KR101281069B1 - 토마토 유래의 ＳｌＦＴＲ-ｃ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 FTR-c (catalytic subunit of ferredoxin:thioredoxin reductase) 유전자를 식물체에서 침묵시키는 단계를 포함하는 식물의 병원균 저항성을 증가시키는 방법, FTR-c 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환시켜 FTR-c 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물의 병원균 저항성을 조절하는 방법 및 병원균 저항성을 유발시키는 FTR-c (catalytic subunit of ferredoxin:thioredoxin reductase) 유전자를 포함하는 식물의 병원균 저항성 조절용 조성물에 관한 것이다.

Description

토마토 유래의 ＳｌＦＴＲ-ｃ 유전자 및 이의 용도{SlFTR-c gene from Solanum lycopersicum and uses thereof}
본 발명은 토마토 유래의 SlFTR-c 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 FTR-c (catalytic subunit of ferredoxin:thioredoxin reductase) 유전자를 식물체에서 침묵시키는 단계를 포함하는 식물의 병원균 저항성을 증가시키는 방법, FTR-c 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환시켜 FTR-c 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물의 병원균 저항성을 조절하는 방법 및 병원균 저항성을 유발시키는 FTR-c (catalytic subunit of ferredoxin:thioredoxin reductase) 유전자를 포함하는 식물의 병원균 저항성 조절용 조성물에 관한 것이다.
식물은 일생동안 다양한 식물병원균를 포함하는 수많은 생물적 스트레스에 대해 끊임없이 자신을 방어해야 한다. 식물은 부동성(immobility) 때문에, 병원균의 공격에 대비하기 위한 다양하고 복잡한 일련의 방어 기전이 발달하였다 (Dangl and Jones, Nature 411 (2001) 826-833). 상기 병원균-저항성 반응은 PCD (programmed cell death) 및 수많은 방어 기전의 조절된 활성화가 종종 동반된다 (Mittler and Lam, Trends Microbiol. 4 (1996) 10-15). 상기 반응은 과민성 반응(HR, hypersensitive response)으로 불리며, 이는 감염부위 주변에 죽은 세포의 구역 형성, 많은 양의 ROS (reactive oxygen species)의 일시적인 생성, 그리고 PR 단백질 및 피토알렉신(phytoalexin)과 같은 항균성 물질의 축적을 야기한다 (Heo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 766-771). 게다가, 상기 식물 방어 반응은 살리실산(salicylic acid), 자스몬산(jasmonic acid), 에틸렌(ethylene) 및 앱시스산(abscisic acid)과 같은 식물호르몬에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다 (Mauchi-Mani and Mauch, Curr. Opin. Plant Biol. 8 (2005) 409-414). 따라서, 병원균 공격에 대한 식물 반응은 세포 수준에서 호르몬 또는 ROS의 고도로 조절된 일련의 순차적인 변화의 결과이다 (Ton et al., Trends Plant Sci. 14 (2009) 310-317).
페레독신/티오레독신(ferredoxin/thioredoxin) 시스템은 산소를 발생하는 광합성 유기체에서 광-의존적, 효소-조절 시스템이며, 여기에서 FTR (ferredoxin:thioredoxin reductase)은 중요한 역할을 하는 효소이다 (Schurmann and Jacquot, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51 (2000) 371-400). FTR은 페레독신으로부터 받은 전자로 티오레독신을 환원시킨다. 환원된 티오레독신은 타겟 효소를 활성화시키고, 이로 인해 신진대사가 동화작용(anabolic) 경로로 전환된다 (Dai et al., Science 287 (2000) 655-658). 철-황 효소로서 FTR은 보존된 12~13 kDa FTR-c (catalytic subunit) 및 7~12 kDa FTR-v (variable subunit)을 포함하는 헤테로다이머(heterodimer)이다. FTR-c는 산화환원-활성(redox-active) 이황화물 및 [4Fe-4S] 중심을 포함한다 (Staples et al., Biochemistry 37 (1998) 4612-4620). 게다가, Keryer 등(Photosynth. Res. 79 (2004) 265-274)은 산화-스트레스-민감성 애기장대 FTR -v 돌연변이체를 규명하였는데, 상기 돌연변이체 식물은 스트레스 조건에 노출될 때까지 정상 상태를 나타내었다. 상기 두 가지 서브유닛 이소폼(isoform)은 기능에 있어서 충분히 공통되므로, 단지 하나만이 정상 조건하에 식물의 요구를 충족시키는데 필요하다 (Buchanan and Balmer, Annu. Rev. Plant Biol. 56 (2005) 187-220). 따라서, FTR의 생물학적 기능을 명확히 밝히기 위해 FTR-c의 기능 상실을 연구하는 것이 필요하다.
