KR101282409B1 - 고추 유래의 ＣａＳＤ1 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고추(Capsicum annuum) 유래의 병 저항성 증진 또는 노화지연 관련 CaSD1(Capsicum annuum senescence - delaying 1) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 CaSD1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 병 저항성 증진 또는 노화지연 방법, 상기 재조합 벡터를 이용한 식물 병 저항성 증진 또는 노화지연 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 증진 또는 노화가 지연된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 상기 유전자를 포함하는 식물의 병 저항성 증진용 또는 노화지연용 조성물에 관한 것이다.

Description

고추 유래의 ＣａＳＤ1 유전자 및 이의 용도{CaSD1 gene from Capsicum annuum and uses thereof}

본 발명은 고추 유래의 CaSD1 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 고추(Capsicum annuum) 유래의 병 저항성 증진 또는 노화지연 관련 CaSD1(Capsicum annuum senescence - delaying 1) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 CaSD1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 병 저항성 증진 또는 노화지연 방법, 상기 재조합 벡터를 이용한 식물 병 저항성 증진 또는 노화지연 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 병 저항성이 증진 또는 노화가 지연된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 유전자를 포함하는 식물의 병 저항성 증진용 또는 노화지연용 조성물에 관한 것이다.

고착성(sessile)인 식물은 병원균, 가뭄, 온도의 변화와 같은 다양한 스트레스에 직면한다. 동물에 비해, 식물은 생물적이거나 비생물적인 스트레스를 극복하기 위해서 특별한 기능이나 구조로 발달되어 왔다. 식물 세포의 독특한 특징 중 하나는 세포벽이 있다는 것이다. 식물 세포벽은 셀룰로오즈(cellulose), 헤미셀룰로오즈(hemicellulose) 및 펙틴(pectin)과 같은 다당류(polysaccharide)로 구성되고 식물 건중량의 90% 까지 차지한다(Cassab GI and Varner JE 1988. Annu Rev Plant Phys 39: 321-353). 그러나 세포벽의 특정 단백질은 식물 세포벽의 기능과 구조 유지에 중요한 역할을 한다.

분비경로를 통해 방출되고 세포벽이나 세포외 공간에 위치하는 단백질 그룹은 시크리톰(secretome)이라 부른다. 시크리톰은 두 가지 그룹으로 나눌 수 있는데, 전형적인(classical) 경로로 분비되는 단백질 및 비전형적인 경로로도 분비되는 단백질이 그것이다(Agrawal GKet al., 2010. Proteomics. 10(4): 799-827). 전형적인 경로를 통해 분비되는 시크리톰은 N-말단 서열(N-terminal sequence)에 신호 펩티드를 가지고 소포체/골지체(Endoplasmic reticulum/Golgi) 경로를 통해 분비되며, 애기장대(Arabidopsis)에서 유전자 게놈의 대략 17%(대략 5,000개의 유전자)를 차지한다(Jamet E et al., 2006. Trends Plant Sci 11(1): 33-39). 반면에 최근 연구에서는 분비 과정 동안에 골지체를 우회하는 신호 펩티드가 없는 단백질이 있는 것으로 밝혀졌다(Agrawal GK et al., 2010. Proteomics. 10(4): 799-827).

식물의 시크리톰은 식물 발생과 환경 스트레스 반응에 있어서 다양한 역할을 하고 있다(Lee SJ et al., 2004. Plant Physiol Biochem. 42(12): 979-988). 다당류에 영향을 주는 단백질뿐만 아니라 구조 단백질은 주로 식물 생장 및 발달에 관여한다. 예를 들어, 익스텐신(extensin) 혹은 프롤린-풍부(proline-rich) 단백질은 세포벽 매트릭스와 연결되어 있고 세포 구조를 유지한다. 자일로글루칸 엔도트랜스글루코실라제/히드롤라제(Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase)와 익스팬신(expansin)은 세포벽 구조에서 세포 증식 및 분화를 조절하는 역할을 한다. 상기 단백질들은 정상적인 생장 동안뿐만 아니라 외부 요인에 대한 반응에서도 활성이 있다(Wei G and Shirsat AH, 2006. Mol Plant Pathol. 7(6): 579-592).

세포벽은 외부 자극을 인식하고 반응하는 첫 번째 구조로서, 식물 세포벽에서 방어-관련 시크리톰은 상처 또는 병원균 감염에 대한 반응에서 항시적으로 발현되거나 유도된다(Veronese P et al., 2003. Plant Physiol. 131(4): 1580-1590). 신호의 인식과 전이에 중요한 세포벽-관련 키나제(kinases) 또는 류신-풍부 익스텐신 단백질(leucine-rich extensin protein)은 널리 연구되어 왔다(Humphrey TV et al., 2007. New Phytol. 176(1): 7-21). 게다가, 몇몇 단백질은 세포벽 강화, 지질 대사 및 아포플라스트 산화 파열(apoplastic oxidative burst)에 의한 방어 반응에 기여한다(Oh IS et al., 2005. Plant Cell. 17(10): 2832-2847). 그러나 상기 단백질의 기능 및 메커니즘은 명확하게 밝혀지지 않았다.

