KR20110101707A - 싸이토키닌 합성 유전자의 발현 정도 및 위치를 조절함으로써 바이오매스를 증진시키고, 식물의 노화를 지연시키는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 싸이토키닌 합성 유전자의 발현 정도 및 위치를 조절함으로써 바이오매스를 증진시키고, 식물의 노화를 지연시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 상기 목적을 달성하기 위해 (1)서열번호 1의 aux promoter와 서열번호 2의 ns-LTP primer의 식물발현을 위한 프라이머 제작단계 ; (2)서열번호 1의 aux promoter와 서열번호 2의 ns-LTP promoter 증폭단계 ; (3)상기 promoter를 이용하여 목적으로 하는 유전자를 도입하는 단계 및 아그로박테리아 세균에서 복제 가능한 발현벡터를 제작하는 단계 ; (4)상기 발현벡터를 아그로박테리아 세균에 도입하여 형질전환 아그로박테리아 세균을 얻는 단계 ; 및 (5)상기 단계에서 얻은 형질전환 아그로박테리아 세균을 식물체에 감염시키는 단계를 포함하는 씨토니킨 합성 유전자의 발현 정도를 조절함으로써 바이오매스를 증진시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본발명은 상기 감염된 식물체의 바이오매스 증진 생산방법을 이용함에 있어 씨토키닌 합성 유전자가 녹색조직에만 발현시키도록 하여 식물의 노화를 지연시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 식물의 바이오매스를 증진시키고, 식물의 지상부의 녹색조직에만 코딩 시퀸스를 발현시켜 녹색조직의 발현시기를 연장시키는 방법을 제공함으로써 우수한 바이오매스를 생산할 수 있게 함은 물론 바이오에너지 공급원에 기여할 수 있게 된다. 또한 본 발명을 통해 싸이토키닌 합성 유전자의 발현정도를 조절함으로써 포플러의 바이오매스를 수배이상 증진시키는 것이 가능하며, 이 유전자를 잔디 등에 도입할 경우 가을에 녹색을 더 오래 유지시킬 것으로 판단되므로 산업상 이용가능성이 우수하다.
본 발명은 식물의 바이오매스를 증진시키고, 식물의 지상부의 녹색조직에만 코딩 시퀸스를 발현시켜 녹색조직의 발현시기를 연장시키는 방법을 제공함으로써 우수한 바이오매스를 생산할 수 있게 함은 물론 바이오에너지 공급원에 기여할 수 있게 된다. 또한 본 발명을 통해 싸이토키닌 합성 유전자의 발현정도를 조절함으로써 포플러의 바이오매스를 수배이상 증진시키는 것이 가능하며, 이 유전자를 잔디 등에 도입할 경우 가을에 녹색을 더 오래 유지시킬 것으로 판단되므로 산업상 이용가능성이 우수하다.
Description
본 발명은 신기능 형질전환체 개발 연구의 일환으로 싸이토키닌(cytokinin)을 합성하는 유전자의 코딩 시퀸스(coding sequence)의 발현을 조절하는 프로모터(promoter)를 변형시켜 발현 정도를 조절하여 측아의 생장을 촉진시키고 잎의 총수를 증가시켜 상부 바이오매스(biomass)를 증진시키는 방법과 지상부의 녹색조직에만 코딩 시퀸스를 발현시켜 녹색조직의 발현시기를 연장시키는 기술에 해당한다.
최근 지구 환경 문제가 한층 더 심각해지고 있고, 이전의 기후 변동 범위 조약 제3회 체결국 회의에서 채택된 쿄토 의정서에서는 온실효과를 초래하는 공해배출의 감축을 요구하며, 장래적으로 화석연료의 고갈이 예측되는 가운데 재생 가능한 에너지의 개발이 전세계적으로 화두로 떠오르고 있다. 이에 대한 해결책으로서 근래 바이오매스가 주목받고 있다.
