CN110358748A - 枸杞水杨酸羧基甲基转移酶及其编码基因与应用 - Google Patents

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张越
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Abstract

本发明公开了枸杞水杨酸羧基甲基转移酶及其编码基因与应用,枸杞水杨酸羧基甲基转移酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的水杨酸羧基甲基转移酶编码基因导入目的植物中,得到能促进提前开花的转基因植物。

Description

枸杞水杨酸羧基甲基转移酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程和生物技术领域,尤其涉及一种枸杞(LyCium ChinenseMiller)水杨酸羧基甲基转移酶及其编码基因与控制植物开花的应用。
背景技术
植物的开花时间是指植物从营养生长到生殖生长的转变时间,它受到外部环境和内部发育因子的调控,且决定着植物分布及地区适应性。对于农作物而言,开花时间适当是作物获得高产和优质的重要条件,而且开花时间受环境影响比较大,因此,开花时间是一项重要的农艺指标,对作物有性繁殖和高产具有重要影响。
开花时间受外界和自身信号调控,受环境影响的光周期途径和环境温度途径,受内部信号调控的自主开花途径、激素途径和衰老途径的显著影响。在多条途径共同作用下,一些主要的整合因子对开花进行了精确的调控。在生产上,一般通过调节光照调控花期,这种操作不仅会造成人力物力的浪费,而且降低了作物或花卉的经济效益。低温处理也是打破植物鳞茎休眠,促进开花的方法之一,但处理时间过长,会降低花朵的数量甚至影响花蕾质量,不适于向个人推广。外施植物生长调节剂控制植物生长发育开花结果是现代生物技术的一大课题,使用浓度较低,有的甚至不到百万分之一,就能对植物的开花起到调节作用,如赤霉素,萘乙酸等,但激素的施用时间及施用方式还需针对不同的作物进行具体分析,浓度不易控制,长期使用激素无法保证作物的养护质量,甚至会产生负面影响。目前,采用基因工程方法改良花期成为提高作物经济效益的研究热点。在基因组水平上鉴定植物开花相关基因,并揭示了这些基因的进化和表达模式,可以为植物开花研究提供更多的候选基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枸杞水杨酸羧基甲基转移酶。
本发明的第二个目的是提供一种编码上述枸杞水杨酸羧基甲基转移酶的基因。
本发明的第三个目的是提供含有编码上述枸杞水杨酸羧基甲基转移酶的基因的表达载体。
本发明的第四个目的是提供含有上述表达载体的重组菌。
本发明的第五个目的是提供上述基因在制备转基因植物的应用。
本发明的技术方案概述如下:
一种枸杞水杨酸羧基甲基转移酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码上述一种枸杞水杨酸羧基甲基转移酶的基因,其脱氧核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
含有上述基因的表达载体。
含有上述表达载体的重组菌。
上述编码上述一种枸杞水杨酸羧基甲基转移酶的基因在制备转基因植物的应用。
本发明的优点:本发明的水杨酸羧基甲基转移酶编码基因导入目的植物中,得到能促进提前开花的转基因植物。
附图说明
图1.pCAMBIA2300-LcSAMT表达载体示意图。
图2.转LcSAMT基因烟草基因组和pCAMBIA2300-LcSAMT质粒的RT-PCR产物电泳图。
图3.野生型烟草与转基因烟草SA含量对比图。
图4.野生型烟草与转基因烟草MeSA含量对比图。
图5.转LcSAMT基因烟草开花图。
具体实施方式
本实验所用培养基:
MS培养基购自天津鼎国生物公司。
侵染培养基1/2MS+70g/L蔗糖+38g/L葡萄糖+150μmol/L乙酰丁香酮pH为5.5。
共培培养基MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA pH=5.8。
脱菌筛选培养基MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+100mg/L卡那霉素+400mg/L头孢霉素pH=6.0。
YEP培养基10g/L蛋白胨+10g/L酵母提取物+5.5g/L NaCl pH=6.8。
抗性苗生根培养基MS+100mg/L卡那霉素+400mg/L头孢霉素pH=5.8
中华枸杞为市售。
枸杞水杨酸羧基甲基转移酶简称LcSAMT。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
枸杞中水杨酸羧基甲基转移酶LcSAMT基因的克隆与生物学分析
