KR100803393B1

KR100803393B1 - 벼에서 ＯｓＬＲＰ 유전자를 이용한 병 저항성을증진시키는 방법

Info

Publication number: KR100803393B1
Application number: KR1020060085006A
Authority: KR
Inventors: 황덕주; 허성기; 이연희; 김호일; 서석철; 이정숙
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2006-09-05
Filing date: 2006-09-05
Publication date: 2008-02-14

Abstract

본 발명은 벼에서 OsLRP 유전자를 이용한 병 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것으로, 도열병 처리에 의해 벼(Oryza sativa)로 부터 분리한 OsLRP 유전자는 살리실산, BTH, 자스몬산 및 염의 처리에 의해 그 발현이 유도되며, 상기 유전자의 형질전환 벼가 병원균에 대해 저항성을 나타내는 것을 확인함으로써, 벼에서 OsLRP 유전자를 이용하여 식물병 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

OsLRP 유전자, 병 저항성유도, 도열병 저항성, 벼 흰 잎마름병 저항성

Description

벼에서 ＯｓＬＲＰ 유전자를 이용한 병 저항성을 증진시키는 방법{A Method Enhancing Disease Resistance Using OsLRP Gene in Rice}

도 1은 OsLRP 유전자의 염기서열을 나타내는 도면이다. 밑줄친 부분은 류신반복영역을 나타낸다.

도 2는 OsLRP 유전자의 발현양상을 보여주는 RT-PCR 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.

도 3은 OsLRP 유전자의 벼로의 형질전환용 벡터지도를 나타낸다. X는 XbaI, N은 NotI, E는 EcoRI의 약자이다.

도 4는 벼 형질전환체의 바 프라이머(BAR primer)의 PCR 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. S는 벡터만 형질전환된 대조구, H는 non-transgenic 대조구, 나머지 숫자는 형질전환체를 나타낸다.

도 5는 OsLRP 형질전환체의 벼 흰잎마름병에 대한 저항성 검정을 나타내는 사진과 그래프이다. NT는 non-transgenic 대조구이고, P는 벡터만 형질전환된 대조구를 나타낸다.

도 6은 OsLRP 형질전환체의 벼 도열병에 대한 저항성 검정을 나타내는 사진이다.

본 발명은 벼에서 OsLRP 유전자를 이용한 병 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것으로, 도열병 처리에 의해 벼로부터 분리한 OsLRP 유전자는 살리실산, BTH, 자스몬산 및 염의 처리에 의해 그 발현이 유도되며, 상기 유전자의 형질전환 벼가 병원균에 대해 저항성을 나타내는 것을 확인함으로써, 벼에서 OsLRP 유전자를 이용하여 식물병 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

식물의 병 또는 해충에 의한 피해는 자연재해와 더불어 인류의 안정적 식량 확보의 가장 큰 장애가 되어 왔다. 일반적인 통계에 의하면 식물의 병 또는 해충에 의한 손실은 각각 전체 생산량의 10% 정도에 이르는 것으로 나타나고 있으며 생산된 작물의 병해충에 의한 질 저하까지 고려한다면 훨씬 높은 수치를 보일 것이다. 또한 기상이변이나 특수한 환경 변화에 의한 일정 병해충의 대발생은 커다란 사회문제를 일으키는 경우도 있다. 일례로 1979년 및 1980년도에 우리나라에 대발병한 벼 도열병은 식량안보 차원에서 심각한 문제를 일으켰고 그 결과로 대량의 쌀을 외국에서 도입하게 되었고 한동안 사회문제가 되었다. 한편 1995년의 중부지방의 대량 강우는 고추 및 기타 작물의 병에 의한 큰 손실을 가져왔으며 고추의 경우 탄저병 및 역병의 피해로 최소한 50% 이상의 수량 손실이 나타난 것으로 추정되고 있다.

