KR100379143B1

KR100379143B1 - 자스몬산 메칠화 효소 유전자 및 이를 이용하여 병충해 및스트레스 저항성 식물체를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR100379143B1
Application number: KR10-2000-0032365A
Authority: KR
Inventors: 최양도; 송종태; 서학수; 이종섭; 구연종; 정종주; 송상익
Original assignee: 주식회사 싸이젠하베스트; 최양도
Priority date: 2000-06-13
Filing date: 2000-06-13
Publication date: 2003-04-08
Also published as: EP1294860A1; AU2001262783A1; JP2004503239A; WO2001096549A1; CN1503841A; CA2412902A1; KR20010111723A; US20030064895A1

Abstract

본 발명은 신규의 자스몬산 메칠화효소(S-adenosyl-L-methionine:jasmonic acid carboxyl methyltransferase) 유전자 및 그로부터 합성되는 신규 자스몬산 메칠화효소 단백질과 상기 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 식물체에 관한 것이다. 상기 효소는 자스몬산과 S-아데노실 메치오닌을 기질로 하여 자스몬산 메칠에스터를 합성하는데 이 물질은 식물체의 성장조절 및 병해충의 침입에 대항하는 반응을 매개하는 것으로 알려져 있다. 꽃에서 특이적으로 발현되는 상기 신규 유전자를 식물체에 도입하여 과다 발현시킴으로써 식물의 성장에는 영향이 없으면서 각종 식물 병해충 및 스트레스에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 식물체를 얻을 수 있다.

Description

자스몬산 메칠화 효소 유전자 및 이를 이용하여 병충해 및 스트레스 저항성 식물체를 제조하는 방법 {Genes for S-adenosyl L-methionine:jasmonic acid carboxyl methyl transferase and a method for the development of pathogen- and stress-resistant plants using the genes}

본 발명은 신규의 자스몬산 메칠화 효소(S-adenosyl-L-methionine:jasmonic acid carboxyl methyltransferase) 유전자 및 그로부터 합성되는 신규 자스몬산 메칠화효소 단백질과 상기 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 병충해 및 스트레스 저항성 식물체에 관한 것이다.

자스몬산(jasmonic acid; JA)과 자스몬산 메칠에스터(jasmonate methyl ester; JAMe)는 다양한 식물에 널리 존재하는 성장조절물질일 뿐만 아니라, 물리적또는 해충에 의한 식물의 상처 또는 병원균의 침입에 대항하는 저항성 반응을 매개하는 물질로 알려져 있다(Creelman and Mullet,Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.48; 355-381, 1992). 그리고 이 저항성 반응은 매우 복잡한 신호전달망을 구성하고 있는 것으로 알려져 있다 (Glazebrook,Curr. Opin. Plant Biol.2: 280-286, 1999).

식물이 바이러스, 세균 및 곰팡이를 포함한 병원균에 감염되었을 때 이를 인식하고 반응하는 경로는 살리실산 (salicylic acid; SA)이 매개하는 경로와 JA가 매개하는 경로로 크게 나눌 수 있으며, 매우 다양한 종류의 유전자와 단백질이 연쇄적으로 반응하는 것으로 알려져 있다. 해충에 의한 상처에 대항하는 경우 주로 JA, 그리고 바이러스에 대항하는 경우 주로 SA, 그리고 세균 및 곰팡이에 대항하는 경우에는 SA 혹은 JA가 병원균에 따라 특이적으로 매개하는 것으로 알려져 있으나, 이러한 구분이 절대적인 것은 아니다(Reymond and Farmer,Curr. Opin. Plant Biol.1; 404-411, 1998). 이러한 반응은 상처 및 감염 부위에 신속히 일어나는 국지적 반응(local response) 뿐만 아니라 식물 전체로 확산되는 체계적 반응(systemic response)을 통해 광범위한 병충해에 대해 식물체가 이들 자극을 극복하는데 기여한다(Durneret al.,Trends Plant Sci.2; 266-274, 1997).

이때 SA는PR-1(pathogenesis related protein-1),PR-2그리고PR-5유전자들 등 일련의 유전자를 자극하여 그 발현을 유도하고 그 결과 식물체 전신에 걸쳐 획득성 전신 저항성(systemic acquired resistance; Ukneset al.,Plant Cell4; 645-646, 1992) 반응을 나타내게 되며, JA는PDF(plant defensin 1.2),PR-3,VSP(vegetative storage protein) 등 일련의 유전자를 자극하여 그 발현을 유도한다 (Penninckxet al.,Plant Cell8; 2309-2323, 1996). 최근 보고에 의하면 일부 공생균은 JA 합성을 통한 유도성 전신 저항성(induced systemic resistance) 반응을 나타내게 된다(Pieterseet al.,Plant Cell10; 1571-1580, 1998). JA는 해충 또는 물리적 요인으로 발생한 상처 부위의 신호를 전달하여 그 결과 식물체는 감염부위 뿐만 아니라 전신에 걸쳐 저항성을 나타내게 된다. 그러나 이때 유도되는 유전자들 중에Pin2(proteinase inhibitor II) 등 일부 유전자는 두 물질에 대해 중복하여 반응하므로 이런 저항성 반응의 구별은 어느 경우이든 그 특이성이 절대적이지는 않다. 따라서 이 두 반응을 매개하는 신호전달체계 사이의 상호 교감이 있을 것으로 받아들여지고 있다(Reymond and Farmer,Curr. Opin. Plant Biol.1; 404-411, 1998).

지금까지 재조합 유전자의 전입 발현을 통한 병충해 저항성 식물을 얻기 위한 분자 육종학적인 노력은, 이러한 SA 및 JA에 의해 유도되어 저항성 반응에 관여할 것으로 판단되는 유전자 중 한 가지 혹은 두 가지 유전자, 예를 들면Pin2, PR3혹은PR5등을 사용하여 시도되었다. 그 결과 다소의 병충해 저항성을 보이기는 하였으나, 그 효과가 미미하거나 일부 한정적인 병충해에 대해서만 그 효과를 나타내었다(Zhuet al.,Bio/Technology12; 807-812, 1994). 한편 SA 신호전달과정에서 주요 조절인자 중 하나로 인식되는NPR1(non-expresser of PR1) 유전자를 아라비돕시스에 형질전환 시켰을 때 노균병균 (Peronospora parasitica)과 잎마름병균 (Pseudomonas syringae)에 다소의 저항성을 보인 결과가 보고되기도 하였다 (Caoet al., Proc. Natl. Acad. Sci.95; 6531-6536, 1998).

이러한 저항성 반응을 매개하는 SA 및 JA의 역할을 규명하기 위하여 병충해 자극을 받은 식물 생체 내에서 이들 물질의 농도 변화를 정량적으로 분석하거나 외부에서 SA 혹은 JA를 살포한 후 식물체의 반응을 저항성 유전자 발현 수준에서 연구하기도 하였다. 그러나 JA의 경우 용해도 및 휘발성이 낮아서 대부분 JAMe를 사용하여 실험을 하였는데, 이는 식물 체내에 침투된 후에 JA로 전환되어 작용하는 것으로 여겨졌다(Farmer and Ryan,Proc. Natl. Acad. Sci.87; 7713-7716, 1990). 뿐만 아니라 식물 조직 내의 JA 및 JAMe의 분포 양상도 별다른 차이를 보이지 않아이들 두 화합물 사이의 구별은 이루어지지 않았다(Creelman and Mullet,Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.48; 355-381, 1992). 더욱이 현재까지 JA에서 JAMe를 합성하는 JMT 효소에 대해서는 알려진 바가 없어서 이 물질의 대사 및 기능에 관한 연구는 전혀 이루어지지 않았다. 그러나 보다 휘발성이 강한 JAMe가 공기를 타고 이동하여 다른 식물 개체의 병저항성 반응을 유도할 수 있는 것으로 보고되었다 (Farmer and Ryan,Proc. Natl. Acad. Sci.87; 7713-7716, 1990). 따라서 JAMe가 어쩌면 저농도에서 작용하는, 보다 강력한 병저항성 유도물질일 가능성을 배제할 수 없다.

이와 같이 SA 및 JA의 식물체내 농도와 병저항성 반응 사이의 상관관계에 착안하여 SA의 체내 농도가 증가된 돌연변이lsd6 (lesions simulating disease 6),lsd7, acd2 (accelerated cell death 2) 등에 대한 연구가 진행되었다. 그러나 SA의 체내 농도가 상시적으로 증가된 돌연변이의 경우 병저항성 관련 유전자들의 발현 수준이 증가하고 비교적 다양한 병에 대해 저항성을 나타내기는 하였으나, 식물의 키가 왜소해지고 조기 노화 현상을 보이는 등 경제작물에 적용하기에는 적합하지 않은 것으로 나타났다 (Greenberget al., Cell77; 551-563, 1994 : Weymannet al., Plant Cell7: 2013-2022, 1995).

그러나 JA의 체내 농도가 상시적으로 증가한 돌연변이체는 아직 알려져 있지 않고, 따라서 JA 생합성 과정의 앞 단계에 관여하는 지방산과산화효소 (lipoxygenase Ⅱ,LOX Ⅱ) 혹은 산화알렌합성효소(allen oxide synthase,AOS) 유전자를 식물체에 이식 발현시켜 체내의 JA 농도를 증가시킴으로써 병충해 저항성을증가시키려는 연구가 수행되었다.AOS유전자를 엽록체에서 과다발현시킨 경우 JA의 체내 농도는 6∼12배 증가하였으나,Pin2와 같은 병저항성 관련 유전자의 발현은 증가하지 않았으며 병저항성 또한 검증되지 못하였다(Harmset al.,Plant Cell7; 1645-1654, 1995). 또한AOS유전자를 세포질에서 과다발현시킨 경우 식물체 내의 JA 농도에는 변화가 없었으며, 이들 식물체가 상처를 받으면 반응하는 양상은 비형질전환체와 다름이 없었다(Wanget al.,Plant Mol. Biol. 40; 783-793, 1999). SA와 달리 JA는 식물의 발달 분화 및 대사에 매우 다양하게 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서 JA의 과다 발현이 식물의 병저항성 이외에도 다양한 반응에 관여하여 SA와 마찬가지로 식물체의 발달 분화 및 대사에 바람직하지 않은 영향을 미칠 가능성이 높은 것으로 여겨져 왔다.