利用Trizol试剂,从300mg的新鲜的枸杞(中华枸杞)叶片中提取总RNA,采用Transgen transecript one-step gDNA removal and cDNA synthesis supermix试剂盒,以枸杞总RNA为模板,OligodT18为引物,在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA第1链。
根据枸杞转录组数据库的Unigene序列设计
SEQ ID NO.3所示的上游引物LcSAMT W-F:5’ATGGAAGTAAAGTTTGCC3’;
SEQ ID NO.4所示的下游引物LcSAMT W-R:5’CTAATTTATTTTGGTCAAGGAG3’
PCR扩增枸杞中水杨酸羧基甲基转移酶LcSAMT基因的尾部片段,设计尾部引物P2。根据枸杞转录组数据库的Unigene序列设计上游引物
P1:5’ATGGAAGTAGCGAAAGTTTGCC3’(SEQ ID NO.5)和下游引物P2:5’CTAATTTATTTTGGTCAAGGAG3’(SEQ ID NO.6)
进行PCR扩增。反应后利用天根公司普通DNA产物纯化试剂盒对PCR反应产物进行纯化,按照试剂盒说明书操作,得到纯化的LcSAMT PCR片段。
对PCR产物序列测序验证,获得长度为1074bp序列。与其它物种的SAMT脱氧核苷酸序列比对,发现是LcSAMT的ORF(open reading frame)序列,该序列为SEQ ID NO.2所示的枸杞水杨酸羧基甲基转移酶的基因。由其表达SEQ ID NO.1所示的枸杞水杨酸羧基甲基转移酶的氨基酸序列。
实施例2
LcSAMT基因的植物表达载体构建
用BamHI、SalI对LcSAMT基因进行酶切。在基因的5’端添加了BamHI的酶切位点,3’端添加了SalI的酶切位点。酶切后回收LcSAMT基因片段,然后与BamHI、SalI酶切过得的已有植物表达载体pCAMBIA2300(商品)进行连接,得到含有LcSAMT基因的植物表达载体pCAMBIA2300-LcSAMT(图1)。
实施例3
LcSAMT基因转化农杆菌。
实验中所用的农杆菌为C58菌株,重组质粒载体pCAMBIA2300-LcSAMT上构建有筛选基因Kan。将保存的C58农杆菌感受态从-70℃冰箱拿出200μL,放在冰上,取出5μLpCAMBIA2300-LcSAMT质粒与C58农杆菌200μL混匀,冰浴15min,放入冰上预冷的电击杯中,用1500V电击转化。将菌液吸入1.5mL离心管中,加入500μLYEP液体培养基,于28℃振荡培养3h,5000r/min,28℃,离心收集菌体,弃300μL上清,重悬菌体,涂板于28℃暗培养2-3天,筛选出转化成功的转化用农杆菌单菌落。
实施例4
农杆菌侵染液的制备
从平板上挑取转化用农杆菌单菌落接种于YEP液体培养基中(含100mg/L卡那霉素),30℃、180r/min振荡培养过夜,当菌生长至对数生长期时(OD600为0.6,20℃,5000r/min离心7min收集菌体,用等体积侵染培养基重悬菌体,得到农杆菌侵染液。
实施例5
转基因LcSAMT烟草的获得。
选取整齐饱满的健康烟草种子用含25%NaOCl(有效氯≥10%)25ml,浓盐酸4ml的水溶液,熏蒸灭菌1.5h,将种子放在MS培养基中,16h/8h光/暗周期,25±1℃培养。
待苗长至4-6cm时,将烟草叶片去除主脉和叶边缘,然后将叶片切成0.5cm×0.5cm大小,浸入制备好的农杆菌侵染液,浸泡15min,浸泡过程摇动2-3次,使叶片与菌液充分接触,取出叶片,用含卡那霉素的无菌水清洗并用无菌滤纸吸净多余的液体,叶面朝下、叶背朝上接种于共培培养基中,25℃左右暗培养2-3天。
将叶片转移至筛选培养基中,20天左右更换一次培养基,诱导抗性芽产生,当抗性芽从愈伤组织上长到1cm左右,从愈伤上切取抗性芽,接种于抗性苗生根培养基中。
RT-PCR分子检测用非转基因对照植株叶片和转基因植株叶片提取总RNA,反转录合成的cDNA作为模板,用LcSAMT特异性引物进行扩增,扩增出的片段大小为1074bp。扩增反应程序为:94℃3min;(94℃30s,58℃30s,72℃30s,32个循环);72℃延伸7min。引物为上游:ATGGAAGTAGCGAAAGTTTGCC(SEQ ID NO.7);下游:CTAATTTATTTTGGTCAAGGAG(SEQ ID NO.8)。产物经0.9%琼脂糖凝胶电泳检测。如图2所示,泳道M为Marker,泳道1-7为转基因植株,WT为非转基因对照,P为质粒pCAMBIA2300-LcSAMT阳性对照。RT-PCR检测结果表明,LcSAMT基因已经成功整合入烟草植物基因组中,表明成功获得了转LcSAMT基因烟草植株。