바이오매스라 함은 넓은 의미로서 에너지 전용의 작물과 나무, 농산품과 사료작물, 농작 폐기물과 찌꺼기, 임산 폐기물과 부스러기, 수초, 동물의 배설물, 도시 쓰레기, 그리고 여타의 폐기물에서 추출된 재생 가능한 유기 물질로 현재 에너지원으로 쓰여지고 있는 목재, 식물, 농ㆍ임산 부산물, 도시 쓰레기와 산업 폐기물 내의 유기 성분 등을 일컫는다.
상기와 같은 바이오매스의 이용기술은 1차 석유파동이 일어났던 1970년대에 본격적으로 등장한 기술로서 태양의 에너지를 탄소로 고정시키는 일종의 식물공정이라 할 수 있다. 나아가 유칼리, 포플러, 유채, 억새 등 다양한 속성생장 식물 중에서 바이오매스 생산량이 많은 품종이 선발되어 이용되고 있다.
바이오매스의 이용과 관련된 품종선발기술은 최근 이미 한계에 이르러 더 이상의 개량의 여지는 많이 남아있지 않다.
이에 본 발명에서는 바이오매스 생산량이 가장 탁월하다고 알려진 포플러에 식물의 생장과 발달을 촉진시키는 호르몬인 싸이토키닌을 합성하는 유전자를 도입하여 바이오매스를 증진시키는 방법을 개발하고자 함에 목적이 있다.
더 상세하게는 싸이토키닌을 합성하는 유전자의 코딩 시퀸스의 발현을 조절하는 프로모터를 변형시켜 발현 정도를 조절하여 측아의 생장을 촉진시키고 잎의 총수를 증가시켜 상부 바이오매스를 증진시키는 방법과 지상부의 녹색조직에만 코딩 시퀸스를 발현시켜 녹색조직의 발현시기를 연장시키는 방법에 관한 것이다.
종래의 식물형질전환으로 도입유전자의 발현을 조절하는 프로모터는 도입유전자의 발현양을 최대로 끌어 올리는 Cauliflower mosaic virus의 35S promoter와 같은 것들이었다.
이러한 강력한 발현유도는 유전자 발현이라는 측면에서는 효과가 탁월하지만 호르몬등과 같이 극소량으로 작용하는 경우 오히려 식물의 정상적인 발육을 저해하거나 죽게 만들 수 있다. 호르몬인 싸이토키닌은 과량으로 처리하면 잎이 작아지고 식물체가 약해지며 뿌리가 발생되지 않는 등 식물의 정상적인 생장을 유지 할 수 없는 경우가 이전의 결과들에서 보고되고 있다. 따라서 호르몬인 싸이토키닌의 발현량을 낮추어 정상적인 형태를 유지하거나 호르몬이 필요한 특정 조직으로만 발현을 제한시킬 필요성이 제기되고 있다. 그러나 어느 정도 낮추어야 최대 바이오매스 생산량을 얻을지에 대하여 알려진 바가 전혀 없다.
또한, 상기한 종래의 식물 형질전환을 위한 프로모토의 경우에는 외국의 일부 기관에서 특허권을 가지고 있으므로 형질전환 식물체를 제조하거나 이를 이용한 실용적인 제품의 생산시 고가의 로열티를 지불해야 하므로 독자적인 프로모터의 개발이 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 연구를 지속적으로 수행하여 서열번호 1의 aux promoter와 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 이용하여 목적으로 하는 코딩 시퀸스의 발현위치와 발현량을 조절할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명의 목적은 싸이토키닌을 합성하는 유전자의 코딩 시퀸스의 발현을 조절하는 프로모터를 변형시켜 발현 정도를 조절하여 측아의 생장을 촉진시키고 잎의 총수를 증가시켜 상부 바이오매스를 증진시키는 방법과 지상부의 녹색조직에만 코딩 시퀸스를 발현시켜 녹색조직의 발현시기를 연장시키는 방법을 제공함에 있다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위해 (1)서열번호 1의 aux promoter와 서열번호 2의 ns-LTP primer의 식물발현을 위한 프라이머 제작단계 ; (2)서열번호 1의 aux promoter와 서열번호 2의 ns-LTP promoter 증폭단계 ; (3)상기 promoter를 이용하여 목적으로 하는 유전자를 도입하는 단계 및 아그로박테리아 세균에서 복제 가능한 발현벡터를 제작하는 단계 ; (4)상기 발현벡터를 아그로박테리아 세균에 도입하여 형질전환 아그로박테리아 세균을 얻는 단계 ; 및 (5)상기 단계에서 얻은 형질전환 아그로박테리아 세균을 식물체에 감염시키는 단계를 포함하는 싸이토키닌 합성 유전자의 발현 정도를 조절함으로써 바이오매스를 증진시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 감염된 식물체의 바이오매스 증진 생산방법을 이용함에 있어 씨토키닌 합성 유전자가 녹색조직에만 발현시키도록 하여 식물의 노화를 지연시키는 방법을 제공한다.
