CN103484436A - 来源于玉米的与生育期相关的蛋白ZmHUB2及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了来源于玉米的与生育期相关的蛋白ZmHUB2及其编码基因与应用。ZmHUB2，是如下蛋白质：a）由序列表中序列2第754-828位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c）将序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第754-828位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有下述至少一种活性的由a）衍生的蛋白质：1）泛素连接酶；2）与植物生育期相关。ZmHUB2具有泛素连接酶活性，降低ZmHUB2表达的转基因玉米在整个生育期过程中，都比未转基因玉米提前，生育期平均提前10天左右，降低ZmHUB2表达的转基因玉米植株与未转基因玉米相比株高没有显著的差异，但是果穗数确有显著的增加。
Description
技术领域
本发明涉及一种来源于植物的蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种来源于玉米的与生育期相关的蛋白ZmHUB2及其编码基因与应用。
背景技术
通过泛素介导的蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是目前已知植物体内蛋白质选择性降解最重要的途径，也是细胞进行自身功能调控的重要机制之一。泛素化系统通过三种关键酶即泛素活化酶、泛素结合酶和泛素连接酶的级联反应来完成，其中泛素连接酶E3决定底物蛋白的选择特异性，它的主要功能是识别靶蛋白，使活化的泛素接近特异靶蛋白的Lys，从而将泛素转移到底物。蛋白质的泛素化降解不仅去除了异常和短命的蛋白质，而且为生长的植物细胞提供了自由氨基酸，参与植物生命活动的各个方面，包括花发育、昼夜节律、光形态建成、细胞周期、胚胎发育、植物激素、信号转导、抗逆抗病和衰老等过程。与其它真核生物一样，植物也具备E1/E2/E3酶的活性来负责泛素的激活和连接。泛素化酶的层级结构分布以及泛素化修饰的多样性决定了泛素连接酶E3生物学功能的多样性。已有研究表明，在植物中，E3泛素连接酶涉及许多关键的生化过程，如激素反应、生理节奏、光形态建成、胁迫反应、花的生长发育等过程。
玉米不仅是重要的粮食和饲料作物，也是现代食品工业、医药工业和化学工业的主要原料。自2001年以来，玉米的种植面积就已经超过水稻和小麦成为全球第一大作物。我国的玉米年产量占世界第二位，消费量占全球玉米的20%左右。2008年，我国玉米种植面积首次超过水稻，跃居我国三大作物之首。随着人口增加和畜牧业及农产品加工业的不断发展，对玉米的需求将继续增长，提高玉米产量、改善玉米品质、增强玉米抗病虫和抗逆境能力，对满足人民生活的需求，保证经济建设持续稳定发展，具有重要的战略意义。而我国广大北方地区玉米种植抽穗过晚，导致收获时温度过低或者日照时间过短而影响产量。因此研究玉米的生育周期，挖掘出与开花时间相关的基因对于培育优质高产早熟的新品种，具有重要的生物学意义和经济价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种与植物生育期相关的蛋白ZmHUB2及其编码基因与应用。
本发明所提供的与植物生育期相关的蛋白，名称为ZmHUB2，来源于玉米（Zeamays），是如下a）或b）或c）的蛋白质：
a）由序列表中序列2第754-828位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
c）将序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第754-828位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有下述至少一种活性的由a）衍生的蛋白质：1）泛素连接酶；2）与植物生育期相关。
其中，序列表中序列2由828个氨基酸残基组成。序列2的第754-828位为C3HC4锌指蛋白结构域，该结构域即为a）所述的蛋白质。
为了使上蛋白便于纯化，可在蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6（通常为5个） | RRRRR |
| Poly-His | 2-10（通常为6个） | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述c）中的蛋白质可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
编码ZmHUB2的核酸分子也属于本发明的保护范围。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
所述核酸分子具体可为如下1）或2）或3）或4）所示的基因：
