CN109182351A

CN109182351A - 大麦HvALS1基因及其用途

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Publication number: CN109182351A
Application number: CN201811086491.0A
Authority: CN
Inventors: 刘文星; 邬飞波; 曹方彬; 冯雪; 戴华鑫; 张国平
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2018-09-18
Publication date: 2019-01-11
Anticipated expiration: 2038-09-18
Also published as: CN109182351B

Abstract

本发明公开了一种大麦HvALS1基因及其在增强大麦耐铝性中的用途，属于基因工程技术领域。所述大麦HvALS1基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过对大麦HvALS1基因的克隆和分析，结合BSMV‑VIGS基因沉默和农杆菌介导的转基因过表达技术对该基因进行功能验证，BSMV‑VIGS‑HvALS1沉默植株耐铝性减弱，HvALS1转基因过表达植株耐铝性增强，结果表明HvALS1基因与大麦的耐酸铝性密切相关，为大麦耐酸铝育种与生产提供了理论依据和相关基因。

Description

大麦HvALS1基因及其用途

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及大麦HvALS1基因及其在增强大麦耐铝性中的用途。

背景技术

铝是地壳中含量最高的金属元素，占比约8％(Mannello等,2011)。在中性环境下，土壤中的铝主要以硅酸盐或者氧化物的形式存在，这些存在形态对植物无毒害作用，然而，当外部环境pH小于5.5的时候，化合态的铝会逐渐解离成离子态的Al³⁺，而这种离子态的Al³ ⁺对植物的生长是有毒害作用的，它最显著的毒害症状是抑制植物根系的伸长，进而抑制了植物对水分和养分的吸收(Kochian,1995)，从而影响植物整体的生长发育，降低植物产量。因此，Al³⁺被认为是抑制酸性土壤中作物生产最主要的因素之一(Bose等,2010)。

目前，应对酸土毒害最主要的策略是外施石灰来中和土壤酸碱度以及使用耐酸铝品种(Delhaize和Ryan,1995)，但是，外施石灰并不总是能经济有效地解决酸土问题，因此，耐酸铝品种的选育被认为是最经济有效的解决酸土问题的策略(Foy,1988)。尽管目前的基因工程技术给我们选育耐酸铝品种提供了技术支持(Delhaize等,2004)，但是目前鉴定到的耐铝基因还很少，因此，耐酸铝相关基因的鉴定便成了我们培育耐酸铝品种所面临的主要障碍。

为了应对酸铝胁迫，植物自身也形成了许多解毒机制，这其中包括内部的和外部的解毒，在这些机制中，研究的最透彻的就是有机酸的分泌，它能够在根际螯合铝，许多调控有机酸分泌的基因也被鉴定到，比如大麦中的HvAACT1基因(Furukawa等,2007)，小麦中的TmALMT1基因(Sasaki等,2004)等，尽管这些外部解毒机制能螯合大部分的铝，但是仍有一部分具有铝进入到了植物内部，因此，植物还有许多内部解毒机制，但是，目前对大麦的内部铝解毒机制的研究仍少有报道。

大麦(Hordeum vulgare L.)是继玉米、水稻和小麦之后的第四大禾谷类作物，但是大麦对酸铝胁迫极其敏感，这严重限制了大麦在全球许多酸性土壤农业区的种植，因此，我们迫切的需要筛选耐酸铝的种质，挖掘耐酸铝相关基因，以培育耐酸铝大麦品种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从大麦中克隆得到的具有耐酸铝特性的基因，为培育耐酸铝大麦品种提供相关基因及理论基础。

为实现上述目的，本发明提供了大麦HvALS1基因，该基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。大麦HvALS1cDNA来源于青藏高原一年生野生大麦(H.vulgareL.ssp.spontaneum)XZ16、XZ61；栽培大麦Dayton及黄金希望(Golden Promise)。XZ16，本课题组前期筛选到的青藏高原一年生六棱型野生大麦(耐酸(铝)基因型，戴华鑫等，2013)；XZ61，本课题组前期筛选到的青藏高原一年生六棱型野生大麦(酸(铝)敏感基因型)；Dayton，国际公认的耐酸铝栽培大麦品种；GP(Golden Promise，黄金希望)，栽培大麦品种，愈伤组织再生能力相对较强，是目前大麦转基因研究的主要材料。

该基因CDS区全长1935bp，编码一个644aa的蛋白序列，该蛋白分子量为69.4KDa，等电点pI＝8.59。

本发明还提供了该基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

蛋白序列比对结果显示与OsALS1存在91.46％的一致性，与高粱SbABCB25的一致性为91.51％，而与TaABCB25的一致性最高，为99.53％。进化树分析结果显示该蛋白与水稻OsALS1和小麦TaABCB25位于同一进化枝上。因此将该基因命名为HvALS1。