상기와 같은 싸이토키닌 합성 유전자의 발현 정도를 조절함으로써 바이오매스를 증진시키는 방법 및 싸이토키닌 합성 유전자가 녹색조직에만 발현시키도록 하여 식물의 노화를 지연시키는 방법을 통하여 식물에 있어 측아의 발생 및 생장을 촉진시키고 잎의 총수를 증가시켜 상부 바이오매스를 증진시키는 유리한 효과가 있다.
나아가 지상부의 녹색조직에만 유전자를 발현시킴으로써 녹색조직의 발현시기를 연장시키는 유리한 효과가 있다.
구체적으로 본 발명을 통해 싸이토키닌 합성 유전자의 발현정도를 조절함으로써 포플러의 바이오매스를 수배이상 증진시키는 것이 가능하며 이 유전자를 잔디 등에 도입할 경우 가을에 녹색을 더 오래 유지시킬 것으로 판단된다.
도 1은 서열번호 1의 aux promoter를 발현조절 promoter로 이용한 형질전환 벡터 및 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 발현조절 promoter로 이용한 형질전환용 vector를 나타낸다. 서열번호 1의 aux promoter를 이용한 식물형질 전환벡터의 T-DNA 지역과 관련하여 RB 및 LB는 각각 T-DNA의 오른쪽 및 왼쪽 경계이고, nos-nptII는 항생제 가나마이신 저항성 유전자이다.
도 2는 서열번호 1의 aux promoter로 발현이 조절된 형질전환체의 기내 생장 모습을 나타낸다. 서열번호 1의 aux promoter로 발현이 조절된 형질전환체의 기내 생장(가운데) 및 coding sequence의 강한 발현을 보이는 35S promoter가 도입된 형질전환체(왼쪽)는 뿌리를 형성하지 못하여 정상적인 식물체로 생장하지 못하나, 서열번호 1의 aux promoter가 도입된 형질전환체(오른쪽)는 약한 발현을 보이며 정상적 식물체로 생장하는 모습을 보이고 있다.
도 3은 서열번호 1의 aux promoter로 발현이 조절된 형질전환체의 포지생장 모습을 나타낸다. Promoter에 따른 형질전환체의 cytokinin 함량과 관련하여 coding sequence의 강한 발현을 보이는 35S promoter가 도입된 형질전환체(오른쪽 3개의 클론)에 비하여 서열번호 1의 aux promoter가 도입된 클론(가운데 3개의 클론)은 일반식물체(왼쪽 3개의 클론)보다 높으면서 35S promoter로 조절된 클론보다는 낮은 세포내 cytokinin함량을 나타낸다.
도 4는 서열번호 1의 aux promoter로 발현이 조절된 형질전환체의 포지생장을 나타낸 사진이다. 서열번호 1의 aux promoter가 도입된 형질전환체(오른쪽 개체)는 측아 생장이 활발하고 잎수가 많아지는 특징을 보인다.