이전 연구에서, 식물세포 방어 및 발달에 관련이 있을 수 있는 101개의 독특한 시크리톰은 효모 분비 트랩(Yeast Secretion Trap) 시스템을 사용한 고추로부터 분리되었다(Yeom SI et al., 2011. Mol Plant Microbe Interact. 24(6): 671-684). 상기 시크리톰 중 하나인 CaSD1 ( Capsicum annuum senescence - delaying 1)은 독특한 특성이 있어 구체적인 연구를 위해 선택되었다. 본 발명자들은 CaSD1이 캡시쿰(Capsicum) 속의 종에서만 존재하고, 캡시쿰(Capsicum) 종과 품종 사이에 반복적인 영역을 갖는 신규 유전자라는 것을 나타내었다. 게다가, 유전자 발현 및 기능획득 연구(gain-of-function)는 CaSD1이 방어 반응, 노화 및 트리콤(trichome) 형성에 있어서 다양한 기능을 갖는다는 것을 나타내었다.

한국공개특허 제2009-0049668호에는 식물의 환경 스트레스 및 병원균 저항성에 관여하는 고추 유래 CaNAC2 유전자가 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2004-0022472호에는 애기장대 유래 식물의 잎 수명 조절 유전자 ORE8을 이용하여 식물의 노화를 지연시키는 방법이 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 고추 유래 CaSD1 유전자를 형질전환시킨 식물체가 병 저항성을 나타내거나 또는 노화지연을 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고추(Capsicum annuum) 유래의 병 저항성 증진 또는 노화지연 관련 CaSD1 ( Capsicum annuum senescence - delaying 1) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 CaSD1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 CaSD1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 병 저항성을 증진시키거나 또는 노화를 지연시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물의 병 저항성 증진 또는 노화지연 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물의 병 저항성이 증진 또는 노화가 지연된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 식물의 병 저항성 증진용 또는 노화지연용 조성물을 제공한다.