이에 본 발명자들은 JA가 식물에 미치는 영향을 연구하던 중, 신규한 자스몬산 메칠화효소 단백질 및 이를 암호화하는 유전자를 발견하고 그 특성을 규명하였으며, 상기 유전자로 형질전환된 식물체가 JAMe의 생산을 통해 병충해 저항성과 관련된 다수의 유전자 발현을 촉진하여 결과적으로 다양한 식물 병충해 및 스트레스에 대해 저항성을 부여함과 동시에 식물의 생장에는 부작용이 거의 없음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 식물의 병해충 저항성 반응에 관여하는 JAMe를 합성하는 신규한 자스몬산 메칠화효소 유전자 및 상기 유전자가 암호화하는 효소 단백질을 제공하는 것이다. 아울러 상기 효소 단백질의 특성을 규명하고 상기 유전자를 재조합하여 형질전환 식물체를 제조하고 이를 과다발현시켜, 다양한 병충해에 대해 저항성이 증진되는 한편, 식물의 성장에 대한 부작용은 최소화된 형질전환식물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 아라비돕시스 (Arabidopsis thaliana)에서 클로닝한 자스몬산 메칠화 효소 (JMT)의 cDNA 클론 pJMT의 구조를 나타낸 것이고,

; 본 발명의 JMT 효소 유전자가 pBlueScript에 삽입된 형태

도 2은 아라비돕시스에서 클로닝한 JMT 효소의 cDNA 유전자로부터 유추되는 단백질의 아미노산 서열과 공지의 살리실산 메칠화 효소 유전자인SAMT로부터 유추되는 단백질(Accession No. AF133053; Ross et al., 1999)의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이고,

AtJMT : 아라비돕시스의 JMT 효소

BcNtr1, 2 : 배추(Brassica campestris ssp. pekinensis)의 자스몬산 메칠화효소 NTR1 과 NTR2

SAMT : 클라키아 브루어리(Clarkia breweri)의 살리실산 메칠화 효소

도 3은 배추에서 클로닝한 자스몬산 메칠화효소의 cDNA 클론 pNTR1의 구조를 나타낸 것이고,

; 본 발명의 자스몬산 메칠화효소 유전자NTR1이 pCR2.1에 삽입된 형태

도 4는 배추에서 클로닝한 자스몬산 메칠화효소 효소의 cDNA 클론 pNTR2의 구조를 나타낸 것이고,

; 본 발명의 자스몬산 메칠화효소 유전자NTR2가 pUC18에 삽입된 형태

도 5는JMT유전자를 대장균 발현 벡터 pGEX-2T에 삽입하여 글루타치온 S-트랜스퍼라제 효소와 융합된 상태로 발현시키기 위한 재조합 유전자 pGST-JMT의 구조를 나타낸 것이고,

Ptac : tac 프로모터

밑줄 : 융합 단백질을 이루는 JMT의 아미노 말단의 염기 및 아미노산 서열

도 6은 재조합 유전자 pGST-JMT를 대장균 BL21에서 대량으로 발현시킨 후 융합 효소단백질을 순수 분리하고 SDS-전기영동법으로 순도를 확인한 결과이고,

레인 1 : 단백질 분자량 마커

레인 2 : 대장균 BL21/pGEX-2T의 전체 단백질 15 ㎍

레인 3 : 본 발명의JMT유전자를 포함하는 pGST-JMT 벡터로 형질전환된 대장균 BL21의 전체 단백질 15 ㎍

레인 4 : 글루타치온 아가로스 칼럼의 용출액 5 ㎍

레인 5 : 수퍼덱스 200 칼럼 용출액 5 ㎍

도 7은 순수 분리한 재조합 효소단백질 GST-JMT을 사용하여 자스몬산 (JA)과 S-아데노실 메치오닌(SAM)을 기질로 반응시킨 다음 가스크로마토그래피와 질량분석을 통해 자스몬산 메칠에스터 (JAMe)의 합성을 확인한 결과이고,

A : 표준 JAMe 의 분석 결과

B : 효소 반응 산물의 분석 결과

도 8은 상기에서 분리한 융합 효소단백질 GST-JMT을 이용하여 여러 물질에 대한 반응의 특이성을 검정함으로써 상기 효소가 JA 와 [¹⁴C]SAM을 기질로 사용하여 메칠화 반응을 특이적으로 촉진함을 확인한 것이고,

Con : 기질 중 JA를 빼고 [¹⁴C]SAM 만으로 효소 반응시킨 결과

SA : 기질로 살리실산과 [¹⁴C]SAM을 넣은 효소 반응 결과

JA : 기질로 JA 와 [¹⁴C]SAM을 넣은 효소 반응 결과

BA : 기질로 벤조산과 [¹⁴C]SAM을 넣은 효소 반응 결과

도 9는 형질전환 및 비형질전환 아라비돕시스의 잎으로부터 추출한 단백질 조추출물을 이용하여 [¹⁴C]JAMe 생산 활성을 조사한 결과를 나타낸 그래프이고,

: 형질전환체의 단백질 조추출물

: 비형질전환체의 단백질 조추출물

도 10은 순수 분리한 융합 효소단백질 GST-NTR1을 이용하여 여러 물질에 대한 반응의 특이성을 검정함으로써 NTR1 효소가 JA 와 [¹⁴C]SAM을 기질로 사용하여 메칠화 반응을 특이적으로 촉진함을 확인한 것이고,

Con : 기질 중 JA를 빼고 [¹⁴C]SAM 만으로 효소 반응시킨 결과

SA : 기질로 살리실산과 [¹⁴C]SAM을 넣은 효소 반응 결과

JA : 기질로 JA 와 [¹⁴C]SAM을 넣은 효소 반응 결과

BA : 기질로 벤조산과 [¹⁴C]SAM을 넣은 효소 반응 결과

도 11은 순수 분리한 융합 효소단백질 GST-NTR2를 이용하여 여러 물질에 대한 반응의 특이성을 검정함으로써 NTR2 효소가 JA 와 [¹⁴C]SAM을 기질로 사용하여 메칠화 반응을 특이적으로 촉진함을 확인한 것이고,

Con : 기질 중 JA를 빼고 [¹⁴C]SAM 만으로 효소 반응시킨 결과

SA : 기질로 살리실산과 [¹⁴C]SAM을 넣은 효소 반응 결과

JA : 기질로 JA 와 [¹⁴C]SAM을 넣은 효소 반응 결과

BA : 기질로 벤조산과 [¹⁴C]SAM을 넣은 효소 반응 결과

도 12는JMT유전자를 식물 형질전환용 발현벡터 pBl121에 재조합한 pCaJMT 유전자의 구조를 나타낸 것이고,

CaMV : 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터

도 13은 형질전환된 아라비돕시스에JMT유전자가 올바르게 삽입되었는지 여부를 확인하기 위하여 게놈 서던 블럿한 결과이고,

레인 W : 야생형(wild-type)

레인 T : 형질전환체(transgenic)

CaMV : CaMV 프로모터 부위를 탐침으로 사용한 경우

AtJMT :JMT유전자 부위를 탐침으로 사용한 경우

도 14는 형질전환된 아라비돕시스에서JMT유전자가 과다 발현되는지 여부(1, 2, 3)와 자스몬산에 의해 유도되는 식물체 저항성 관련 유전자들의 발현여부를 노던 블럿으로 확인한 결과이고,

레인 W : 야생형

레인 T : 형질전환체

AOS : 산화알렌합성효소(allene oxide synthase)

DAHP : 3-데옥시-D-아라비노-헵튤로소네이트 7-포스페이트 합성효소

(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase)

JR2 : 자스몬산 반응단백질 2(jasmonate response protein 2)

JR3 : 추정 아미노하이드롤라제(putative aminohydrolase)

LOXⅡ : 지방산과산화효소 Ⅱ(lipoxigenase Ⅱ)

VSP : 식물저장단백질(vegetative storage protein)등 탐침 유전자를 표시함

도 15는 형질전환 및 비형질전환 아라비돕시스에 잿빛 곰팡이 병원균(Botrytis cinerea)을 접종하여 식물체의 진균병 저항성을 조사한 결과를 보여주는 사진이다.

왼쪽 : 비형질전환 아라비돕시스

오른쪽 : 형질전환 아리비돕시스

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 신규한 자스몬산 메칠화효소, 보다 상세하게는 아라비돕시스에서 분리한 JMT 효소, 배추로부터 분리한 NTR1 및 NTR2를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 자스몬산 메칠화효소 단백질을 암호화하는 cDNA 유전자를 제공한다. 나아가 본 발명은 상기 유전자를 식물 형질전환용 발현벡터에 재조합한 재조합 벡터와 상기 재조합 벡터를 이용하여 식물체의 전체에서 자스몬산 메칠화효소 유전자를 과다 발현하는 형질전환 식물체를 제조하는 방법 및 이를 통해 식물체의 병충해 및 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 "자스몬산 메칠화효소"는 JA에 메칠기를 전이하여 JAMe를 합성하는 활성을 갖는 효소를 의미하는 일반 명칭으로 사용된다. 또한 "JMT 효소"는 상기 "자스몬산 메칠화효소"의 하나로서 본 발명에서 최초로 찾아낸 아라비돕시스의 꽃꿀샘에 존재하는 신규한 효소 단백질을 나타내며, 상기 효소 단백질을 암호화하는 유전자는 "JMT유전자"로 표시하였다. 본 발명에서는 "자스몬산 메칠화효소"에 해당하는 것으로 아라비돕시스에서 분리한 JMT 효소 외에도 배추의 꽃꿀샘에 특이적인 NTR1 및 NTR2를 제공한다.