HvALS1蛋白序列功能域预测分析，结果显示该蛋白含有1个功能域：AAA功能域，同时，该基因具有五次跨膜结构。

对照情况下，HvALS1主要在植株的地上部表达，而遭受铝胁迫后，只有植株的根尖部位的表达被显著诱导；对该基因基因进行单独酸、Al、Cd、La的诱导表达，结果显示该基因的表达仅受到Al的诱导，而且在耐铝基因型XZ16中，24小时内该基因表达量随着时间的延长不断增加。

本发明还提供了一种重组质粒BSMV:HvALS1，包括RNAγ载体以及插入RNAγ载体的NheⅠ位点间的目的基因片段，所述目的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明将一个262bp的HvALS1基因片段连入RNAγ载体的NheⅠ位点间，建立BSMV-VIGS体系，成功沉默了XZ16中的HvALS1基因。

本发明利用BSMV-VIGS方法在野生大麦XZ16上验证HvALS1基因功能，结果显示，沉默后大麦的耐铝性显著降低，表现为，与模拟接种BSMV:γ的植株相比，接种BSMV:HvALS1的植株铝处理后根系的再伸长量显著降低，主根根尖部分受到的损伤更加严重，此外，接种BSMV:HvALS1的植株铝处理后根系的铝含量显著提高且桑色素染色结果显示细胞质中的铝荧光强度也显著提高。

本发明提供了一种重组表达载体，包括原始载体和插入所述原始载体的目标基因，所述目标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

重组表达载体的构建可采用常规方法，如可采用Gateway系统将HvALS1基因连入表达载体中。所述原始载体为pBract214载体。

本发明还提供了一种包含所述的重组表达载体的重组转化子。宿主菌为农杆菌AGL1。

本发明研究表明HvALS1基因过表达增强了大麦的耐铝性，表现为：铝胁迫后，过表达株系的根系再伸长量显著增加，根系的干重也显著增加，同时两个过表达株系细胞质内的铝荧光强度显著降低，表明过表达后分布在细胞质中的铝显著降低，这从另外一方面说明了该基因与大麦耐铝性有重要的关系。这些结果说明该基因过表达后使大麦对酸铝的耐受性显著增强。

本发明具备的有益效果：

本发明通过对大麦HvALS1基因的克隆和分析，结合BSMV-VIGS基因沉默和农杆菌介导的过表达对该基因进行功能验证，BSMV:HvALS1转基因植株耐铝性减弱，HvALS1过表达转基因植株耐铝性增强，表明HvALS1基因与大麦的耐酸铝性密切相关。本发明为大麦耐酸铝育种与生产提供了理论依据和相关基因。

附图说明

图1为HvALS1功能域预测图(A)及HvALS1与水稻、玉米、小麦三个物种的ABCB家族基因的进化树分析(B)。

图2为HvALS1与水稻OsABCB25、小麦TaABCB25、玉米ZmABCB10氨基酸序列对比。

图3为HvALS1基因的表达模式。(A)铝处理和正常条件下的HvALS1基因的组织定位；(B)HvALS1基因在不同条件下的诱导表达；(C)HvALS1基因在基因型XZ16中的时空表达；(D)在基因型XZ16中接种BSMV:HvALS1后的基因表达。

图4为BSMV:HvALS1载体构建图、线性化图和体外转录图。(A)BSMV:HvALS1载体构建示意图；(B)RNAγ:HvALS1酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；(C)RNAγ:HvALS1线性化琼脂糖凝胶电泳图；(D)RNAγ:HvALS1体外转录琼脂糖凝胶电泳图；其中1是RNAγ:HvALS1，2是RNAγ:HvALS1经MluI酶切，3是RNAγ:HvALS1经NheI酶切，箭头所指为从载体上酶切下来的HvALS1基因片段，4是RNAα经MluI酶切，5是RNAβ经SpeI酶切，6是RNAγ经MluI酶切，7是RNAγ:HvALS1经MluI酶切，8是体外转录的RNAα，9是体外转录的RNAβ，10是体外转录的RNAγ，11是体外转录的RNAγ:HvALS1。M1是15000bp DNA marker，M2是2000bp DNA marker。

图5为利用BSMV-VIGS方法沉默HvALS1后铝胁迫对植株根系生长的影响。A图表示沉默HvALS1后根系相对伸长的变化；B图表示沉默HvALS1后根系干重的变化；C图表示沉默HvALS1后影响根系生长的照片；D图表示沉默HvALS1后根系形态变化的照片。