본 발명의 고추 유래 CaSD1 유전자는 병원균 접종 및 방어-관련 신호전달 분자의 처리에 의해서 발현이 증가하였고, 상기 유전자를 과발현시킨 식물체의 잎에서 노화 지연 효과가 나타났으므로, 이를 이용하면 병 저항성 증진 또는 노화지연 형질전환 식물체를 개발하는데 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 CaSD1의 서열 분석을 나타낸 것이다. (a)는 고추(Capsicum annuum) 부강(Bukang) 및 CM334 품종에서 CaSD1의 서열 정렬을 나타낸 것이다. 흑색 박스는 부강 및 CM334 품종 사이에 CaSD1의 일치된 서열을 나타낸다. (b)는 CaSD1의 아미노산 서열 구조를 나타낸다. 흑색 박스: 신호 펩티드, 옅은 회색: 비-반복 영역(1), 흰색: 반복 영역, 진한 회색: 비-반복 영역(2).
도 2는 다양한 캡시쿰(Capsicum) 종 유래 CaSD1 유전자의 PCR 증폭 결과를 나타낸 것이다. (a)는 CaSD1 게놈 DNA의 구조를 모식도로 나타낸 것이다. 흑선은 5' 및 3' UTR(untranslated region)과 인트론(intron)을 나타낸다. 회색 박스는 CaSD1의 엑손(exon)을 나타낸다. 흑색 화살표는 반복영역을 포함하는 PCR 증폭을 위한 프라이머를 나타낸다. (b)는 각 PCR 증폭을 위해 사용된 캡시쿰 종 유래 네가지 게놈 DNA를 나타낸다. PCR 산물은 1% 아가로오스 겔에서 전기영동을 하였고, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색한 다음, 자외선 광 하에 촬영하였다.
도 3은 공지된 식물 게놈 신테니 분절(syntenic segments)의 비교 유전체학적 분석 결과를 나타낸 것이다. CaSD1을 포함하는 신테니 분절은 다른 공지된 식물 게놈과 비교되었다. 고추 BAC 529L23의 ORF는 FGENESH 프로그램을 사용하여 예측되었고, 각 ORF는 FGENESH 수의 순서에 따라 나타내었다. 동일한 색은 서열 유사성을 나타낸다.
도 4는 CaSD1의 기관-특이적 발현 및 병원균 또는 방어-관련 신호전달 분자를 이용한 처리 후의 발현 결과를 나타낸 것이다. (a)는 고추 식물에서 CaSD1의 기관-특이적 발현을 나타낸 것이다. (b)는 Xav(X. axonopodis pv. vesicatoria) 레이스(race) 1 또는 레이스 3으로 접종된 고추 ECW30R에서 CaSD1의 발현을 나타낸 것이다. (c)는 TMV(tobacco mosaic virus)로 접종된 저항성 품종인 부강 및 감수성 품종인 ECW30R에서 CaSD1의 발현을 나타낸 것이다. (d)는 비숙주 박테리아 병원균인 Xag 8ra(Xanthomonas axonopodis pv. glycines 8ra)로 접종된 고추 부강 품종에서 CaSD1의 발현을 나타낸 것이다. 실시간 PCR이 CaSD1-특이적 프라이머를 이용하여 수행되었고, 상기 수치는 CaActin으로 표준화되어, 잎(a) 또는 비감염 대조군(b-d)에 대한 상대값으로 계산되었다. 막대는 4 반복의 표준편차를 나타낸다. 고추 부강 품종은 3 mM 에테폰(ethephon, ET)으로 침윤되거나, 5 mM 살리실산(salicylic acid, SA)을 분무시키거나 또는 60 μM 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate, MeJA)로 침윤되었다(e 내지 g). CaAccOx (C. annuum 1-aminocyclopropane-1-carboxylate), CaBPR1(C. annuum basic pathogenesis - related protein 1) 및 CaPINII (C. annuum proteinase inhibitor II ) 유전자의 발현 수준은 ET, SA 및 MeJA 처리에 대한 양성 마커(positive markers)로 각각 모니터링되었다. CaUBQ 및 CaActin 유전자의 발현 수준은 대조군으로 사용되었다. IMG :미성숙 녹색, MG: 성숙 녹색.
도 5는 세포벽에서 CaSD1의 위치를 나타낸 것이다. pMBP1:smGFP 또는 pMBP1:CaSD1-smGFP을 포함하는 아그로박테리움은 담배 잎에 침윤되었다. 사진은 침윤 후 1일째에 공초점 레이저 현미경(LSM510, Carl Zeiss, Wetzlar, Germany)으로 촬영되었다. DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)는 핵 염색에 사용되었다.
도 6은 CaSD1의 일시적인 과발현이 노화를 지연시키고 노화-관련 유전자의 발현을 조절한다는 것을 나타낸다. 담배 잎에서 pMBP1 또는 pMBP1:CaSD1의 아그로박테리움-매개 과발현을 나타낸다. 사진은 접종 후 20일째에 촬영되었고 (a), 동일한 잎이 분리 후 8일째에 촬영되었다(b). 또한 접종 후 45일째에 사진이 촬영되었다(c). 총 RNA는 TOE(transient overexpression) 후 특정 시점에 잎으로부터 분리되었고, 반정량 RT-PCR이 유전자-특이적 프라이머 세트를 사용하여 수행되었다(d). NbActin 유전자는 대조군으로 사용되었다. C : 대조군 식물체, NtHin1(N. tabaccum Harpin - induced 1), NtSgr (N. tabaccum Staygreen ), NtCAB(N. tabaccum Chlorophyll a/b binding protein gene ).
도 7은 CaSD1-과발현 담배에서 트리콤(trichome) 밀도의 증가를 나타낸 것이다. 벡터 과발현(왼쪽) 및 CaSD1-과발현 담배 잎(오른쪽)의 표면이 TOE 후 10일째에 광학 현미경을 사용하여 관찰되었다(a). 흰색 막대:1 mm. pMBP 또는 CaSD1-과발현 잎의 표면은 TOE 후 특정 시점에 전계 방출형 투과전자현미경(field-emission scanning electron microscopy)을 사용하여 관찰되었다(b). 흑색 박스는 인접한 트리콤의 클러스터를 확대한 것이다. 흑색 막대, 200 ㎛.
도 8은 CaSD1-과발현 담배에서 세포 크기 및 세포 분열-관련 유전자의 발현 수준을 나타낸 것이다. pMBP 또는 CaSD1-과발현 잎의 표면은 접종 후 7일째 전계방출형 투과전자현미경(field-emission scanning electron microscopy)으로 관찰되었다(a). 20개의 각 세포 면적은 ImageJ 프로그램을 사용하여 계산되었다(b). 막대는 반복의 표준편차를 나타낸다. 두 개의 별표는 세포 크기의 현저한 차이를 나타낸다(b)(T-검정, P<0.01). 과발현된 식물에서 세포 분열-관련 유전자의 발현 양상을 조사하였다(c). 흑색 막대: 100 ㎛, NtCYCD(N. tabaccum D- type cyclin ), NtCYCA(N. tabaccum Cyclin A), NtCDKA (N. tabaccum Cyclin - dependent kinase A), NtCDKB (N. tabaccum Cyclin - dependent kinase B).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 고추(Capsicum annuum) 유래의 식물의 병 저항성 증진 또는 노화지연 관련 CaSD1(Capsicum annuum senescence - delaying 1) 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 CaSD1 단백질의 범위는 고추로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 병 저항성 증진 또는 노화지연시키는 활성을 의미한다.

본 발명은 또한 CaSD1 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 CaSD1 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명은 상기 CaSD1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 CaSD1 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

서열번호 2로 표시되는 성숙(mature) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드(및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.

용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체, 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안(alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열 및 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 가지는 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 스트린전트 조건하에 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, "스트린전트 조건"은 (1) 0.2 × SSC, 0.1% SDS, 60℃와 같은 더 낮은 이온강도 및 더 높은 온도하에서의 혼성화 및 세척; 또는 (2) 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소혈청/0.1% Ficoll 및 42℃ 등과 같은 변성제의 존재하에 혼성화; 또는 (3) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 단지 2개의 서열 사이에서 발생하는 혼성화를 말한다. 게다가, 혼성화가 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성은 서열번호 2 표시되는 성숙 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성과 동일하다.