도 5는 Real time PCR로 promoter별 유전자 발현량 조사하여 coding sequence가 형질전환식물체에서 발현되고 있는 양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 서열번호 1의 aux promoter에 의해 조절을 받는 싸이토키닌 생산 유전자를 도입시킨 형질전환 클론들의 식물체 건중량을 나타낸 표이다.
도 7은 광합성율과 관련하여 일반포플러의 광합성이 억제되는 늦가을에도 여전히 광합성을 하는 AUX-tzs 포플러를 확인할 수 있는 표이다.
도 8은 서열번호 1의 aux promoter에 의한 coding sequence 발현으로 측아발생이 증가하는 모습을 나타낸다.
도 9는 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 통한 유전자 발현조절 모습이다. 서열번호 2의 ns-LTP promoter에 의한 coding sequence 발현 부위 조절로 지상부 녹색조직으로만 유전자 발현이 한정된 모습을 보인다.
도 2는 서열번호 1의 aux promoter로 발현이 조절된 형질전환체의 기내 생장 모습을 나타낸다. 서열번호 1의 aux promoter로 발현이 조절된 형질전환체의 기내 생장(가운데) 및 coding sequence의 강한 발현을 보이는 35S promoter가 도입된 형질전환체(왼쪽)는 뿌리를 형성하지 못하여 정상적인 식물체로 생장하지 못하나, 서열번호 1의 aux promoter가 도입된 형질전환체(오른쪽)는 약한 발현을 보이며 정상적 식물체로 생장하는 모습을 보이고 있다.
도 3은 서열번호 1의 aux promoter로 발현이 조절된 형질전환체의 포지생장 모습을 나타낸다. Promoter에 따른 형질전환체의 cytokinin 함량과 관련하여 coding sequence의 강한 발현을 보이는 35S promoter가 도입된 형질전환체(오른쪽 3개의 클론)에 비하여 서열번호 1의 aux promoter가 도입된 클론(가운데 3개의 클론)은 일반식물체(왼쪽 3개의 클론)보다 높으면서 35S promoter로 조절된 클론보다는 낮은 세포내 cytokinin함량을 나타낸다.
도 4는 서열번호 1의 aux promoter로 발현이 조절된 형질전환체의 포지생장을 나타낸 사진이다. 서열번호 1의 aux promoter가 도입된 형질전환체(오른쪽 개체)는 측아 생장이 활발하고 잎수가 많아지는 특징을 보인다.
도 5는 Real time PCR로 promoter별 유전자 발현량 조사하여 coding sequence가 형질전환식물체에서 발현되고 있는 양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 서열번호 1의 aux promoter에 의해 조절을 받는 싸이토키닌 생산 유전자를 도입시킨 형질전환 클론들의 식물체 건중량을 나타낸 표이다.
도 7은 광합성율과 관련하여 일반포플러의 광합성이 억제되는 늦가을에도 여전히 광합성을 하는 AUX-tzs 포플러를 확인할 수 있는 표이다.
도 8은 서열번호 1의 aux promoter에 의한 coding sequence 발현으로 측아발생이 증가하는 모습을 나타낸다.
도 9는 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 통한 유전자 발현조절 모습이다. 서열번호 2의 ns-LTP promoter에 의한 coding sequence 발현 부위 조절로 지상부 녹색조직으로만 유전자 발현이 한정된 모습을 보인다.
본 발명은 (1)서열번호 1의 aux promoter와 서열번호 2의 ns-LTP primer의 식물발현을 위한 프라이머 제작단계 ; (2)서열번호 1의 aux promoter와 서열번호 2의 ns-LTP promoter 증폭단계 ; (3)상기 promoter를 이용하여 목적으로 하는 유전자를 도입하는 단계 및 아그로박테리아 세균에서 복제 가능한 발현벡터를 제작하는 단계 ; (4)상기 발현벡터를 아그로박테리아 세균에 도입하여 형질전환 아그로박테리아 세균을 얻는 단계 ; 및 (5)상기 단계에서 얻은 형질전환 아그로박테리아 세균을 식물체에 감염시키는 단계를 포함하는 씨토니킨 합성 유전자의 발현 정도를 조절함으로써 바이오매스를 증진시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 감염된 식물체의 바이오매스 증진 생산방법을 이용함에 있어 씨토키닌 합성 유전자가 녹색조직에만 발현시키도록 하여 식물의 노화를 지연시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 식물 형질전환 발현조절에 사용된 프로모터는 이미Agrobacterium rhizogenes에서 aux1과 aux 2 유전자의 발현을 조절한다고 알려져 있다. 이들 프로모터를 미생물에서 분리하고 식물에서 발현되도록 조작한 후 이를 T-DNA 벡터에 도입하여 식물 형질전환시 프라이머로 사용한다.