图6为利用BSMV-VIGS方法沉默HvALS1后铝胁迫对植株铝含量及铝在细胞内分布的影响。A图表示沉默HvALS1后根系铝含量的变化；B图表示沉默HvALS1后地上部铝含量的变化；C图表示沉默HvALS1后根系桑色素染色结果；D图表示沉默HvALS1后根系桑色素染色荧光强度的变化。

图7为HvALS1过表达对植株耐铝性的影响。A图是过表达植株中HvALS1的表达量的变化；B图是过表达植株铝胁迫后根系再伸长的变化；C图是铝胁迫对过表达植株生长的影响。

图8为HvALS1过表达对植株根系干重、铝含量及其分布的影响。A图是HvALS1过表达后植株根系干重的变化；B图是HvALS1过表达后植株根系铝含量的变化；C，D是HvALS1过表达后植株根系桑色素染色及荧光强度的变化。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明克隆和分析调控大麦耐铝性的关键基因，对阐明大麦响应酸铝胁迫的分子机理和大麦耐酸铝的育种及生产工作具有重要的指导意义。

实施例1

HvALS1基因CDS区和启动子序列的克隆和分析

1、HvALS1基因CDS区序列的克隆

基于课题组前期研究，从根部基因芯片结构中挑选出一个铝胁迫条件下在耐铝基因型(XZ16)和铝敏感基因型(XZ61)中的差异表达基因，在耐铝基因型中高表达的ABC家族基因，从XZ16中克隆了该基因的全长CDS区序列(如SEQ ID NO.1所示)，将其命名为HvALS1。

使用总RNA提取试剂盒(Takara，日本)提取青藏高原一年生野生大麦XZ16根部总RNA，并用DNaseI(Takara，日本)去除总RNA中基因组DNA污染，用PrimeScripffM II 1stStrand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(Takara，日本)将提取的总RNA反转录成单链的cDNA。根据Blast到的序列进行特异性引物设计，具体引物序列为：

HvALS1-CDS-F：5'-ATGGTGAGGGAGCTGCGCAT-3'(SEQ ID No：4)；

HvALS1-CDS-R：5'-CTATTGGCCATTACTGCTGGGT-3'(SEQ ID No：5)。

将扩增出来的产物，连接到pMD18-T(Takara，日本)载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆送公司测序，测序正确的分别进行提质粒和甘油保存，所得质粒命名为pMD18-T-HvALS1质粒。PCR引物合成工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，基因测序工作由上海铂尚生物技术有限公司完成。

2、HvALS1基因序列分析

将HvALS1蛋白序列通过SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)网站进行功能域的预测和分析，结果如图1所示。随后将HvALS1蛋白序列通过InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)网站进行功能域预测分析，结果显示该蛋白与ATP酶活性以及物质的跨膜运输所偶联。

通过Clustal W和MEGA 6软件将包含了HvALS1的序列和水稻OsALS1(UniProtKB:Q9FNU2.1)、拟南芥AtALS1(GenBank:ABG37923.1)、小麦TaABCB25(GeneBank:AIE39900.1)和高粱SbABCB25(NCBI Reference Sequence:XP_002466435.1)的蛋白序列进行比对，结果如图2所示。

3、HvALS1基因的铝诱导表达情况

青藏高原一年生野生大麦XZ16种子用2％的H₂O₂消毒30min，蒸馏水冲洗干净，之后将种子置于发芽盒内于生长室中暗培养(22℃/18℃)直至萌发，萌发之后补光(22℃/18℃)。5天后选取长势一致的幼苗转移至1L的黑色塑料桶中，每桶4个孔，每孔两株幼苗，用海绵固定，桶中盛有基本培养液且通气，基本培养液使用1/5Hogland营养液配方，培养液的pH用NaOH或HCl调至5.8±0.1，3天后用pH 4.3的基本营养液预处理1天，之后进行铝处理，设置两个处理，(1)对照(pH 4.3的基本培养液)；(2)铝处理(pH 4.3基本培养液+200μMAlCl₃)，24小时后分别取根尖(0-1cm)、根基部(2-4cm)、茎、叶进行HvALS1组织定位及铝诱导表达分析，同样的处理条件分别于处理后0、1、3、6、12、24小时取根尖0-1cm进行HvALS1的时空表达分析。

RT-PCR检测HvALS1基因的表达量

用总RNA提取试剂盒(Takara，日本)分别提取不同处理样本的总RNA，并用DNaseI去除总RNA中基因组DNA污染，用PrimeScript^TMRT reagent Kit反转录试剂盒(Takara，日本)将各样本总RNA分别反转录成单链cDNA。用SYBR绿色荧光酶复合物(Takara，日本)和Light Cycler 480PCR仪(Roche，瑞士)对相应样本中HvALS1基因的表达进行荧光定量PCR分析(qRT-PCR)，并用一个内参基因Actin对表达值进行矫正处理。