본 발명의 구현예에 따라, CaSD1 유전자는 바람직하게는 고추 유래라는 것을 이해해야 한다. 그러나, 본 발명의 구현예는 고추 CaSD1 유전자와 높은 상동성(예를 들면, 60% 이상, 즉 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 심지어 98%의 서열 동일성)을 갖고 다른 식물로부터 유래한 다른 유전자를 또한 포함한다. 서열정렬 방법, 및 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 수단(예를 들면, BLAST)은 당업계에 주지되어 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 CaSD1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, CaSD1 단백질을 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

CaSD1 단백질-암호화 DNA 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 pKBS1-1 벡터, pBI101 벡터 및 pCAMBIA 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 CaSD1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 병 저항성 증진 또는 노화지연을 증진시키는 방법을 제공한다. 상기 식물 병은 바이러스성 병 또는 세균성 병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물의 병 저항성 증진 또는 노화지연 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물의 병 저항성 증진 또는 노화지연을 증진시키기는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물체는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 단자엽 식물은 택사과(Alismataceae), 자라풀과(Hydrocharitaceae), 지채과(Juncaginaceae), 장지채과(Scheuchzeriaceae), 가래과(Potamogetonaceae), 나자스말과(Najadaceae), 거머리말과(Zosteraceae), 백합과(Liliaceae), 지모과(Haemodoraceae), 용설란과(Agavaceae), 수선화과(Amaryllidaceae), 마과(Dioscoreaceae), 물옥잠과(Pontederiaceae), 붓꽃과(Iridaceae), 버먼초과(Burmanniaceae), 골풀과 (Juncaceae), 닭의장풀과(Commelinaceae), 곡정초과(Eriocaulaceae), 화본과(벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과(Araceae), 개구리밥과(Lemnaceae), 흑삼릉과 (Sparganiaceae), 부들과(Typhaceae), 사초과(방동사니과, Cyperaceae), 파초과(Musaceae), 생강과(Zingiberaceae), 홍초과(Cannaceae) 또는 난초과(Orchidaceae)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 또한, 본 발명의 CaSD1 유전자를 포함하는, 식물의 병 저항성 증진용 또는 노화지연용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 CaSD1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물은 유효 성분으로서 고추 유래의 CaSD1 유전자를 포함하며, 상기 유전자 CaSD1를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 병 저항성 증진 또는 노화지연을 증진시킬 수 있는 것이다. 상기 식물 및 식물체의 병은 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

식물 재료

고추 식물은 클로닝 및 유전자 발현 분석을 위해 사용되었다. 고추(Capsicum annuum) 품종인 부강(Bukang)은 전장 CaSD1(Capsicum annuum senescence - delaying 1) cDNA을 클로닝하고, Xag 8ra(Xanthomonas axonopodis pv. glycines 8ra) 또는 TMV로 접종한 후 CaSD1 발현을 평가하기 위해 사용되었다. 고추 품종인 ECW30R(Early Calwonder 30R)은 Xav(X. axonopodis pv. vesicatoria) 레이스 1, 레이스 3 또는 TMV를 이용한 접종을 위해 사용되었다. 각 5가지 다른 캡시쿰(Capsicum) 종 중 4개의 품종은 반복영역(repeat region)의 PCR 증폭을 통해 임의로 선택되었다(표 1). 담배(Nicotiana benthamiana) 식물은 CaSD1의 TOE(transient overexpression)을 위해 사용되었다. 모든 식물은 22~25℃로 유지된 워크-인 챔버(walk-in chamber)에서 생장되었고 4~6주 동안 16시간 광주기 하에 두었다.

클로닝과 DNA 염기서열 분석

CaSD1의 전장 서열은 고추 품종인 CM334의 BAC(bacterial artificial chromosome) 서열(BAC number 529L23)로부터 분리되었다(Yoo EY et al., 2003. Theor Appl Genet. 107(3): 540-543). 유전자-코딩 영역 및 3' UTR(untranslated region)은 FGENESH 프로그램(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)을 사용하여 예측되었고, 유전자-특이적 프라이머는 상기 BAC 서열을 기초로 하여 CaSD1의 PCR 증폭을 위해 고안되었다(표 2). PCR은 CaSD1을 증폭하기 위해 수행되었고, 상기 증폭 산물은 pJET^TM PCR Cloning Kit(Fermentas Canada Inc., Burlington, Canada)을 사용하여 pJET 벡터로 클로닝되었다. 상기 CaSD1 서열은 NICEM(National Instrumentation Center for Environmental Management, Seoul, Korea)에서 ABI 3730 xl (Applied Biosystems INC, Foster City, CA, USA)을 사용한 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 상기 서열 분석은 ExPasy translation tool(http://us.expasy.org/tools/dna.html), NCBI 블라스트 서치(National Center for Biotechnology Information Blast search), SignalP signal peptide prediction(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 및 TCoffee multi-alignment tool(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/)을 사용하여 수행되었다(Altschul SF et al., 1997. Nucleic Acids Research. 25(17): 3389-3402).