이와 같은 병해충 방제를 위한 노력의 일환으로 인공 합성된 농약을 개발하여 방제에 이용하는 방법이 농업에 주로 이용되어 왔으나, 인구의 끊임없는 증가로 인해 더 많은 양의 식량 확보가 필요하게 되면서, 이를 위한 양질의 동일품종의 대량재배는 병해충의 대량발생으로 이어지고 이들의 방제를 위한 합성 농약의 남용으로 인해 자연 생태계의 파괴는 물론 잔류독성, 인축에 대한 독성, 약제 내성인 새로운 병해충의 출현 등의 문제가 최근 들어 크게 야기되어 있고 이를 대체하기 위하여 신농약(저독성농약, 천연물농약 또는 생물농약)의 개발을 위한 연구가 진행되고 있으나 그 개발속도가 수요를 충족시키지 못하고 있다.

또한 근래에 크게 일고 있는 환경보호운동과 오염되지 않은 청정농산물을 취하려는 인류의 성향은 인축에 해가 없고 잔류독성이나 자연생태계 파괴의 우려가 없는 새로운 방법을 절실히 요구하고 있다.

최근에 들어 유전공학기술이 발달되면서 병 저항성 형질전환 식물이 농약을 적게 사용하면서도 안정적인 식량작물을 생산할 수 있는 대안으로 제시되고 있으며, 식물의 병 저항성 기작을 연구하여 인축 및 환경에 독성이 없는 새로운 개념의 식물보호제를 개발하려는 시도를 선진국을 중심으로 이루어지고 있다.

이에 본 발명자들은 벼(Oryza sativa)로부터 여러 스트레스에 의해 발현이 유도되어지는 식물병 저항성 유전자 OsLRP를 분리함으로써, 이를 식물병 저항성 식물체를 개발하는데 적용시키고자 하였다.

본 발명의 목적은 OsLRP 유전자를 과량 발현시켜 벼에서 병 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 병 저항성을 증진시키는 OsLRP 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 OsLRP 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터로 형질전환시킴으로써 병 저항성이 증진된 벼 식물체를 제공하는데 있다.

본 발명에서는 OsLRP 유전자를 과량 발현시켜 벼에서 병 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서는 병 저항성을 증진시키는 OsLRP 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터를 제공한다.

본 발명에서는 OsLRP 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터로 형질전환시킴으로써 병 저항성이 증진된 벼 식물체를 제공한다.

본 발명에서 식물병은 마름병, 점무늬병, 무름병, 시들음병, 혹병, 궤양병의 식물 세균병 중 하나임을 특징으로 한다.

또한 본 발명에서 식물병은 도열병 혹은 흰잎마름병 중 하나임을 특징으로 하는 한다.

지금까지 밝혀진 대부분의 식물병 저항성 유전자들은 뉴클레오티드 결합 영역(nucleotide binding site, NBS)과 류신반복 영역(leucine rich repeat, LRR)을 코딩하는 단백질들인 NBS-LRR 부류에 속하는 것으로 알려지고 있다.

본 발명에서는 도열병을 처리한 벼(Oryza sativa)의 잎에서 mRNA를 분리하여 만든 cDNA 라이브러리(library)로부터 OsLRP 유전자를 분리하고, 상기 유전자가 류신 반복영역 단백질을 코딩하는 유전자임을 확인하였다. 상기 유전자는 살리실산, BTH, 자스몬산 및 염의 처리에 의해 다량발현 되는 양상을 나타냈다.