水杨酸(SA)含量与MeSA(水杨酸甲酯)含量测定根据(图3,图4)野生型烟草中的SA含量显著高于转LcSAMT株系,而对转基因株系中的水杨酸甲酯含量显著高于野生型烟草。在转LcSAMT基因烟草中水杨酸更易于转化为水杨酸甲酯。
实施例6
转基因苗移栽
将根系生长良好、生命力旺盛的转LcSAMT基因烟草苗,用自来水冲洗培养基(尽量减少根系损伤),种植在珍珠岩,蛭石和腐殖土(质量比为1:2:2)的培养土中,覆盖薄膜保湿、透气,在24℃,培养8-10天,然后揭开薄膜,定期浇水、施肥,并转移至温室中,收获转LcSAMT基因株系种子。
实施例7
将转LcSAMT基因株系种子播种于MS培养基并放置于培养箱中,在4℃黑暗条件下培养3天,待种子萌发,子叶完全舒展时挑选健壮的苗20株单独培养,用于记录开花情况。
对照:挑选野生型种子播种于MS培养基并放置于培养箱中,在4℃黑暗条件下培养3天,待种子萌发,子叶完全舒展时挑选,挑选健壮的苗20株单独培养,用于记录开花情况。
转基因植株开花提前
观察获得的20株转LcSAMT的烟草植株在温室长日照(每天16小时光照/8小时黑暗)培养条件下的开花情况,以同苗龄20株野生型烟草WT为对照。在相同培养条件下,转LcSAMT的烟草植株全部开花,大约在46天左右,而同苗龄的野生型烟草植株尚未开花且开花情况晚于转LcSAMT型烟草6-7天(图5,图中MT为转LcSAMT基因)。可以证明枸杞水杨酸羧基甲基转移酶的基因对植物开花有明显促进作用。
序列表
<110> 天津大学
<120> 枸杞水杨酸羧基甲基转移酶及其编码基因与应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 357
<212> PRT
<213> 中华枸杞(Lycium chinenseMill)
<400> 1
Met Glu Val Ala Lys Val Cys His Met Asn Gly Gly Thr Gly Asp Ala
1 5 10 15
Ser Tyr Ala Lys Asn Ser Leu Leu Gln Gln Lys Val Val Leu Met Thr
20 25 30
Lys Gly Ile Asn Asp Glu Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Arg Asn Leu Ser
35 40 45
Pro Glu Thr Ile Cys Ile Ala Asp Leu Gly Cys Ser Ser Gly Pro Asn
50 55 60
Ser Phe Leu Pro Val Ser Gln Leu Ile Lys Thr Ile Asn Glu Glu Cys
65 70 75 80
Lys Asn Asn Cys Gln Gln Ser Pro Glu Phe His Ile Phe Leu Asn Asp
85 90 95
Leu Pro Gly Asn Asp Phe Asn Thr Ile Phe Trp Leu Leu Pro Ala Phe
100 105 110
His Glu Asp Leu Lys Lys Gln Asn Met Gly Gln Asp Gly Leu Asp Gln
115 120 125
Pro Lys Cys Phe Val Thr Gly Val Ala Gly Ser Phe Tyr Thr Arg Leu
130 135 140
Phe Pro Ser Lys Ser Leu His Phe Val His Ser Ser Tyr Ser Leu His
145 150 155 160
Trp Leu Ser Gln Val Pro Asp Gly Ile Glu Asn Asn Lys Glu Asn Ile
165 170 175
Tyr Ala Ala Thr Thr Ser Pro Pro Ser Val His Lys Ala Tyr Tyr Glu
180 185 190
Gln Tyr Glu Arg Asp Phe Val Thr Phe Leu Lys Tyr Arg Ser Glu Glu
195 200 205
Leu Val Lys Gly Gly Arg Met Val Leu Thr Val Leu Gly Lys Glu Asn
210 215 220
Glu Asp Arg Phe Ser Lys Gly Cys His Tyr Leu Val Glu Pro Leu Ser
225 230 235 240
Met Ala Leu Lys Glu Leu Val Ala Glu Gly Ser Val Glu Glu Glu Lys
245 250 255
Val Asn Ser Phe Asn Ile Pro Gly Tyr Cys Pro Ser Pro Glu Glu Val
260 265 270
Met Tyr Val Val Glu Lys Glu Gly Ser Phe Thr Ile Asn Cys Leu Glu