PCR 증폭을 위한 프라이머 리스트

프라이머 명	정방향 서열 (5'→3')	역방향 서열 (5'→3')
CaSD1_full	CGGGATCCCGATGGTGTCAGGTAGTTTCAATATT (서열번호 3)	GGAGCTCGTATTGTTTCATTTGTGAGGAAAGA (서열번호 4)
CaSD1_repeat	TCCAGAACAAAATCATAAGAGAAGC (서열번호 5)	AGCACGATTATGTAGAATCCAAAAG (서열번호 6)
CaSD1_RT	AAAGGACTATGAGCGCAAGC (서열번호 7)	TTGTGAGGAAAGACCGATCA (서열번호 8)
CaAccOx	AGAAAGCTGCAGAGGAAAGCAAAC (서열번호 9)	TGAGATGCAACCGTTACTCCTATAC (서열번호 10)
CaBPR1	TCACAATGCAGCTCGTAGACA (서열번호 11)	TTTCATTGACCCACATCTTCAC (서열번호 12)
CaPINII	TTCATAATATGGCTGTTCACAAAGA (서열번호 13)	AGACGCTCAAGCATATTACAGAGAT (서열번호 14)
CaUBQ	CGTGGTGGTTTTTAAGATGATG (서열번호 15)	AAAGAAACACAAGGGAACAGAAA (서열번호 16)
CaActin	CCACCTCTTCACTCTCTGCTCT (서열번호 17)	ACTAGGAAAAACAGCCCTTGGT (서열번호 18)
NtHin1	GAGCTATGTATaCAAGGCCAGAG (서열번호 19)	GCTTCACTTCCATCTCAAAAAC (서열번호 20)
NtSgr	AAAGAACTCCCTGTGGTTCTGA (서열번호 21)	AATCCCAGTTGCTATTGCTTGT (서열번호 22)
NtCAB	ACAGAGCTCTTGAGGTTATCCA (서열번호 23)	CACAACTTGAAAACCTAGCACA (서열번호 24)
NbActin	CCAGGTATTGCTGATAGAATGAG (서열번호 25)	CTGAGGGAAGCCAAGATAGAG (서열번호 26)
NtCYCD3;1	AAATGATTCATGGGATTTGGAG (서열번호 27)	CAACCACCAGCTAAGCTCTTCT (서열번호 28)
NtCYCA	TTCAAAACCAGTCCAATCACTG (서열번호 29)	AAGCCTTCACATTTCCACCTAA (서열번호 30)
NtCDKA;4	TCCTGTTGATGTGTGGTCAG (서열번호 31)	AATGGAACATCAGAGCATTGTG (서열번호 32)
NtCDKB1-1	AATGGACGAAGAAGGGATTC (서열번호 33)	TGAGAGAAGGAGGGAGAGGT (서열번호 34)

병원균 접종

병원균 접종을 위해, Xag 8ra(X. axonopodis pv. glycines 8ra), Xav 레이스 1 및 Xav 레이스 3은 YEP(Yeast extract peptone) 액체 배지에서 30℃에서 18시간 동안 200rpm으로 진탕 배양되었다. 상기 배양액의 원심분리 후, 박테리아 세포는 멸균된 10 mM MgCl₂ 용액에 재현탁되었다. 각각 병원균은 OD₆₀₀ 0.2로 희석되어 바늘 없는 주사기를 사용하여 식물 잎에 침윤되었다. TMV P₀ 균주로 감염시킨 담배 잎 1g은 수확되었고, TMV 접종물을 만들기 위해 0.1 M 인산(phosphate) 완충액(pH 7.0) 10 ㎖에서 분쇄되었다(Kang WH et al., 2010. heor TAppl Genet. 120(8): 1587-1596). 카보런덤(carborundum)(Hayashi Pure Chemical Ind., Japan)과 함께 상기 접종물은 고추 잎에 문질러졌고 10분 후에 물로 세척되었다. 처리된 모든 잎은 특정 시점에 수확되었고, RNA 추출을 위하여 액체 질소에 냉동되었다.

방어-관련 신호전달 분자의 처리

신호전달 분자의 처리를 위해, 5주 된 고추 잎은 상기와 같이 바늘이 없는 주사기를 사용하여 10% 아세톤 내 3 mM 에테폰(ethephon, ET) 또는 60 μM 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate, MeJA)로 침윤되었다(Yeom SI et al., 2011. Mol Plant Microbe Interact. 24(6): 671-684). 살리실산(Salicylic acid, SA) 처리는 5 mM SA를 고추 잎에 분무하여 수행되었다. SA로 처리된 고추 식물은 3시간 동안 비닐 봉지에 넣어 보관되었다. 잎은 처리 후 특정 시점에 수집되었고 RNA 추출을 위해 액체 질소에 냉동되었다.