본 발명에서는 아라비돕시스로부터 신규한JMT효소 유전자를 분리하였으며, 그 염기 서열을 결정한 결과 1,170 bp에 걸쳐 389개의 아미노산을 암호화함을 확인하였다. 먼저 배추의 꽃에서 제조한 cDNA 라이브러리를 대상으로 차별화 혼성화법을 이용하여 꽃꿀샘에서만 특이적으로 발현되는 c38 클론을 선별하였다. 이 유전자는 길이가 416 bp에 불과하여 꽃꿀샘에서 특이적으로 발현되는 유전자의 부분 클론임을 알 수 있었으나 그 기능은 알 수 없었다. 이에 상기 c38 클론을 탐침으로 사용하여 아라비돕시스의 cDNA 라이브러리로부터 c38과 유사 한 클론을 선별하였다. 선별된 cDNA 클론은 전체 길이가 1,476 bp이며, 3' 말단에 13개의 아데노신이 연속해서 존재하고 5' 말단으로부터 15번째 bp 지점에 번역 개시 코돈 AUG가 있으며, 그로부터 1,167 bp에 걸쳐 389개의 아미노산을 연속해서 암호화하는데, 이러한 구조적인 특징으로 보아 전장 cDNA 클론임을 알 수 있었다. 이 클론은 이후에 설명하는 방법에 따라 그 기능을 분석한 결과 자스몬산 메칠화효소 유전자임을 알 수 있었고 따라서 클론의 이름을 pJMT로 명명하였다. 상기 클론 pJMT는 2000년 5월 29일자로 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호 : KCTC 0794BP).

상기 유전자가 암호화하는 JMT 효소는 서열번호 3으로 표시되는 389개의 아미노산 서열을 가지며, 분자량은 43,453이다. 차별화 혼성화법 및 게놈 서던 블럿 분석 결과 상기 JMT 효소는 아라비돕시스의 꽃꿀샘에서만 특이적으로 발현됨이 확인되었다.

상기 효소의 활성을 검정하기 위하여 NCBI 유전자 자료기지를 검색한 결과,JMT유전자는SAMT(살리실산 메칠화효소) 유전자와 염기 수준에서는 전혀 유사성이 없었으나 JMT 효소단백질은 SAMT 효소와 아미노산 수준에서 43%의 동질성을 나타내었다. 그러나 재조합 효소단백질을 사용하여 SA, JA 및 이와 유사한 벤조산(BA)을 SAM과 반응시켜 가스 크로마토그래피와 질량분석기로 확인한 결과, 상기 효소는 SA 및 BA와는 거의 반응을 하지 않는 반면 JA와는 높은 활성도를 보여 SAMT와는 다른 활성을 갖는 효소임을 확인하였다. 또한 상기 재조합 효소 단백질에 JA 및 SAM을 기질로 사용하여 반응시킨 후 가스 크로마토그래피로 분석한 결과, 표준 JAMe와 동일한 체류시간(11.7분) 후에 검출되었고, 검출된 물질의 분자량은 표준 JAMe와 같은 224였다. 따라서 상기 효소는 하기 화학식 1의 SAM과 하기 화학식 2의 JA를 기질로 하여 JA에 메칠(methyl)기를 전이하여 꽃의 주된 향기성분 중 하나인 JAMe를 합성하는 자스몬산 메칠화효소임을 알 수 있다. 이러한 자스몬산 메칠화효소의 활성 및 그 유전자는 지금까지 전혀 보고된 바 없다.

본 발명에서는 상기 신규 JMT 효소의 특성을 규명하기 위하여 효소의 반응속도 상수를 조사하였으며, 그 결과 K_m은 6.3 μM, V_m은 84 nmole/min, K_cat는 70 s^-1, K_cat/K_m은 11.1 μM/s^-1인 것으로 나타났다.

또한, 본 발명은 배추로부터 분리한 새로운 자스몬산 메칠화효소 NTR1과NTR2를 제공한다. 상기와 마찬가지로 c38 클론을 탐침으로 배추의 cDNA 라이브러리를 선별하여 클론 pNTR1 과 pNTR2를 얻었다. pNTR1 클론은 전체 길이 1,241 bp로 서열번호 5의 염기서열을 가지며 5' 말단으로부터 2 번째 염기쌍에서 번역 개시 코돈 AUG가 시작된다. 상기 번역 개시 코돈으로부터 1,179 bp에 걸쳐 서열번호 6으로 표시되는 392 개의 아미노산(분자량 43,764)을 연속해서 암호화하고 있으며, 구조적인 특징으로 보아 c38 클론의 전장 cDNA 클론임을 알 수 있다. 이 클론의 유전자는 배추의 꽃꿀샘에서만 특이적으로 발현되는 것으로, 이를NTR1(nectarin 1)으로 명명하고, 클론 pNTR1은 2000년 5월 29일자로 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호 : KCTC 0793BP). 상기 NTR1은 JMT 효소와 아미노산 수준에서 82%의 동질성을 나타내며, 그 기능을 분석한 결과 새로운 자스몬산 메칠화효소임을 확인하였다.

pNTR2 클론은 전체 길이 1,370 bp로 서열번호 8의 염기서열을 가지며, 3' 말단에 18 개의 아데노신이 연속해서 존재하고, 5' 말단으로부터 14 번째 염기쌍에 번역 개시 코돈 AUG를 갖고 있었다. 상기 번역 개시 코돈으로부터 1,179 bp에 걸쳐 서열번호 9로 표시되는 392 개의 아미노산(분자량 43,541)을 연속해서 암호화하고 있으며, 구조적인 특징으로 보아 c38 클론과는 다른 유전자의 전장 cDNA 클론임을 알 수 있다. 상기 클론 pNTR2는 2000년 5월 29일자로 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호 : KCTC 0793BP).

본 발명에서는 JMT 효소를 대량으로 얻기 위해 서열번호 10 및 11로 기재되는 올리고뉴클레오티드를 시발체로 이용하고 cDNA 클론을 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응을 통해JMT유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자는 제한효소EcoR I으로 절단하여 같은 효소로 처리한 대장균 발현벡터 pGEX-2T에 삽입하였으며, 상기 재조합 플라스미드 pGST-JMT로 대장균 BL21을 형질전환시킨 후 배양하여 재조합 단백질을 대량 생산하였으며, 이를 이후의 실험에 이용하였다.

또한, 본 발명은 자스몬산 메칠화효소의 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다. 본 발명의 자스몬산 메칠화효소의 유전자로 형질전환된 식물체는 꽃에서만 특이적으로 발현되는 자스몬산 메칠화효소의 유전자를 식물체 전체에서 상시적으로 발현함으로써 바이러스, 세균, 곰팡이를 포함하는 각종 식물병원균 또는 해충에 기인하는 식물 병충해 및 스트레스에 대해 강한 저항성을 나타낸다.

일반적으로 JA 및 JAMe는 식물에서 상처 혹은 병원균의 침입에 대항하는 반응을 매개하는 물질로 알려져 있다. 본 발명의 자스몬산 메칠화효소의 유전자로 형질전환된 식물체는 식물에 JA 또는 JAMe를 처리했을 때 유도되는 저항성 관련 유전자, 예를 들어AOS,JR2(jasmonate response protein 2),JR3(putative aminohydrolase),DAHP(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase),LOXⅡ,VSP와 같은 다수의 유전자들을 상시적으로 발현한다. 따라서 자스몬산 메칠화효소의 유전자로 형질전환된 식물체의 효과는 외부에서 JA 또는 JAMe를 처리한 효과와 유사함을 알 수 있다.

자스몬산 메칠화효소의 유전자를 포함하는 발현벡터로 식물체를 형질전환 시킴으로써 저항성을 갖도록 할 수 있는 식물체의 병충해로는 일반적인 진균병, 세균병, 바이러스병 또는 해충에 의한 피해 등을 들 수 있으며, 그 중에서 특히 벼 도열병, 흰잎마름병, 이삭마름병 및 멸구, 보리의 붉은 곰팡이병, 옥수수의 깨씨무늬병, 콩의 모자이크병, 감자모자이크병, 고추의 역병 및 탄저병, 배추와 무우의 무름병, 뿌리혹병 및 배추흰나방, 참깨의 세균성점무늬병, 딸기의 잿빛곰팡이병 및 시들음병, 수박의 만할병, 토마토의 청고병, 오이의 흰가루병 및 노균병, 담배 모자이크병, 토마토의 시들음병, 인삼의 뿌리썩음병, 목화의 모무늬병, 사과, 배, 복숭아, 양다래, 포도 및 감귤 등 과수류의 탄저병과 잿빛곰팡이병, 사과의 부란병, 대추나무의 빗자루병, 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파 등 사료 작물류의 흰가루병 및 녹병, 장미, 거베라, 카네이션 등 화훼류의 잿빛곰팡이병, 시들음병, 장미의 검은무늬병, 글라디올러스 및 난류의 모자이크병, 백합의 줄기 썩음병 등에 대해 적용할 수 있다.

본 발명의 자스몬산 메칠화효소의 유전자로 형질전환된 식물체는 SA의 체내 농도가 상시적으로 증가된 돌연변이 등에서 나타나는 식물의 성장에 미치는 악영향, 즉 식물의 키가 왜소해지거나 조기 노화 현상을 보이는 등의 문제점을 보이지 않으므로, 경제 작물 등에 적용할 경우 SA의 체내 농도가 증가된 돌연변이를 이용하거나 JA 생합성의 앞단계에 관여하는 효소 유전자로 형질전환하는 것보다 효과적이다.

또한, JAMe가 다양한 식물체에 널리 존재하는 것으로 보아 본 발명에서 최초로 클로닝한JMT유전자는 다양한 식물체에 널리 존재할 것으로 여겨진다. 따라서 본 발명의JMT유전자를 이용하여 공지의 방법에 따라 다양한 식물체로부터 유사한 자스몬산 메칠화효소 단백질 및 이를 암호화하는 유전자를 탐색하는 데에 본 발명의JMT유전자 및 효소 단백질이 유용하게 이용될 수 있다. 실제로 이런 원리를 응용하여 배추에서 분리한 2 개의 유사 유전자NTR1과NTR2가 자스몬산 메칠화효소 활성이 있음을 본 발명에서 규명하게 되었다.