PCR体系为：

PCR的具体程序为：95℃30s，(95℃5s，60℃30s)40个循环。溶解曲线程序为：95℃5s，60℃1min，95℃，50℃30s降温。利用2^-ΔΔCq相对定量方法计算基因表达值变化。每组实验重复三次。RT-PCR引物序列为：

HvALS1-RT-PCR-F：5'-CATCAGGTGCAAGCCGTAGA-3'(SEQ ID No：6)；

HvALS1-RT-PCR-R：5'-TGCAAACCAGACATCGTCCA-3'(SEQ ID No：7)；

Actin-F：5'-TGGCTGACGGTGAGGACA-3'(SEQ ID No：8)；

Actin-R：5'-CGAGGGCGACCAACTATG-3'(SEQ ID No：9)。

如图3所示，通过qRT-PCR的结果显示，对照情况下，HvALS1基因主要在大麦的地上部表达，但是铝胁迫下，该基因只有根尖部分的表达显著上调，同时在XZ16中，24小时内该基因表达量随着时间的延长而不断增加，沉默后，不论是对照还是铝胁迫情况下，该基因的表达均显著受到抑制。

实施例2

BSMV-VIGS方法验证HvALS1基因功能

1、BSMV:HvALS1载体构建

使用总RNA提取试剂盒(Takara，日本)提取XZ16根部总RNA，并用DNaseI(Takara，日本)去除总RNA中基因组DNA污染，用PrimeScript^TMII 1st Strand cDNASynthesis Kit反转录试剂盒(Takara，日本)将总RNA反转录成cDNA。根据Blast结果设计引物，扩增得到一个262bp的HvALS1基因片段。

KOD酶PCR反应体系：

扩增程序为：94℃5min，(98℃10s，58℃30s，68℃30s)35个循环，68℃10min。

引物序列为(下划线为酶切位点)：

HvALS1-γ-F：5'-GTACGCTAGCCAAAACATGACGCCGGGAAG-3'(SEQ ID No：10)；

HvALS1-γ-R：5'-GTACGCTAGCCGAGCAACGACTCTCTCACT-3'(SEQ ID No：11)。

将HvALS1基因片段连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆送往公司测序，测序正确的单克隆摇菌，提取质粒。用NheⅠ限制性内切酶将质粒上的HvALS1基因片段切下，然后与经过同样限制酶内切酶酶切并且去磷酸化的RNAγ载体用T4连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，用HvALS1基因的正向引物HvALS1-γ-F和RNAγ载体上的引物γ-stain-F验证反向插入，将验证的反向插入的阳性克隆送公司测序，测序正确的单克隆进行摇菌提质粒并进行酶切再次验证(图4(B))，所得的质粒是RNAγ:HvALS1。

所用的RNAγ载体上的引物序列为：

γ-stain-F：5'-CAACTGCCAATCGTGAGTAGG-3'(SEQ ID No：12)。

PCR引物合成工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，基因测序工作由上海铂尚生物技术有限公司完成。

2、BSMV载体线性化和体外转录

RNAα、RNAγ和RNAγ:HvALS1用MluⅠ限制性内切酶单酶切，同时RNAβ用SpeⅠ限制性内切酶单酶切，分别使其线性化，酶切产物跑胶，胶回收并纯化产物(图4(C))。将纯化后的RNAα、RNAβ、RNAγ和RNAγ:HvALS1线性化产物用RiboMAX^TM LargeScale RNA ProductionSystem-T7kit和Ribo m⁷G Cap Analog kit试剂盒进行体外转录(Promega，美国)，确保所有的操作环境没有RNase的干扰，完成之后跑胶验证(图4(D))。

将体外转录后的RNAα、RNAβ和RNAγ质粒按照1:1:1的体积比进行混合，将体外转录后的RNAα、RNAβ和RNAγ:HvALS1质粒按照1:1:1的体积比进行混合，分别加入三倍体积的RNase-free水进行稀释，随后在稀释产物中加入等体积的2×GKP缓冲液(1％膨润土、1％硅藻土、50mM甘氨酸和30mM磷酸氢二钾pH 9.2)，所得产物命名为BSMV:γ和BSMV:HvALS1，混匀之后用于的接种。

3、BSMV接种前大麦幼苗培养

青藏高原一年生野生大麦XZ16用2％的H₂O₂消毒30min，蒸馏水冲洗干净，之后将种子置于发芽盒内于生长室中暗培养(22℃/18℃)直至萌发，萌发之后补光(22℃/18℃)。5天后选取长势一致的幼苗转移至1L的黑色塑料桶中，每桶4个孔，每孔两株幼苗，用海绵固定，桶中盛有基本培养液且持续通气，基本培养液使用1/5Hogland营养液配方。每3天更换一次培养液，营养液的pH用NaOH或HCl调至5.8±0.1。

