CN104093844B - Grf3突变体、方法和植物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新的修饰基因rGRF3或其直向同源物，所述基因或其直向同源物显示脱离miR396控制，特别在存在至少一个GIF基因如GIF1、AtGIF2、AtGIF3、Os11g40100、Os12g31350、Os03g52320或其组合过量表达的情况下。在植物中存在时，GRF3导致生产率增加的表型(例如增加的产量、增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的种子产生、增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度、延迟的叶衰老或增加的耐旱性及它们的组合)。

Description

GRF3突变体、方法和植物

技术领域

通过向植物中引入GRF3生长因子中或在GRF3直向同源物中的突变而显示改善的生产率和/或产量表型和/或增加的耐旱性的植物，所述突变体解除miR396对GRF3或GRF3直向同源物的控制(任选地与至少一个GIF基因的过量表达组合)。

背景技术

与动物相比，植物在它们的整个生命周期期间持续产生新器官。地上部分器官源自苗顶端分生组织(SAM)，所述苗顶端分生组织包含存在于植物生长锥的干细胞池。正在增殖的SAM细胞产生过量子代细胞，所述子代细胞并入SAM周界处正在发育的叶原基中或变成苗的一部分。控制植物中以及在其他真核生物中细胞周期进展的核心装置依赖于细胞周期蛋白依赖性激酶的活性(Inze和De Veylder，2006)。细胞周期调节的许多方面在真核生物之间是高度保守的。然而，正是基本细胞周期机制与发育程序的整合(一个知之甚少的过程)在多细胞生物之间产生无数表型变异(Inze和De Veylder，2006)。

与拟南芥(Arabidopsis thaliana)中不确定的SAM相反，叶是具有明确形态的确定器官。叶发育涉及各种激素信号传导途径和转录因子网络的协同作用。参与叶中细胞增殖控制的一些主要转录调节物包括AINTEGUMENTA(Mizukami和Fischer,2000)、PEAPOD(White,2006)、JAGGED(Dinneny等人,2004；Ohno等人,2004)、茎上的叶片(Ha等人,2003)、TCPs(Nath等人,2003)和生长调节因子(GRF)(Kim等人,2003)。

为了获得其特征性最终尺寸和形状，正在发育的叶的生长需要首先通过细胞增殖并且随后通过细胞扩张得到密切协调(Piazza等人，2005；Tsukaya，2006)。最初，在整个正在发育的叶范围内观察到细胞增殖(Donnelly等人，1999)。随后，细胞周期在叶尖处停止并且有丝分裂阻滞线移向器官基部(Donnelly等人，1999)。一旦细胞停止分裂，它们开始扩膨大并且细胞生长变成调节器官尺寸的驱动力(Piazza等人，2005；Tsukaya，2006)。

目前，对在整个正在发育的叶范围内协调细胞增殖的分子机制知之甚少。一种已知调节物是TCP基因CINCINNATA(CIN)，其控制金鱼草中有丝分裂阻滞线的推进(Nath等人， 2003)。突变如cin(Nath等人，2003)及其拟南芥(Arabidopsis)同源物tcp2/4/10的三重敲除(Schommer等人，2008)造成叶形态发生的变化和不均匀的器官曲率，原因在于叶缘处细胞过度增殖。有趣地，5种拟南芥TCP(TCP2、3、4、10和24)以及CIN具有微RNA(miRNA)miR319的靶位点(Palatnik等人，2003)。miR319的过量表达造成这些TCP降解和产生卷缩叶，类似于tcp功能丧失突变体中观察到的那些(Palatnik等人，2003)。TCP的靶位点中削弱与该miRNA相互作用的突变影响拟南芥中的叶形态(Palatnik等人，2003；Palatnik等人，2007)和番茄中的叶复杂性(Ori等人，2007)，并且在极端情况下是致死的(Palatnik等人，2003)。

转录因子GRF家族在拟南芥中包含9个成员(Kim等人，2003)。它们中7个具有miR396的靶位点(Jones-Rhoades和Bartel，2004)。已经显示不同GRF中的功能丧失型突变或降低GRF水平的miR396过量表达减少拟南芥叶中的细胞数目(Horiguchi等人，2005；Kim 等人，2003；Kim和Kende，2004；Liu等人,2003)。GRF与GRF相互作用因子(GIF，一个编码与人SYT转录辅助激活物同源的蛋白质的小基因家族)一起发挥作用(Horiguchi等人，2005；Kim和Kende，2004)。由于细胞增殖减少，GIF1(Kim和Kende，2004)(也称作ANGUSTIFOLIA3，AN3)(Horiguchi等人，2005))的失活产生更窄的叶。

Rodriguez等人，Development137,103-112(2010)已经公开，一种微RNA，即miR396，在协调拟南芥叶中的细胞增殖方面发挥作用。他们证实在叶原基中，miR396以低水平表达，但是其表达在器官发育期间稳定增加。他们证实miR396拮抗其靶标，生长调节因子(GRF)转录因子，的表达模式。显示miR396偏好地积累于正在发育的幼叶的远端部分中，从而使GRF2的表达限于该器官的近端部分。这转而证实了与细胞增殖标志物CYCLINB1；1的活性相一致。显示miR396通过阻遏GRF活性和减少细胞周期基因的表达，减弱正在发育的叶中的细胞增殖。另外，他们报道，缺少GRF-相互作用因子1(GIF1)的突变体中miR396的过量表达严重损害苗分生组织。发现miR396以低水平在整个分生组织范围内表达，与其靶GRF2的表达重叠。此外，证实miR396的过量表达可以减少细胞增殖和分生组织的尺寸。转录因子TCP4活性增加(这减少叶中细胞增殖)的拟南芥植物显示具有较高的miR396水平和较低的GRF水平。经突变以干扰与miR396相互作用的修饰GRF2显示与miR396调节作用无关，而野生型GRF2接受miR396调节。据报道这些植物具有比野生型略微较大的叶，然而这些叶向下弯曲，这可能有害于光捕获和光合作用。那些结果表明miR396水平可以显著地限制植物中的细胞增殖

在本公开中，显示一种突变GRF3(有时在本文中称作rGRF3)和突变GRF3直向同源物(有时在本文中称作rGRF3直向同源物)不受miR396调节，并且包含突变GRF3或突变GRF3直向同源物的植物具有改善的生产率(productivity)和/或产量(yield)(包括更大的叶面积、更大的细胞数目、增加的生物量、增加的胁迫抗性、延迟的叶衰老、增加的种子产生(production)、增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度和更大的耐旱性)，无论与野生型植物相比或与包含不受miR396调节的突变GRF2的植物相比。另外，来自突变GRF3植物或突变GRF3直向同源物植物的叶不像突变GRF2植物的叶那样向下弯曲。在突变GRF2植物中观察到的叶面积轻微增加由其水平与野生型植物中的GRF2水平相比增加至少20倍引起；然而，已经观察到与野生型植物中的GRF3水平相比，只高3至5倍的突变GRF3就对叶尺寸和植物生物量造成大得多的影响。