나아가 형질전환 식물체의 병충해 저항성은 자스몬산 메칠화효소의 유전자 자체에 의한 것이라기 보다는 자스몬산 메칠화효소 활성에 의해 생성된 JAMe가 식물체의 병저항성 반응의 매개체로서 많은 저항성 유전자의 발현을 촉진하기 때문인 점으로 볼 때, 이러한 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자라면 본 발명의 유전자에 한정되지 않고 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 식물의 종류에 관계없이 재조합 후 식물체에 형질전환 함으로써 다양한 병충해에 대해 비슷한 저항성을 부여할 수 있다.

상기 자스몬산 메칠화효소의 유전자로 형질전환된 식물체의 제조방법은 공지의 방법에 따라 수행될 수 있다. 즉, 자스몬산 메칠화효소의 유전자를 발현하는 재조합 플라스미드는 공지의 식물 발현용 벡터를 기본 벡터로 하여 제조될 수 있으며, 일반적인 이원벡터(binary vector), 코인테그레이션 벡터(cointegration vector) 또는 T-DNA 부위를 포함하지는 않지만 식물에서 발현될 수 있도록 디자인된 일반 벡터가 사용될 수 있다.

이 중 이원벡터로는 식물체의 형질전환을 위해 T-DNA 중 외래 유전자의 감염에 관여하는 약 25 bp 크기의 왼쪽 경계(left border) 및 오른쪽 경계(right border)를 포함하며, 그 내부에 식물체에서 발현시키기 위한 프로모터 부위와 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 벡터를 사용할 수 있다. 상기 이원벡터는 추가적으로 카나마이신 저항성 유전자와 같은 선별 표지 유전자를 포함하는 것이 바람직한데, 형질전환 식물체의 선별을 위한 표지 유전자로는 항생제 저항성 유전자 이외에도 제초제 저항성 유전자, 대사관련 유전자, 발광 유전자(luciferase), 물리적 특성에 관련된 유전자, GUS(β-glucuronidase) 또는 GAL(β-galactosidase) 유전자 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 카나마이신 저항성 선별 유전자와 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터를 가진 pBl121 벡터의SmaI 자리에JMT유전자를 삽입함으로써 식물 형질전환용 발현벡터 pCaJMT를 제작 사용하였다.

상기에서 이원벡터 또는 코인테그레이션 벡터를 사용하는 경우, 식물체에 상기 재조합 벡터를 도입하기 위한 형질전환용 균주로는 아그로박테리움을 사용하며(Agrobacterium-mediated transformation), 이때 아그로박테리움 튜마파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스 (Agrobacterium rhizogenes)를 사용할 수 있다.

그밖에 T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는, 전기천공법(electroporation), 입자 총법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake) 등이 재조합 플라스미드를 식물체로 도입하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 카나마이신 저항성 선별 유전자와 CaMV 프로모터를 가진 pBl121 벡터의SmaI 자리에JMT유전자가 삽입된 재조합 플라스미드 pCaJMT를 꽃대침지법(floral dip transformation)에 의해 아그로박테리움 C58C1에 형질전환시켰다. 이후 상기 형질전환용 균주 배양액에 꽃대를 15 분간 담근 후 그늘에서 하룻 밤 재운 후 배양하였다. 이로부터 종자를 받아 카나마이신 배지에서 발아 선별한 후 저항성 형질전환체를 토양에 이식하여 제 2 세대 종자를 얻었다. 이를 다시 선별하여 카나마이신 감수성 개체가 나오지 않는 제 2 세대 종자를 대상으로 실험을 하였다.

먼저 외래 재조합 유전자가 올바르게 삽입되었는지를 확인하기 위하여JMT유전자를 탐침으로 게놈 서던 블럿을 수행하였다. 그 결과, 비형질전환체에서는 약 6.5 kbp 길이 정도의 원래 아라비돕시스에 존재하던 1 개의 유전자가 확인되었으며, 형질전환체에서는 이외에도 약 2.0 kbp 와 0.7 kbp 두 개의 DNA 절편을 관찰하였는데 이것이 형질전환한JMT유전자에서 유래한 것임을 알 수 있었다 (프로모터 앞 부위와 단백질 암호화 부위 후반부에HindIII 자리가 있음). 이를 다시 재조합 유전자에만 있는 CaMV 프로모터 부위를 탐침으로 혼성화한 후 X-선 필름에 감광시켰더니 예상대로 형질전환체에서만 약 2.0 kbp 정도 길이의 유전자 부위가 존재하여 재조합 유전자 1 개가 안정적으로 삽입되었음을 확인하였다.

또한 형질전환된 아라비돕시스에서JMT유전자가 과다 발현되는지 여부를 노던 블럿으로 확인하였다. 그 결과 형질전환체에서만JMT유전자가 발현되었으며, 특히 외부에서 식물체에 JA 또는 JAMe를 처리했을 때 유도되는 저항성 관련AOS,JR, LOXⅡ, VSP등 다수의 유전자가 형질전환체에서 상시적으로 발현되고 있음을 확인하였다. 이는 전입한JMT유전자가 식물체에서 발현되는 효과가 외부에서 JA 혹은 JAMe를 처리했을 때의 효과와 유사함을 보여주는 것이다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 형질전환 식물체에 잿빛 곰팡이 병원균을 접종한 결과, 분무접종 후 약 48시간 후에 비형질전환체는 완전히 죽었지만 형질전환체는 거의 변화가 없음을 확인하였다. 그러나 파이티움(Phytium) 속 병원균의 경우 130 μM 수준의 JA를 처리하더라도 병원균의 증식에는 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있다(Vijayanet al.,Proc. Natl. Acad. Sci.95; 7209-7214, 1998). 따라서JMT유전자 형질전환체가 병원균 저항성을 보이는 원리는 식물체에서 합성된 JAMe가 직접 병원균의 생육을 억제하는 것이라기 보다는 JMT 효소에 의해 생성된 JAMe에 의해 다양한 종류의 방어 관련 유전자의 발현이 유도되기 때문임을 알 수 있다. 이와 같이JMT유전자로 형질전환된 식물체가 JAMe를 매개로 다양한 방어 관련 유전자의 상시 발현을 나타낸다는 사실은JMT유전자가 다양한 식물 병원균, 해충 및 스트레스에 대한 폭넓은 저항성을 식물체에 부여하는데 이용될 수 있음을 의미한다.

또 다른 실시예에서는 상기의JMT형질전환 아라비돕시스에 세균병원균, 바이러스 및 해충을 처리하였으나 한결같이 저항성을 나타내었다.

또 다른 실시예에서는 재조합JMT유전자를 이용하여 벼, 담배, 감자, 밀감, 수박, 오이 등 다양한 식물체를 형질전환시키고 도열병균, 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 감자 역병균, 밀감 잿빛곰팡이병균, 수박 만할병균, 오이 노균병균 등 다양한 병원균과 해충을 처리해 보았으나 한결같이 저항성을 보였다.

또 다른 실시예에서는 상기의JMT형질전환 아라비돕시스에 대해 내한성, 내염성과 내냉성을 조사한 결과 비형질전환체에 비해 현저한 저항력을 보였다. 따라서 자스몬산 메칠화효소 유전자로 형질전환된 식물체는 각종 병충해에 대한 저항성은 물론 저온, 수분 부족, 높은 염도 등의 스트레스에 대해서도 저항성을 나타냄을 알 수 있다.

또한 상기JMT유전자 형질전환체는 식물의 일반적인 성장 특성면에서 비형질전환체와 별다른 차이를 나타내지 않았다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것이 아님은 당업자에게 자명할 것이다.

<실시예 1> 아라비돕시스에서 자스몬산 메칠화 효소 유전자 pJMT 의 클로닝

실험에 사용한 아라비돕시스(Arabidopsis thalianaecotype Col-0)는 종자를 온실에서 재배하고, 다양한 조직을 수집하여 액체 질소에서 급속 냉동한 다음, 사용 전까지 -70℃에서 보관하였다.

식물의 꽃에서 특이적으로 발현되는 유전자를 분리하기 위하여, 플라스미드 pUC18 (파아마시아, 스웨덴)을 이용하여 공지의 방법에 따라 배추 꽃의 cDNA 라이브러리를 제작하였다(Choiet al., J. Korean Agric. Chem. Soc. 36; 315-319,1993). 다음, 각각 꽃과 잎에서 전체 RNA를 촘친스키 등의 방법 (Chomczynskiet al., 1987)에 따라 추출하고, 올리고 (dT) 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 poly(A)⁺RNA를 분리한 다음 RT-PCR(reverse transcriptase - polymerase chain reaction)로 첫 번째 cDNA 탐침을 합성하였다. 꽃과 잎에서 각각 제조한 [³²P]로 표지된 cDNA 탐침을 사용한 차별화 혼성화법(differential hybridization)을 이용하여 배추 꽃의 cDNA 라이브러리를 대상으로 꽃에서만 특이적으로 발현하는 클론 c38을 선별하였다. 그러나, 이 유전자는 길이가 416bp에 불과하여 배추의 꽃에서 특이적으로 발현되는 유전자의 부분 클론임을 알 수 있었지만 그 기능은 알 수 없었다.

상기 유전자의 특성을 연구하기 위하여 아라비돕시스에서 c38 클론을 탐침으로 사용하여 유사 유전자를 선별하였다. 아라비돕시스의 cDNA 라이브러리로부터 선별하여 얻은 클론 pJMT는 전체 길이 1,476bp로 서열번호 2의 염기서열을 가지며, 3' 말단에 13개의 아데노신이 연속해서 존재하고, 5' 말단으로부터 15번째 염기쌍에 번역 개시 코돈 AUG를 갖고 있었다. 상기 번역 개시 코돈으로부터 1,167 bp에 걸쳐 서열번호 3으로 표시되는 389개의 아미노산(분자량 43,453)을 연속해서 암호화하고 있으며, 구조적인 특징으로 보아 전장 cDNA 클론임을 알 수 있었다. 이 클론은 이후에 설명하는 방법에 따라 그 기능을 분석한 결과 JMT 효소 유전자임을 알 수 있었고 따라서 클론의 이름을 pJMT로 명명하였으며 그 구조는도 1과 같다. 이 클론 pJMT는 2000년 5월 29일자로 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호 : KCTC 0794BP).

