tb1은 벼와 애기장대에서도 측아 발생을 억제하는 주요한 유전자임이 확인되었다 (Takeda et al. 2003, Finlayson 2007, Aquilar-Martinez et al. 2007). 벼, 옥수수 등 주요 곡물 이외에도 토마토 등 원예작물의 측지 발생을 억제하는 유전자 (lateral suppressor, blind)가 이미 규명된 바 있고 (Schumacher et al. 1999, Schmitz et al. 2002), 사탕수수, 대나무 등의 바이오매스를 증진시키기 위한 줄기생성 조절 유전자를 탐색하는 연구가 시작단계에 있다 (Aiteken et al. 2008). 또한 최근 연구결과는 옥수수의 tb1 유전자를 밀에 도입하여 분열을 억제하였는데 (Lewis 2008) 이는 이런 측아 발생 조절 유전자들이 생명공학기술의 측면에서 이용가능성이 있음을 보여주는 것이다.

일례로 Knotted-like homeobox (KNOX), PHANTASTICA (PHAN), ROUGH SHEATH (RS), ASYMETRIC LEAVES 1 (AS1) 등 엽원기 형성에 관여하는 유전자와 HD-ZIP III, PHABULOSA (PHB), PHAVOLUTA (PHV), REVOLUTA (REV), YABBY, KANADI등 등배축 형성에 관여하는 유전자 외에도 세포증식 및 세포신장에 관여하는 유전자들 (ICK1 (cyclindependent kinase inhibitor 1), KRP2 (Kip-related protein), ROT (ROTUNDIFOLIA), AN (ANGUSTIFOLIA), LNG (LONGIFOLIA)등)이 잎의 형태발생을 변화시키는 것으로 알려져 있다. 또한 Aintegumenta (ANT), KLUH (KLU), STRUWWELPETER (SWP), Growth-regulating factor (GRF), GRF-interacting factor (GIF)등의 유전자가 잎 발생의 양성 조절자 (positive regulator)로 작용하는 것과는 달리 (Anastasiu et al., 2007, Autran et al., 2002, Mizukami and Fisher 2000, Horiguchi et al. 2005, Kim and Kende 2004), BIG BROTHER (BB)나 PEAPOD (PPD) 등은 잎의 생장을 억제하는 음성 조절자 (negative regulator)로 알려져 있다. 이들 유전자들은 전사인자, 생합성 유전자, 단백질 분해인자, 효소 등 다양한 기능적 카테고리를 갖고 있으며, 엽원기 형성, 잎의 축 형성, 세포증식, 세포생장 등 그 작용 기작이 달라서, 잎의 형태와 크기에 영향을 주는 세포내 기작 혹은 유전자의 스펙트럼이 매우 다양하다는 것을 시사해준다.

이에 본 발명자들은 식물의 생장에 관여하는 새로운 유전자를 찾기 위해 연구를 거듭한 결과, 생장을 촉진하고 수수의 수를 증가시켜 작물의 생산성 증대에 기여할 수 있는 벼 유래의 유전자인 OsPP2CTS를 찾아내고 이를 이용하여 벼의 생장 및 수수의 증가를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고 벼(O. sativa L. cv.)에서 유래한 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 생장 촉진된 형질전환체의 제조방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2의 폴리펩티드의 세포내 발현 수준(level)을 조절하여 식물의 생장을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고 벼(O. sativa L. cv.)에서 유래한 폴리펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 생장 촉진된 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 서열번호 2의 폴리펩티드의 세포내 발현 수준(level)을 조절하여 식물의 생장을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 벼 유래 OsPP2CTS 유전자를 과발현하는 벡터로 형질전환된 형질전환벼는 수장, 간장 및 수수가 증가하였으므로, 생장 및 수확량이 증대된 벼 육종소재로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 OsPP2CTS 유전자를 포함하는 과발현용 벡터의 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 OsPP2CTS를 과발현하는 형질전환체의 OsPP2CTS 전사체 양을 비교한 RT-PCR 그래프이다;
DJ: 동진벼 (대조군); 및
C16-2, C16-3, C16-4 및 C16-12: 형질전환체.
도 3은 OsPP2CTS를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 T1와 대조군 동진벼의 간장 및 수장을 비교한 사진이다.
도 4는 OsPP2CTS 과발현 형질전환벼의 수장(위) 및 수수(아래)의 길이를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고 벼(O. sativa L. cv.)에서 유래한 폴리펩티드를 제공한다.