在过量表达GIF1的植物中组合GRF3修饰或GRF3直向同源物修饰时，这些作用大为增强。

附图简述

图1显示与本发明相关的核酸构建体和序列；顶部小图显示与miR396b基本上互补的区域中GRF3野生型序列的序列，显示结合亲和力(ΔG＝-33.9kcal/摩尔)；中部小图显示修饰型GRF3序列(rGRF3)，它包含不同于野生型序列的5个碱基变化(A->U、G->A、U->A、G->A和A->G修饰)，碱基变化均保留天然氨基酸序列，但是使与miR396b微RNA相互作用大幅度去稳定化，(减少ΔG至-14.4kcal/摩尔)；底部小图显示35S:GIF1表达构建体的示意图。

图2显示GRF3和GIF1在转基因拟南芥植物中如通过RT-qPCR估计的相对表达水平以及在这类转基因植物之间的杂交体中的相对表达水平，野生型植物中的GRF3水平以相对值1代表，可以见到miR396(在35S启动子控制下)的过量表达减少了GRF3表达，而rGRF3转基因植物中GRF3的表达水平大约5倍于野生型植物中GRF3的表达水平。表达突变形式的转基因植物中GRF3的这种增加由解除miRNA阻遏作用引起。

在rGRF3和35S:GIF1植物之间的杂交体中，GRF3表达是略微(但是不显著地)低于rGRF3植物中所见的5倍表达水平。通过比较，GIF1表达水平(再次以野生型植物中的水平以1代表)在表达35S:miR396的植物中未显著地改变，但是几乎40倍于rGRF3植物中和rGRF3xGIF1植物之间的杂交体中的野生型水平。量值是三次重复±SEM。

图3显示在rGRF3植物、35S:GIF1植物和rGRF3x35S:GIF1植物中观察到的叶发育的修饰。在左小图中，确定全展第一叶的叶面积、鲜重和干重，这些叶显示最容易观察到的变化；右小图显示短日照下正在发育的植物的叶表型，同时底部右小图显示短日照条件下在大容器中培育的植物。

图4在顶部小图中显示rGRF3x35S:GIF1杂交植物的叶衰老延迟；在底部小图中，对全展叶5显示单片叶的延迟叶衰老，将所述全展叶5剥离并在黑暗下温育(黑暗引起的衰老)。衰老推进后测量叶绿素荧光(Fv/Fm)。

图5显示用野生型形式的GRF3(GRF3)和/或用miR396抵抗形式的GRF3(rGRF3)转化的植物的叶面积。

图6显示rGRF3、GRF2和35S:miR396植物的鲜重(图6A)和干重(图6B)，全部都在长日照条件下，垂直轴以克为单位。

图7显示以无根进化支图显示的GRF邻接分析，所述GRF来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)(AtGRF#)、稻(Oryza sativa)(OsGRF#)、玉蜀黍(Zea mays)(ZmORF#)、大豆(Glycine max)(GmGRF)、毛果杨(Populus trichocarpa)(PtGRF)、桃(Prunus persica)(PpGRF)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)(MtGRF)和番木瓜(Carica papaya)(CpCRF)。加下划线：具有miR396结合位点的GRF：用星号标记：具有FFD保守基序的GRF。

图8显示QLQ、WRC和FDD蛋白质基序在来自拟南芥(AtGRF#)、稻(OsGRF#)、玉蜀黍(ZmORF#)、大豆(GmGRF)、毛果杨(PtGRF)、桃(PpGRF)、蒺藜苜蓿(MtGRF)和番木瓜(CpGRF)的GRF中的分布

图9显示以无根进化支图显示的来自拟南芥和稻的GIF的邻接分析：序列从PlantTFDB2.0(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn)抽取。

图10显示有害的叶形状变化(向下“卷曲”)，这些变化随rGRF2一起存在，但是不存在于rGRF3中。

图11显示与GRF2(25x)的巨大积累量相比，GRF3(3x)轻微增加造成生产率(例如，生物量)较高增加。

图12显示rGRF3植物显示更高比率的茎生长和茎生物量积累。左图：在10日的野生型(wt)和rGRF3植物中4.5cm长的茎节段伸长。

图13显示-短日照培育的植物的莲座丛表型。注意本发明植物的叶尺寸和生物质积累增加。

图14显示不同转基因植物中的干旱影响。

图15显示拟南芥GRF在增生性组织中表达。

左小图：叶发育期间的GRF3表达模式(DAS＝播种后的天数)。右小图：GRF3拟南芥发育期间随有丝分裂特异性基因一起共表达。

图16显示玉米GRF随有丝分裂特异性基因一起共表达。

图17显示由拟南芥miR396抗性GRF3引起的植物尺寸增加。

A)与独立转基因植物品系：空载体(WT，左侧)、miR396抗性GRF3(rGRF3，中央)和野生型GRF3(GRF3，右侧)相对应的30日龄植物。注意用rGRF3转化的莲座丛的较大尺寸。

B)在(A)中描述的不同转基因植物的全展第一叶的面积。对每种载体评定至少50株独立植物。用不同字母标记的标度是显著差异的，通过ANOVA和Duncan多重范围检验所确定(P<0.05)。

图18显示组织特异性表达改善了rGRF3在植物生产率方面的表现。从以下不同启动子表达rGRF3的转基因植物的全展第一叶的面积：GRF3、非对称叶1(AS1)或aintegumenta(ANT)。对每种载体评定至少50株植物。对于AS1:rGRF3和ANT:rGRF3，数据代表独立的原代转基因品系，而对于GRF3:rGRF3，使用一个代表性品系。用不同字母标记的标度是显著差异的，通过Kruskal-Wallis和Duncan多重范围检验所确定(P<0.05)。

图19显示因rGRF3所致的茎直径增加。从以下不同启动子表达rGRF3的转基因植物的茎直径：GRF3、非对称叶1(AS1)和aintegumenta(ANT)。用不同字母标记的标度是显著差异的，通过Kruskal-Wallis和Duncan多重范围检验所确定(P<0.05)。

图20显示使用组织特异性启动子，对叶尺寸的影响脱离对叶衰老时程的那些影响。如本文中显示GRF3:rGRF3增加叶尺寸并延迟叶衰老。如果需要，后一种影响可以脱离叶尺寸的增加。来自ANT和AS1启动子的rGRF3表达显著地增加叶尺寸，同时对叶衰老影响微弱。黑暗诱导的全展叶#5衰老。从莲座丛切下全展叶后(第1日)和将它们在暗处温育6日后(第6日)立即拍照。对于GRF3:rGRF3，使用代表性品系，并且对于AS1:rGRF3和ANT:rGRF3载体，选择叶面积最大的4株原代转基因植物。