본 발명자들은 식물 질병 저항성 반응에서 SlFTR -c의 역할을 나타내었는데, SlFTR-c의 침묵은 자연발생적 과민성 반응 및 식물 방어-관련 유전자의 활성화를 야기하였고, 토마토 식물에서 세균 병원균에 대한 질병 저항성을 증가시켰다. 이는 병원균에 대한 식물 방어 반응에서 FTR -c의 역할에 대한 첫 번째 보고이다.
한국등록특허 제10-0379143호에는 자스몬산 메틸화 효소 유전자를 이용하여 병충해 및 스트레스 저항성 식물체를 제조하는 방법이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-0803393호에는 벼에서 OsLRP 유전자를 이용한 병 저항성을 증진시키는 방법이 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 SlFTR -c 유전자를 침묵시킨 토마토 식물체에서 병원성-관련 유전자의 발현이 증가하고 병원균의 생장이 억제되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 FTR-c (catalytic subunit of ferredoxin:thioredoxin reductase) 유전자를 식물체에서 침묵시키는 단계를 포함하는 식물의 병원균 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 FTR-c 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 일시적으로 발현시켜 FTR-c 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물의 병원균 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 FTR-c 유전자를 포함하는, 식물의 병원균 저항성 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 토마토 유래 SlFTR -c 유전자를 이용하여 병원균에 대해 저항성이 강한 형질전환 식물체를 개발하면, 식량 작물의 생산성을 향상시키는데 유용할 것으로 사료된다.
도 1은 ClustalW를 이용한 FTR-c의 서열 정렬 및 SlFTR -c의 발현 양상을 나타낸다. (A) 동일한 잔기는 검정 박스에 흰색 글자로 나타내었다. 대시 기호는 잔기가 없음을 나타낸다. 보존된 CPC 및 CHC 모티프는 서열 위에 가는 선으로 나타내었다(a 내지 c). Sl - 토마토 (Solanum lycopersicum) AK320377, St - 감자 (Solanum tuberosom) CAC39620, At - 애기장대 (Arabidopsis thaliana) AAD22336, So - 시금치 (Spinacia oleracea) P41348, Os - 벼 (Oryza sativa) AK099860, Zm - 옥수수 (Zea mays) P41347, As - 남조류 (Anabaena sp.) NP_486509, Ss - 남세균 (Synechocystis sp.) Q55781. (B) 다양한 조직에서 SlFTR -c 전사체의 발현 양상. 총 RNA는 마이크로-톰(Micro-Tom) 토마토 품종 유래의 종자, 잎, 뿌리, 녹색 열매, 적색 열매 및 꽃으로부터 분리되었다. RT-PCR은 주형으로서 제1가닥 cDNA를 이용하여 수행되었다. SlActin은 RT-PCR에 사용된 cDNA가 동일한 양임을 증명하기 위해 또한 증폭되었다.
도 2는 마이크로-톰 토마토 식물에서 SlFTR -c 유전자의 침묵을 나타낸다. (A) 비-침묵(TRV) 및 SlFTR -c-침묵(TRV-SlFTR -c) 식물에서 SlFTR -c의 발현 수준의 RT-PCR 분석. (B) 20℃ 및 26℃ 배양 조건에서 배양된 비-침묵 및 SlFTR -c-침묵 식물의 VIGS 표현형. 상기 식물은 접종 20일 후에 촬영되었다.
도 3은 SlFTR -c-침묵 마이크로-톰 토마토 식물에서 유도된 세포사 및 ROS 축적을 나타낸다. (A) 트립판 블루를 이용한 비-침묵(TRV) 및 SlFTR -c-침묵(TRV-SlFTR-c) 식물의 잎 염색 결과. (B) 비-침묵 및 SlFTR -c-침묵 식물의 DAB (3,3′-diaminobenzidine) 염색에 의한 ROS의 인시투(In situ) 검출. 모든 식물은 접종 20일 후에 촬영되었다.