1）其编码序列是序列表中序列1的第2311-2538位核苷酸的DNA分子；
2）其编码序列是序列表中序列1的第52-2538位核苷酸的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
其中，序列表中的序列1由2538个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质。
下述1）-4）中的任一种生物材料也属于本发明的保护范围：
1）含有编码ZmHUB2的核酸分子的表达盒；
2）含有编码ZmHUB2的核酸分子的重组表达载体；
3）含有编码ZmHUB2的核酸分子的重组微生物；
4）含有编码ZmHUB2的核酸分子的转基因细胞系。
上述生物材料中，1）所述的含有编码ZmHUB2的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达ZmHUB2的DNA，该DNA不但可包括启动ZmHUB2基因转录的启动子，还可包括终止ZmHUB2转录的终止子。进一步，所述含有ZmHUB2表达盒还可包括增强子序列。3）所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。4）所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。
实验证明ZmHUB2可作为泛素连接酶，也可调控植物的生育期。所述调控植物的生育期可为调控玉米的生育期；所述玉米的生育期具体可为1）-7）中的至少一种：
1）成熟期；
2）乳熟期；
3）吐丝期；
4）抽雄期；
5）七叶期；
6）三叶期；
7）出苗期。
实验证明ZmHUB2还可调控玉米的果穗数。
所述调控玉米的生育期和调控玉米的果穗数可体现在如下培育生育期缩短和/或果穗数增加的转基因玉米的方法上。
该培育生育期缩短和/或果穗数增加的转基因玉米的方法，是降低目的玉米中所述蛋白质的编码基因的表达，得到生育期短于所述目的玉米的转基因玉米；所述生育期为1）-7）中的至少一种：
1）成熟期；
2）乳熟期；
3）吐丝期；
4）抽雄期；
5）七叶期；
6）三叶期；
7）出苗期。
上述方法中，所述降低目的玉米中所述蛋白质的编码基因的表达可通过将如下式I所示的DNA片段导入所述目的玉米中实现的：
SEQ正向-X-SEQ反向
式I；
所述SEQ正向是选自序列表中序列1且包括序列表中序列1第2172-2538位核苷酸所示的DNA片段；
所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；
所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。
其中，所述SEQ正向的核苷酸序列具体可为序列1中第2172-2538位核苷酸。所述X的序列具体可为序列表中的序列3。
所述式I所示的DNA片段可通过重组表达载体pTCK303-ZmHUB2导入所述目的玉米；所述pTCK303-ZmHUB2按照包括如下步骤的方法构建：1）将序列2中第2172-2538位核苷酸的反向互补序列所示的DNA插在载体pTCK303的SpeⅠ和SacⅠ位点间，得到的重组载体记作中间重组载体；2）将序列2中第2172-2538位核苷酸所示的DNA插在所述中间重组载体的KpnⅠ和BamHⅠ位点间，得到重组载体pTCK303-ZmHUB2。
实验证明，ZmHUB2具有泛素连接酶活性，降低ZmHUB2表达的转基因玉米在整个生育期过程中，都比未转基因玉米提前，差异达到极显著，生育期平均提前10天左右（表3），降低ZmHUB2表达的转基因玉米植株与未转基因玉米相比株高没有显著的差异，但是果穗数确有显著的增加（表4）。
附图说明
图1为PCR扩增到的玉米ZmHUB2基因。
图中，从左至右的条带依次为PCR扩增产物、PCR扩增产物和Marker。Marker为1kb DNA ladder，由下到上分别为250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，2500bp，3000bp等。
图2为原核表达载体pMAL-ZmHUB2E示意图。
图3为PCR扩增ZmHUB2E基因和载体pMAL-ZmHUB2E酶切鉴定图。
A：1-2：PCR扩增ZmHUB2E基因，3：1kb DNA ladder；B：1-2：EcoRI和SalI双酶切pMAL-ZmHUB2E，3：1kb DNA ladder，由下到上分别为250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp等。
图4为MBP-ZmHUB2E蛋白和MBP-ZmHUB2EC814S突变蛋白的体外泛素化反应。
图5为植物干扰载体pTCK303-ZmHUB2的示意图。
图6为PCR扩增ZmHUB2基因干扰片段和载体pTCK303-ZmHUB2酶切鉴定图。