본 발명에 사용된 벡터는 도 1과 같은 계열지도를 갖는 T-DNA 벡터로서 도 1에서 RB 및 LB는 각각 T-DNA의 오른쪽 및 왼쪽 경계, nos-nptII는 항생제 가나마이신 저항성 유전자, NOS 3'는 Nopaline synthase terminator, CaMV 35S는 Cauliflower mosaic virus 35S promoter를 의미하는데, 본 발명에서는 CaMV 35S promoter를 대치하여 서열번호 1의 aux promoter 및 서열번호 2의 ns-LTP promoter가 사용된다.
본 발명에 의한 서열번호 1의 aux promoter 및 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 이용하여 발현부위와 발현량을 조절하는 벡터의 도입에 사용되는 아그로박테리아 세균은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterim rhyzogenes) 등이 이용될 수 있다.
본 발명에 의한 서열번호 1의 aux promoter 및 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 이용하여 발현부위와 발현량을 조절하는 이용하는 방법에서는 형질전환 식물체의 싸이토키닌 유전자의 발현수준, 호르몬 싸이토키닌의 생산량 및 biomass 생산능력을 확인한다.
이하 본 발명의 내용을 실시 예를 통하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나 다음의 실시 예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니다.
<실시예 1> promoter의 식물 발현을 위한 프라이머 제작
서열번호 1의 aux promoter 증폭을 위한 프라이머(primer)로 aux 1은 '5-aag ctt gat gcg gtt gaa agg agt g-3(서열번호 4)' 이고, aux 2는 '5-aag ctt ttc gtt gtg ctg agg gaa c-3(서열번호 5)'를 사용하였다.
세균 유래 유전자임을 감안하여 진핵식물의 리보솜 부착부위(ribosome binding site인 CGAAA)를 ATG 개시 코돈 앞에 삽입하였다. Cloning의 용이성을 위하여 aux 1과 aux 2 primer에 제한효소 Hind III의 절단부위를 삽입하였다. 또한 서열번호 2의 ns-LTP promoter 증폭을 위한 프라이머(primer)로 nsl-pro13은 '5-aag ctt ttt acg tac ggg caa tgc ta-3' nsl-pro14는'5-cag tag ctt gtc gac att ttg agg atc c-3'를 사용하였다.
pBI121과의 coning의 용이성을 위하여 nsl-pro13에는 제한효소 Hind III(aagctt)를 nsl-pro14에는 BamH I의 절단부위(ggatcc)를 삽입하였다.
<실시예 2> 서열번호 1의 aux promoter 및 서열번호 2의 ns-LTP promoter의 증폭
aux 프로모터(promoter)는 Agrobacterium rhizogenesis의 플라스미드 DNA를 분리하여 주형 DNA로 이용하고, 프라이머 aux 1과 aux 2로 서열번호 1의 aux promoter를 PCR로 증폭하였다. 서열번호 2의 ns-LTP 프로모터(promoter)는 nsl-pro13과 nsl-pro14로 서열번호 2의 ns-LTP 프로모터(promoter)를 증폭하였다.
증폭을 위한 PCR cycle은 94에서 2분간 가열한 후 35 싸이클(cycle)을 94에서 40초간, 55에서 40초간, 72에서 1분 20초간 실행하였다.