도 4는 마이크로-톰 토마토 식물에서 SlFTR -c의 침묵에 의한 방어 반응의 유도를 나타낸다. (A) 비-침묵(TRV) 및 SlFTR -c-침묵(TRV-SlFTR -c) 식물에서 방어-관련 유전자의 발현 양상. (B) 비-침묵 및 침묵 식물에서 세균 생장. 비-침묵 및 SlFTR-c-침묵 식물 유래 잎은 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000으로 접종되었다. 상기 잎에서 Pst DC3000의 생장은 접종 0, 2 및 4일 후에 모니터링되었다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FTR-c (catalytic subunit of ferredoxin:thioredoxin reductase) 유전자를 식물체에서 침묵시키는 단계를 포함하는 식물의 병원균 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 유전자 침묵은 VIGS (Virus-induced gene silencing)를 이용할 수 있으나, 유전자의 발현을 저해할 수 있는 방법이면 특별히 제한되지 않는다.
상기 병원균은 세균 병원균일 수 있으나, 이제 제한되지는 않는다. 바람직하게는 상기 병원균은 슈도모나스 시린개 피브이. 토마토(Pseudomonas syringae pv. tomato) DC3000 (Pst DC3000)이다.
상기 FTR-c 유전자는 바람직하게는, 토마토(Solanum lycopersicum) 유래 SlFTR-c 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 FTR-c 유전자는 토마토로부터 분리된 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 이의 변이체를 포함한다. 상기 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체 및 삽입 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안(alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.
상기 FTR-c 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 FTR-c 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.
상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 쌍자엽 식물은 가지과(Solanaceae), 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 상기 쌍자엽 식물은 가지과(Solanaceae)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 쌍자엽 식물은 토마토이다.
본 발명은 또한, FTR-c (catalytic subunit of ferredoxin:thioredoxin reductase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환시켜 FTR-c 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물의 병원균 저항성을 조절하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 FTR-c 유전자는 토마토(Solanum lycopersicum) 유래 SlFTR-c 유전자일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. FTR-c 유전자에 대한 자세한 내용은 전술한 바와 같다.
상기 병원균은 세균 병원균일 수 있으나, 이제 제한되지는 않는다. 바람직하게는 상기 병원균은 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000)이다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 FTR-c 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
FTR-c 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 쌍자엽 식물은 가지과(Solanaceae), 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 상기 쌍자엽 식물은 가지과(Solanaceae)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 쌍자엽 식물은 토마토이다.
본 발명은 또한, 상기 FTR-c (catalytic subunit of ferredoxin:thioredoxin reductase) 유전자를 포함하는, 식물의 병원균 저항성 조절용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 FTR-c 유전자는 토마토(Solanum lycopersicum) 유래 SlFTR -c 유전자일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 상기 병원균은 세균 병원균일 수 있으나, 이제 제한되지는 않는다. 바람직하게는 상기 병원균은 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000)이다. 본 발명의 조성물은 유효 성분으로 FTR-c 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환시켜 상기 유전자의 발현을 조절하면 식물의 병원균 저항성을 조절할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
식물 재료 및 생장 조건
토마토(Solanum lycopersicum L.) 품종은 마이크로-톰(Micro-Tom) 및 헤인즈(Heinz)가 사용되었다. 식물은 토양(60% 상대습도) 또는 3% 수크로스 및 0.25% 피타겔(phyta-gel) (pH 5.8)을 포함하는 MS 배지(Murashige and Skoog, Physiol. Plant 15 (1962) 473-497)에서 16시간 광(100 μE/s/m2) 및 8시간 암의 주기로 20℃ 또는 26℃에서 배양되었다.
RT - PCR 분석
RT-PCR 분석을 위해, cDNA는 2 ㎍의 총 RNA로부터 합성되었다. 각 cDNA 샘플은 1:10로 희석되었고, 희석된 1 ㎕의 cDNA는 유전자-특이 프라이머 세트(표 1)와 함께 50 ㎕의 부피로 PCR 증폭(94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분)에 사용되었다. 상기 증폭된 PCR 산물은 전기영동 및 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 염색에 의해 분석되었다.