A：1-2：PCR扩增ZmHUB2基因干扰片段，3：1kb DNA ladder，由下到上分别为250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp；B：1：SpeI和SacI双酶切，2：KpnI和BamHI双酶切，3：1kb DNA ladder，由下到上分别为250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp。
图7为农杆菌转化玉米幼胚再生植株的获得。
A：侵染的幼胚；B：诱导的愈伤组织；C：诱导的胚性愈伤组织；D：胚状体E：抗性苗的形成；F：再生苗的形成G：转基因苗种植在花盆；H：转基因苗种植在大田。
图8为转基因玉米的PCR鉴定。
1：阴性对照（未转化玉米）；2：阳性对照；3-5、7-11和13-14：PCR鉴定阳性植株；6和12：PCR鉴定阴性植株；15：1kb DNA ladder，由下到上分别为250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp。
图9为T1代转基因玉米的PCR检测。
1：1kb DNA ladder，由下到上分别为250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp；2：阴性对照（未转化玉米）；3：阳性对照；4-6：转pTCK303-ZmHUB2玉米株系（T1、T2和T3）。
图10为玉米ZmHUB2基因在转基因株系中的表达分析。
CK为未转化玉米，line1、line2和line3分别为转pTCK303-ZmHUB2株系T1、T2和T3。
图11为转基因玉米的GUS活性分析。
WT为未转化玉米。
图12为转pTCK303-ZmHUB2玉米生育期与对照的差异。
A：转pTCK303-ZmHUB2玉米生育期与对照统计图，**：与对照组相比差异极显著（p≤0.01）；B：转基因株系与对照田间图。RNAi为转pTCK303-ZmHUB2玉米，CK为未转化玉米作为对照。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、ZmHUB2及其编码基因的获得
ZmHUB2是本发明的发明人通过RACE技术从玉米自交系综31（杨会，王国英，戴景瑞.玉米优良自交系综3、综31的转化研究.农业生物技术学报2001,9（4）334-337，公众可从中国农业大学获得）中克隆一个与生育期相关基因。该基因的全长cDNA可利用如下引物，以玉米自交系综31总RNA反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增得到：ZmHUB2__5’：5’-ATG GAT TCC ACA GCT CTT CAA TAT G-3’；ZmHUB23’：5’-TCA TAT CTT CAC CTC CCT AAC GTC G-3’）。PCR产物的电泳结果如图1所示。将扩增产物回收后分别与pMD18-T simple Vector（Takara）连接，并转化大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选、质粒DNA的酶切鉴定筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，该PCR产物的核苷酸序列是序列表中的序列1的第52-2538位核苷酸，编码序列表中序列2的蛋白质ZmHUB2。其中，序列表中序列1由2538个脱氧核苷酸组成，其编码序列是第52-2538位。序列表中序列2由828个氨基酸残基组成，序列2的第754-828位为C3HC4锌指蛋白结构域。将序列1的第2311-2538位所示的DNA片段命名为ZmHUB2E，其编码序列2的第754-828位所示的多肽，将该多肽命名为ZmHUB2E。将克隆到的序列输入玉米数据库网站（www.maizegdb.org）进行比对，发现该基因定位在玉米第一条染色体上，共有18个外显子。
实施例2、ZmHUB2的C3HC4锌指蛋白结构域多肽ZmHUB2E具有泛素连接酶的功能
以玉米自交系综31总RNA反转录得到的cDNA为模板，通过引物F-5’-AAGAATTCGAGACTGAAGAGACTAC-3’和R-5’-TTGTCGACTCATATCTTCACCTCCCT-3’PCR扩增序列1的第2311-2538位（编码序列2的754-828位所示的ZmHUB2E），在ZmHUB2E的两端分别加上EcoRⅠ和SalⅠ两个酶切位点，将PCR产物连接在pMD18-Tsimple载体上，送公司测序。
反应体系：
PCR反应程序为：第一轮：95℃变性5min，第二轮：95℃变性50sec，56℃退火50sec，72℃延伸50sec，30个循环，第三轮：72℃延伸10min。反应结束后，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
将测序正确的克隆用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，回收约228bp的条带，与原核表达载体pMAL-c2x（NEB）连接，完成重组质粒pMAL-ZmHUB2E（图2）的构建。用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，得到约300bp条带，证明载体pMAL-ZmHUB2E构建正确（图3）。