图21显示以下9种拟南芥GRF的核苷酸序列，即AtGRF1(SEQ ID No.40)、AtGRF2(SEQ ID No.87)、AtGRF3(SEQ ID No.2)、AtGRF4(SEQ ID No.19)、AtGRF5(SEQ ID No.41)、AtGRF6(SEQ ID No.42)、AtGRF7(SEQ ID No.43)、AtGRF8(SEQ ID No.44)和AtGRF9(SEQ IDNo.45)。加下划线的序列区段代表编码WRC(Trp、Arg、Cys)结构域的核苷酸序列的部分；并且加下划线和加粗的序列区段代表miR396靶位点，如果存在的话。

图22显示以下9种拟南芥GRF的氨基酸序列(AtGRF1(SEQ ID No.46)、AtGRF2(SEQID No.47)、AtGRF3(SEQ ID No.20)、AtGRF4(SEQ ID No.21)、AtGRF5(SEQ ID No.48)、AtGRF6(SEQ ID No.49)、AtGRF7(SEQ ID No.50)、AtGRF8(SEQ ID No.51)和AtGRF9(SEQ IDNo.52)，加下划线的序列区段代表称作WRC(Trp、Arg、Cys)结构域的氨基酸序列的部分；并且加下划线和加粗的序列区段代表FFD基序。

图23显示12种稻(Oryza sativa)GRF的核苷酸序列。(OsGRF1(SEQ ID No.3)、OsGRF2(SEQ ID No.4)、OsGRF3(SEQ ID No.5)、OsGRF4(SEQ ID No.6)、OsGRF5(SEQ IDNo.53)、OsGRF6(SEQ ID No.54)、OsGRF7(SEQ ID No.55)、OsGRF8(SEQ ID No.56)、OsGRF9(SEQ ID No.57)、OsGRF10(SEQ ID No.58)、OsGRF11(SEQ ID No.59)和OsGRF12(SEQ IDNo.60))，加下划线和加粗的序列区段代表miR396靶位点，如果存在的话。

图24显示12种稻GRF的氨基酸序列。(OsGRF1(SEQ ID No.22)、OsGRF2(SEQ IDNo.23)、OsGRF3(SEQ ID No.24)、OsGRF4(SEQ ID No.25)、OsGRF5(SEQ ID No.61)、OsGRF6(SEQ ID No.62)、OsGRF7(SEQ ID No.63)、OsGRF8(SEQ ID No.64)、OsGRF9(SEQ IDNo.65)、OsGRF10(SEQ ID No.66)、OsGRF11(SEQ ID No.67)和OsGRF12(SEQ ID No.68))。

图25显示14种玉蜀黍(玉米)GRF的核苷酸序列。(ZmORF1(SEQ ID No.7)、ZmORF2(SEQ ID No.69)、ZmORF3(SEQ ID No.8)、ZmORF4(SEQ ID No.70)、ZmORF5(SEQ ID No.9)、ZmORF6(SEQ ID No.10)、ZmORF7(SEQ ID No.11)、ZmORF8(SEQ ID No.71)、ZmORF9(SEQ IDNo.12)、ZmORF10(SEQ ID No.72)、ZmORF11(SEQ ID No.13)、ZmORF12(SEQ ID No.73)、ZmORF13(SEQ ID No.74)和ZmORF14(SEQ ID No.14))。加下划线和加粗的序列区段代表miR396靶位点，如果存在的话。

图26显示14种玉蜀黍(玉米)GRF的氨基酸序列。(ZmORF1(SEQ ID No.26)、ZmORF2(SEQ ID No.75)、ZmORF3(SEQ ID No.27)、ZmORF4(SEQ ID No.76)、ZmORF5(SEQ IDNo.28)、ZmORF6(SEQ ID No.29)、ZmORF7(SEQ ID No.30)、ZmORF8(SEQ ID No.77)、ZmORF9(SEQ ID No.31)、ZmORF10(SEQ ID No.78)、ZmORF11(SEQ ID No.32)、ZmORF12(SEQ IDNo.79)、ZmORF13(SEQ ID No.80)和ZmORF14(SEQ ID No.33))。

图27显示与AtGRF3具有高相似性的GRF的核苷酸序列，即大豆GRF(GmGRF)(SEQ IDNo.16)。加下划线和加粗的序列区段代表miR396靶位点，如果存在的话。

图28显示与AtGRF3具有高相似性的GRF的核苷酸序列，即蒺藜苜蓿GRF(MtGRF)(SEQ ID No.17)。

图29显示与AtGRF3具有高相似性的GRF的核苷酸序列，即毛果杨GRF(PtGRF)(SEQID No.18)。

图30显示与AtGRF3具有高相似性的GRF的核苷酸序列，即桃GRF(PpGRF)(SEQ IDNo.15)。

图31显示蒺藜苜蓿GRF(MtGRF)(SEQ ID No.36)的氨基酸序列；加下划线的序列区段代表称作WRC(Trp、Arg、Cys)结构域的氨基酸序列的部分；并且加下划线和加粗的序列区段代表FFD基序。

图32显示大豆GRF(GmGRF)(SEQ ID No.35)的氨基酸序列；加下划线的序列区段代表称作WRC(Trp、Arg、Cys)结构域的氨基酸序列的部分；并且加下划线和加粗的序列区段代表FFD基序。

图33显示毛果杨GRF(PtGRF)(SEQ ID No.37)的氨基酸序列；加下划线的序列区段代表称作WRC(Trp、Arg、Cys)结构域的氨基酸序列的部分；并且加下划线和加粗的序列区段代表FFD基序。

图34显示桃GRF(PpGRF)(SEQ ID No.34)的氨基酸序列；加下划线的序列区段代表称作WRC(Trp、Arg、Cys)结构域的氨基酸序列的部分；并且加下划线和加粗的序列区段代表FFD基序。

图35显示带突变的miR396-靶位点的拟南芥GRF3(At-rGRF3)的核苷酸序列(SEQID No.81)；加阴影和加下划线的序列部分是突变的miR396-靶位点。小写指使GRF抵抗miR396的碱基替换。为避免疑问，当时本文中提到突变体AtGRF3，除非另外声明，否则正在提到的是这个序列。这个序列在本文中也称作At-rGRF3和rGRF3。这个突变的At-rGRF3在本文中尤其用来产生转基因拟南芥植物。

图36显示带突变的miR396-靶位点的大豆GRF(Gm-rGRF)的核苷酸序列(SEQ IDNo.82)；加阴影和加下划线的序列部分是突变的miR396-靶位点。小写指使GRF抵抗miR396的碱基替换。这个突变的Gm-rGRF在本文中用来产生转基因拟南芥植物。

图37显示带突变的miR396-靶位点的稻GRF4(Os-rGRF4.1)的核苷酸序列(SEQ IDNo.83)；加阴影和加下划线的序列部分是突变的miR396-靶位点。小写指使GRF抵抗miR396的碱基替换。这个突变的Os-rGRF4在本文中用来产生转基因拟南芥植物。这个序列在本文中也称作Os-rGRF4.1和rOsGRF4.1。