상기 유전자가 병원균이나 병저항 유도 자극에 의해 특이적으로 발현이 증진되는 효과를 보여 과량 발현시키기 위해 식물형질 전환용 벡터를 제작하였으며, 상기 형질전환용 벡터를 이용하여 OsLRP 유전자를 벼에 도입시켰다. 유전자의 도입확인을 위해 0.1% 바스타에 저항성을 보이는 형질전환 벼에서 벡터에 삽입된 선발표지유전자인 BAR 유전자 존재를 확인하였다. 그리고 상기 OsLRP 유전자가 도입된 형질전환 벼의 식물병에 대한 저항성을 검정하기 위하여 벼 흰잎마름병 및 벼 도열병에 대한 저항성을 검정하였다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. OsLRP 유전자의 분리

벼(Oryza sativa)에 도열병을 처리한 잎으로부터 mRNA를 분리하여 만든 cDNA 라이브러리(library)로부터 플라스미드 DNA(plasmid DNA)를 위자드 미니프렙 키트(Wizard miniprep kit, Promega 사)로 분리하여 염기서열을 분석하고 NCBI의 BlastX program을 이용하여 류신 반복영역 단백질(Leucine Rich Repeat protein)을 코딩(coding)하는 유전자임을 알 수 있었다. OsLRP의 염기서열은 도 1에 나타내었다(서열번호 1).

실시예 2. OsLRP 유전자의 발현양상

화청벼 종자를 2~3일간 발아시켜 파종한 후 3주된 벼를 흙을 제거하고 1mM 살리실산(SA), 1mM BTH, 200mM 염화나트륨(NaCl), 1uM 엡시스산(ABA)을 각각 6~24시간 처리하였고, 자스몬산(JA)은 스프레이(spray)방법으로 격리된 곳에서 처리하였으며, 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv . oryzae)은 PSA배지에서 2일간 키운 후 1mM 염화마그네슘(MgCl₂₎에 현탁시켜 흡광도 OD₆₀₀에서 0.5로 조정하여 스프레이로 접종하였다. 그런 다음 각각의 잎을 채취하여 트리졸(Trizol)을 이용하여 전체 RNA를 분리하였다. 올리고 dT 프라이머(Oligo dT primer)를 이용하여 역전사(reverse transcription)를 수행하고 OsLRP 특이 5´ 프라이머 A (5´-CTGGTCATCTGGTGCCTGAGCTTG-3´: 서열번호 2)와 3´ 프라이머 B (5´-GCAGTTGGTGTCATATACAGCCAG-3´: 서열번호 3)로 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여(94°C 4분, 94°C 30초, 55°C 30초, 72°C 1분 30 cycle, 72°C 7분), OsLRP유전자의 발현을 확인하였고 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이 OsLRP는 벼흰잎마름병원균 84번 98번 균주에서 24시간에 발현이 유도되는 것을 볼 수 있었고, 살리실산, BTH, 자스몬산은 6시간부터 유도되기 시작하였다. 또한 염화나트륨 처리시에도 발현이 유도되었으나 엡시스산 처리시는 발현이 유도되지 않음을 알 수 있었다. OsLRP는 병저항성 유도 자극에 의해 특 이적으로 유도되며 염처리에서도 유도됨을 알 수 있었다.

실시예 3. 형질전환용 운반체 작성 및 벼로의 형질전환

도 2에서 보여주는 바와 같이 OsLRP 유전자가 병원균이나 병저항 유도 자극에 의해 특이적으로 발현이 증진되는 효과를 보았기 때문에 벼에서 과량 발현시키기 위해 식물형질전환용 벡터를 만들었다. 먼저 OsLRP cDNA clone으로 5´ 프라이머 C (5´- CGATATCGTGCGCGTCCAGAT-3´: 서열번호 4)와 3´ 프라이머 D (5´-GCCTAGGCTAGCAGTTGGTGTC-3´: 서열번호 5)로 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭하여 토포 클로닝 벡터(TOPO cloning vector)에 T7 방향으로 클로닝하였고 그 벡터의 이름을 DJ129라 명명하였다. DJ129를 EcoRV와 SpeI으로 절단하여 인서트(insert)를 만들고, pKS-LS9을 EcoRV와 XbaI으로 절단하여 OsLRP를 클로닝하여 DJ136을 만들었고 DJ136을 XhoI과 NotI으로 절단하여 OsLRP 인서트를 만들고 pSBGMAR를 XhoI과 NotI으로 절단하여 클로닝해서 DJ140인 OsLRP형질전환용 벡터를 만들었고 그 벡터의 지도는 도 3에 나타내었다.