将鉴定正确的原核表达载体pMAL-ZmHUB2E重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株TB1中，通过PCR鉴定阳性克隆。用亲和层析的方法纯化MBP-ZmHUB2E融合蛋白，将蛋白加入5%甘油，分装、保存于-80℃备用。纯化的带有MBP标签的融合蛋白MBP-ZmHUB2E经SDS-PAGE检测后进行体外的泛素化反应。反应体积为30μL，包括有50mM Tris-HCl(pH7.4),5mM MgCl2,2mM DTT,4mM ATP，8μg泛素(购自Boston Biochem公司),275ngUBE1（即为E1）(购自Boston Biochem公司)和250ng UbcH5c（即为E2）(购自BostonBiochem公司)，另外在反应体系中加入500ng纯化的MBP-ZmHUB2蛋白作为E3，各个反应成分依次加入。还构建了RING结构域突变体ZmHUB2EC814S的原核表达载体pMAL-ZmHUB2EC814S。ZmHUB2EC814S是将ZmHUB2E的序列2的第814位的cys突变为丝氨酸（ser），其它氨基酸不变得到的ZmHUB2E突变体。pMAL-ZmHUB2EC814S是将ZmHUB2EC814S的编码基因也插入pMAL-c2x的EcoRⅠ和SalⅠ位点得到的重组载体，该重组载体表达融合蛋白MBP-ZmHUB2EC814S。MBP-ZmHUB2EC814S的表达纯化方法同MBP-ZmHUB2。
纯化的带有MBP标签的融合蛋白MBP-ZmHUB2E和MBP-ZmHUB2EC814S经SDS-PAGE检测后进行体外的泛素化反应。反应体积为30μL，包括有50mM Tris-HCl(pH 7.4),5mM MgCl2,2mM DTT,4mM ATP，8μg泛素(购自Boston Biochem公司),275ng UBE1(购自Boston Biochem公司)和250ng UbcH5c(购自Boston Biochem公司)，另外在反应体系中加入500ng纯化的MBP-ZmHUB2E蛋白或MBP-ZmHUB2EC814S蛋白作为E3，各个反应成分依次加入。将反应混合液放入37℃中温育120min，加入2×SDS上样缓冲液，100℃温育5min终止连接反应，应用Western杂交通过抗泛素抗体anti-Ub（Abcam公司）和抗MBP抗体anti-MBP（AmeriBiopharma）检测。
结果表明在泛素化的反应体系中，泛素、E1、E2和E3（MBP-ZmHUB2）分别按顺序缺失，结果都没有出现泛素条带，只有体系中所有的成分都存在才能出现弥散条带，当用E3突变体（ZmHUB2EC814S）替代E3时，结果也没有弥散的泛素条带（图4）。上述结果说明，在泛素化体系中ZmHUB2具有E3连接酶的功能，而且确定E3连接酶的活性位点为第814位的cys。图4中，“+”表示加入该物质，“-”表示未加入该物质，左图为与抗MBP抗体杂交的结果，右图为与抗泛素抗体的杂交结果；ubiquitin表示泛素。
实施例3、抑制玉米中ZmHUB2的表达缩短转基因玉米的生育期
1、pTCK303-ZmHUB2干扰载体的构建
以玉米自交系综31总RNA反转录得到的cDNA为模板，以5’-GGGGTACCACTAGTATCCTCTGAGAAAGAATACG-3’和5’-GGGGATCCGAGCTCTCATATCTTCACCTCCCTAAC-3’为引物扩增序列1的第2172-2538位核苷酸，通过PCR扩增在ZmHUB2基因C-末端结构域的两端分别加上KpnⅠ/SpeⅠ和SacⅠ/BamHⅠ两对酶切位点，将PCR产物连接在pMD18-Tsimple载体上，送由公司测序。将测序正确的克隆分别用KpnⅠ/BamHⅠ和SpeⅠ/SacⅠ，回收约395bp的条带，带有KpnⅠ/BamHⅠ酶切位点的干扰片段先与干扰载体pTCK303（Zhen Wang,Changbin Chen,Yunyuan Xu,Rongxi Jiang,Ye Han,Zhihong Xu,Kang Chong(2004)A practicalvector for efficient knockdown of gene expression in rice(Oryza sativaL.).Plant Molecular Biology Reporter 22：409-417；公众可从中国农业大学获得）连接，完成中间载体pTCK303-ZmHUB2-F的构建。用KpnⅠ/BamHⅠ双酶切pTCK303-ZmHUB2-F，得到约400bp条带，证明中间载体pTCK303-ZmHUB2-F构建正确。用SpeⅠ/SacⅠ双酶切pTCK303-ZmHUB2-F，回收产物与带有SpeⅠ/SacⅠ酶切位点的干扰片段连接，完成最终载体pTCK303-ZmHUB2的构建（图5）。用SpeⅠ/SacⅠ双酶切鉴定，得到约400bp条带，证明pTCK303-ZmHUB2构建正确（图6）。