상기 폴리펩티드는 탈인산화 효소인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에는 이의 기능적 동등물이 포함된다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 종자의 발아 또는 생장을 조절하는 활성을 의미한다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 야생형에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 OsPP2CTS 단백질의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 OsPP2CTS 단백질의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와 같은 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함된다. 또한, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 단편(fragment)으로서 야생형의 OsPP2CTS 단백질과 실질적으로 대등한 생리활성을 갖는 폴리펩타이드는 야생형 OsPP2CTS 단백질의 기능적 동등물의 또 다른 바람직한 그룹을 형성한다. 상기 "단편"은 단백질의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위 내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 메카니즘을 가진 것을 말하며 야생형에 존재하는 것이거나, 프로테이즈를 사용하여 절단한 것이거나 화학적으로 절단된 것이 모두 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에 따른 OsPP2CTS단백질을 암호화하는 염기 서열은 gDNA, cDNA 및 RNA를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 염기 서열은 야생형 단백질과 그의 기능적 동등물을 암호화하는 염기 서열 및 이들 서열과 고긴축 조건 (high stringent condition) 하에서 하이브리드화하는 서열들을 모두 포함한다. 고긴축 조건은 공지된 문헌(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 바와 같다. 바람직하게, 본 발명에 따른 OsPP2CTS 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 및 이의 서열 변이체가 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 서열 변이체는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열이 포함될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "상동성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서의 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. 본 발명에서의 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서의 용어, "발현 벡터"는 목적한 암호화 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 적합한 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 재조합 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 상기 선택 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예컨대, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서의 용어, "프로모터"는 정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 작동 가능하게 연결된다(operably linked)는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol.Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 a-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacteriumtumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있다.

또한 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 형질전환체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다.

상기 식물은 벼, 보리, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 캐놀라, 대두, 마초, 기장, 사탕수수, 라이그래스, 및 오차드그래스 등의 식물일 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 OsPP2CTS 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 제조된 벡터를 식물체에 도입하는 단계; 및

3) OsPP2CTS 유전자가 과발현되는 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 생장 촉진된 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

상기 단계 2)의 식물체는 벼, 애기장대, 배추, 양배추, 겨자, 평지(유채), 무, 호무(Brassica napobrassica) 및 순무(Brassica rapa/Brassica campestris)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하며, 동진벼가 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

아울러, 본 발명은 서열번호 2의 폴리펩티드의 세포내 발현 수준(level)을 조절하여 식물의 생장을 조절하는 방법을 제공한다.

상기 식물은 벼, 애기장대, 배추, 양배추, 겨자, 평지(유채), 무, 호무(Brassica napobrassica) 및 순무(Brassica rapa/Brassica campestris)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하며, 동진벼가 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 "세포 내 발현 수준"이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 1의 OsPP2CTS 유전자 또는 이의 변이체를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 서열번호 1의 OsPP2CTS 유전자 또는 이의 변이체의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 서열번호 1의 OsPP2CTS 유전자 또는 이의 변이체를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 단백질 또는 단백질의 안정성을 증진하는 방법 또는 단백질 또는 단백질의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법의 보다 구체적인 예로 1군 인트론 타입, M1 RNA 타입, 망치머리(hammerhead) 형 또는 머리핀(hairpin) 형 또는 microRNA 형 등의 전사된 mRNA에 작용하는 RNA를 암호화하는 DNA서열로 형질전환하거나, 표적 유전자 서열과 동일 또는 유사한 서열을 가지는 DNA의 형질전환을 통한 동시억제(cosuppression)를 유도할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 서열번호 2의 단백질 또는 이에 대한 기능적 동등물의 세포내 수준을 조절하는 것은 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 증가 또는 감소시키는 방법은 각각 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 2의 단백질 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 그 발현을 증진시키거나, 프로모터에 상기 유전자에 대한 안티센스 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 그 발현을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 벼로부터 탈인산화 효소의 유전자로 추측되는 OsPP2CTS 유전자를 분리하였으며, 이를 재조합 벡터에 도입하였고, 이를 벼에 형질전환하여 OsPP2CTS를 과발현하는 형질전환 벼를 제작하였으며, 상기 형질전환벼의 간장, 수장 및 수수가 대조군인 동진벼에 비하여 증가하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 과발현하는 벡터 및 형질전환체는 생장이 증진되는 것을 알 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

< 실시예 1> OsPP2CTS 유전자 분리 및 염기서열 결정

본 발명자들은 탈인산화 효소를 암호화하는 OsPP2CTS 유전자를 벼로부터 분리하였다.