OsLRP형질전환용 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium)에 트리페어런털 메이팅(triparental mating)에 의해 도입시키고 그 균을 이용하여 화청벼에서 유도된 캘리(calli)에 형질전환하였다. 껍질을 벗긴 낙동벼 종자를 70% 에탄올에서 1분, 50% 클로락스 용액(Clorox solution)에서 15분씩 2회 소독하고 멸균수로 10분씩 3 회 이상 세척하였다. 소독한 종자는 2N6 배지(Hiei, Y. et al. 1994)에 치상하고 28℃, 암 상태에서 4주간 배양하여 배발생 캘러스(embryogenic callus)를 형성시킨 후 새로운 2N6 배지에 옮겨 4일간 더 배양하였다. 형질전환을 위해 각 유전자를 가지고 있는 LBA4404 균주들은 50 ㎎/ℓ의 스펙티노마이신(spectinomycin), 10 ㎎/ℓ의 테트라사이클린(tetracycline)을 포함하는 AB agar 배지(KH₂PO₄ 3g/ℓ, NaH₂PO₄ 1g/ℓ, NH₄Cl 1g/ℓ, MgSO₄ 300mg/ℓ, KCl 150mg/ℓ, CaCl₂ 10mg/ℓ, FeSO₄ ?7H₂O 5mg/ℓ, Glucose 5g/ℓ, Bacto Agar 15g/ℓ) 전체에 고루 퍼지도록 접종하여 28℃에서 2일간 배양한 후, 50mg/ℓ의 스펙티노마이신, 10 ㎎/ℓ의 테트라사이클린을 포함하는 AAM 배지(Hiei, Y. et al. 1994)에 현탁하여 600 mM에서 흡광도가 1.8~2.0이 되도록 준비하였다. 새로운 배지에서 4일간 배양한 캘리와 각 균주의 현탁액을 10분간 공동 배양(co-culture)한 후 2N6-AS 배지(Hiei, Y. et al. 1994)에 옮겨 23~25℃, 암 상태에서 3일간 배양하였다. 3일 후 켈리를 250 ㎎/ℓ의 세포탁심(cefotaxime)을 포함한 멸균수로 수차례 세척하여 250 ㎎/ℓ의 세포탁심과 6 ㎎/ℓ의 포스피노트리신(L-phosphinothricin, PPT)이 첨가된 2N6-CP 배지로 옮겨 28℃, 암상태에서 3주간 배양하였다. 3주 후 갈변하지 않고 생생한 캘리를 새로운 2N6-CP로 옮겨 2주간 더 배양하였다. 2주 후 살아남은 켈리를 수크로오즈(sucrose) 30 g/ℓ ,키네틴(kinetine) 2 ㎎/ℓ, 나프탈렌 초산(naphthaleneacetic acid, NAA) 0.5 ㎎/ℓ, 세포탁심 250 ㎎/ℓ과 포스피노트리신 3 ㎎/ℓ을 포함하는 MSR-CP(pH 5.8)로 옮겨 26℃의 항시 빛이 비치는 조건에서 한 달간 배양하였다. 한 달 후 새 로운 MSR-CP로 옮겨 더 배양한 후 형성된 수트(shoot)를 30 g/ℓ의 수크로오즈을 포함하는 MS0(pH 5.8)에 옮겨 뿌리를 형성시켰다. 7~8일 후 뿌리가 잘 형성되면 순화과정을 거쳐 흙에 이식한 후 온실로 옮겼다. 식물체가 어느 정도 적응하면 제초제(0.1% 바스타)를 스프레이 하여 갈변이 되지 않는 제초제 저항성을 확인하였다.