图38显示来自其他植物物种的At-GRF3和GRF之间基于一级氨基酸序列的相似性表。使用Needle评定GRF3和来自At、Os和Zm的每种GRF(外加来自选择物种的其他高度相似的GRF)之间的总体相似性(EMBOSS:http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)。同一性指相同氨基酸处于相应位置时的情况；而相似性指氨基酸的保守性置换于相应位置时的情况。

图39显示编码JD16_GIF1的核苷酸序列(包含35S启动子(nt427-1295)-加下划线部分；GIF1编码序列(nt1310-1942)-斜体和加粗的部分；和终止子(nt2106-2755)–加粗和加下划线的部分。

图40显示编码RER32GRF3的核苷酸序列(SEQ ID No.85)(包括GRF3启动子(427-1707)-加下划线部分；5'UTR(1708-1913)-小写和斜体；GRF3编码序列+内含子[小写](1914-4231)-斜体和加粗；3'UTR(4232-4454)-小写和斜体；和终止子(4455-5105)-加粗和加下划线的部分。

图41显示载体35S:GIF1(JD16)(SEQ ID No.84)的图-载体尺寸：11332pb，用BamHI和Sal I消化，产物：10682和650pb。

图42显示载体GRF3:GRF3r(RER32)的图-载体尺寸：13642pb，用Xba I和Sal I消化，产物：11962和1680pb。

图43显示GIF1、GIF2和GIF3的过量表达促进细胞增殖和叶尺寸并且GIF2和GIF3蛋白是GIF1的功能等同物(见图43连同图9)。

图44显示包含pBRACT114中rGRF3:GIF1的两个质粒的图。pBRACT114从www.bract.org可获得。pBRACT基于pGreen/pSoup载体系统并且pGreen的原始参考文献是：Hellens等人,2000。

图45显示原代转基因拟南芥植物中由突变的拟南芥GRF(At-rGRF3)和由突变的大豆GRF(Gm-rGRF)所致的叶衰老延迟。

图46显示当脱离miR396调节作用时，来自大豆和来自稻的GRF3直向同源物在拟南芥中的表达还增加植物生物量。测量转基因植物的全展第一叶的面积，所述转基因植物表达来自拟南芥、大豆或稻的GRF。

图47显示与AtGRF3具有高相似性的GRF的核苷酸序列，即番木瓜GRF(CpGRF)(SEQID No.88)。

图48显示番木瓜GRF(CpGRF)的氨基酸序列(SEQ ID No.89)；加下划线的序列区段代表称作WRC(Trp、Arg、Cys)结构域的氨基酸序列的部分；并且加下划线和加粗的序列区段代表FFD基序。

图49显示在用拟南芥rGRF3转化的甘蓝(Brassica oleracea)植物和对照植物(无At rGRF3)中比较开花时土壤层以上10cm的茎宽度和开花时最大茎宽度的数据。

图50显示来自组织特异性启动子的rGRF3表达。

A)顶部：将GRF3作为与GFP的翻译融合物表达的构建体的示意图。底部：从GRF3:GRF3-GFP植物和GRF3:rGRF3-GFP植物所采集的不同年龄叶中GRF3-GFP融合蛋白的表达模式。B)顶点和不同年龄叶中GRF3mRNA的表达水平。C)用ANT:GUS报道基因和AS1:GUS报道基因转化的植物的GUS染色。上半部分，报道基因的示意图。

图51显示rGRF3在组织特异性启动子下的表达水平和转化体的叶面积。

A)从不同启动子表达GRF3的转基因籽苗中GRF3的表达水平。通过RT-qPCR实施测定并针对野生型植物归一化。B)全展第一和第二叶的面积。C)全展第一叶(左侧)和第三叶(右侧)。

图52显示从其内源性启动子和从ANT和AS1启动子表达rGRF3的40日龄植物的图片。

图53显示当rGRF3在其自身启动子控制下表达时延迟的衰老。衰老在野生型中并且当rGRF3在AS1和/或ANT控制下表达时明显。

A)50日龄莲座丛的图片。注意GRF3:rGRF3植物的衰老延迟和AS1:GRF3和ANT:GRF3植物的正常发育。B)显示剥离并在黑暗下温育(黑暗诱导的衰老)的全展叶#5的单独叶的衰老。通过测定Fv/Fm对衰老的进展定量。

图54显示针对独立原代转基因植物作图的叶面积。CHF3是空载体对照，带FFD基序的rGRF3是从其自身启动子表达的rGRF3cDNA。rGRF3AAD是FFD基序(FFDDW)中存在三个突变的rGRF3的cDNA，所述三个突变以三个丙氨酸替换两个苯丙氨酸和色氨酸(AADDA)。

图55显示表达rGRF2和rGRF3的植物之间的比较。如本文中显示，rGRF3表达导致产生比野生型或rGRF2表达更大的植物。rGRF2还产生扭曲的莲座丛。

图56是显示表达rGRF3的甘蓝转化体和对照植物(TC)的开花时和10cm茎重量的最宽茎宽度的表。

图57，左侧，显示在播种后各种天数时野生型甘蓝和表达rGRF3的两个转基因甘蓝植物的根长度的图。右侧，显示野生型和表达rGRF3的两个转基因植物的根伸长速度的图。

发明简述

本发明基于以下令人惊讶的研究结果：经证实脱离miR396控制，特别在GIF1过量表达存在的情况下脱离miR396控制的新的修饰型GRF3基因，rGRF3，可以用来在植物中显著地改善生物量、改善胁迫抗性、改善耐旱性、延迟叶衰老。生物量积累的改令人惊讶地高并且出乎意料地好于唯一其他已报道的脱离miRNA的GRF，即rGRF2，同时从先前报道的数据未曾预料到耐旱性。

本发明人还已经令人惊讶地发现，也经修饰以脱离miR396控制的GRF3的直向同源物也提供这些令人惊讶和出乎意料的效果。

在第一方面提供一种分离的核酸，其编码修饰的生长调节因子(GRF)-3或其直向同源物，所述核酸脱离miR396控制。

在另一个方面提供包含本发明核酸的构建体，所述核酸与启动子和终止子可操纵的连接。

本发明还提供包含本发明核酸或本发明构建体的载体。

在又一个方面，本发明提供了包含本发明核酸、本发明构建体或本发明载体的植物、植物细胞或植物组织。

在又一个方面，提供一种用于使用本发明核酸的方法，所述方法包括将本发明的核酸或本发明的构建体或本发明的载体引入植物中。

在本发明的另一个方面，提供本发明核酸或本发明构建体或本发明载体，用于产生植物，所述植物具有增加的生产率和/或产量(例如包括增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、增加的种子产生、增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度、延迟的叶衰老及它们的组合)。

在本发明的另一个方面，提供了一种产生植物的方法，所述植物具有增加的生产率/产量(例如包括以下一者或多者：增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老、增加的种子产生、增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度及它们的组合)，所述方法包括用本发明的核酸或本发明的构建体或本发明的载体转化植物。