구체적으로, 동진벼(O. sativa L. cv.)로부터 총 RNA를 trizol로 분리한 다음, 역전사 효소를 이용하여 총 RNA 5 ㎍로부터 30 ㎍의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성한 cDNA로부터 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 OsPP2CTS의 coding 영역을 PCR로 증폭하였다. PCR 후 1% 아가로스젤(agarose gel)에 전기영동하여 PCR 산물을 확인하였고, Qiagen Gel extraction kit를 사용하여 DNA를 추출하여 pGEM-Teasy 벡터(Promega)에 클로닝하였다. 클로닝 후, T7 프라이머와 SP6 프라이머, BigDye Terminator 3.1 (ABI)을 이용하여 목적 유전자인 OsPP2CTS의 염기서열을 분석하였다.

서열번호	프라이머 명	프라이머 서열 (5＇→3＇)
3	OsPP2CTS-F	CACC ATGAGGGAGACGGGCGCGA
4	OsPP2CTS-R	TCAAGCTGCCCTGCTCTTGAGCCGCCT

< 실시예 2> OsPP2CTS 유전자 과발현 벡터 제작

본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 분리한 OsPP2CTS 유전자를 과발현하는 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 증폭한 PCR 산물인 OsPP2CTS 유전자를 pENTR/D-Topo kit를 이용하여 Entry 클론을 제작하였으며, LR 반응을 통하여 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터를 가지고 박테리아 마커 유전자로 테트라사이클린 및 식물 마커 유전자로 하이크로마이신을 사용할 수 있는 바이너리(binary) 벡터인 pGA2897로 클로닝되었다. 클로닝 후 pga2897-OsPP2CTS 벡터는 시퀀싱을 통해 유전자의 삽입이 확인되었으며, 상기 벡터 2 ㎕를 마커로 리팜피신 및 스트렙토마이신을 가지는 균주인 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)-LBA4404 100 ㎕에 넣은 후 얼음에 두었다. 그 후, 이를 큐벳에 넣은 뒤 1.25 kV의 전기충격을 가하고 YEP 배지 1 ml를 넣고 15 ml 튜브에 옮겨 30 ℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후 형성된 콜로니를 선별하여 콜로니 PCR을 통해 유전자 삽입을 확인하고 스탁으로 보관하였다.

그 결과, pGA2897-OsPP2CTS 벡터 및 이로 형질전환된 아크로박테리움이 제작되었다 (도 1).

< 실시예 3> OsPP2CTS 유전자 과발현 형질전환체 제작 및 선별

본 발명자들은 OsPP2CTS 유전자를 과발현하는 형질전환체를 제작하기 위하여 아그로박테리움 매개형질전환방법(Hiei et al. 1994)을 이용하여 현미를 형질전환하였다.