RT-PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머
등록번호 타겟 유전자 프라이머 서열 예상 크기 (bp)
AK320377 SlFTR -c GGTACCATGAGAACTCTTCAAGCTTCCAC (서열번호 2)
TCTAGATCACATGTTGGCTGTTGTTTCC (서열번호 3)		 450
AJ011520 SlPR1 CGGGTGATTGTAATTTGATT (서열번호 4)
TTGCCTACAGGATCGTAGTT (서열번호 5)		 262
M80608 SlPR2 AACACATTTCTTCTGGGATG (서열번호 6)
TTAATGTCATTTCCCAAACC (서열번호 7)		 208
AJ277064 SlPR5 ATGGGGTAAACCACCAAACA (서열번호 8)
AAGTGAACCAGGGCATTCAC (서열번호 9)		 236
M80604 SlGlucA GGTCTCAACCGCGACATA (서열번호 10)
TTGAGTTGATACTTTGGC (서열번호 11)		 543
Z15141 SlChi3 TGCAGGAACATTCACTGGAG (서열번호 12)
CCCTTATTGATTACATCC (서열번호 13)		 566
Z15140 SlChi9 AATTGCTGCTTTCCTTGC (서열번호 14)
CTGATTGCCACAATCAAG (서열번호 15)		 552
U60480 SlActin1 TGGCATCATACTTTCTACAATG (서열번호 16)
CTAATATCCACGTCACATTTCAT (서열번호 17)		 615
VIGS ( Virus - induced gene silencing )
전장 SlFTR -c cDNA를 증폭하기 위해, RT-PCR이 헤인즈 토마토 식물로부터 획득된 총 RNA을 사용하여 수행되었다. 반응은 SlFTR -c에 대한 PCR 프라이머를 사용하여 수행되었다(표 1). 상기 RT-PCR 산물은 TA-overhang을 사용하여 pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI) 내로 클로닝되었다. 상기 구축물의 완전성(integrity)은 시퀀싱에 의해 증명되었다. 그 후, 상기 SlFTR -c cDNA는 KpnI 및 XbaI로 절단되었고, 절단된 0.45 kb 절편은 pTRV2 VIGS 벡터내로 삽입되었다. VIGS는 이전에 기재된 방법에 따라 수행되었다(Liu et al., Plant J. 31 (2002) 777-786). 유전자 침묵을 확인하기 위해, RT-PCR은 PCR 프라이머(정방향 프라이머: 5'-AAC GAA GCA ACA ACT ACC GG-3'(서열번호 18) 및 역방향 프라이머: 5'-CAT GTA TAA GAT GTC CGA GC-3'(서열번호 19)) 및 SlFTR -c 비번역 영역(UTR) 서열을 이용하여 수행되었다.
트립판 블루 ( Trypan blue ) 및 DAB (3,3′- diaminobenzidine ) 염색
세포사는 이전에 기재된 바와 같이 트립판 블루 염색 후, 토마토 잎 조직에서 시각화되었다 (Adam and Somerville, Plant J. 9 (1996) 341-356). DAB 염색은 Thordal-Christensen 등(Plant J. 11 (1997) 1187-1194)에 의해 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다.
세균 병원균 접종
P. syringae pv. tomato DC3000은 King's B 배지에서 배양되었다. 식물은 0.1% 실웨트(Silwet)를 포함하는 세균 배양액 (OD600=0.001, 1 × 105 cfu/㎖)에 90초 동안 침지함으로써 접종되었다. 식물은 VIGS를 위한 접종 후 25일 동안 배양되었다. 각 접종된 식물 유래 6개의 잎 디스크가 수확되었고, 상기 세균은 10 mM MgCl2를 포함하는 1.5 ㎖ 원심 튜브에서 상기 조직을 분쇄함으로써 방출되었다. 10 ㎍의 세균액은 King's B 배지에서 배양되었다. 콜로니의 수는 질병의 중증도를 결정하기 위해 카운팅되었다.