2、pTCK303-ZmHUB2干扰载体农杆菌介导法转化玉米
2.1农杆菌感受态细胞的制备
（1）接种根癌农杆菌EHA105单菌落至5mL YEP培养基中，小量摇取220rpm 28℃振荡培养12-16h后，再取2mL菌液转接于100mL YEP液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。
（2）转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清，加入10mL预冷的0.15M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min；
（3）4℃，5000rpm离心5min，去上清，加入4mL预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮；
（4）农杆菌悬浮液分装于无菌1.5mL离心管管中，每管200μL于液氮中速冻1min，冻存于-70℃。
2.2干扰载体转化农杆菌EHA105
（1）取1μg的干扰载体质粒DNA加入到200μL EHA105感受态细胞中，混匀；
（2）液氮中速冻1min，37℃水浴5min，加入1mL YEP液体培养基，28℃150rpm振荡培养4h；
（3）10000rpm离心30sec，弃上清，加入0.1mL YEP液体培养基，重新悬浮细胞；
（4）涂布于含50μg/mL卡那霉素和125μg/mL利福平的YEP固体平板上，28℃培养约48h；
（5）挑取平板上长出的单菌落，得到含有pTCK303-ZmHUB2的重组农杆菌EHA105/pTCK303-ZmHUB2，接种于YEP液体培养液（含50μg/mL Kan和125μg/mL利福平）中，28℃220rpm振荡过夜培养。
2.3农杆菌介导转化玉米与培养
（1）剥取穗子：玉米Hi II杂交种（Bronwyn R.Frame,et al.ImprovedAgrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MSsalts.Plant Cell Rep(2006)25:1024–1034）人工授粉后10-13天，未成熟胚大小为1.5-2mm，取玉米幼穗在超净台上剥去苞叶，切去穗子顶端1cm的部分，浸泡到700mL灭菌溶液（5%（V/V）NaClO，0.1%吐温-20）灭菌消毒30min，灭菌水彻底洗涤3次，时间分别为1min、5min、10min期间不时晃动；
（2）用解剖刀将玉米穗上的头部切去（1-2mm），注意不要削得太深，小铲挑取1mm-1.5mm大小的幼胚，将刚剥离的Hi II玉米植株的幼胚(20-100个)剥取后置于2mL加有预培养培养基（N6培养基+2mg/L 2,4-D+0.7g/L脯氨酸+68.5g/L蔗糖+36g/L葡萄糖，pH 5.2；过滤灭菌后加入乙酰丁香酮至终浓度为100μM）的灭菌离心管中，使幼胚处于易侵染的状态，吸出培养基后，然后加入1-1.5mL农杆菌悬浮液（OD600=0.3-0.4）混匀（上下缓慢倒置20次），然后在黑暗条件下严格静置10min；
（3）把浸染过的幼胚转移到共培养培养基（N6培养基+1.5mg/L 2,4-D+0.7g/L脯氨酸+30g/L葡萄糖+3g/L植物凝胶，pH 5.8；121℃灭菌15min后加入AgNO3至终浓度为0.85mg/L，乙酰丁香酮至终浓度为100mM，半胱胺酸至终浓度为300mg/L），使幼胚的胚轴接触培养基表面（即盾片朝上放置），同时驱除培养基表面多余的农杆菌，用封口膜封住培养皿，在22℃条件下暗培养3d；
（4）培养2-3d后，即农杆菌生长至可见愈伤组织下有少量菌斑时，挑取共培养的幼胚置于无菌三角瓶中，用（含有100mg/L羧苄青霉素）无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中看不到丝状菌体。最后一次清洗时静止1h，让黏附于幼胚上的农杆菌充分扩散到水中。最后，加入含200mg/L的羧苄青霉素的无菌水，静止30-50min，期间振荡几次，倒掉液体，置愈伤组织于无菌滤纸上凉干，然后转移到静息培养基（共培养培养基+100mg/L羧苄青霉素）上，置28℃培养箱内暗培养。
（5）将共培养并用羧苄青霉素清洗的所有幼胚放在静息培养基上，同时用封口膜封住培养皿28℃黑暗条件下恢复培养7d；
（6）将恢复培养后的幼胚（35个幼胚/皿）转到选择培养基I（N6培养基+1.5mg/L2,4-D+0.7g/L脯氨酸+30g/L葡萄糖+3g/L植物凝胶，pH 5.8；121℃灭菌15min后加入AgNO3至终浓度为0.85mg/L，半胱胺酸至终浓度为300mg/L羧苄青霉素至终浓度为100mg/L，潮霉素至终浓度为10mg/L）上28℃继代2次暗培养14d，再转移到新鲜配制的选择培养基II（N6培养基+1.5mg/L 2,4-D+0.7g/L脯氨酸+30g/L葡萄糖+3g/L植物凝胶，pH 5.8；121℃灭菌15min后加入AgNO3至终浓度为0.85mg/L，半胱胺酸至终浓度为300mg/L，羧苄青霉素至终浓度为100mg/L，潮霉素至终浓度为20mg/L）上继续第二次筛选28℃继代2次，暗培养14d至产生明显的愈伤组织；