구체적으로, 벼 형질전환에 사용하는 볍씨는 껍질을 벗긴 현미를 사용하였다. 볍씨를 70% 에탄올에서 1분간 침지시킨 후 50% 락스 용액 (락스 30 ml당 Tween 20 10 ㎕ 첨가)에서 40분 동안 소독하였다. 소독액을 모두 따라 버린 후 볍씨를 멸균수로 5회 세척하였다. 소독액이 잘 세척이 된 후 여과지를 이용해 볍씨에서 물기를 제거한 뒤 2N6 배지에 볍씨를 배지 안에 박아 넣어 배지와 접촉이 잘되도록 하고 씨눈은 위로 향하도록하여 치상하였다. 2N6 배지는 N6에 배지 (Chu et al., Scin Sin(1975) 18:659-668)에 다량원소, 미량원소와 비타민을 함유한 혼합물 4 g/L, 30 g/L sucrose, 0.5 g/L proline, 0.5 g/L glutamine, 0.3 g/L casamino acids, 0.01 g/L myo-inositol, 2 mg/L 2,4-D 및 4 g/L phytagel를 첨가한 고체 배지 (pH5.8)이다. 28 ℃로 처리하여 5일간 배양하였으며, 캘러스가 유도되면 배유를 제거하였다. 배유는 캘러스가 훼손되지 않도록 핀셋을 이용하여 조심스럽게 제거하며, 자엽과 뿌리 부분은 그대로 두어 캘러스가 훼손되는 것을 방지하였다. 형질전환시켜둔 아그로박테리움을 AB 고체 배지에 3일간 배양한 후 AAM 액체 배지에 모아서 현탁액을 만들었다. 흡광도기계를 이용하여 현탁액의 농도를 측정하며 먼저 OD₅₉₅=0.1이 되도록 만든 후 AAM으로 10배 희석하여 OD₅₉₅=0.01이 되도록 만들었다. 상기 아그로박테리움 현탁액에 배유를 제거한 캘러스를 2분 동안 침지하고 부드럽게 용액을 흔들어 아그로박테리움을 접종하였다. 접종이 끝나면 캘러스에서 현탁액만을 따라 버리며 여과지를 이용하여 여액을 제거하였다. 이 작업은 신속히 진행하며 캘러스가 지나치게 여과지 위에 오래 방치되어 마르지 않도록 주의하여야 한다. 2N6 배지에 10 g/L 글루코오스 및 100 μM acetosyringone을 추가하여 pH를 5.2로 조정한 2N6-AS 배지 위에 미리 여과지를 한 장씩 깔아놓아서 충분히 배지 성분이 스며들게 한 다음, 상기 캘러스를 여과지 위에 올려놓아 25 ℃에서 7일간 암배양하여 공동배양하였다. 여과지는 공동배양 기간 동안 아그로박테리움이 과도하게 성장하여 캘러스가 물러지는 현상을 방지하기 위한 것이다. 공동배양 후 선택적으로 아그로박테리움을 멸균증류수 1L에 항생제인 carbenicillin을 500 mg을 넣은 용액으로 세척하여 제거할 수 있으나, 아그로박테리움 LBA4404 균주를 사용하는 경우에는 공동배양 기간동안 아그로박테리움의 과도한 성장이 이루어지지 않았기 때문에 세척 작업을 하지 않는 것이 더 바람직하다. 그 후 캘러스를 2N6 배지에 항생제인 cefotaxime 200mg/L, Hygromycin 40mg/L가 첨가된 2N6-CH 배지로 옮겼다. 이때 핀셋을 이용하여 자엽과 뿌리 부분을 제거하며 캘러스는 2-3조각으로 나누어 배지와 닿는 면적이 최대가 되게 옮겨 배양한다. 배양온도는 28 ℃가 적당하며 암배양기에서 14일 동안 배양하여 형질전환된 캘러스를 유도하였다. 배앙 14일 후, 항생제인 하이그로마이신이 첨가된 2N6-CH 배지에서 형질전환된 캘러스가 분열하면서 성장하면 슈트와 뿌리를 유도할 수 있는 재분화 배지인 MSR 배지로 계대배양하였다. 형질전환된 캘러스의 구분은 새롭게 분화된 캘러스 덩어리의 유무로 판단하며 갈변되어 죽은 캘러스는 버렸다. 그 후, 형질전환된 벼를 선별하기 위하여 한 달간 키운 벼를 동결건조시켜 파쇄한 후 이로부터 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여 Genomic DNA를 분리하였다. 분리한 Genomic DNA 및 표 2의 하이그로마이신 유전자 프라이머 (서열번호 5 및 6)를 이용하여 PCR를 수행하여 OsSPP2CTS 유전자와 함께 삽입된 하이그로마이신 유전자의 삽입을 확인함으로써 OsPP2CTS 유전자의 삽입 여부를 확인하였다.

그 결과, OsPP2CTS 과발현 형질전환체를 선발하였다.

서열번호	프라이머 명	프라이머 서열 (5＇→3＇)
5	hygromycin-F	ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC GCG
6	hygromycin-R	CTA TTC CTT TGC CCT CGG ACG AGT

< 실시예 4> 형질전환체의 RT - PCR 을 이용한 과발현 검정

본 발명자들은 상기 <실시예 3>에서 제작한 형질전환체에서의 OsPP2CTS 유전자 과발현을 확인하였다.

구체적으로, <실시예 3>에서 선별한 벼 형질전환체의 총 RNA를 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여 분리하였으며 SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA와 표 2의 서열번호 7 및 8 프라이머, 및 서열번호 9 및 10 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 형질전환체에서의 OsPP2CTS 유전자의 과발현을 직접적으로 확인할 수 있었다 (도 2).