4、BSMV接种验证基因功能

当大麦幼苗生长至两叶一心期后，在RNase-free环境下对第二叶进行BSMV摩擦接种，每个植株使用8μL之前混合均匀的BSMV:γ或BSMV:HvALS1。接种后的植株立即喷施少量的DEPC水，并用透明的塑料罩罩住植株保湿3天，之后将玻璃罩取掉，在大麦生长培养室中继续培养(22℃/18℃)，定时观察植株的表型。

实验共设4个处理：(1)接种BSMV:γ并在基本培养液(BNS)中生长14天；(2)种BSMV:γ并在基本培养液(BNS)中生长7天，再进行200μM铝处理7天；(3)接种BSMV:HvALS1并在基本培养液(BNS)中生长14天；(4)接种BSMV:HvALS1并在基本培养液(BNS)中生长7天，再进行200μM铝处理7天。每个处理5个重复，每个重复6个植株。于第7天铝处理开始时对各个处理的根系长度进行测定，铝处理7天后再次测定根长并观察各处理主根根尖的生长情况以及植株的铝含量和分布情况。

结果显示，与模拟接种BSMV:γ的植株相比，接种BSMV:HvALS1的植株铝处理后根系的再伸长量显著降低，主根根尖部分受到的损伤更加严重(图5)，此外，接种BSMV:HvALS1的植株铝处理后根系的铝含量显著提高且桑色素染色结果显示细胞质中的铝荧光强度也显著提高(图6)，这些结果表明，HvALS1基因沉默后的XZ16植株的耐铝性显著降低。

5、RT-PCR验证HvALS1基因的表达量

参照实施例1第3部分的步骤进行RT-PCR检测。

如图3(D)所示，对于接种BSMV:HvALS1的植株来说，无论是在对照还是铝处理条件下，与未接种的XZ16植株相比，根系中HvALS1基因的表达量分别被抑制了47％和87％。

综上所述，通过对大麦HvALS1的克隆和分析，并结合BSMV-VIGS技术在青藏高原一年生野生大麦XZ16上对该基因进行功能验证发现，HvALS1基因与铝胁迫条件下XZ16的Al低积累密切相关，对XZ16的耐铝性发挥重要作用。

实施例3

HvALS1基因过表达

1、过表达载体的构建

本实验构建过表达载体的方法为Gateway。提取大麦品种黄金希望(GoldenPromise)的总RNA，将其反转录成cDNA，设计关于HvALS1基因的过表达载体引物，以cDNA为模板进行目的基因的扩增。经序列比对，黄金希望(Golden Promise)HvALS1基因的CDS序列与XZ16一致。

其中HvALS1基因的过表达引物扩增1935bp的目的片段引物序列如下：

AttB-F-Overexpression-HvALS1:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGTGAGGGAGCTGCGC(SEQ ID No：13)；

AttB-R-Overexpression-HvALS1:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTATTGGCCATTACTGCTGG(SEQ ID No：14)。

将PCR扩增的产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测条带位置，对目标基因进行胶回收纯化，测量回收产物浓度。随后进行BP重组反应，将已知浓度的基因回收产物按下表所述进行BP反应。

BP反应体系：

attB-PCR product up to 10μl

pDONRZeo载体 150ng

BP ClonaseⅡEnzyme Mix 2μl。

25℃反应至少1h，加入1μl的Proteinase K，37℃继续反应10min，反应产物立即转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布博来霉素抗性的LB平板，37℃培养16h左右，挑取单克隆，摇菌进行菌液PCR，将有目的条带的菌液送往公司测序，测序正确的单克隆进行扩繁，菌液甘油保存和提质粒保存，质粒命名分别为pDONRZeo-Overexpression-HvALS1。将上述已知浓度的质粒按照下表进行LR反应(pBract214载体为过表达载体)。

LR反应体系：

pDONRZeo-gene载体 up to 10μl

Destination载体(pBract214) 150ng

LRClonaseⅡEnzyme Mix 2μl。

25℃反应至少1h，加入1μl的Proteinase K，37℃继续反应10min，反应产物立即转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素抗性的LB平板，37℃培养16h左右，挑取单克隆，摇菌进行菌液PCR，将有目的条带的菌液送往公司测序，测序正确的单克隆进行扩繁，菌液甘油保存和提质粒保存，质粒命名为pBract214-HvALS1。将测序正确的质粒转化农杆菌感受态细胞，涂布利福平+卡那霉素抗性的YEB平板，28℃培养40-48h左右，PCR验证阳性克隆，阳性克隆进行扩繁，-80℃保存备用。