RNA 추출과 유전자 발현 분석

유전자 발현 조사를 위해 총 RNA는 TRIZOL 시약을 사용하여 냉동된 고추 및 담배로부터 추출되었다(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA). 제1가닥 cDNA는 Oligo(dT) 및 SuperScript II reverse transcriptase(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 5 ㎍의 총 RNA로부터 합성되었다. 정량 또는 반정량 RT-PCR은 Primer3 software(http://frodo.wi.mit.edu/primer3)로 고안된 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 수행되었다(표 2). 유전자 발현량의 분석을 위해 정량적 RT-PCR은 Syto 9(Invitrogen)을 사용한 Roter-Gene 2000(Qiagen, Chatsworth, CA, USA)으로 수행되었다. 형광은 72℃에서 60 주기 동안 수행되었고, 각 샘플의 발현 수준은 액틴(Actin)으로 표준화되었다. 반정량 RT-PCR은 MyCycler(Biorad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 수행되었고, PCR 산물은 1% 아가로스 겔에 전기영동되었고, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색된 다음, 자외선 광 하에 사진촬영되었다.

CaSD1 - smGFP ( CaSD1 - soluble modified form of green fluorescent protein ) 또는 smGFP 의 세포내 위치( subcellular localization )

pMBP1:CaSD1-smGFP(pBI121-변형) 및 pMBP1:smGFP은 LI(ligation-independent) 방법을 사용하여 구축되었고, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV2260 균주 내로 형질전환 되었다(Oh SK et al., 2010. Mol Cells. 30(6): 57-562). 상기 형질전환된 세포는 YEP 배지에서 30℃, 200 rpm로 밤새 진탕 배양되었고, 그 후 원심분리된 다음 10 mM MES (pH 5.5)/10 mM MgCl₂ 을 x포함하는 침윤 완충액에 재현탁되었다. 상기 세포 현탁액(OD₆₀₀=0.5)은 200 μM 아세토시린곤(acetosyringone)으로 3시간 동안 실온에서 배양되었다. 그 후 상기 세포 현탁액은 바늘이 없는 주사기를 사용하여 담배(N. benthamiana) 잎의 뒷면에 침윤되었다. 침윤 하루 후, 배축의 표피 세포층이 벗겨졌고, GFP 형광은 공초점 레이저 현미경(LSM510, Carl Zeiss, Wetzlar, Germany)에 의해 관찰되었다. DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole) 화합물은 핵 염색에 사용되었다.

담배( N. benthamiana )에서 TOE( Transient overexpression )

3' UTR을 포함하는 CaSD1 ORF(open reading frame)는 5' 및 3' 말단에 BamHI및 SacI 인식 서열을 각각 포함하는 프라이머로 증폭되었다. 상기 PCR 산물은 BamHI 및 SacI로 처리된 pMBP1 벡터에 클로닝되었다(Suh MC et al., 1998. Mol Cells. 8(6): 678-684). 상기 클로닝 산물은 아그로박테리움 GV2260 균주에 형질전환되었다. 아그로박테리움 형질전환-pMBP1:CaSD1 및 pMBP1 대조군은 YEP 배지에서 30℃, 200rpm으로 밤새 진탕 배양되었다. 상기 세포는 원심분리되었고 10 mM MES(pH 5.5)/10 mM MgCl₂을 포함하는 침윤 완충액에 재현탁되었다. 상기 박테리아 현탁액(O.D₆₀₀=0.5)은 실온에서 3시간 동안 200 μM 아세토시린곤에서 배양되었다. 배양 후, 상기 박테리아 현탁액은 바늘 없는 주사기를 사용하여 담배 잎의 뒷면에 침윤되었다. 상기 침윤시킨 잎은 RNA 추출을 위해 사용되었고 특정 시점에 현미경으로 관찰되었다.

광학현미경 및 전계 방출주사 전자 현미경

일시적으로 과발현된 담배 잎 표면이 모니터링되었고, TOE 후 10일째에 트리콤(trichome)의 관찰을 위해 광학 현미경(Siwon Optical Technology, Suwon, Korea)하에 사진 촬영되었다. 트리콤 밀도 및 세포크기의 분석을 위해, 전계 방출주사 전자 현미경(SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Wetzlar, Germany, NICEM at Seoul National University)이 TOE 후 2, 7 및 10일째에 낮은 진공 모드(low-vacuum mode)에서 샘플의 처리 없이 사용되었다. 상기 샘플은 15-kV 가속 전압(accelerating voltage)으로 모니터링되었고 사진은 디지털 방식으로 촬영되었다.