又一个方面提供本发明的核酸或本发明的构建体或本发明的载体在产生用于增加生产率和/或产量(例如以下一者或多者：增加生物量、增加胁迫抗性、增加耐旱性、延迟叶衰老、增加种子产生、增加种子产量、增加根生长、增加根伸长速度或它们的组合)的植物中的用途。

在另一个方面，本发明提供一种新的修饰型基因，rGRF3，所述基因经证实脱离miR396控制，特别在存在GIF1过量表达的情况下。

因此，本发明的一个目的是提供新的修饰型GRF3基因或新的修饰型GRF3直向同源基因。

本发明的又一个目的是提供包含修饰型GRF3基因或修饰型GRF3直向同源基因的新植物。

本发明的又一个目的是提供在GIF1过量表达存在的情况下包含修饰型GRF3基因或修饰型GRF3直向同源物的新植物。

本发明的再一个目的是提供一种使用本文中公开的修饰型GRF3或修饰型GRF3直向同源物的方法。

本发明的再一个目的是提供一种用于产生植物的方法，与野生型植物或包含修饰型GRF2(rGRF2)的植物相比，所述植物具有增加的生产率/产量表型(例如以下表型：延迟的叶衰老、增加的生物量、增加的胁迫反应、增加的耐旱性、增加的种子产生、增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度或它们的组合)。

本发明的又一个目的是提供植物，其中，所述植物具有增加的生产率和/或产量表型(例如以下表型：延迟的叶衰老、增加的生物量、增加的胁迫反应、增加的耐旱性、增加的种子产生、增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度或它们的组合)，而没有在表达修饰型GRF2(rGRF2)的植物中观察到的不良副作用如有害性叶形状变化，例如弯曲叶或下卷叶。

将参考本文提供的完整公开内容和所附权利要求书理解本发明的其他目的和优点。

本发明优选实施方案的详细公开内容

Rodriguez等人(2010)使用在顶端中的小RNA印迹和原位杂交，直接跟踪miR396的表达模式，并且通过野生型和miRNA抗性GRF2-GUS报道基因的差异性表达，间接跟踪miR396的表达模式。miR396以低水平在分生组织和叶原基中表达，并且随后它随叶的发育稳定积累。与之相比，在SAM和幼叶中高度表达的GRF在叶发育期间减少，与细胞增殖隐退(retreat)协调一致。

已经分别观察了miR156和miR172及它们的靶SPL和AP2样转录因子的表达的时间拮抗性谱图(Chuck等人，2007；Wu和Poethig，2006)。异时性miR156和miR172网络相应地调节幼体至成体转变和营养期至繁殖期转变，这需要牵涉整个植株的决定(Aukerman和Sakai，2003；Chen，2004；Chuck等人，2007；Schmid等人，2005；Wu和Poethig，2006)。对miR396的观察表明这种miRNA还参与植物中发育事件的协调；然而，其作用限于单个器官。

拟南芥发育程序指导基本塑形模式(basiplastic pattern)，而叶成熟在顶端开始并且随后向该器官的基部推进(Donnelly等人，1999)。细胞分裂首先在原基各处发生并且随后有丝分裂阻滞线从叶顶端移向基部，从而叶远端部分中的细胞停止循环并开始膨大，而基部处的细胞继续增殖(Donnelly等人，1999)。Rodriguez等人的结果显示，叶的远端部分积累更多miR396，并且一个miRNA活性梯度指向器官基部。该结果得到了小RNA印迹和观察到的野生型GRF2-GUS报道基因隐退的支持，这则匹配CYCB1；1报道基因的模式。这些观察结果促使这些作者指向通过作为有丝分裂阻滞线组分的miR396对GRF表达的阻遏。

已经观察到在分生组织和叶原基中GRF2mRNA和miR396的相似空间表达模式，这表明在这个早期阶段存在miRNA和其靶的共表达。然而在叶发育的晚期，情况不同。野生型GRF2-GUS报道基因仅在正在发育的幼叶的近端部分中有活性，而rGRF2-GUS报道基因遍及叶各处表达。野生型GRF2-GUS表达的这种定性变化平行于miR396大量增加，其中miR396的水平在不同发育年龄的叶中变化达10-30倍。有趣地，GRF表达的下降在miR396达到其最大水平之前出现，这表明该miRNA的部分增加足以在体内阻抑GRF；然而，不能排除与miR396一致的发挥作用的其他因素也可能参与这个过程。

已经提出miRNA可能具有导致其靶完全消除的定性作用，和更难以察觉的定量作用(Bartel和Chen，2004)。在植物中，已经对miR169(Cartolano等人，2007)和miR156(Wang等人，2007)、miR319(Ori等人，2007)和miR164(Baker等人，2005；Nikovics等人，2006)和它们的靶提出这些定量性相互作用。从机理性观点看，正试图猜测的是miR396在叶发育期间具有双重功能：它可能定量地调节在SAM和叶原基中的GRF表达，同时造成巨大的定性作用，有助于从较老器官清除GRF活性。清除GRF转录物的后一种功能作用可能解释miR396水平的持续升高，甚至在细胞增殖已经停止之后也是如此。在另一方面，早期叶发育期间对GRF活性的潜在定量性调节可能在精细调节细胞增殖方面发挥相关作用，已经显示调整miR396水平和GRF2水平之间的平衡对器官中细胞最终数目具有重要影响。

miR396因其在拟南芥和稻之间保守而首先鉴定(Jones-Rhoades和Bartel，2004)。miR396和具有miR396靶位点的GRF存在于许多植物物种中(Axtell和Bartel，2005；Jones-Rhoades和Bartel，2004)，表明miR396-GRF调节网络的古老来源。基于grf突变体(Horiguchi等人，2005；Kim等人，2003；Kim和Lee，2006)和gif突变体(Horiguchi等人，2005；Kim和Kende，2004)的表型和具有高miR396水平的植物(Liu等人,2003)，明确确定了GRF作为叶中细胞数目的调节物的功能。

Rodriguez等人(2010)扩充了这些观察结果并且发现GRF调节SAM中的细胞增殖，这至少部分地解释了过量表达miR396的an3-1突变体(这项研究)中和grf多重敲除情况下(Kim等人，2003；Kim和Lee，2006)功能性分生组织的缺乏。分析中度miR396过量表达者的转录组已经显示有丝分裂特异性基因的下调是高miR396水平的主要分子作用之一。然而，GRF本身在细胞周期期间不改变它们的表达(Menges等人，2005)，并且将需要未来工作以鉴定GRF活性的潜在机制。

通过RT-qPCR对GRF的测量表明，miR396靶和非靶在相似的叶发育阶段关闭并且它们以冗余方式发挥作用。其中启动子已经与GUS报道基因直接融合的先前研究已经显示了GRF基因的转录可以在叶的不同区域内发生(Horiguchi等人，2005)。Rodriguez等人观察到，miR396对GRF2的转录后控制显著地促进其最终表达模式，并得出结论，miRNA也可能在调节其他GRF表达方面发挥重要作用。