<실시예 3> T-DNA 벡터의 및 형질전환 세균의 제조
증폭된 서열번호 1의 aux promoter는 바이너리 벡터(binary vector) pBI121의 35S promoter 부분을 Hind III으로 절단하여 제거하고 서열번호 1의 aux promoter를 클로닝(cloning)하여 도 1와 같은 유전자 배열을 가진 T-DNA 벡터를 제조하였으며 서열번호 2의 ns-LTP promoter는 Hind III와 Bam HI으로 절단하여 동일한 방법으로 벡터를 제조하였다(도 1 참조).
상기에서 제조한 T-DNA 벡터를 동결용해(freezing and thawing) 방법으로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 삽입시켰다.
<실시예 4> 식물형질전환 및 식물체 재분화
시험관에서 생장중인 포플러에서 채취한 줄기조각과 aux-tzs, nsLTP-tzs 유전자가 들어있는 아그로박테리움 투메퍼시엔스 벡터를 20분간 공조배양하여 이 유전자를 포플러 세포에 삽입시켰다.
삽입된 유전자가 포플러 DNA와 결합하고 분열될 수 있도록 MS 기본배지에 2,4-D 1.0 mg/L, BA 0.1mg/L, NAA 0.01mg/L를 첨가한 한천배지에서 3일간 배양하였다.
과도한 아그로박테리아의 생장을 막기 위하여 줄기 조각을 0.85% NaCl로 씻어 준 후, 캘러스 유도배지에(MS 기본배지 + 2,4-D 1.0mg/L, BA 0.1mg/L, NAA 0.01mg/L)에 50mg/L의 가나마이신(kanamycin) 500mg/L의 세포탁심(cefotaxime)이 첨가된 배지로 옮겨 4주간 배양한 후 캘러스를 유도하였다.
발생된 캘러스를 줄기유도 배지(WPM +1.0mg/L의 제아틴(zeatin), 0.1mg/L 의 BA, 0.01mg/L의 NAA)에 50mg/L의 가나마이신(kanamycin) 500mg/L의 세포탁심(cefotaxime)이 첨가된 배지로 옮겨 배양하여 캘러스로부터 줄기를 재분화시켰다.
<실시예 5> 형질전환 식물체의 유전자 삽입 및 발현조절 확인
형질전환체의 총 RNA를 분리한 후, Real time PCR을 수행한 결과 도 5에서 보는 바와 같이 코딩 시퀸스의 발현이 조절되었음을 확인하였다.
<실시예 6> 형질전환 식물체에서 싸이토키닌 생산 유전자의 발현조절 효과 확인
aux-tzs 유전자가 도입된 형질전환체는 식물체를(MS 기본배지 + IBA 0.1 mg/L)에 배양하여 35S promoter가 도입된 형질전환체와 4주간 배양하여 형질전환 식물체의 생육형태를 조사하였는데, 서열번호 2에서 보는 바와 같이 35S promoter가 도입된 형질전환체는 호르몬의 강력한 발현으로 인하여 뿌리가 발달되지 못하고 저조한 생장을 보였으나 aux-tzs 유전자가 도입된 형질전환체는 정상적인 생장을 보여주었다.
<실시예 7> 호르몬 함량분석을 통한 biomass 생산용 품종 선발 가능성 확인
aux-tzs 유전자가 도입된 형질전환체를 삽목으로 포지에 식재한 후 biomass 증진을 확인하였다.
도 4및 도 6 에서 보는 바와 같이, 형질전환체는 측아 생장이 활발하고 잎의 총 수가 많아져서 바이오매스 생장이 증가하는 것을 알 수 있었다. 도 6에서 확인한 것처럼 트랜스 제아틴(trans zeatin) 함량이 0.008mg/g/F.W. 이하일 때 최대의 biomass를 가짐을 확인하였다.
<실시예 8> aux-tzs 유전자가 도입된 형질전환체를 포지에 식재하여 조사한 결과
도 6에서 보는 것과 같이 가을 일반포플러의 생장이 멈춘 후에도 광합성 효율이 높아 그만큼 생장기간이 연장되는 것을 확인하였다.