실시예 1: SlFTR -c 클론의 분리 및 서열 분석
SlFTR -c 유전자를 분리하기 위해, 가지과(Solanaceae) 데이타베이스(SOL Genomics Network; http://sgn.cornell.edu)가 시금치의 SoFTR-c 아미노산 서열(P41348)과 tblastn 프로그램을 이용하여 검색되었다 (Chow et al., Eur. J. Biochem. 231 (1995) 149-156). SlFTR -c는 149개의 아미노산으로 이루어지는 연역된 단백질을 암호화하는 단 하나의 ORF (open reading frame)를 포함한다. 추정된 분자량 및 등전점은 각각 16.85 kDa 및 6.87이다.
도 1A는 고등 식물 유래 6개(쌍자엽 4개 및 단자엽 2개) 및 시아노박테리아(cyanobacteria) 유래 2개, 즉 총 8개의 FTR-c 단백질에 대한 서열 정렬을 나타낸다. SlFTR-c는 시금치 SoFTR-c (P41348)와 71.8%의 동일성, 벼 OsFTR-c (AK099860)와 63.0%의 동일성, 그리고 시아노박테리아 SsFTR-c (Q55781)와 50.7%의 동일성을 나타내었다. 상기 단백질들의 높은 서열 상동성(homology)에도 불구하고, 고등식물 유래 FTR-c 단백질은 시아노박테리아 유래의 것보다 상대적으로 더 긴 N-말단 영역을 가진다(도 1A).
실시예 2: SlFTR -c 전사체의 분석
SlFTR -c 전사체의 공간적 분포를 조사하기 위해, RT-PCR 분석은 몇몇 마이크로-톰(Micro-Tom) 조직(뿌리, 잎, 꽃, 열매 및 종자)으로부터 분리된 총 RNA를 이용하여 수행되었다. SlFTR -c 전사체는 모든 검사 조직에서 검출되었고 유사한 발현 수준을 나타내었다(도 1B). 상기 결과는 마이크로-톰 품종에서 SlFTR -c가 잎 조직뿐만 아니라 다른 조직의 기능과도 관련이 있다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 토마토 식물에서 산화방출( oxidative burst )과 자연발생적-병변 표현형을 유발하는 SlFTR -c의 침묵
마이크로-톰 품종에서 SlFTR -c의 기능상실 표현형을 규명하기 위해, SlFTR -c 전장 영역의 450 bp를 포함하는 pTRV2-SlFTR -c 벡터가 SlFTR -c를 침묵시키기 위해 제조되었다. 유전자 침묵을 유도하기 위한 아그로박테리움의 접종 3주 후, 타겟 유전자의 전사체 수준은 RT-PCR 분석에 의해 조사되었다. 비록 SlFTR -c 전사체가 SlFTR-c-침묵 마이크로-톰 식물에서 검출되었다 할지라도, SlFTR -c의 발현 수준은 pTRV2-빈 벡터가 접종된 대조군 식물에 비해 현저하게 감소되었다 (도 2A). 아그로박테리움-접종 후 첫 2주의 생장 동안 대조군 및 침묵된 식물 사이에 식물 크기 또는 잎 형태에 있어서 명확한 차이는 없었다. 그러나, 특유의 괴사 병변이 20℃에서 배양된 SlFTR -c-침묵 식물에서 3주 후 나타났다(도 2B). 게다가, 침묵된 식물 유래 잎이 트립판 블루로 염색되었을 때, 검푸른 점상의 괴사 병변이 검출되었다(도 3A). 상기 병변은 향축면(adaxial) 및 배축면(abaxial)에서 관찰되었다(데이타 미제시).
많은 돌연변이체에서 방어의 병변 모사(mimic) 표현형은 온도 조건에 대해 의존적이라고 알려져 있다. SlFTR -c-침묵 식물의 병변 모사 표현형이 온도에 대해 의존적인지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 20℃ 및 26℃ 생장 챔버에서 SlFTR -c-침묵 식물을 배양하였다. 그 결과, 상기 식물이 20℃에서 반점상의 황녹색(yellowish-green) 잎을 나타내었지만, SlFTR -c-침묵 식물의 괴사 병변은 26℃에서 완전히 억제되었다 (도 2B).