已经显示金鱼草TCP基因CIN在叶发育期间以动态模式表达并调节细胞周期蛋白表达(Nath等人，2003)。来自拟南芥的受miR319调节的CIN样基因也参与叶中细胞增殖和分化的协调(Efroni等人，2008；Koyama等人，2007；Masuda等人，2008；Palatnik等人，2003；Schommer等人，2008)。因损害与miR319相互作用的突变所致的TCP4水平增加产生较小的叶(Efroni等人，2008；Palatnik等人，2003；Schommer等人，2008)。

Rodriguez等人观察到，表达miR319抗性形式的TCP4的植物诱导miR396。由于miR396和GRF之间的定量性平衡调节叶中的细胞数目，由TCP4引起的miR396增加可能造成soj8突变体中细胞数目的至少部分减少。然而，他们观察到，TCP4水平增加还造成不受miR396和GIF1调节的GRF减少，表明在转录水平起作用。在动物中充分描述了其中转录因子导致靶基因的转录性阻遏和miRNA的诱导(其转而转录后抑制相同基因群)的调节性回路，在动物中它们称作相干前馈环(Hornstein和Shomron，2006)。

miR319过量表达者(Efroni等人，2008；Ori等人，2007；Palatnik等人，2003)和tcp敲除者(Nath等人，2003；Schommer等人，2008)具有叶形态的巨大变化，以及其他表型缺陷，如开花时间延迟(Palatnik等人，2003)。这表示TCP具有超出叶发育之外的功能。然而，可能的是miR319调节的TCP招募miR396网络作为它们生物学功能的部分。Rodriguez等人提出，miR396网络可能是不同发育性输入或环境刺激和细胞周期装置各组分之间的纽带。

在本公开中，在植物中显示了以类似于Rodriguez等人对GRF2所报道的方式使GRF3(及其直向同源物)突变以产生新分子rGRF3(或其直向同源物)的作用。然而令人惊讶的是，与具有野生型(例如未突变的)GRF3、野生型GRF2或Rodriguez等人中描述的突变GRF2(rGRF2)的植物相比，本文报道的结果具有明显增加的生产率和/或产量的植物(例如具有明显增加的生物量、增加的胁迫反应、延迟的叶衰老、增加的种子产生、增加的种子产量、增加的根生长、增加的根伸长速度和/或增加的耐旱性)。

此外，显示在至少一种GIF(例如GIF1)在突变的GRF3(rGRF3)或其直向同源物存在的情况下过量表达时，这些作用增强。

另外，来自突变GRF3植物和/或突变GRF3直向同源物植物的叶不像Rodriguez等人中报道的突变GRF2植物的叶那样向下弯曲。

如果rGRF2水平增加到至少20倍于GRF2水平，则可以在rGRF2植物中观察到叶面积轻微增加；然而，在GRF3或GRF3直向同源物仅高3至5倍的rGRF3植物和rGRF3直向同源物植物中，可以观察到对生产率(例如叶尺寸和植物生物量)的大得多的影响。

因而，按照本公开，如下文提供的实施例和实验方法中详细显示，产生了在核酸序列中包含几个同义突变(即GRF3的氨基酸序列没有变化)的rGRF3或其直向同源物。

结果是其中本来由miR396实现的阻遏作用与rGRF3脱离的植物，并且因而可产生具有增加的生产率/产量(包括增加的生物量、增加的胁迫抗性、延迟的叶衰老和增加的耐旱性或它们的组合)的植物。

在第一方面提供一种分离的核酸，其编码修饰的生长调节因子(GRF)-3或其直向同源物，所述核酸脱离miR396控制。

核酸可以通过使miR396靶位点突变而脱离miR396控制。

优选地，突变或修饰的核酸仅在miR396靶位点中修饰，例如基因剩余部分未修饰或未突变。

在一个优选实施方案中，修饰的核酸以这样的方式修饰，从而包含保守的核酸变化。换句话说，如此修饰核酸，从而在该核酸表达的GRF3或GRF3直向同源物的氨基酸序列中不存在变化。

对核酸的修饰使该核酸(例如基因)实质上(substantially)脱离了miR396控制。

优选地，通过突变miR396靶位点中的核酸，使该核酸脱离miR396控制。

优选地，本发明的核酸编码具有FFD基序的蛋白质。

在一些实施方案中，本发明的核酸优选地编码具有FFD(D/E)WP基序的蛋白质。

为避免疑问，“(D/E)”意指在该位置处存在D或E残基。换句话说，FFD(D/E)WP意指FFDDWP或FFDEWP。

为了决定某个GRF是否为本发明的GRF3直向同源物，可以查询编码具有FFD(例如FFD(D/E)WP)基序的蛋白质的GRF。

本发明的GRF3直向同源物是至少包含miR396靶位点的GRF。

适当地，miR396靶位点(例如在本发明的核酸中，如在GRF3基因中或在GRF3直向同源物基因中)可以具有、包含以下核苷酸序列CGTTCAAGAAAGCCTGTGGAA(SEQ ID No.1)或由其组成。在一些实施方案中，这个核苷酸序列可以视为野生型miR396靶位点序列。

本发明的GRF3直向同源物根据优选地是选自如下已经脱离miR396控制的一种或多种GRF：拟南芥GRF4；稻GRF1、2、3、4或5；玉蜀黍GRF1、3、5、6、7、9、11或14；大豆GRF；蒺藜苜蓿GRF；毛果杨GRF、番木瓜GRF和桃GRF。

在一个实施方案中，GRF3直向同源物是在图7中描述的进化支图中与AtGRF3聚类的一种直向同源物。已经发现这些GRF3直向同源物以类似于AtGRF3的方式发挥作用。

为避免疑问，与AtGRF2或AtGRF9聚类的GRF不是本申请的目的，因为已经发现这些GRF不像AtGRF3那样发挥作用。

本发明的GRF3直向同源物是与AtGRF3具有相同功能性的一种直向同源物。

如本文所用的术语“直向同源物”意指功能相似或相同但是在不同物种中出现的基因。

如7图中所示，GRF3直向同源物可以优选地是包含miR396靶位点并编码具有FFD(例如FFD(D/E)WP)基序的蛋白质的一种直向同源物。

本发明的GRF3直向同源物是至少包含miR396靶位点的GRF。

本发明涉及分离的核酸，所述分离的核酸包含i)显示为SEQ ID No.2(AtGRF3)的核苷酸序列；ii)或与SEQ ID No.2相同至少45％、优选地至少50％、优选地至少60％、优选地至少65％的核苷酸序列；或iii)在严谨条件下与i)或ii)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在miR396靶位点中包含使核酸脱离miR396控制的修饰。