상기 유전자의 기능을 유추하기 위해 NCBI (National Center for BioInformation)의 유전자 자료 기지를 검색한 결과 기탁번호 AF133053 (Accession No. AF133053; Rosset al., 1999)의SAMT유전자 산물과 염기 수준에서는 전혀 유사성이 없었으나, 아미노산 수준에서 43%의 유사성을 나타내었다(도 2참조).

<실시예 2> 배추에서 자스몬산 메칠화 효소 유전자 pNTR1 과 pNTR2의 클로닝

실시예 1에서 분리한 배추의 c38 클론은 길이가 416 bp에 불과한 cDNA 부분 클론으로 판단되었다. 따라서 전장 cDNA 클론을 분리하기 위하여 c38 클론을 탐침으로 배추의 cDNA 라이브러리를 선별하여 클론 pNTR1 과 pNTR2를 얻었다. pNTR1 클론은 전체 길이 1,241 bp로 서열번호 5의 염기서열을 가지며 5' 말단으로부터 2 번째 염기쌍에서 번역 개시 코돈 AUG가 시작된다. 상기 번역 개시 코돈으로부터 1,179 bp에 걸쳐 서열번호 6으로 표시되는 392 개의 아미노산(분자량 43,764)을 연속해서 암호화하고 있으며, 구조적인 특징으로 보아 c38 클론의 전장 cDNA 클론임을 알 수 있었다. 이 클론의 유전자는 그 기능은 알 수 없었지만 배추의 꽃꿀샘에서만 특이적으로 발현되는 것으로 규명되었기에 유전자 이름을NTR1(nectarin 1)으로 명명하고 클론의 이름을 pNTR1 이라고 하여 발표한 바 있다 (Songet al., Plant Mol. Biol.42; 647-655, 2000). 그러나 상기 클론은 아라비돕시스의JMT유전자와 아미노산 서열에서 87% 동질성을 보였으며, 이후에 설명하는 실시예에 따라 그 기능을 분석한 결과 JMT 효소 유전자임을 알 수 있었다. 클론 pNTR1의 구조는도 3과 같다. 이 클론 pNTR1은 2000년 5월 29일자로 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호 : KCTC 0792BP).

pNTR2 클론은 전체 길이 1,370 bp로 서열번호 8의 염기서열을 가지며, 3' 말단에 18 개의 아데노신이 연속해서 존재하고, 5' 말단으로부터 14 번째 염기쌍에 번역 개시 코돈 AUG를 갖고 있었다. 상기 번역 개시 코돈으로부터 1,179 bp에 걸쳐 서열번호 9로 표시되는 392 개의 아미노산(분자량 43,541)을 연속해서 암호화하고 있으며, 구조적인 특징으로 보아 c38 클론과는 다른 유전자의 전장 cDNA 클론임을 알 수 있었다. 이 클론의 유전자는 그 기능을 알 수 없었지만 배추의 꽃꿀샘에서만 특이적으로 발현되는 것으로 규명되었으므로 유전자 이름을 NTR2으로 명명하고 클론의 이름을 pNTR2 이라고 하여 발표한 바 있다 (Songet al., Plant Mol. Biol.42; 647-655, 2000). 이 클론은 아라비돕시스의JMT유전자와 아미노산 서열에서 82% 동질성을 보였으며, 이후에 설명하는 실시예에 따라 그 기능을 분석한 결과 JMT 효소 유전자 임을 알 수 있었다. 클론 pNTR2의 구조는도 4와 같다. 상기 클론 pNTR2는 2000년 5월 29일자로 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호 : KCTC 0793BP).

<실시예 3> 재조합 JMT 유전자의 제조 및 대장균에서의 대량 발현

실시예 1에서 클로닝한 pJMT 클론의 기능을 밝히기 위하여 이 클론의 암호화 부위를 대장균 발현벡터에 재조합하여 대장균에서 대량 발현을 유도하였다.JMT유전자 증폭을 위한 프라이머로는 서열번호 10 및 서열번호 11로 기재되는 염기서열을 각각 PCR 반응의 순방향 시발체 및 역방향 시발체로 이용하였다.

PCR의 조건은 10 mM 트리스(pH 8.3), 50 mM 염화칼륨, 0.8 mM 염화마그네슘을 포함하는 완충용액에서 94℃로 2분간 방치한 후, 94℃ 1분(denaturation); 56℃ 1분 30초(annealing); 72℃ 2분 30초(extension)의 반응을 30회 반복하였고, 마지막 단계에서 72℃로 10분간 추가 반응시켰다(DNA Thermal Cycler 480, Perkin Elmer). 얻어진 PCR 산물을 2% 아가로스 겔에서 전기영동시켜 진클린 키트(Geneclean kit, BioRad, 미국)를 이용하여 분리한 다음 제한 효소EcoR I 으로 절단하고, 미리 같은 효소로 절단한 대장균 발현벡터 pGEX-2T(파아마시아, 스웨덴)에 삽입하였다(도 5참조). 상기 재조합 발현벡터 pGST-JMT는 tac 프로모터의 조절 하에JMT유전자의 아미노 말단이 GST (glutathione S-transferase)의 카복시 말단과 결합한 형태의 융합단백질을 생산한다. 상기에서 얻어진 재조합 플라스미드로 대장균 BL21을 형질전환한 후 배양하고 0.5 mM 이소프로필-β-D-치오갈락토사이드(isopropyl-β-D-thiogalactoside)를 처리하여 발현을 유도하였다. 재조합 단백질은 글루타치온 아가로스 크로마토그래피(glutathione agarose chromatography) 및 수퍼덱스 200 칼럼 크로마토그래피로 순수분리하였고, SDS-전기영동법(12.5%)으로 그 순도를 검정하였다(도 6참조). 그 결과 재조합 단백질 GST-JMT는 예상했던 크기 (분자량 67,000)대로 순수 분리 되었음을 확인하였다.

<실시예 4> 재조합 JMT 단백질의 효소 활성 검정

실시예 3에서 순수 분리한 재조합 효소 단백질을 사용하여 JA와 SAM을 기질로 반응시키고 가스 크로마토그래피(gas chromatography)와 질량분석기(mass spectroscopy)를 통해 JAMe의 합성을 확인하였다.

시험관 내에서 100 mM 염화칼륨 존재 하에 1 mM의 JA와 1 mM의 SAM을 첨가하고 순수 분리한 JMT 효소 단백질 10 pmole을 섞어 총반응액의 부피를 100㎕로 한 다음 20℃에서 30분간 반응시켰다. 반응산물을 에틸 아세테이트를 이용하여 추출한 다음 에틸 아세테이트 농축액 3 ㎕에 대해 가스 크로마토그래피로 분석한 결과, 반응 산물은 표준 JAMe와 같은 체류 시간(11.7분) 후에 검출되었고, 분자량은 표준 JAMe와 같은 224였다(도 7참조). 상기 결과로부터 cDNA 클론 pJMT는 JMT 효소 유전자임을 확인할 수 있었다.

한편,도 8에 나타난 바와 같이 효소 반응의 기질로 JA와 [¹⁴C]SAM을 사용한 경우의 활성도를 100%으로 하면 기질을 JA 대신 SA 또는 이와 유사한 벤조산(BA)으로 바꾸었을 때에는 거의 반응이 진행되지 않아, 순수 분리한 JMT 효소 단백질이 JA에 특이적으로 반응함을 확인할 수 있었다.

또한 단백질 조추출물을 이용하여 100 mM 염화칼륨 존재 하에 6.4 mM의 [¹⁴C]SAM과 1mM JA를 기질로 하여 20℃에서 30분간 반응시킨 후 [¹⁴C]JAMe 생산의 활성도를 측정하였으며, 그 결과를도 9에 나타내었다.도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 형질전환된 아라비돕시스 조추출물의 [¹⁴C]JAMe 생산 활성은 비형질전환체에 비해 많게는 2배에 달하였다.

<실시예 5> 재조합 JMT 단백질의 효소적 특성 조사

SAM과 JA를 기질로 하여 기질 농도와 반응 속도와의 관계를 조사하였으며, 이중역수 도표(Lineweaver-Burk plot)을 통해 K_m, V_m, K_cat및 K_cat/K_m을 구하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

자스몬산 메칠트랜스퍼라제의 반응 속도 상수

기질	K_m(μM)	V_m(nmole/min)	K_cat(s^-1)	K_cat/K_m(μM^-1s^-1)
SAM	6.3	84	70	11.1
(±)JA	38.5	30	15	0.4

<실시예 6> 재조합 NTR1 과 NTR2 단백질의 효소 활성 검정

NTR1 과 NTR2 단백질의 효소 활성을 검정하기 위하여 실시예 3 에서와 같이 NTR 유전자의 단백질 암호화 부위를 대장균 발현 벡터에 재조합 한 후 대장균에서 발현시켰다. NTR1 단백질 경우 pNTR1 플라스미드를 제한효소EcoRI으로 절단한 후NTR1유전자 1.2 kbp 절편을 동일한 효소로 절단된 pGEX-2T 벡터에 삽입시켜 재조합 유전자 pGST-NTR1을 얻었다. 또한 NTR2 단백질 경우 pNTR2 플라스미드를 제한효소EcoRI과XhoI으로 이중 절단한 후NTR2유전자 1.4 kbp 절편을 분리하고 클리노우(Klenow) 효소를 이용하여 끝을 메웠다. pGEX-2T 벡터 플라스미드를 제한효소BamHI으로 절단하고 끝을 메운 후 분리한NTR2절편을 삽입하여 재조합 유전자 pGST-NTR2를 얻었다. 이들을 대장균 BL21에 형질전환 한 후 배양하여 발현을 유도하였다.