（7）将抗性愈伤组织转移到预分化培养基（MS培养基+2mg/L 6-BA+2mg/L KT+0.2mg/L NAA+0.2mg/L IAA+0.6g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶，pH 5.8；121℃灭菌15min后加入羧苄青霉素至终浓度为100mg/L，潮霉素至终浓度为20mg/L）上28℃暗培养7-14d，形成胚状体，然后再转移到分化培养基（MS培养基+2mg/L 6-BA+2mg/L KT+0.2mg/L NAA+0.2mg/L IAA+1g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶，pH 5.8，121℃灭菌15min）上继续培养14-28d直到长出完整的叶片和部分根。
（8）将长出的大部分根去掉，只保留主根和叶片，在生根培养基（MS大量元素（20×）25mL，MS微量元素（200×）2.5mL，MS铁盐（200×）5mL，MS有机物（200×）5mL+20g/L蔗糖+3g/L植物凝胶，pH 5.8，121℃灭菌15min）上促进生根，大约14d后即可得到完整的转基因植株，培养条件为26℃光照强度为1000LUX条件下培养。然后进入炼苗阶段，打开封口膜在培养试管中加入无菌水隔绝空气1-2d后，洗掉培养基和须根，直接移栽到花盆中，并用保鲜膜覆盖促进转基因苗的生长，然后移栽到温室或大田里。
结果表明将EHA105/pTCK303-ZmHUB2转化转基因受体Hi II幼胚，然后放到共培养培养基上，在22℃条件下暗培养3d，幼胚经过洗涤后转移到静息培养基上（图7中A），28℃黑暗条件下恢复培养7d后转化体放到含有潮霉素的选择培养基I上，暗培养14d至出现愈伤组织（图7中B）。然后将抗性愈伤组织继代到选择培养基II上继续第二次筛选，28℃暗培养至产生淡黄色、湿润、有光泽、疏松状的的胚性愈伤组织（图7中C）。把胚性愈伤组织转移到预分化培养基上，形成胚状体（图7中D），把胚状体转移到分化培养基上，胚状体逐渐变绿，分化形成叶（图7中E）。待生长出两片叶子后转移到生根培养基上（图7中F）。当幼苗在培养瓶中生出主根后，先把组培瓶口打开，练苗1-2d左右，移栽到小花盆中（图7中G）。当玉米长出2片新叶时，将其移栽到温室或田间（图7中H）。将转基因再生植株（T0）进行自花授粉，收获其T1代种子，将T1代种子播种于试验田中，观察T1代植株生育期性状。
同时按照上述方法将pTCK303转入玉米Hi II得到T0代植株、T1代植株作为空载体对照。
3、转基因玉米后代的筛选
3.1PCR检测
以转pTCK303-ZmHUB2玉米基因组DNA为模板，质粒pTCK303-ZmHUB2为阳性对照，未转化玉米和空载体对照的玉米的基因组DNA为阴性对照，用5’-TGAAAATCTCGAAACAGCCGTGTC-3’和5’-GGTAAGTTACTACAAACCTTTTTG-3’，该引物在干扰载体pTCK303-ZmHUB2的内含子序列：
反应体系：
PCR反应程序为：第一轮：95℃变性5min；第二轮：95℃变性50sec，反应退火温度50℃，50sec，72℃延伸90ses，35个循环；第三轮：72℃延伸10min。反应结束后，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果。
结果表明，在T0代12株抗性转基因植株中有10株扩增出大小为478bp左右条带，与阳性对照条带大小一致，阴性对照（未转化玉米和空载体对照）未扩增出目的条带（图8）。
为了检测是否能够稳定遗传至玉米后代，将转基因再生植株（T0代）进行自花授粉，收获其T1代种子，将T1代种子播种于试验田中，T1代植株自花授粉后收获其T2代种子，目前已经繁殖到T2代。随机挑选三个转pTCK303-ZmHUB2株系，命名为T1、T2和T3，用CTAB法从三个转基因株系T1代的玉米叶片中提取基因组DNA，以相同引物PCR扩增干扰载体pTCK303的内含子，长度为478bp（其序列是序列表中的序列3）。结果表明：三个转基因株系的T1代都可以扩增到目的条带（图9），转基因可以稳定遗传至T2代种子。未转化玉米未扩增出目的条带，空载体对照也得到了478bp的扩增条带。
3.2Real-time PCR检测；
玉米cDNA合成
以完整性好、无污染的RNA为模板，用M-MLV酶（购自TaKaRa生物工程公司）反转录RNA为cDNA，反转录反应体系：
反转录体系：
将上述混合物混匀，短暂离心收集于管底，于70℃温育5min，立即置于冰上5min，再加入以下成分：
轻柔混匀，42℃60min，70℃15min，4℃保温；得到双链cDNA，离心后于-20℃待用。
转基因植株荧光定量PCR检测
以持家基因ubiquitin-9作为内参基因。
1)所用引物