本发明的分离核酸可以包含i)显示为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQID No.17、SEQ ID No.18或SEQ ID No.19的核苷酸序列；ii)或与SEQ ID No.SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18或SEQ ID No.19相同至少45％、优选地至少50％、优选地至少60％、优选地至少65％的核苷酸序列；或iii)在严谨条件下与i)或ii)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其中i)、ii)或iii)的核苷酸序列在miR396靶位点中包含使核酸脱离miR396控制的修饰。

本发明的分离核酸可以包含i)编码本文中如下所示的多肽的核苷酸序列：SEQ IDNo.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ IDNo.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36或SEQ ID No.37；ii)或与i)的核苷酸序列具有至少45％、优选地至少50％、优选地至少60％、优选地至少65％同一性的核苷酸序列；或iii)在严谨条件下与i)或ii)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其中i)、ii)或iii)的核苷酸序列在miR396靶位点中包含使核酸脱离miR396控制的修饰。

优选地，根据本发明脱离miR396控制的核酸在至少一个GIF基因(例如GIF1)过量表达存在的情况下显示出进一步的增强作用。

可以通过用包含与启动子可操作连接的至少一种GIF(例如GIF1)编码序列的构建体转化植物、或植物细胞或植物组织，完成至少一种GIF(例如GIF1)的过量表达。

在一个实施方案中，植物、植物细胞或植物组织包含至少2种，例如2或3种，过量表达的GIF基因。

本发明的GIF基因可以是任何合适的GIF基因，包括AtGIF1(有时在本文中称作GIF1)、AtGIF2、AtGIF3、Os11g40100、Os12g31350、Os03g52320或它们的组合。

GIF(例如GIF1)编码序列可以处于组成型启动子如CaMV35S启动子控制下或可以处于组织特异性启动子控制下。

如下文提供的实施例和实验方法中详细显示，可以产生包含几个核酸同义改变(即GRF3的氨基酸序列没有变化)的rGRF3或其直向同源物。

在一个实施方案中，修饰型GRF3或其直向同源物可以在miR396靶位点中包含至少一个或全部以下碱基变化：A->U、G->A、U->G、U->A、G->C、A->T、G->A、T->A、G->A、A->G修饰。这些变化可以保留天然氨基酸序列，但是使miR396与所述rGRF3的相互作用大幅去稳定化。

在一个实施方案中，修饰型GRF3或其直向同源物可以在miR396靶位点中包含至少一个或全部以下碱基变化：A->U、G->A、U->A、G->A、A->G修饰。这些变化可以保留天然氨基酸序列，但是使miR396与所述rGRF3的相互作用大幅去稳定化。

在一个优选实施方案中，修饰型GRF3或其直向同源物包含具有以下序列的修饰的miR396靶位点：CGTTCxAGAAAxCCxGTxGAx(SEQ ID No.86)，其中x表示(例如与野生型序列相比)已经修饰(例如突变)的碱基。

修饰型GRF3或其直向同源物包含具有以下序列的修饰的miR396靶位点：CGTTCtAGAAAaCCaGTaGAg(SEQ ID No.38)，其中小写字母表示修饰的碱基(例如与野生型序列相比)。

可以通过任何已知方法产生突变序列，并且多种方法易于被本领域普通技术人员获得。本领域技术人员理解，可以向核苷酸序列产生众多位点定向突变或随机突变并随后通过各种手段筛选所编码多肽的改善功能性。

可以使用合成性寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有分布在所需突变位点侧翼的核苷酸序列。

合适的方法在Morinaga等人,(Biotechnology(1984)2,第646-649页)中公开。在核苷酸序列中引入突变的另一种方法在Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989),180,第147-151页)中描述。

用于向核苷酸序列中引入突变的一种方法使用来自Stratagene的位点定向诱变试剂盒。

在一些实施方案中，Colbert等人,2001(Plant Physiology June2001，第126卷，第480-484页)中描述的基因组内定向引入局部损伤(TILLING)技术可以用来筛选引起的突变，例如引起的点突变。

在另一个方面提供包含本发明核酸的构建体，所述核酸与启动子和/或终止子可操作的连接。

启动子可以是组成型启动子，如CaMV35S启动子，天然AtGRF3启动子，或天然GRF3直向同源物启动子，或可以是组织特异性启动子。

在一个实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子。

当需要使GRF3的不同功能脱离(如使增加的生物量脱离延迟的叶衰老时)，本发明的核酸优选地与组织特异性启动子可操作的连接。

此外，组织特异性启动子的使用可以改善植物生产的性能并进一步改善生产率。

在一些实施方案中，组织特异性启动子可以包括(或可以是)在叶早期发育期间瞬时表达的启动子。

在一个实施方案中，组织特异性启动子可以包括(或可以是)非对称叶1(AS-1)启动子或AINTEGUMENTA(ANT)启动子。

本领域技术人员知晓使本发明核酸的表达定向于植物的适宜位置中的其他合适的组织特异性启动子。不希望受理论约束，在具有或没有GIF共过量表达时，脱离miR396控制的突变GRF3或突变GRF3直向同源物可调节所述核酸在其中特异性表达的叶或其他器官中的细胞数目。因此，rGRF3将仅影响其中出现表达的植物的那部分。

本领域技术人员还知晓，也可能调节表达的时间模式和水平。例如，AS-1启动子具有活性的时间比ANT启动子长，并且因此当表达突变的GRF3(rGRF3)序列或突变的GRF3直向同源物序列时产生更大的叶。

因此，组织特异性启动子可以是在空间和/或时间上调节表达的启动子。

本发明还提供一种包含本发明核酸或本发明构建体的载体。

在又一个方面，本发明提供了包含本发明核酸、本发明构建体或本发明载体的植物、植物细胞或植物组织。

在一个实施方案中，本发明的植物、植物细胞或植物组织还可以包含修饰型GRF2(rGRF2)，所述修饰型GRF2也脱离miR396控制。换句话说，GRF2也可以在本发明的miR396靶位点中被突变。为避免疑问，这个实施方案仅涉及本发明rGRF3或rGRF3-直向同源物与rGRF2的组合。

AtGRF2和AtGRF9不是本发明的GRF3直向同源物。

因此，如本文所用的术语“GRF3直向同源物”不包括AtGRF2或AtGRF9。

因此，本发明的核苷酸序列不包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含本文中作为SEQ ID No.87或EQ ID No.45显示的核苷酸序列。

同样，如本文所用的术语“修饰型GRF3直向同源物”或“rGRF3直向同源物”不包括修饰型AtGRF2或修饰型AtGRF9。

在本发明的一个实施方案中，植物、植物细胞或植物组织可以额外地过量表达至少一种GIF(例如GIF1)。

可以通过用包含与启动子可操作的连接的至少一种GIF(例如GIF1)编码序列的构建体转化所述植物、或植物细胞或植物组织，实现至少一种GIF(例如GIF1)的过量表达。

在一些实施方案中，本发明的植物、植物细胞或植物组织可以包含多于一种(例如两种，例如三种)本发明的核酸。

仅以举例方式，本发明的植物、植物细胞或植物组织可以包含多于一种(例如两种，例如三种)rGRF3基因和/或rGRF3直向同源物。例如，本发明的植物、植物细胞或植物组织根据可以包含与一种或多种rGRF3直向同源物组合的rGRF3。