재조합 단백질은 실시예 3 에서와 같이 글루타치온 아가로스 크로마토그래피 (glutathione agarose chromatography) 및 수퍼덱스 200 칼럼 크로마토그래피로 순수분리하였고, SDS-전기영동법(12.5%)으로 그 순도를 검정하였다. 그 결과 재조합 단백질 GST-NTR1 및 GST-NTR2는 예상했던 크기 (분자량 67,000)대로 순수 분리되었음을 확인하였다.

NTR1 과 NTR2 단백질의 효소 활성을 검정하기 위하여 실시예 4에서와 같이 순수 분리한 재조합 효소 단백질을 사용하여 JA와 [¹⁴C]SAM을 기질로 반응시키고 반응산물을 에틸 아세테이트로 추출하고 합성된 [¹⁴C]JAMe를 측정하였다. 그 결과도 10및도 11에 나타난 같이 효소 반응의 기질로 JA와 [¹⁴C]SAM을 사용한 경우의 활성도를 100%로 하면 기질을 JA 대신 SA 또는 이와 유사한 BA로 바꾸었을 때에는 거의 반응이 진행되지 않아, 순수 분리한 NTR1 과 NTR2 효소 단백질이 JA에 특이적으로 반응함을 확인할 수 있었다.

<실시예 7> JMT 유전자를 이용한 형질전환 식물체의 제조

식물체에JMT유전자를 이식하기 위하여 식물 형질전환벡터에 재조합을 실시하였다. 기본벡터로서 카나마이신(kanamycin) 저항성 선별 유전자와 CaMV 프로모터를 가진 pBl121 벡터(ClonTech, 미국)에서 GUS 유전자를 제거하고SmaI 자리에 대신AflⅢ로 절단한JMT유전자를 삽입하여 재조합 플라스미드 pCaJMT를 제작하였다(도 12참조). 상기 재조합 플라스미드를 급속 냉동-해동법(freeze-thawmethod, Holster M. et al.,Mol. Gen. Genet.163: 181-187, 1978)을 이용하여 아그로박테리아 C58C1 (Koncz and Schell,Mol. Gen. Genet.204: 383-396, 1986)에 도입하였다.

우선, 아그로박테리아를 5 ㎖ YEP(yeast extract-peptone) 배지에서 28℃로 24시간 배양한 후, 4℃에서 5,000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 균주 펠렛을 20 mM 염화칼륨 용액 1 ㎖에 재현탁시키고, 제조한 벡터 DNA를 약 1㎍ 정도 넣어준 뒤, 액체 질소에서 5분, 37℃에서 5분간 처리하였다. 여기에 1㎖ YEP 배지를 첨가하여 28℃에서 2∼4시간 배양하여 회수한 후, pCaJMT로 형질전환된 균주만을 선별하기 위해 겐타마이신 (25 ㎍/㎖)과 카나마이신(50㎍/㎖)을 포함하는 YEP 배지에서 28℃로 2∼3일간 배양하였다.

상기에서 선별된 균주를 아라비돕시스에 형질전환시켰다. 형질전환 식물체의 제조는 공지의 아그로박테리아 형질전환법(Agrobacterium-mediated floral dip method, Clough and Bent,Plant J. 16: 735-743, 1998)을 이용하였다. 항생제를 포함하는 YEP 배지에서 밤새 배양한 아그로박테리아를 원심분리한 후 Silwet L-77 (Lehle Seeds, 미국) 0.05%를 가한 MS 배지에 OD₆₀₀= 0.8 까지 현탁하였다. 여기에 꽃이 피기 시작하는 아라비돕시스의 꽃대 부분을 거꾸로 15 분 담근 후 물기를 빼고 서늘한 그늘에 밤새 방치한 다음 이튿날 배양실로 옮겨 배양 후 종자를 받았다. 이 종자를 카나마이신 배지에서 발아 선별하고 카나마이신 저항성을 보이는 형질전환체를 토양에 이식하여 제 2세대 종자를 얻었다. 이를 다시 카나마이신 배지에서선별하여 카나마이신 감수성 개체가 나오지 않는 제 2세대 종자를 순수 2배체로 인식하고 이 식물체를 대상으로 실험을 계속하였다.

재조합 유전자가 올바르게 삽입되었는지를 확인하기 위하여 게놈 서던 블럿 (genomic southern blot)을 수행하였다. 먼저, 형질전환 및 비형질전환 식물체로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 제한효소HindⅢ로 절단하고 0.8% 아가로스 겔에 전기 영동한 다음 겔을 필터에 찍어JMT유전자를 탐침으로 혼성화 반응시키고, X-선 필름에 감광시킨 결과, 예상한 바대로 비형질전환체에서는 약 6.5 kbp 길이 정도의 원래 아라비돕시스에 존재하던 1 개의 유전자가 확인되었으며, 형질전환체에서는 이외에도 약 2.0 과 0.7 kbp 절편으로 이루어진 유전자가 1 개 더 나타났다(프로모터 앞 부위와 단백질 암호화 부위 후반부에HindIII 자리가 있음 :도 13참조). 같은 필터를 씻은 후 재조합 유전자에만 있는 CaMV 프로모터 부위를 탐침으로 혼성화 한 다음 X-선 필름에 감광시킨 결과 형질전환체에서만 약 2.0 kb 길이의 유전자 부위가 나타나 재조합 유전자 1 개가 안정적으로 삽입되었음을 확인할 수 있었다.

<실시예 8> 형질전환 식물체에서 JMT 유전자의 발현 확인

형질전환된 아라비돕시스에서JMT유전자가 과다 발현되고 있는지 확인하기 위하여 노던 블럿(Northern blot)을 수행하였다.

먼저,JMT유전자가 검출된 형질전환 아라비돕시스의 잎 조직에서 3-시약 (Tri-reagent, Sigma사, 미국)을 이용하여 단일단계 RNA 분리법 (Chomczynski,Analytical Biochemistry62; 156-159, 1987)에 따라 전체 RNA를 분리하였다. 즉,아라비돕시스 잎조직 2∼5g을 액체질소에서 고운 분말이 될 때까지 마쇄한 후, 10 ㎖의 3-시약을 넣어 10초간 세게 흔들고, 얼음 위에서 15분간 정치시켰다. 그 후 2 ㎖의 클로로포름을 넣고 잘 섞은 후 상온에서 15분간 정치시키고, 4℃에서 3000rpm으로 20분간 원심분리하였다. 상등액을 취하여 10 ㎖ 이소프로필 알콜을 넣고 상온에서 10분간 침전시킨 후, 다시 10,000×g로 20분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액은 버리고, 침전된 RNA를 75% 에탄올로 씻은 다음 DEPC 처리한 증류수에 녹이고, OD₂₆₀과 OD₂₈₀의 흡광도를 측정하여 정량한 다음 사용 전까지 -70℃에서 보관하였다.

상기와 같이 분리된 전체 RNA 중 30 ㎍을 최종 부피 4.5㎕로 농축시킨 다음 10×MOPS [0.2 M 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (pH 7.0), 50 mM sodium acetate, 10 mM EDTA (pH 8.0)], 포름아마이드, 포름알데히드를 1 : 1.8 : 5의 비율로 첨가하여 총 20 ㎕로 하였다. 이것을 65℃에서 15분간 열처리하여 2차 구조를 풀어준 다음, 포름알데히드 겔 로딩 완충 용액(50% glycerol, 1 mM EDTA(pH 8.0), 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF) 2㎕와 잘 섞어 포름알데히드(2.2M)를 포함한 1.5% 아가로스 겔에 4V/cm로 천천히 전기영동하였다.

전개된 RNA를 1시간 정도 DEPC 처리한 물에 담궈 포름알데히드를 제거한 뒤, 모세관 이동방법(capillary transfer method)으로 약 16시간 이상 나일론 막 (Hybond-N, Amersham)으로 옮기고 자외선 조사(254nm, 0.18J/Sq·cm²)로 고정시켜 혼성화 반응에 사용하였다. 랜덤 프라이머 표지 키트 (random primer labelingkit, Boeringer Manheim)를 사용하여 [α-³²P]dCTP로 표지된JMT유전자를 혼성화 반응의 탐침으로 이용하였다. RNA가 완전 결합된 나일론 막에 전혼성화 (prehybridization) 용액 (5×SCC, 5×Denhardt's reagent, 0.1% SDS, 100 ㎍/㎖ denatured salmon sperm DNA)을 넣어 65℃ 혼성화 반응용 오븐에서 2시간 가량 방치한 후 표지된 탐침을 끓는 물에서 5분간 변성시킨 후, 전혼성화 반응액에 첨가하여 18시간 동안 반응시켰다. 다음 날 2 ×SCC, 0.1% SDS에서 나일론 막을 10분간 상온에서 씻어 주었고, 다시 0.2 ×SSC, 0.1% SDS에서 20분간 씻어준 다음 가이거 계수기(Geiger counter)로 신호를 측정해 가면서 온도를 65℃로 올려 씻어주었다. 나일론 막을 씻어준 후, 랩으로 덮고 X-선 필름을 얹어 -70℃에서 감광시켰다.

그 결과,도 14에 나타난 바와 같이 형질전환된 아라비돕시스에서JMT유전자가 과다 발현되고 있음을 확인하였다. 실시예 7의 게놈 블럿에서 보았듯이 아라비돕시스에는 원래JMT유전자가 존재하지만 노던 블럿에 의하면 그 유전자는 꽃에서만 특이적으로 발현이 되고 잎에서는 발현이 되지 않는다. 그러나 이식된 외래 재조합JMT유전자는 CaMV 프로모터와 재조합시킴으로써 식물체 전신에 걸쳐 골고루 발현되었다.