서열번호	프라이머 명	프라이머 서열 (5＇→3＇)
7	OsSDT-F	CCG TCC ACC TGG TTT GGT CT
8	OsSDT-R	GGC TCG GTT TGG TCC TTG AC
9	actin-F	TGC TCT GTA CGT CGC CAT CCA G
10	actin-R	AAT GAG TAA CCA CGC TCC GTC A

< 실시예 5> OsPP2CTS 유전자 과발현 형질전환체의 줄기 생장 및 생체량 증가 검정

본 발명자들은 OsPP2CTS 유전자가 과발현되는 형질전환체의 생장을 확인하였다.

구체적으로, OsPP2CTS 유전자가 과발현되는 형질전환체의 T1 형질전환 종자를 GM 포장에서 생육시킨 뒤, 종자 수확 후 형질전환체 및 대조구의 수장 및 수수 (분얼(tillering) 수)를 측정하였다.

그 결과, OsPP2CTS 과발현 형질전환벼는 수장이 크며, 수수도 증가된 것으로 나타났다.

따라서, OsPP2CTS의 전신 과발현이 벼 형질전환체의 수장 및 수수를 증진시킴을 확인할 수 있었다 (도 3 및 4).

<110> republic of Korea <120> Rice derived OsPP2CTS gene and transformant using OsPP2CTS-overexpression vector <130> p130268 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1146 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgagggaga cgggcgcgac ggatgagggg cacgcgtgcg aagttgtagt agccggaggt 60 gacggcaagg ccgcggcggc acgccggcgc cgacgtctcg agctccggcg gctcgggctg 120 gcggcggagg atgatgcggc ggcgaagaga atccggtcgg tgaaggacgg gtcgtcgtct 180 gatgactcgt cgacggaggt tgttccccgg agctggccgg cgtgcgtgtc gcacggctcg 240 gtgtcggtga tcgggcggcg gagggagatg gaggacgcgg tggccatcga gcggacgttc 300 atggcttcga cgggggatgg tgcgggcgct atcaggggcg gcggggaggg cgaggaggac 360 ttcttcgcgg tgtacgacgg ccacggcggg tcgcgggtgg cggaggcgtg caggaagcgg 420 atgcacgttg tgctcgcgga ggaggtgagc ctgcggcggc tgcgggggca gagcgcgtcg 480 ggcggcgacg tgcgctggaa ggaggcgatg ttggccagct tcgcgaggat ggacggcgag 540 gtcgtcggga gcgtcgccgc cgccgccccc cgcgtcgacg gcaccgagcc gtcggggttc 600 aggacggtgg gctccaccgc cgtggtcgcc gtcgtgggac gccgccgcat cgtcgttgcc 660 aactgcggcg actcgcgcgc cgtgctctcc cgcggtggcg tcgcgctgcc actctccact 720 gaccacaagc cagatcggcc tgacgagttg gaacgagtgg aagcagctgg aggcagagtc 780 atcaactgga acggttaccg tgtccttggt gttttagcca cttctagatc cataggcgac 840 tactacctga agccgttcgt gagcgcagag ccggaggtga gggtggtgga gaggacggac 900 aaggacgagt tcctgatcct ggcgagcgac gggctgtggg acgtggtgtc caacgaggtg 960 gcgtgcaaga tcgccaggaa ctgcctcaac ggccgcgcgg cctccatgtt cccggagtcc 1020 gtctccggca gctcggccgc cgacgccgcg gcgctcctcg ccgagctcgc cgtctcgcgc 1080 ggcagcaggg acaacatcag cgtcgtcgtc gtcgagctca ggcggctcaa gagcagggca 1140 gcttga 1146 <210> 2 <211> 381 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Arg Glu Thr Gly Ala Thr Asp Glu Gly His Ala Cys Glu Val Val 1 5 10 15 Val Ala Gly Gly Asp Gly Lys Ala Ala Ala Ala Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Leu Glu Leu Arg Arg Leu Gly Leu Ala Ala Glu Asp Asp Ala Ala Ala 35 40 45 Lys Arg Ile Arg Ser Val Lys Asp Gly Ser Ser Ser Asp Asp Ser Ser 50 55 60 Thr Glu Val Val Pro Arg Ser Trp Pro Ala Cys Val Ser His Gly Ser 65 70 75 80 Val Ser Val Ile Gly Arg Arg Arg Glu Met Glu Asp Ala Val Ala Ile 85 90 95 Glu Arg Thr Phe Met Ala Ser Thr Gly Asp Gly Ala Gly Ala Ile Arg 100 105 110 Gly Gly Gly Glu Gly Glu Glu Asp Phe Phe Ala Val Tyr Asp Gly His 115 120 125 Gly Gly Ser Arg Val Ala Glu Ala Cys Arg Lys Arg Met His Val Val 130 135 140 Leu Ala Glu Glu Val Ser Leu Arg Arg Leu Arg Gly Gln Ser Ala Ser 