실시예 1: 캡시쿰 ( Capsicum ) 속의 종에서만 존재하는 신규 단백질인 CaSD1

식물-병원균의 상호작용에 관련되는 분비 단백질을 동정하기 위해서, CaS(C. annuum secretome) 유전자는 YST 시스템을 사용하여 파이토프쏘라 캡사이시(Phytophthora . capsici) 접종 후 고추 뿌리로부터 분리되었다(Yeom SI et al., 2011. Mol Plant Microbe Interact. 24(6): 671-684). 상기 유전자들 중 병원균 감염 동안 발현 증가를 보인 CaS113은 추가적인 연구를 위해 선택되었다. CaS113의 부분적인 서열을 사용하여, 추정(putative) 전장 cDNA가 고추 품종 CM334의 BAC 서열에서부터 동정되었다(Yoo EY et al., 2003. Theor Appl Genet. 107(3): 540-543). 상기 예상되는 유전자는 신호 펩티드, 비반복 영역, 다중반복 영역 및 또 다른 비반복 영역으로 구성되는 58 kDa 분자량을 가진 493개의 아미노산을 코딩한다(도 1). 그 후 유전자는 CaSD1(C. annuum senescence - delaying gene 1)으로 명명되었다. 상기 다중반복 영역에서, 하나의 반복 단위는 1개 또는 2개의 아미노산이 종종 다른 15개의 다른 아미노산(KPPIHNHKPTDYDRS)으로 이루어진다. 358개의 아미노산으로 이루어진 부강 품종 유래 CaSD1이 클로닝되었고(서열번호 2), 반복의 수는 CM334 품종보다 적었다. 반복 영역을 제외한, 다른 영역은 동일하였다(도 1A). 게놈 DNA PCR 및 서열 분석을 이용한 추가 연구는 반복 단위 수가 캡시쿰 속의 종 및 품종에서 다양하다는 것을 나타내었다(도 2). 추가적으로, 두 개의 유전자가 CaSD1 주변의 BAC 서열에서 예상되었고, 이들은 보존적 신호 펩티드 및 비-반복 영역은 가지고 있지만 반복 영역은 없었다(도 3). 공지된 식물 게놈을 이용한 비교 게놈 분석은 반복 영역이 없는 유전자가 가지(Solanacea)과에 존재하는 반면, 반복 영역을 가지는 CaSD1 동족체(homolog)는 캠시쿰 속에서만 존재한다는 것을 나타내었다(도 3). 유전자은행 데이터베이스를 이용한 추가적인 연구에서 임의의 일치하는 유전자가 동정되지는 않았다(데이터 미제시). 상기 결과는 CaSD1이 캡시쿰-특이적 유전자라는 것을 나타낸다.

실시예 2: CaSD1 의 기관-특이적 및 병원균-반응성 발현

CaSD1 기관-특이적 발현을 조사하기 위해, 실시간 RT-PCR이 다른 고추 기관유래의 RNA 샘플을 사용하여 수행되었다. CaSD1은 잎에서보다 뿌리에서 전사 수준이 16배 정도 더 높게 구성적으로 발현되었다(도 4A). 이전 연구에서, CaSD1의 발현 수준은 고추 뿌리에서 증가하다가 파이토프쏘라 캡사이시 접종 후 급속하게 감소되었다(Yeom SI et al., 2011. Mol Plant Microbe Interact. 24(6): 671-684). CaSD1의 전사 수준은 파이토프쏘라 캡사이시를 같은 양으로 접종하였을 때 감수성 품종인 칠성초(Chilsungcho)보다 저항성 품종인 CM334에서 현저하게 더 높았다. 고추 잎에서 CaSD1의 전사 수준은 다른 병원균에 의한 감염 후 또한 증가하였다. 또한, 바이러스 및 박테리아 균 접종 후 CaSD1의 유사한 발현 양상이 관찰되었다. 고추 품종 ECW30R은 고추 점무늬 박테리아 병원균인 Xav 레이스 1(AvrBs3 / AvrBs3) 및 Xav 레이스 3(avrbs3 / avrbs3)으로 감염되었다. Xav 레이스 1과 상호작용 후 CaSD1의 발현은 Xav 레이스 3 과의 상호작용한 것에 비해 증가되었다(도 4B). 유사하게, TMV P₀ 균주는 부강 품종(TMV 저항성) 및 ECW30R 품종(TMV 감수성) 잎에 접종되었고, 부강 품종에서만 CaSD1의 발현이 유도되었다(도 4C). 또한, CaSD1은 비숙주 병원균 Xag 8ra의 접종에 의해 유도되었는데, 이는 고추 잎에서 과민성 반응을 유발한다(도 4D). 모든 경우, CaSD1의 전사 수준은 양립성(compatible) 병원균 상호작용 동안보다 비양립성 병원균 상호작용 동안에 현저하게 더 높았다.

CaSD1의 발현에 대한 비생물적 유도인자(elicitor)의 효과를 조사하기 위해, 고추 잎은 SA, ET 및 MeJA로 처리되었다. CaSD1의 발현은 SA 및 ET 처리 후 1시간 안에 유도되었고 6시간까지는 높게 유지된 반면, MeJA는 CaSD1의 발현을 억제하였다(도 4E 내지 G). 종합해보면, 상기 결과들은 CaSD1이 병원균 감염에 대한 고추 식물의 방어 반응에서 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 3: CaSD1 의 세포내 위치

CaSD1의 세포내 위치를 결정하기 위해, 식물에서 타겟팅(targeting) 실험이 형광 마커인 smGFP을 융합시킨 CaSD1를 전달하는 아그로박테리움을 사용한 TOE에 의해 수행되었다(Davis SJ and Vierstra RD, 1998. Plant Mol Biol. 36(4): 521-528). smGFP는 CaSD1의 C-말단에 융합되었고, TOE를 위한 pMBP1 벡터로 클로닝되었다(Suh MC et al., 1998. Mol Cells. 8(6): 678-684). pMBP1:CaSD1-smGFP 또는 pMBP1:smGFP을 전달하는 아그로박테리움 현탁액은 담배 잎에 침윤되었다. TOE 후 1일째, 잎의 배축 표피 세포층은 공초점 레이저 현미경(confocal laser scanning microscopy)으로 관찰되었다. pMBP1:CaSD1-smGFP의 GFP 형광은 세포벽을 포함하는 세포외 매트릭스에서 관찰된 반면, pMBP1:smGFP는 세포 전반에 걸쳐 관찰되었다(도 5). 상기 결과는 CaSD1이 담배 식물의 세포벽 또는 세포외 공간으로부터 분비되고, 그곳에 위치하고 있다는 것을 나타낸다.