<실시예 9> 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 통한 유전자 발현조절 모습 확인
도 9에서 보는 것과 같이 서열번호 2의 ns-LTP 프로모터가 도입된 형질전환체를 표지유전자를 발현시켜 유전자가 녹색조직에만 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명은 바이오매스 생산량이 가장 탁월하다고 알려진 포플러에 식물의 생장과 발달을 촉진시키는 호르몬인 싸이토키닌을 합성하는 유전자를 도입하여 유전자의 코딩시퀸스의 발현을 조절하는 프로모터를 변형시켜 발현 정도를 조절함으로써 바이오매스를 증진시키는 방법을 개발하고 지상부의 녹색조직에만 코딩 시퀸스를 발현시켜 녹색조직의 발현시기를 연장시키는 방법을 개발함으로써 기존의 포플러와 우수한 바이오매스를 생산할 수 있음으로써 바이오에너지 공급원에 기여할 수 있으므로 산업상 이용가능성이 우수하다고 할 것이다.
나아가 본 발명을 통해 싸이토키닌 합성 유전자의 발현정도를 조절함으로써 포플러의 바이오매스를 수배이상 증진시키는 것이 가능하며, 이 유전자를 잔디 등에 도입할 경우 가을에 녹색을 더 오래 유지시킬 것으로 판단되므로 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.
<110> Kangwon University Educational-Industrial Complex
<120> Recombinant mutiplex PCR primer detecting diarrhoeal typed toxin
and emetic typed toxin simultaneously
<160> 12
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward multiplex PCR primer of cytK
<400> 1
tgctagtagt gctgtaactc 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse multiplex PCR primer of cytK
<400> 2
cgttgtttcc aacccagt 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward multiplex PCR primer of nheA
<400> 3
ggaggggcaa acagaagtga a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse multiplex PCR primer of nheA
<400> 4
cgaagagctg cttctctcgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward multiplex PCR primer of ces
<400> 5
ttccgctctc aataaatggg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse multiplex PCR primer of ces
<400> 6
tcacagcaca ttccaaatgc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward multiplex PCR primer of CER
<400> 7
gcgtaccaaa tcacccgttc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse multiplex PCR primer of CER
<400> 8
tgcaggtggc acacttgtta 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward multiplex PCR primer of hblC
<400> 9
cgcaacgaca aatcaatgaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse multiplex PCR primer of hblC
<400> 10
attgcttcac gagctgcttt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward multiplex PCR primer of entFM
<400> 11
aggcccagct acatacaacg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse multiplex PCR primer of entFM
<400> 12
ccactgcagt caaaaccagc 20
Claims (10)
- 서열번호 1의 aux promoter 및 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 이용하여 식물체내의 싸이토키닌합성유전자의 발현정도를 조절하는 방법.
- 서열번호 1의 aux promoter 및 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 이용하여 식물체내의 싸이토키닌합성유전자의 발현정도를 조절함으로써 바이오매스를 증진시키는 방법.
- 서열번호 1의 aux promoter 및 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 이용하여 식물체내의 싸이토키닌합성유전자의 발현위치를 조절하는 방법.
- 서열번호 1의 aux promoter 및 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 이용하여 식물체내의 싸이토키닌합성유전자가 녹색조직에만 발현되도록 조절함으로써 식물의 노화를 지연시키는 방법.
- 제2항에 있어서, 서열번호 1의 aux 프로모터와 서열번호 2의 ns-LTP 프로모터의 식물발현을 위해 프라이머를 제작하는 단계; 상기 aux 프로모터와 상기 ns-LTP 프로모터를 증폭하는 단계; 상기 증폭된 프로모터를 이용하여 싸이토키닌합성유전자를 도입하는 단계; 아그로박테리아 세균에서 복제 가능한 발현벡터를 제작하는 단계; 상기 제작된 발현벡터를 아그로박테리아 세균에 도입하여 형질전환 아그로박테리아 세균을 얻는 단계; 상기 세균을 식물체에 감염시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 서열번호 1의 aux promoter 및 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 이용하여 식물체내의 싸이토키닌합성유전자의 발현정도를 조절함으로써 바이오매스를 증진시키는 방법.