ROS가 식물 세포사 과정에 관여하기 때문에(Jabs, Biochem. Pharm. 57 (1999) 231-245), 본 발명자들은 SlFTR -c-침묵 잎에서 자연발생적 괴사 병변 동안 과산화수소 생성을 조사하였다. 잎에서 과산화수소의 생성은 DAB 염색에 의해 관찰되었는데, 이는 염료의 퍼옥시다제-촉매(peroxidase-catalyzed) 반응에 의해 갈색 침전물을 생성한다(Schraudner et al., Plant J. 16 (1998) 235-245). 본 발명자들은 SlFTR -c-침묵 잎에서 갈색 침전물을 관찰하였고, 이는 과산화수소의 생성을 나타낸다(도 3B). 상기 결과는 SlFTR -c-침묵 식물에서의 세포사가 과산화수소 생성에 의해 매개된다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 방어 반응과 관련된 유전자를 구성적으로( constitutively ) 발현하는 SlFTR -c-침묵 토마토 식물
본 발명의 SlFTR -c-침묵 토마토 식물은 병원균 감염이 없을 때 자연발생적 병변을 나타내었다. 상기 병변은 병원균-유도성 과민성 반응 세포사 병변과 유사하였다. 방어-관련 유전자의 발현이 과민성 반응의 전형적인 특징이기 때문에(Heath, Plant Mol. Biol. 44 (2000) 324-334), 본 발명자들은 방어-관련 유전자의 발현 양상을 또한 조사하였다. 총 RNA는 20℃에서 아그로박테리움 접종 3주 후 SlFTR -c-침묵 및 대조군 식물의 잎에서 추출되었다. RT-PCR 분석은 방어-관련 유전자 프라이머 세트를 이용하여 수행되었다. HR과 밀접하게 연관이 있는 병원성-관련(PR) 유전자인 PR1 (AJ011520), PR2 (M80608) 및 PR5 (AJ277064)의 발현은 SlFTR-c-침묵 식물에서 구성적으로 모두 발현되었다(도 4A). 게다가, 글루카나제 A(glucanase A) (SlGlucA) (M80604), 키티나제 3(chitinase 3) (SlChi3) (Z15141) 및 키티나제 9 (SlChi9) (Z15140)의 전사체가 SlFTR -c-침묵 식물에서 또한 증가하였다(도 4A). 따라서, 상기 결과는 SlFTR -c-침묵 식물이 과민성 반응 세포사와 관련된 방어 반응을 가진다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 세균 병원균에 대한 저항성을 부여하는 토마토 식물에서의 SlFTR -c 침묵
SlFTR -c-침묵 토마토 식물이 병원균-관련 유전자를 조절하기 때문에(도 4A), 본 발명자들은 SlFTR -c-침묵 토마토 식물이 세균 병원균에 대한 저항성을 가질 수 있다고 가정하였다. 상기 가정을 조사하기 위해, 본 발명자들은 병원균 저항성을 직접적으로 시험하였다. SlFTR -c-침묵 토마토 식물은 토마토 반점 병원균인 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000)으로 접종되었다. 3번의 독립적 실험에서, SlFTR -c-침묵 잎은 병원균 접종 4일 후에 대조군 잎보다 3 내지 5배 더 낮은 세균의 생장을 나타내었다(도 4B). 상기 결과는 SlFTR -c-침묵 식물이 병원균-관련 유전자의 조절에 의해 세균 병원균에 대한 병 저항성을 향상시킨다는 것을 나타낸다.
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Claims (13)

  1. 토마토(Solanum lycopersicum) 유래의 FTR-c (catalytic subunit of ferredoxin:thioredoxin reductase) 유전자를 쌍자엽 식물체에서 침묵시키는 단계를 포함하는 쌍자엽 식물의 세균 병원균 저항성을 증가시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 유전자 침묵은 VIGS (Virus-induced gene silencing)를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 FTR-c 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 토마토(Solanum lycopersicum) 유래의 FTR-c (catalytic subunit of ferredoxin:thioredoxin reductase) 유전자를 포함하는, 쌍자엽 식물의 세균 병원균 저항성 증가용 조성물.
  11. 삭제
  12. 제10항에 있어서, 상기 FTR-c 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 삭제
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