실시예 4. 형질전환체의 분자생물학적 특성분석

상기 실시예 3의 0.1% 바스타에 저항성벼 보이는 형질전환 벼에서 게노믹 DNA를 분리하여 BAR 유전자의 존재유무를 BAR 유전자의 특이적인 5´ 프라이머 E (5´-ACAGCGACCACGCTGTTGAA-3´: 서열번호 6)와 3´ 프라이머 F (5´-TGCACCATCGTCAACCACTA-3´: 서열번호 7)로 중합효소 연쇄반응(94°C 4분, 94 °C 30초, 55 °C 30초, 72 °C 1분 30 cycle, 72 °C 7분)을 수행하여 검정하였고 그 결과는 도 4에 나타내었다.

두 대조구(S, H)와 비교하여 형질전환 벼에서 26번 형질전환 벼를 제외하고는 BAR 유전자가 모두 존재함을 나타내었다.

실시예 5. OsLRP 유전자가 도입된 형질전환 벼의 흰잎마름병균 및 도열병균에 대한 저항성검정

5-1. 벼 흰잎마름병 저항성 검정

OsLRP 유전자의 형질전환 벼가 병에 대해 저항성을 보이는지 알아보기 위하여 벼 흰잎마름병균을 PSA배지에서 2일간 키운 후 1mM 염화마그네슘에 현탁시켜 OD₆₀₀에서 0.5로 조정하여 가위로 벼 잎의 끝을 자르는 방법에 의해 접종하였다. 접종 후 17일후에 병원균이 진전되는 정도를 자로 재었고 그 결과는 도 5에 나타내었다. 두 대조구(NT, P)에 비하여 22번 및 26번은 약소한 차이를 보이나, 나머지 형질전환 벼에서는 흰잎마름병이 거의 진전되지 않거나 그 진전이 아주 적음을 나타내어 벼 흰잎마름병에 저항성을 가지는 것을 확인하였다.

5-2. 벼 도열병 저항성 검정

OsLRP의 과량발현 형질전환 벼가 벼 도열병에 대해 저항성을 보이는지 여부를 알아보기 위하여 벼 종자의 종피를 벗기고 50% 락스로 소독하고 배양병에 치상한 다음 일주일 정도 키운 후에 벼 도열병균으로부터 유도된 포자를 분무 접종한 후 병반수를 살펴보았다. 그 결과는 도 6에 나타내었다. 대조구인 비형질전환 벼와 비교하여 형질전환 벼에서는 도열병이 거의 발병하지 않음을 나타내어 벼 도열병에 저항성을 가지는 것을 확인하였다.

본 발명의 OsLRP 유전자는 살리실산, BTH, 자스몬산 및 염의 처리에 의해 다량발현이 확인되었으며, 상기 유전자를 이용한 형질전환 벼의 경우 대표적인 곰팡이 병인 도열병과 대표적인 세균병인 벼 흰잎마름병 모두에 대하여 저항성을 보임으로써, 벼와 다른 작물에서의 병저항성 작물개발을 위한 분자육종소재로 이용 가능하며, 병 저항성 품종육성으로 농약사용절감을 가능하게 하고 그로 인해 생산성향상 및 안전한 농산물공급을 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 염기서열을 갖는 OsLRP (Oryza sativa Leucine Rich Repeat protein) 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 OsLRP 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물병 저항성을 증진시키는 방법.
식물병 저항성을 증진시키는, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 OsLRP (Oryza sativa Leucine Rich Repeat protein) 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터.
제 1항에 있어서, 식물병은 마름병, 점무늬병, 무름병, 시들음병, 혹병, 궤양병의 식물 세균병 중 하나임을 특징으로 하는 식물병 저항성을 증진시키는 방법.
제 1항에 있어서, 식물병은 도열병 혹은 흰잎마름병 중 하나임을 특징으로 하는 식물병 저항성을 증진시키는 방법.
제 2항의 형질전환용 벡터로 벼를 형질전환시킴으로써 병 저항성이 증진된 벼 식물체.