- 제4항에 있어서, 서열번호 1의 aux 프로모터와 서열번호 2의 ns-LTP 프로모터의 식물발현을 위해 프라이머를 제작하는 단계; 상기 aux 프로모터와 상기 ns-LTP 프로모터를 증폭하는 단계; 상기 프로모터를 이용하여 싸이토키닌합성유전자를 도입하는 단계; 아그로박테리아 세균에서 복제 가능한 발현벡터를 제작하는 단계; 상기 제작된 발현벡터를 아그로박테리아 세균에 도입하여 형질전환 아그로박테리아 세균을 얻는 단계; 상기 세균을 식물체에 감염시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 서열번호 1의 aux promoter 및 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 이용하여 식물체내의 싸이토키닌합성유전자가 녹색조직에만 발현되도록 조절함으로써 식물의 노화를 지연시키는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 벡터는 도 1과 같은 개열지도(cleavage map)를 갖는 T-DNA 벡터인 것을 특징으로 하는 서열번호 1의 aux promoter 및 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 이용하여 식물체내의 싸이토키닌합성유전자의 발현정도를 조절함으로써 바이오매스를 증진시키는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 벡터는 도 1과 같은 개열지도를 갖는 T-DNA 벡터인 것을 특징으로 하는 서열번호 1의 aux promoter 및 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 이용하여 식물체내의 싸이토키닌합성유전자가 녹색조직에만 발현되도록 조절함으로써 식물의 노화를 지연시키는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 아그로박테리아 세균은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterim rhyzogenes)인 것을 특징으로 하는 서열번호 1의 aux promoter 및 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 이용하여 식물체내의 싸이토키닌합성유전자의 발현정도를 조절함으로써 바이오매스를 증진시키는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 아그로박테리아 세균은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterim rhyzogenes)인 것을 특징으로 하는 서열번호 1의 aux promoter 및 서열번호 2의 ns-LTP promoter를 이용하여 식물체내의 싸이토키닌합성유전자가 녹색조직에만 발현되도록 조절함으로써 식물의 노화를 지연시키는 방법.
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| KR1020100020913A KR20110101707A (ko) | 2010-03-09 | 2010-03-09 | 싸이토키닌 합성 유전자의 발현 정도 및 위치를 조절함으로써 바이오매스를 증진시키고, 식물의 노화를 지연시키는 방법 |
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| KR (1) | KR20110101707A (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013062327A2 (ko) * | 2011-10-27 | 2013-05-02 | 제노마인(주) | 식물의 생산성 증대 기능, 노화 지연 기능 및 스트레스 내성 기능을 갖는 ａｔｐｇ4 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도 |
| KR101282409B1 (ko) * | 2011-11-02 | 2013-07-04 | 서울대학교산학협력단 | 고추 유래의 ＣａＳＤ1 유전자 및 이의 용도 |
| KR20160019171A (ko) * | 2014-08-11 | 2016-02-19 | 대한민국(산림청 국립산림과학원장) | 식물의 정단 및 근단 분열조직에 특이적으로 발현하는 현사시나무(Populus alba×Populus glandulosa) 유래 ns-LTP 유전자의 프로모터 |
-
2010
- 2010-03-09 KR KR1020100020913A patent/KR20110101707A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013062327A2 (ko) * | 2011-10-27 | 2013-05-02 | 제노마인(주) | 식물의 생산성 증대 기능, 노화 지연 기능 및 스트레스 내성 기능을 갖는 ａｔｐｇ4 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도 |
| WO2013062327A3 (ko) * | 2011-10-27 | 2013-06-20 | 제노마인(주) | 식물의 생산성 증대 기능, 노화 지연 기능 및 스트레스 내성 기능을 갖는 ａｔｐｇ4 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도 |
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