2、大麦幼胚遗传转化

2.1大麦幼胚的选取

大麦遗传转化以黄金希望(olden Promise)胚为外植体，一般在大麦开花2-3周后收获籽粒，当幼胚直径在1.5-2mm时收获穗。

2.2幼胚分离及消毒

选取符合标准的未成熟幼胚种子，将其从穗上剥离，去除芒，种子用70％酒精表面消毒30s，用灭菌水洗涤数次。用50％(v/v)次氯酸钠(0％)置4min，用灭菌水洗涤数次。在无菌滤纸上，进行未成熟胚的分离，分离以后，放入培养基中培养1-2d。

2.3农杆菌侵染和共培养

将标准管菌液加入到10mL MG培养液中，不加抗生素，在28℃过夜培养20h，180rpm，用于侵染。将准备好的农杆菌侵染液滴加在每一个幼胚上，晾干。用封口膜封住平板，共培养3d。

2.4选择培养

3d共培养后，将幼胚转移到新鲜的培养基平板上，加50mg/L潮霉素和160mg/L特泯菌以除去多余农杆菌，23-24℃暗培养2周。更换新鲜培养基，将幼胚和愈伤一起转移，再2周后更换新鲜的培养基，此时去除幼胚，将单个幼胚的愈伤组织留在一起，在培养基培养6周后，将由幼胚分离得到的愈伤组织转移到培养基，在24℃弱光下，培养2周，此时将产生绿点。

2.5转基因植株再生

在培养基中继续培养，当地上部叶子达到2-3cm时，根开始建成，将小苗转移到玻璃管中，不添加任何生长调节剂，抗生素不变。此时根系变得强壮，用镊子将根系建成的小苗从试管中移除，洗掉培养基，然后在含基质的小盆中生长。

3、转基因植株的验证

选取转基因植株叶片，提取DNA，验证是否转入HvALS1基因，对转基因成功的植株提取总RNA并反转录，进行HvALS1基因的表达量的验证。验证引物为：

pBract-F：GCATATGCAGCAGCTATATGTG(SEQ ID No：15)；

erexpression-HvALS1-R：CCCGGTCACAACTATCAGCA(SEQ ID No：16)。

结果显示，两个转基因株系的HvALS1基因的表达量显著提高，分别是GP的3.13倍和2.61倍。

4、验证成功的植株，发芽2天后，用50mM的pH 4.3的CaCl₂预处理24h后，进行200μMAlCl₃处理3天(pH 4.3+200μM AlCl₃)，处理前后分别对植株的根长进行测定，处理完成后取样分析植株根系干重、铝含量及分布。结果(图7、8)显示，铝胁迫后，过表达株系OX1和OX2的根系相对伸长量分别是对照的2.75倍和2.51倍，根系的干重分别是对照的2.18和2.29倍，说明过表达株系OX1和OX2的耐铝性显著增强，虽然过表达株系的根系铝含量没有显著变化，但是桑色素染色结果显示，两个过表达株系的铝荧光强度分别只有对照的60.8％和62.9％，表明过表达后分布在细胞质中的铝显著降低，这从另外一方面说明了该基因在大麦耐铝性中的重要作用。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 大麦HvALS1基因及其用途

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1935

<212> DNA

<213> 青藏高原一年生野生大麦XZ16(Hordeum vulgare L. ssp. spontaneum)