한편, 외부에서 JA 또는 JAMe을 처리하였을 때 유도되는AOS,JR2,JR3,DAHP,LOXⅡ,VSP와 같은 유전자의 발현여부를 조사한 결과,JMT유전자로 형질전환된 식물체에서는 상기 유전자들이 상시적으로 발현됨을 확인하였다(도 14참조). 이는 이식된JMT유전자에 의해 식물체에서 발현되는 효과가 외부에서 JA 또는JAMe를 처리하였을 때의 효과와 유사함을 보여주는 것이다.

<실시예 9> 형질전환 식물체의 진균병 저항성 조사

JMT유전자로 형질전환시킨 아라비돕시스에 잿빛곰팡이병원균(Botrytis cinerea)를 접종하여JMT유전자가 식물체의 진균성 병원균에 대한 저항성에 미치는 영향을 조사하였다. 형질전환 또는 비형질전환 아라비돕시스 각각을 7주간 재배한 다음 잎에 잿빛 곰팡이 병원균 포자를 10⁷/㎖ 농도로 분무 접종하였다. 48시간 후 비형질전환체는 완전히 죽은데 반해,JMT유전자를 상시적으로 발현하는 형질전환체는 거의 변화가 없음을 확인하였다(도 15참조). 파이티움(Phytium) 속 병원균의 경우 130 μM 수준의 자스몬산을 처리하더라도 병원균의 증식에는 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있다(Vijayanet al.,Proc. Natl. Acad. Sci.95; 7209-7214, 1998). 이는JMT형질전환체가 병원균 저항성을 보이는 것이 식물체에서 합성된 JAMe가 직접 병원균의 생육을 억제하기 때문이라기 보다는, JA 및 JAMe에 의해 유도되는 다양한 종류의 방어 관련 유전자를 상시 발현시키는 것에 기인함을 의미한다. 그러나, 형질전환 식물체의 일반적인 성장 특성은 비형질전환체와 별로 차이를 보이지 않았다.

<실시예 10> 형질전환 식물체의 세균병 저항성 조사

JMT유전자로 형질전환시킨 아라비돕시스에 세균성 흑반병균 (PseudomonassyringaepvtomatoDC3000)을 접종하여JMT유전자가 식물체의 세균성 병원균에 대한 저항성에 미치는 영향을 조사하였다. 형질전환 또는 비형질전환 아라비돕시스 각각을 7주간 재배한 다음 잎에 세균성 흑반병균 세포를 10⁷/㎖ 농도로 분무 접종하였다. 3일 후 비형질전환체에서는 투명한 황색 병반이 잎 가장자리부터 나타난 반면,JMT유전자를 상시적으로 발현하는 형질전환체에는 잎 가장자리에 미세한 병반이 관찰되었다(표 2 참조). 이는JMT유전자 형질전환체가 세균병에 저항성이 있음을 보여준다.

JMT형질전환 아라비돕시스의 세균병 저항성 조사

	식물 개체 수(개체)	병반 면적율(%)
비형질전환체(야생형)	10	60
형질전환체(JMT)	10	5

<실시예 11> 형질전환 식물체의 바이러스병 저항성 조사

JMT유전자로 형질전환시킨 아라비돕시스에 BCTV(beet curly top virus)를 접종하여JMT유전자가 식물체의 바이러스 병에 대한 저항성에 미치는 영향을 조사하였다. 형질전환 또는 비형질전환 아라비돕시스 각각을 4 주간 재배한 다음 잎에 주사기로 BCTV 클론으로 형질전환한 아그로박테리아를 접종하였다. 4 주 후 비형질전환체에서는 잎이 말리는 현상이 나타나기 시작하였으나,JMT유전자를 상시적으로 발현하는 형질전환체에는 별다른 변화를 보이지 않았다(표 3 참조). 이는JMT유전자 형질전환체가 바이러스병에 저항성이 있음을 보여준다.

JMT형질전환 아라비돕시스의 바이러스병 저항성 조사

	식물 개체 수(개체)	말린 잎 수(개)	잎 말린 면적율(%)
비형질전환체(야생형)	10	47	60
형질전환체(JMT)	10	4	5

<실시예 12> 형질전환 식물체의 해충 저항성 조사

JMT유전자로 형질전환시킨 아라비돕시스에 검정날개버섯파리 20 마리를 망실에서 접종하여JMT유전자가 식물체의 해충에 대한 저항성에 미치는 영향을 조사하였다. 형질전환 또는 비형질전환 아라비돕시스 각각을 6주간 재배한 다음 검정날개버섯파리 20 마리를 망실에서 접종하였다. 4 주후 비형질전환체는 잎을 거의 갉아 먹은 반면,JMT유전자를 상시적으로 발현하는 형질전환체에는 별다른 피해를 관찰할 수 없었다(표 4 참조). 이는JMT유전자 형질전환체가 해충에 저항성이 있음을 보여준다.

JMT형질전환 아라비돕시스의 해충 저항성 조사

	식물 개체 수(개체)	갉아 먹은 면적율(%)	생존율(%)
비형질전환체(야생형)	10	80	40
형질전환체(JMT)	10	5	100

<실시예 13> 형질전환 벼의 도열병 저항성 조사

JMT유전자로 형질전환시킨 벼에 도열병균 (Magnaporthe grisea)을 접종하여JMT유전자가 식물체의 바이러스 병원균에 대한 저항성에 미치는 영향을 조사하였다. 형질전환 또는 비형질전환 벼를 각각 10 주간 재배한 다음 도열병균 포자를 10⁶/㎖ 농도로 분무 접종하고 25℃ 상대습도 100%에서 하루 밤 지낸 뒤 식물 배양기에서 길렀다. 5일 후 비형질전환체에서는 잎마다 5 - 10 개 정도의 갈색 반점이 나타나 병반면적율 약 80%에 이르렀으나,JMT유전자를 상시적으로 발현하는 형질전환체에는 2 개 미만의 미세한 반점이 관찰되었다(표 5 참조). 이는JMT유전자 벼 형질전환체가 도열병에 저항성이 있음을 보여준다.

JMT형질전환 벼의 도열병 저항성 조사

	식물 개체 수(개체)	병반 수/면적율(개/%)	평균 병반 수/면적율 (개/%/개체)
비형질전환체(야생형)	10	579/80	57.9/80
형질전환체(JMT)	10	37/5	3.7/5

<실시예 14> 형질전환 담배의 담배모자이크병 저항성 조사

JMT유전자로 형질전환시킨 담배에 담배 모자이크 바이러스 (tobacco m,osaic virus, TMV)를 접종하여JMT유전자가 식물체의 바이러스 병원균에 대한 저항성에 미치는 영향을 조사하였다. 형질전환 또는 비형질전환 담배를 10 주간 재배한 다음 카보런덤과 함께 TMV를 잎에 접종하였다. 일주일 후 비형질전환체에서는 잎마다 50 - 100 개 정도의 갈색 반점이 나타난 반면,JMT유전자를 상시적으로 발현하는 형질전환체에는 10 개 미만의 미세한 반점이 관찰되었다(표 6 참조). 이는JMT유전자 형질전환체가 바이러스병에 저항성이 있음을 보여준다.

JMT형질전환 담배의 담배 모자이크병 저항성 조사

	접종한 잎 수(잎)	병반의 수(개)	잎 당 평균 병반 수 (개/잎)
비형질전환체(야생형)	5	387	77.4
형질전환체(JMT)	5	61	6.1

<실시예 15> 형질전환 감자의 역병균 저항성 조사

JMT유전자로 형질전환시킨 감자에 역병균 (Phytophthora infestans)을 접종하여JMT유전자가 감자의 곰팡이 병원균에 대한 저항성에 미치는 영향을 조사하였다. 형질전환 또는 비형질전환 감자를 12 주간 재배한 다음 역병균 포자를 10⁷/㎖ 농도로 잎에 분무 접종하였다. 일주일 후 비형질전환체에서는 잎마다 50 - 100 개 정도의 갈색 반점이 나타난 반면,JMT유전자를 상시적으로 발현하는 형질전환체에는 10 개 미만의 미세한 반점이 관찰되었다(표 7 참조). 이는JMT유전자 형질전환체가 역병에 저항성이 있음을 보여준다.

JMT형질전환 감자의 역병 저항성 조사

	식물 개체 수(개체)	병반 수/면적율(개/%)	평균 병반 수/면적율 (개/%/개체)
비형질전환체(야생형)	10	464/70	46.4/70
형질전환체(JMT)	10	58/10	5.8/10

<실시예 16> 형질전환 밀감의 잿빛곰팡이병 저항성 조사

JMT유전자로 형질전환시킨 밀감에 잿빛곰팡이 병원균 (Botrytis cinerea)을 접종하여JMT유전자가 밀감의 곰팡이 병원균에 대한 저항성에 미치는 영향을 조사하였다. 형질전환 또는 비형질전환 밀감 열매에 잿빛곰팡이 포자를 10⁷/㎖ 농도로 분무 접종하였다. 일주일 후 비형질전환체에서는 열매 표면을 잿빛곰팡이가 거의 덮은데 비해JMT유전자를 상시적으로 발현하는 형질전환체에는 가끔 1 - 2 개의 작은 곰팡이 콜로니가 관찰되었다 (표 8 참조). 이는JMT유전자 형질전환체가 밀감의 잿빛곰팡이병원균에 저항성이 있음을 보여준다.

JMT형질전환 밀감의 잿빛곰팡이병 저항성 조사

	접종한 열매 수(잎)	병반의 수(개)	평균 병반 수/면적율 (개/%/열매)
비형질전환체(야생형)	10	87	8.7/90
형질전환체(JMT)	10	34	3.4/10

<실시예 17> 형질전환 수박의 만할병 저항성 조사

JMT유전자로 형질전환시킨 수박에 만할병원균 (Fusarium oxysporum)을 접종하여JMT유전자가 식물체의 만할병원균에 대한 저항성에 미치는 영향을 조사하였다. 만할병원균 곰팡이 포자를 10⁷/㎖ 농도로 현탁한 후에 토양에 썩은 후 유묘를 이식하였다. 3 주일 후 비형질전환체에서는 줄기 부분이 갈라지며 뿌리가 썩기 시작한 반면,JMT유전자를 상시적으로 발현하는 형질전환체에는 드문드문 병증을 보였으나 비교적 정상적인 성장 모습을 보였다 (표 9 참조). 이는JMT유전자 형질전환체가 수박의 만할병에 저항성이 있음을 보여준다.