ZmHUB2检测引物：ZmHUB2-qPCR-F：5’-TGGAGGTACAGAAGTCCGAAA-3’，ZmHUB2-qPCR-R：5’-GGAAGGACACGACTCCAAAG-3’；
泛素检测引物：Ubiquitin-F：5’-CCACTTCGACCGCCACTACT-3’，Ubiquitin-R：5’-CGCCTGCTGGTTGTAGACGTA-3’。
2)Real-time PCR反应体系：
Real-time PCR程序：
酶激活95℃30s；扩增反应95℃10s，55℃30s，采集荧光信息，扩增40个循环；95℃10s；溶解曲线65-95℃，采集荧光信息。
3)Real-time PCR产物检测
取10μL PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳，4V/cm条件下电泳30min，EB染色，凝胶图像分析系统记录结果，回收产物，并送公司测序。
4)数据处理
所有的数据通过Bio-Rad CFX Manager进行数据分析处理。
用SDS法提取转pTCK303-ZmHUB2株系T1、T2和T3的T1代植株总RNA，DNaseⅠ消化除去DNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品分子完整性和DNA污染情况，用NanoDrop-1000微量紫外分光光度计测定RNA浓度。取2μg无DNA污染的植物总RNA进行反转录，以反转录产物为模板，用持家基因ubiquitin-9的引物Ubiquitin-F和Ubiquitin-R和玉米ZmHUB2的基因的ZmHUB2-qPCR-F和ZmHUB2-qPCR-R引物进行Real-time PCR对ZmHUB2基因进行表达特征分析（图10）。与对照相比，3个转基因株系中ZmHUB2的相对表达量下降了3-5倍，结果证明ZmHUB2基因的表达被干扰。空载体对照的表达量和未转化玉米相同。
3.3GUS染色检测
（1）GUS染色液的配制如下：
（2）将需要染色的植株浸泡到X-Gluc溶液中37℃黑暗中染色1-24h，直到出现蓝点[如果所染材料特殊不容易着色，可以将材料浸泡到X-Gluc溶液后在真空泵中抽真空30min（时间可以根据具体材料调整）]；
（3）用磷酸缓冲液冲洗一次；
（4）用2%（v/v）甲醛、0.5%（v/v）戊二醛、100mM磷酸缓冲液室温固定50min；
（5）系列浓度乙醇（50%、70%、100%）（v/v）漂洗各5min；
（6）浸泡在75%（v/v）乙醇中脱色，直到将背景颜色脱去。
将T1代转基因株系T1、T2和T3和非转基因玉米的根尖用GUS染色液进行染色，直到出现蓝点，再用不同浓度梯度的乙醇进行脱色，进行观察并拍照（图11）。结果表明与未转化玉米相比，三个转基因玉米株系以及空载体对照中的根尖可以显示蓝色，说明干扰载体pTCK303-ZmHUB2已经成功的转入转基因玉米，GUS基因可以表达。
4、转基因玉米性状分析
2011年5月上旬在中国农业大学上庄试验田播种。5-7月开始调查玉米的开花期，9月中收获的T1代转pTCK303-ZmHUB2玉米（T1、T2、T3、T4和T5株系）果穗，调查株高、果枝数、开花期等农艺性状。采用SPSS17.0统计软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，比较差异显著性。
4.1转基因玉米生育期性状分析
对转基因玉米生长过程中一些重要特征的出现时间进行调查记录。主要生育期划分为播种、出苗期（从播种到种子发芽出土高约2厘米的天数）、三叶期（从播种到玉米第三片叶露出叶心3厘米的天数）、七叶期（从播种到第七片叶从第六片叶叶鞘中露出约2厘米的天数）、抽雄期（从播种到雄穗主轴顶端露出5厘米的天数）、吐丝期（从播种到植雌穗花丝伸出苞叶2厘米长的天数）、乳熟期(从播种到植株果穗中部子粒干重迅速增加并基本建成，胚乳呈乳状后至糊状的天数)和成熟期（从播种到雌穗苞叶变黄而松散，子粒呈现本品种固有形状、颜色，种胚下方尖冠处形成黑色层的天数）。通过单因素方差分析发现与受体玉米相比，转基因玉米的5个株系在玉米的整个生育期都提前了，其中在出苗期、三叶期、吐丝期、乳熟期和成熟期所有株系与受体的差异达极显著（p≤0.01），而在七叶期中的T4和T1株系，抽雄期的T1株系差异达显著（p≤0.05），其它转基因株系达极显著（p≤0.01）（表2）。
表2转基因株系生育期与对照的差异
*：与对照组（CK）相比差异显著（p≤0.05）
**：与对照组（CK）相比差异极显著（p≤0.01）；CK为未转化玉米。
统计分析所有的转pTCK303-ZmHUB2植株和受体材料，结果显示在整个生育期过程中，所有的转基因植株都比受体材料提前，差异达到极显著（p≤0.01），生育期平均提前10天左右（表3，图12中A）。通过对T1代转基因玉米的田间观察可知，与受体材料相比，转pTCK303-ZmHUB2玉米的生育期显著缩短。图12中B反映的是播种75天以后的转pTCK303-ZmHUB2玉米和受体材料的对比情况。
表3转基因株系生育期与对照的差异
RNAi为转pTCK303-ZmHUB2玉米，CK为未转化玉米作为对照。**：与对照组相比差异极显著（p≤0.01）。