<400> 1

atggtgaggg agctgcgcat caacaccgcg ccccgcggca accgcgtccc gctcctcaac 60

aacggggaga cgtccaggat cctctccgac ctcgaggagg gcagcaacgt ccaggcggcc 120

aacgtcggct tctgccgggt catcaagttg gcaaaacatg acgccgggaa gctcgtcttc 180

gccaccatcg cgctgctcgt cgcctctctc agtaacctcc tcgttcccaa atatggcggc 240

aagataattg atattgtgtc aagagatgtt cagcggccag aggataaggc tcaagccctg 300

gcggatgtga acggcacgat attgtacatc gtgctgatag ttgtgaccgg gtcagtttgc 360

acagctcttc gggcatggct attcaattct gctagtgaga gagtcgttgc tcgacttaga 420

caggacttgt tcagtcatct cataaaccag gaaatagcat tttttgacgt gactagaaca 480

ggagagctct taagcaggct ttctgaagat acccaaatta taaagaatgc tgcaacaaca 540

aacctttcag aagcactgcg taatctgact accacagcta ttggtcttgg cttcatgttt 600

tcaacttcat ggaagctgac attgttggca cttgtaattg ttccagtgat atcagttgct 660

gtgcgtaaat ttgggcgttt tcttcgtgag ctttcacatc agacacaagc tgcggctgct 720

gtagcttcat ccatagctga ggaatctttt ggtgccattc gcacagtaag agcctttgct 780

caggagcctc atgagatttc acgatatggc ggaaaagtaa acgagacact gaagcttggt 840

ctcaagcaag ctaaagttgt tggactattt tctggagggc ttaatgctgc atcaaccctg 900

tcggttgttg ttgtagttat ttatggagct aacttaacca tcaatggtta catgacaact 960

ggttcgctta cgtcattcat cttatacagc cttacagttg gctcgtcagt ctctgccttg 1020

tcaggactat acacaactgt aatgaaagca tcaggtgcaa gccgtagagt ttttcaacta 1080

cttgatcgtg tttcctcaat gacaaacact ggggacaaat gtccgaaaaa tgaaaatgag 1140

ggggaagttg agctggacga tgtctggttt gcatatcctt cgcgtccttc tcatatgatt 1200

cttaagggaa tcacattgaa gctagcacca ggttcaaagg ttgcacttgt tgggccgagt 1260

ggtggtggaa aaactacaat agcaaatttg atcgaaaggt tttatgaccc tctaaaggga 1320

aggatcttgc taaacggagt gcctttggta gaaatttcac atcagtatct ccaccaaaag 1380

gtaagcatag ttagccagga gcctacactc tttaactgct ccattgaaga gaatattgcc 1440

tatgggttgg agggcaaagc tagctccgct gacgttgaaa atgcagctaa aatggcaaac 1500

gcgcatgact tcatatgcag cttcccagac caatacaaga ctgtcgtggg agagcggggc 1560

atcaggttat ctggcgggca gaagcagagg gtcgccattg caagagcttt gcttatgaac 1620

ccacgagtgc ttctcttaga tgaagctacc agtgccctgg atgccgaaag cgaatacctt 1680

gttcaggatg caatggactc gttgatgaaa gggaggacgg ttcttgtgat agctcatcgg 1740

ctctccaccg tgaagagcgc cgacacggtt gccgtcatct ctgagggcca gatcgtggag 1800

agcggcacgc acgacgagct cctcgagcgc gacggcatct acacggccct ggtgaagagg 1860

cagctgcagt tgcccaagtt tgaagggacc gccaacggga cagccgaagt agaacccagc 1920

agtaatggcc aatag 1935

<210> 2

<211> 644

<212> PRT

<213> 青藏高原一年生野生大麦XZ16(Hordeum vulgare L. ssp. spontaneum)

<400> 2

Met Val Arg Glu Leu Arg Ile Asn Thr Ala Pro Arg Gly Asn Arg Val

1 5 10 15

Pro Leu Leu Asn Asn Gly Glu Thr Ser Arg Ile Leu Ser Asp Leu Glu

20 25 30

Glu Gly Ser Asn Val Gln Ala Ala Asn Val Gly Phe Cys Arg Val Ile

35 40 45

Lys Leu Ala Lys His Asp Ala Gly Lys Leu Val Phe Ala Thr Ile Ala

50 55 60

Leu Leu Val Ala Ser Leu Ser Asn Leu Leu Val Pro Lys Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Lys Ile Ile Asp Ile Val Ser Arg Asp Val Gln Arg Pro Glu Asp Lys