145 150 155 160 Gly Gly Asp Val Arg Trp Lys Glu Ala Met Leu Ala Ser Phe Ala Arg 165 170 175 Met Asp Gly Glu Val Val Gly Ser Val Ala Ala Ala Ala Pro Arg Val 180 185 190 Asp Gly Thr Glu Pro Ser Gly Phe Arg Thr Val Gly Ser Thr Ala Val 195 200 205 Val Ala Val Val Gly Arg Arg Arg Ile Val Val Ala Asn Cys Gly Asp 210 215 220 Ser Arg Ala Val Leu Ser Arg Gly Gly Val Ala Leu Pro Leu Ser Thr 225 230 235 240 Asp His Lys Pro Asp Arg Pro Asp Glu Leu Glu Arg Val Glu Ala Ala 245 250 255 Gly Gly Arg Val Ile Asn Trp Asn Gly Tyr Arg Val Leu Gly Val Leu 260 265 270 Ala Thr Ser Arg Ser Ile Gly Asp Tyr Tyr Leu Lys Pro Phe Val Ser 275 280 285 Ala Glu Pro Glu Val Arg Val Val Glu Arg Thr Asp Lys Asp Glu Phe 290 295 300 Leu Ile Leu Ala Ser Asp Gly Leu Trp Asp Val Val Ser Asn Glu Val 305 310 315 320 Ala Cys Lys Ile Ala Arg Asn Cys Leu Asn Gly Arg Ala Ala Ser Met 325 330 335 Phe Pro Glu Ser Val Ser Gly Ser Ser Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu 340 345 350 Leu Ala Glu Leu Ala Val Ser Arg Gly Ser Arg Asp Asn Ile Ser Val 355 360 365 Val Val Val Glu Leu Arg Arg Leu Lys Ser Arg Ala Ala 370 375 380 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPP2CTS-F primer <400> 3 caccatgagg gagacgggcg cga 23 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPP2CTS-R primer <400> 4 tcaagctgcc ctgctcttga gccgcct 27 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hygromycin-F primer <400> 5 atgaaaaagc ctgaactcac cgcg 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hygromycin-R primer <400> 6 ctattccttt gccctcggac gagt 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsSDT-F primer <400> 7 ccgtccacct ggtttggtct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsSDT-R primer <400> 8 ggctcggttt ggtccttgac 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> actin-F primer <400> 9 tgctctgtac gtcgccatcc ag 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> actin-R primer <400> 10 aatgagtaac cacgctccgt ca 22

Claims (10)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 서열번호 1의 OsPP2CTS 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 생장 촉진된 형질전환체.
   
6. 1) 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 OsPP2CTS 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
   2) 상기 제조된 벡터를 식물체에 도입하는 단계; 및
   3) OsPP2CTS 유전자가 과발현되는 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 생장 촉진된 형질전환체의 제조방법.
   
7. 제 6항에 있어서, 상기 단계 2)의 식물체는 벼, 애기장대, 배추, 양배추, 겨자, 평지(유채), 무, 호무(Brassica napobrassica) 및 순무(Brassica rapa/Brassica campestris)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 형질전환체의 제조방법.
   
8. 제 6항에 있어서, 상기 단계 2)의 식물체는 동진벼인 것을 특징으로 하는 생장 촉진된 형질전환체의 제조방법.
   
9. 서열번호 2의 폴리펩티드의 세포내 발현 수준(level)을 조절하여 식물의 생장을 조절하는 방법.
   
10. 제 9항에 있어서, 상기 식물은 벼, 애기장대, 배추, 양배추, 겨자, 평지(유채), 무, 호무(Brassica napobrassica) 및 순무(Brassica rapa/Brassica campestris)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 식물의 생장을 조절하는 방법.

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