275 280 285
Thr Ser Glu Leu His Leu Asp Ala Ser Gly Glu Ser Met Ala Gln Cys
290 295 300
Met Arg Ala Val Ala Glu Pro Leu Leu Val Ser His Phe Gly Asp Gly
305 310 315 320
Tyr Val Leu Met Asp Asp Val Phe His Lys Tyr Arg Gly Ile Tyr Val
325 330 335
Asn Cys Met Thr Lys Glu Asp Ala Met Val Thr Ser Val Ile Val Ser
340 345 350
Leu Thr Lys Ile Asn
355
<210> 2
<211> 1074
<212> DNA
<213> 中华枸杞(Lycium chinenseMill)
<400> 2
atggaagtag cgaaagtttg ccacatgaat ggaggaactg gagacgctag ctatgcaaaa 60
aattctctgc ttcagcaaaa ggtggtcctc atgacaaagg gaataaatga tgaagctata 120
actgctctgt accgcaacct ttcaccagaa accatatgca ttgcagactt aggttgttcc 180
tctggaccta actctttctt gccagtctcc caactcatta aaactattaa tgaagaatgc 240
aaaaacaatt gtcaacagtc gccggagttt catattttct tgaatgatct tcctggcaat 300
gatttcaata ccattttctg gttgttgccc gcattccacg aagatttgaa gaaacaaaat 360
atgggacaag atggacttga tcaaccaaaa tgttttgtga caggagttgc tggttcattt 420
tatactagac tttttccttc caaaagtcta cattttgtcc attcttctta cagtctccac 480
tggctttctc aggtgcctga tggaatagag aataacaaag agaatattta cgcagcaact 540
acaagcccac caagcgtcca taaagcatat tatgagcaat atgaaagaga ttttgtaact 600
tttctcaagt atcgctcaga ggaattggtg aaaggtggac gtatggtatt gaccgtgttg 660
ggcaaagaaa atgaagatcg ctttagcaaa gggtgtcact acctggtgga acctttgtcc 720
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aacattcctg gatactgtcc atctcctgaa gaagtgatgt atgtggttga gaaggaagga 840
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aaagaagatg ctatggtcac aagtgtcatt gtctccttga ccaaaataaa ttag 1074
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaagtag cgaaagtttg cc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
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<400> 4
ctaatttatt ttggtcaagg ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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Claims (5)

1.一种枸杞水杨酸羧基甲基转移酶,其特征是其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1的一种枸杞水杨酸羧基甲基转移酶的基因,其特征其脱氧核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含有权利要求2所述基因的表达载体。
4.含有权利要求3所述表达载体的重组菌。
5.权利要求2所述基因在制备转基因植物的应用。
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