85 90 95

Ala Gln Ala Leu Ala Asp Val Asn Gly Thr Ile Leu Tyr Ile Val Leu

100 105 110

Ile Val Val Thr Gly Ser Val Cys Thr Ala Leu Arg Ala Trp Leu Phe

115 120 125

Asn Ser Ala Ser Glu Arg Val Val Ala Arg Leu Arg Gln Asp Leu Phe

130 135 140

Ser His Leu Ile Asn Gln Glu Ile Ala Phe Phe Asp Val Thr Arg Thr

145 150 155 160

Gly Glu Leu Leu Ser Arg Leu Ser Glu Asp Thr Gln Ile Ile Lys Asn

165 170 175

Ala Ala Thr Thr Asn Leu Ser Glu Ala Leu Arg Asn Leu Thr Thr Thr

180 185 190

Ala Ile Gly Leu Gly Phe Met Phe Ser Thr Ser Trp Lys Leu Thr Leu

195 200 205

Leu Ala Leu Val Ile Val Pro Val Ile Ser Val Ala Val Arg Lys Phe

210 215 220

Gly Arg Phe Leu Arg Glu Leu Ser His Gln Thr Gln Ala Ala Ala Ala

225 230 235 240

Val Ala Ser Ser Ile Ala Glu Glu Ser Phe Gly Ala Ile Arg Thr Val

245 250 255

Arg Ala Phe Ala Gln Glu Pro His Glu Ile Ser Arg Tyr Gly Gly Lys

260 265 270

Val Asn Glu Thr Leu Lys Leu Gly Leu Lys Gln Ala Lys Val Val Gly

275 280 285

Leu Phe Ser Gly Gly Leu Asn Ala Ala Ser Thr Leu Ser Val Val Val

290 295 300

Val Val Ile Tyr Gly Ala Asn Leu Thr Ile Asn Gly Tyr Met Thr Thr

305 310 315 320

Gly Ser Leu Thr Ser Phe Ile Leu Tyr Ser Leu Thr Val Gly Ser Ser

325 330 335

Val Ser Ala Leu Ser Gly Leu Tyr Thr Thr Val Met Lys Ala Ser Gly

340 345 350

Ala Ser Arg Arg Val Phe Gln Leu Leu Asp Arg Val Ser Ser Met Thr

355 360 365

Asn Thr Gly Asp Lys Cys Pro Lys Asn Glu Asn Glu Gly Glu Val Glu

370 375 380

Leu Asp Asp Val Trp Phe Ala Tyr Pro Ser Arg Pro Ser His Met Ile

385 390 395 400

Leu Lys Gly Ile Thr Leu Lys Leu Ala Pro Gly Ser Lys Val Ala Leu

405 410 415

Val Gly Pro Ser Gly Gly Gly Lys Thr Thr Ile Ala Asn Leu Ile Glu

420 425 430

Arg Phe Tyr Asp Pro Leu Lys Gly Arg Ile Leu Leu Asn Gly Val Pro

435 440 445

Leu Val Glu Ile Ser His Gln Tyr Leu His Gln Lys Val Ser Ile Val

450 455 460

Ser Gln Glu Pro Thr Leu Phe Asn Cys Ser Ile Glu Glu Asn Ile Ala

465 470 475 480

Tyr Gly Leu Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Asp Val Glu Asn Ala Ala

485 490 495

Lys Met Ala Asn Ala His Asp Phe Ile Cys Ser Phe Pro Asp Gln Tyr

500 505 510

Lys Thr Val Val Gly Glu Arg Gly Ile Arg Leu Ser Gly Gly Gln Lys

515 520 525

Gln Arg Val Ala Ile Ala Arg Ala Leu Leu Met Asn Pro Arg Val Leu

530 535 540

Leu Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ala Leu Asp Ala Glu Ser Glu Tyr Leu

545 550 555 560

Val Gln Asp Ala Met Asp Ser Leu Met Lys Gly Arg Thr Val Leu Val

565 570 575

Ile Ala His Arg Leu Ser Thr Val Lys Ser Ala Asp Thr Val Ala Val

580 585 590

Ile Ser Glu Gly Gln Ile Val Glu Ser Gly Thr His Asp Glu Leu Leu

595 600 605

Glu Arg Asp Gly Ile Tyr Thr Ala Leu Val Lys Arg Gln Leu Gln Leu

610 615 620

Pro Lys Phe Glu Gly Thr Ala Asn Gly Thr Ala Glu Val Glu Pro Ser

625 630 635 640

Ser Asn Gly Gln

<210> 3

<211> 262

<212> DNA

<213> 青藏高原一年生野生大麦XZ16(Hordeum vulgare L. ssp. spontaneum)

<400> 3

caaaacatga cgccgggaag ctcgtcttcg ccaccatcgc gctgctcgtc gcctctctca 60

gtaacctcct cgttcccaaa tatggcggca agataattga tattgtgtca agagatgttc 120

agcggccaga ggataaggct caagccctgg cggatgtgaa cggcacgata ttgtacatcg 180

tgctgatagt tgtgaccggg tcagtttgca cagctcttcg ggcatggcta ttcaattctg 240

ctagtgagag agtcgttgct cg 262

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggtgaggg agctgcgcat 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctattggcca ttactgctgg gt 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catcaggtgc aagccgtaga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgcaaaccag acatcgtcca 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tggctgacgg tgaggaca 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgagggcgac caactatg 18

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtacgctagc caaaacatga cgccgggaag 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtacgctagc cgagcaacga ctctctcact 30

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caactgccaa tcgtgagtag g 21

<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aatggtgagg gagctgcgc 49

<210> 14

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tattggccat tactgctgg 49

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcatatgcag cagctatatg tg 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cccggtcaca actatcagca 20

Claims

1.大麦HvALS1基因，其特征在于，该基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的大麦HvALS1基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.重组质粒BSMV:HvALS1，其特征在于，包括RNAγ载体以及插入RNAγ载体的NheⅠ位点间的目的基因片段，所述目的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种重组表达载体，包括原始载体和插入所述原始载体的目标基因，其特征在于，所述目标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.如权利要求1所述的大麦HvALS1基因在增强大麦耐铝性中的用途，其特征在于，该基因受酸铝胁迫诱导，提高大麦的耐铝性。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，BSMV:HvALS1沉默植株耐铝性减弱，HvALS1转基因过表达植株耐铝性增强。