实验测定结果表明空载体对照的各个生育时期和未转化玉米无显著差异。
4.2、转基因玉米产量性状分析
统计分析所有的转pTCK303-ZmHUB2植株和受体材料的株高和果穗数，结果转pTCK303-ZmHUB2植株与受体材料相比株高没有显著的差异，但是果穗数确有显著的增加（p≤0.05）（表4）。
表4转基因株系产量性状与对照的差异
RNAi为转pTCK303-ZmHUB2玉米，CK为未转化玉米作为对照。*：与对照组相比差异显著（p≤0.05）。
实验测定结果表明空载体对照的果穗数和未转化玉米无显著差异。
Claims (10)
1.一种蛋白质，是如下a）或b）或c）的蛋白质：
a）由序列表中序列2第754-828位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
c）将序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第754-828位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有下述至少一种活性的由a）衍生的蛋白质：1）泛素连接酶；2）与植物生育期相关。
2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1）或2）或3）或4）所示的基因：
1）其编码序列是序列表中序列1的第2311-2538位核苷酸的DNA分子；
2）其编码序列是序列表中序列1的第52-2538位核苷酸的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
4.下述1）-4）中的任一种生物材料：
1）含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒；
2）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组表达载体；
3）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组微生物；
4）含有权利要求2或3所述核酸分子的转基因细胞系。
5.权利要求1所述蛋白质的应用，其特征在于：所述应用是所述蛋白质作为泛素连接酶和/或所述蛋白质调控植物的生育期。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述调控植物的生育期为调控玉米的生育期；所述玉米的生育期为1）-7）中的至少一种：
1）成熟期；
2）乳熟期；
3）吐丝期；
4）抽雄期；
5）七叶期；
6）三叶期；
7）出苗期。
7.一种培育生育期缩短和/或果穗数增加的转基因玉米的方法，是降低目的玉米中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达，得到生育期短于所述目的玉米和/或果穗数多于所述目的玉米的转基因玉米；所述生育期为1）-7）中的至少一种：
1）成熟期；
2）乳熟期；
3）吐丝期；
4）抽雄期；
5）七叶期；
6）三叶期；
7）出苗期。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述降低目的玉米中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达是通过将如下式I所示的DNA片段导入所述目的玉米中实现的：
SEQ正向-X-SEQ反向
式I；
所述SEQ正向是选自序列表中序列1且包括序列表中序列1第2172-2538位核苷酸所示的DNA片段；
所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；
所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述SEQ正向的核苷酸序列是序列1中第2172-2538位核苷酸。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述式I所示的DNA片段通过重组表达载体pTCK303-ZmHUB2导入所述目的玉米；所述pTCK303-ZmHUB2按照包括如下步骤的方法构建：1）将序列2中第2172-2538位核苷酸的反向互补序列所示的DNA插在载体pTCK303的SpeⅠ和SacⅠ位点间，得到的重组载体记作中间重组载体；2）将序列2中第2172-2538位核苷酸所示的DNA插在所述中间重组载体的KpnⅠ和BamHⅠ位点间，得到重组载体pTCK303-ZmHUB2。
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2012
- 2012-06-11 CN CN201210191216.1A patent/CN103484436B/zh not_active Expired - Fee Related
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