JMT형질전환 수박의 만할병 저항성 조사

	접종한 개체 수(개)	병증 개체(개)	치사율(%)
비형질전환체(야생형)	10	8	70
형질전환체(JMT)	10	1	10

<실시예 18> 형질전환 오이의 노균병 저항성 조사

JMT유전자로 형질전환시킨 오이에 노균병원균 (Pseudoperonospora cubensis)을 접종하여JMT유전자가 오이의 노균병원균에 대한 저항성에 미치는 영향을 조사하였다. 형질전환 또는 비형질전환 오이를 10 주간 재배한 다음 노균병에 감염된 오이 잎 절반을 갈아서 1 개 잎마다 접종하였다. 2 주일 후 비형질전환체에서는 잎 가장자리부터 황갈색 반점이 나타나며 마르기 시작하였으나,JMT유전자를 상시적으로 발현하는 형질전환체에는 미세한 반점이 관찰되었다(표 10 참조). 이는JMT유전자 형질전환체가 노균병에 저항성이 있음을 보여준다.

JMT형질전환 오이의 노균병 저항성 조사

	접종한 잎 수(잎)	병 감염 잎(개)	평균 병반 면적율(%)
비형질전환체(야생형)	10	8	50
형질전환체(JMT)	10	4	10

<실시예 19> 형질전환 아라비돕시스의 내한성 조사

JMT유전자로 형질전환시킨 아라비돕시스를 2 주간 급수를 중단함으로써JMT유전자가 식물체의 내한성에 미치는 영향을 조사하였다. 형질전환 또는 비형질전환 아라비돕시스를 6 주간 배양한 다음 2 주동안 급수를 중단하였다. 다시 급수를 재개하더라도 비형질전환체는 거의가 시들어 죽었으나JMT유전자를 상시적으로 발현하는 형질전환체에는 약 65% 정도의 생존율을 보였다 (표 11 참조). 이는JMT유전자 형질전환체가 식물의 수분 스트레스에 대해 저항성이 있음을 보여준다.

JMT형질전환 아라비돕시스의 내한성 조사

	식물 개체 수(개)	생존 개체 수(개)	생존율(%)
비형질전환체(야생형)	20	3	15
형질전환체(JMT)	20	13	65

<실시예 20> 형질전환 아라비돕시스의 내염성 조사

JMT유전자로 형질전환시킨 아라비돕시스를 높은 염농도에서 재배함으로써JMT유전자가 식물체의 내염성에 미치는 영향을 조사하였다. 형질전환 또는 비형질전환 아라비돕시스를 300 mM 농도의 소금을 가한 MS 배지에서 발아시켰다. 일주일 후 비형질전환체는 거의가 발아하지 못한 상태였으나JMT유전자를 상시적으로 발현하는 형질전환체에는 약 82% 정도의 발아율을 보였으며 비교적 건강하게 자랐다. (표 12 참조). 이는JMT유전자 형질전환체가 식물의 염분 스트레스에 대해 저항성이 있음을 보여준다.

JMT형질전환 아라비돕시스의 내염성 조사

	실험 종자 수(개)	발아한 종자 수(개)	발아율(%)
비형질전환체(야생형)	100	8	8
형질전환체(JMT)	100	82	82

<실시예 21> 형질전환 아라비돕시스의 내냉성 조사

JMT유전자로 형질전환시킨 아라비돕시스를 낮은 온도에서 재배함으로써JMT유전자가 식물체의 내냉성에 미치는 영향을 조사하였다. 형질전환 또는 비형질전환 아라비돕시스를 4 ℃ 냉장고에서 1 주일간 처리한 후 23 ℃에서 1 주일 후 생존율을 측정하였다. 비형질전환체는 거의가 회복을 못하고 시들어 죽었으나JMT유전자를 상시적으로 발현하는 형질전환체에는 약 70% 정도의 생존율을 보였으며 비교적 건강하게 자랐다. (표 13 참조). 이는JMT유전자 형질전환체가 식물의 온도 스트레스에 대해 저항성이 있음을 보여준다.

JMT형질전환 아라비돕시스의 내냉성 조사

	처리 개체 수(개)	생존 개체 수(개)	생존 율 (%)
비형질전환체(야생형)	10	1	10
형질전환체(JMT)	10	7	70

본 발명의 자스몬산 메칠화효소 유전자는 식물체의 꽃에서만 특이적으로 발현하는 신규한 유전자로서, 상기 유전자를 포함하는 식물형질전환용 발현벡터로 형질전환 식물체를 제조하면 일반적인 성장 특성에는 영향을 미치지 않으면서 효과적으로 식물체의 진균병, 세균병, 바이러스병 및 해충, 그 중에서 특히 벼 도열병, 흰잎마름병, 이삭마름병 및 멸구, 보리의 붉은 곰팡이병, 옥수수의 깨씨무늬병, 콩의 모자이크병, 감자모자이크병, 고추의 역병 및 탄저병, 배추와 무우의 무름병, 뿌리혹병 및 배추흰나방, 참깨의 세균성점무늬병, 딸기의 잿빛곰팡이병 및 시들음병, 수박의 만할병, 토마토의 청고병, 오이의 흰가루병 및 노균병, 담배 모자이크병, 토마토의 시들음병, 인삼의 뿌리썩음병, 목화의 모무늬병, 사과, 배, 복숭아, 양다래, 포도 및 감귤 등 과수류의 탄저병과 잿빛곰팡이병, 사과의 부란병, 대추나무의 빗자루병, 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파 등 사료 작물의 흰가루병 및 녹병, 장미, 거베라, 카네이션 등 화훼류의 잿빛곰팡이병, 시들음병, 장미의 검은무늬병, 글라디올러스 및 난류의 모자이크병, 백합의 줄기 썩음병 등에강한 저항성을 보이는 식물체를 얻을 수 있다. 아울러 저온, 수분 부족, 높은 염도 등 각종 스트레스에 대한 저항성이 높은 식물체를 얻을 수 있다. 따라서 농약 등의 사용량을 줄이면서도 식물 병에 대한 저항성을 나타내므로 경제 작물 등의 수확량 증대 등에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명을 통해 식물체의 병충해 저항성에 JAMe가 주로 관여함을 밝힘으로써 본 발명의JMT, NTR1및NTR2유전자 및 효소 단백질은 향후 병충해 저항성 식물체의 개발에 있어 새로운 자스몬산 메칠화효소 및 유전자 탐색 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 자스몬산 메칠화효소 JMT
서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 자스몬산 메칠화효소 NTR1
서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 자스몬산 메칠화효소 NTR2
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 자스몬산 메칠화효소를 암호화하는 cDNA 유전자
제 4항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 cDNA 유전자
제 5항에 있어서, 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 cDNA 유전자JMT(기탁번호 : KCTC 0794BP)
제 4항에 있어서, 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 cDNA 유전자
제 7항에 있어서, 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 cDNA 유전자NTR1(기탁번호 : KCTC 0792BP)
제 4항에 있어서, 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 cDNA 유전자
제 9항에 있어서, 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 cDNA 유전자NTR2(기탁번호 : KCTC 0793BP)
제 4항의 자스몬산 메칠화효소 cDNA 유전자를 포함하는 식물형질전환용 재조합 벡터
제 11항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 cDNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물형질전환용 재조합 벡터 pCaJMT
제 11항의 식물 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된, 병충해 및 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체
자스몬산 메칠화효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물형질전환용 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물체의 병충해 및 스트레스 저항성을 증진시키는 방법
제 14항에 있어서, 자스몬산 메칠화효소를 암호화하는 유전자는 제 4항의 유전자인 것을 특징으로 하는 방법
제 15항에 있어서, 자스몬산 메칠화효소를 암호화하는 유전자는 제 5항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 유전자인 것을 특징으로 하는 방법
제 14항에 있어서, 병충해는 식물체의 진균병, 세균병, 바이러스병 또는 해충 피해인 것을 특징으로 하는 방법
제 17항에 있어서, 병충해는 벼 도열병, 흰잎마름병, 이삭마름병 및 멸구, 보리의 붉은 곰팡이병, 옥수수의 깨씨무늬병, 콩의 모자이크병, 감자모자이크병, 고추의 역병 및 탄저병, 배추와 무우의 무름병, 뿌리혹병 및 배추흰나방, 참깨의 세균성점무늬병, 딸기의 잿빛곰팡이병 및 시들음병, 수박의 만할병, 토마토의 청고병, 오이의 흰가루병 및 노균병, 담배 모자이크병, 토마토의 시들음병, 인삼의 뿌리썩음병, 목화의 모무늬병, 사과, 배, 복숭아, 양다래, 포도 및 감귤 등 과수류의 탄저병과 잿빛곰팡이병, 사과의 부란병, 대추나무의 빗자루병, 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파 등 사료 작물의 흰가루병 및 녹병, 장미, 거베라, 카네이션 등 화훼류의 잿빛곰팡이병, 시들음병, 흰가루병, 녹병, 균핵병, 탄저병, 잎마름병, 노균병, 역병, 연부병, 풋마름병, 두점박이응애, 꽃노랑총채벌레, 온실가루이, 깍지벌레 및 진딧물류, 장미의 검은무늬병, 글라디올러스 및 난류의 모자이크병, 백합의 줄기 썩음병인 것을 특징으로 하는 방법
제 14항에 있어서, 형질전환되는 식물체는 식량작물류, 채소작물류, 특용작물류, 과수류, 화훼류 및 사료작물류를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
제 19항에 있어서, 식량작물류는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수; 채소작물류는 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근; 특용작물류는 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채; 과수류는 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나; 화훼류는 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립; 사료작물류는 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
제 14항에 있어서, 스트레스 저항성은 내한성, 내염성 또는 내냉성인 것을 특징으로 하는 방법