실시예 4: 노화 지연 및 트리콤 ( trichome ) 형성 유도의 원인이 되는 CaSD1 의 TOE

식물에서 CaSD1의 기능을 조사하기 위해서, pMBP1(pBI121-변형) 또는 pMBP1:CaSD1의 아그로박테리움-매개 TOE가 담배에서 수행되었다(Suh MC et al., 1998. Mol Cells. 8(6): 678-684). CaSD1- 및 공벡터-발현 식물 사이의 현저한 차이는 접종 후 7일째에 관찰되었다. CaSD1-과발현 영역은 노화지연을 보인 반면, 공 벡터 pMBP1-발현 영역에서 노화는 촉진되었다(도 6A). 게다가, 상기 노화-지연 영역은 잎이 분리된 후에도 녹색 반점이 남아있었고(도 6B), 온전한 식물체 잎은 pMBP1-대조군 잎이 죽을 때까지도 여전히 옅은 녹색이었다(도 6C). 노화에 대한 CaSD1의 영향을 더 이해하기 위해서, 유전자 프로파일링 실험이 수행되었다. 식물에서 노화뿐 아니라 세포사의 마커 유전자인 Hin1(Harpin - induced 1) 및 엽록소 분해를 조절하는 Sgr(Staygreen)이 모니터링 되었다(Park SY et al., 2007. Plant Cell. 19(5): 1649-1664). 상기 2개 유전자의 발현 수준은 벡터-대조군 식물체에 비해 CaSD1-과발현된 식물체에서 하향조절되었다(도 6D). 반면에, 광합성 진행과 관련이 있는 CAB(Chlorophyll a/b binding protein gene)의 발현 수준은 유지되었다. 상기 결과는 CaSD1이 특정 노화-관련 유전자의 발현 수준에 영향을 준다는 것을 나타낸다.

CaSD1-과발현 식물체의 또 다른 독특한 표현형은 트리콤 형성의 유도이다. 트리콤은 식물잎에 규칙적으로 분포하는 특정 표피 세포이다. TIS(Trichome initiation sites)는 상기 공 벡터에 비해 CaSD1-과발현 잎에서 TOE 후 10일째 대략 10배 정도가 현저하게 증가되었다(도 7A). 대조군 잎에서 분리된 트리콤에 비해, 몇몇 CaSD1-과발현 잎은 TIS당 하나 이상의 트리콤을 발생시켰고, 이는 인접한 트리콤과 클러스터를 야기하였다(도 7B). 게다가, CaSD1-과발현 식물체에서 표피 세포의 크기는 대조군 식물체에 비해 트리콤 세포가 발달 전에 현저하게 확장되었다(도 8A 및 8B).

트리콤 발달 및 세포 크기는 내재복제를 포함하는 세포 주기 조절과 관련된다(Dewitte W et al., 2007. Proc Natl Acad Sci U S A. 104(36): 14537-14542). CaSD1-과발현 식물체에서 세포주기 조절의 분자 메커니즘을 설명하기 위해, 사이클린(cyclin) 또는 사이클린-의존성 키나제(cyclin-dependent kinase)와 같은 세포 분화-관련 유전자의 반정량 RT-PCR이 수행되었다. 상기 유전자 발현 수준은 pMBP1-대조군 식물체에서 노화 동안 하향조절된 반면, CaSD1-과발현 식물체에서는 여전히 발현되었다(도 8C). 상기 결과는 CaSD1이 세포 운명 결정 및 세포 분열 조절에서 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (20)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 고추(Capsicum annuum) 유래의 병 저항성 증진 또는 노화지연 관련 CaSD1( Capsicum annuum senescence - delaying 1) 단백질.
2. 제1항의 단백질을 코딩하는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
6. 제5항에 있어서, 식물세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
7. 삭제
8. 삭제
9. 제4항의 재조합 벡터를 쌍자엽 식물세포에 형질전환시켜 CaSD1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 쌍자엽 식물의 노화를 지연시키는 방법.
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 제4항의 재조합 벡터로 쌍자엽 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 쌍자엽 식물세포로부터 쌍자엽 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 노화지연 형질전환 쌍자엽 식물체의 제조 방법.
15. 제14항의 방법에 의해 제조된 노화가 지연된 형질전환 쌍자엽 식물체.
16. 삭제
17. 제15항에 따른 쌍자엽 식물체의 종자.
18. 삭제
19. 삭제
20. 제2항의 유전자를 포함하는, 쌍자엽 식물의 노화를 지연시키기 위한 조성물.

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