如本文所用的术语“GRF3”意指可获自(优选地获自)拟南芥的生长调节因子3。

如本文所用的术语“rGRF3”意指可获自(优选地获自)拟南芥的突变或修饰的生长调节因子3。优选地，突变或修饰的生长调节因子3已经经过突变或修饰从而使其脱离miR396控制。

如本文所用的术语“GRF3直向同源物”可以涵盖选自如下的一种或多种GRF：拟南芥GRF4；稻GRF1、2、3、4或5；玉蜀黍GRF1、3、5、6、7、9、11或14；大豆GRF；蒺藜苜蓿GRF；毛果杨GRF；番木瓜GRF和桃GRF。

如本文所用的术语“rGRF3直向同源物”可以涵盖选自已经脱离miR396控制的如下的一种或多种GRF：拟南芥GRF4；稻GRF1、2、3、4或5；玉蜀黍GRF1、3、5、6、7、9、11或14；大豆GRF；蒺藜苜蓿GRF；毛果杨GRF；番木瓜GRF和桃GRF。

编码修饰型GRF-3或其直向同源物的核酸可以包含内含子或可以排除内含子。

在一个实施方案中，编码修饰型GRF-3或其直向同源物的核酸包含内含子。不希望受理论约束，内含子可以增强转基因的表达。

在又一个方面，提供使用本发明核酸的方法，所述方法包括将本发明的核酸或本发明的构建体或本发明的载体引入植物中。

在本发明的另一个方面，提供本发明核酸或本发明构建体或本发明载体，用于产生植物，其中所述植物具有增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老及它们的组合。

在本发明的另一个方面，提供产生植物的方法，所述植物植物具有增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老及它们的组合，所述方法包括用本发明的核酸或本发明的构建体或本发明的载体转化植物。

又一个方面提供本发明的核酸或本发明的构建体或本发明的载体在产生用于增加生物量、增加胁迫抗性、增加耐旱性、延迟叶衰老或其组合的植物中的用途。

优选地，本发明的植物具有增加的生物量、增加的胁迫抗性、增加的耐旱性、延迟的叶衰老或它们的组合。

术语“增加的生物量”可以包括选自如下的一者或多者：增加的总体植物生物量、增加的鲜重、增加的叶面积或尺寸、增加的根长度、增加的干重、增加的茎生长、增加的茎生物量、增加的茎直径和开花时增加的茎宽度。

使用rGRF3或rGRF3直向同源物(其不同于使用rAtGRF2)的一个令人惊讶的技术优点是产生了增加的生物量，增加的耐旱性，延迟的叶衰老或它们的组合而没有有害的叶形状变化，例如向下卷曲。

在一些实施方案中，可以优选使增加的生物量脱离延迟的叶衰老。发明人已经令人惊讶地发现，这可以通过使用组织特异性启动子实现。

如本文所用的术语“增加的胁迫抗性”意指植物甚至在置植物于胁迫(例如干旱等)下的条件下保生产(例如维持或增加生物量等)的能力。

术语“增加的生物量”、“增加的胁迫抗性”、“增加的耐旱性”、“延迟的叶衰老”、“增加的根生长”、“增加的根伸长速度”意指与野生型植物(例如包含未修饰的GRF3或GRF3直向同源物的植物)或包含修饰型GRF2(rGRF2)的植物相比增加或延迟。

术语“增加的总体植物生物量”、“增加的鲜重”、“增加的叶面积或尺寸”、“增加的干重”、“增加的茎生长”、“增加的茎生物量”、“增加的茎直径”和“开花时增加的茎宽度”意指与野生型植物(例如包含未修饰的GRF3或GRF3直向同源物的植物)或包含修饰型GRF2(rGRF2)的植物相比增加或延迟。

如本文所用的术语“修饰”可以意指突变。如本文所用的术语“修饰”意指不同于野生型。

如本文所用的术语“野生型”意指天然存在的核酸。也就是指这样一种核酸，与宿主生物的遗传密码相比，其发现于内源遗传密码中并且从其尚未突变(即不含碱基缺失、添加或置换)的内源宿主生物分离。

本发明的载体可以是表达载体。术语“表达载体””意指能够体内或体外表达的构建体。

优选地，表达载体并入合适宿主生物(例如植物)的基因组中。术语“并入”优选地涵盖稳定并入基因组中。

本发明的核苷酸序列可以存在于载体中，在所述载体中，核苷酸序列与能够导致核苷酸序列通过合适宿主生物(例如植物)表达的调节序列可操作的连接。

如下文描述，可以将用于本发明中的载体转化入合适的宿主细胞，例如植物细胞。

用于本发明中的载体可以含有一种或多种选择标记基因，如赋予抗生素耐药性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。

载体可以例如在体外使用，用于产生RNA或用来转染、转化、转导或感染宿主细胞。

因此，在又一个实施方案中，本发明提供一种通过以下方式产生本发明核苷酸序列的方法：将本发明的核苷酸序列引入复制型载体中，将该载体引入相容性宿主(例如植物)细胞中并且在导致载体复制的条件下培育宿主(例如植物)。

如本文中所用，术语“可操作的连接”指并置，其中所述组件处在允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。与编码序列“有效连接”的调节序列以这样的方式连接，从而在与所述调控序列相容的条件下实现编码序列的表达。

术语“调节序列”包括启动子和启动子和其他表达调节信号。

术语“启动子”以本领域正常含义使用，例如RNA聚合酶结合位点。

术语“构建体”-其与术语如“缀合物”、“盒”和“杂交分子”同义-包括根据本发明使用的与启动子直接或间接连接的核苷酸序列。

间接连接的例子是提供合适的间隔序列如内含子序列，如Sh1-内含子或ADH内含子介于启动子和本发明的核苷酸序列间。对于本发明而言，这也适用于术语“融合”，所述融合包括直接或间接连接。在一些情况下，该术语不涵盖通常与野生型基因启动子结合和它们均处于其天然环境时的编码蛋白质的核苷酸序列的天然组合。

构建体可以甚至含有或表达标记，所述标记允许选择基因构建体。

对于一些应用，本发明的构建体优选地至少包含与启动子可操作的连接的本发明核苷酸序列。

适于本发明核酸转化的宿主生物可以是植物。在这个方面，构建基因修饰植物方面的基本原理是在植物基因组中插入遗传信息从而实现所插入遗传物质的稳定维持。一般技术的综述可以见于Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42:205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April199417-27)。

用农杆菌直接感染植物组织是已经广泛使用并且在Butcher D.N.等人,(1980),Tissue Culture Methods for Plant Pathologists,编者：D.S.Ingrams和J.P.Helgeson,203-208中描述的一项简单技术。

用于转化植物的其他技术包括抛射体转化、碳化硅晶须技术(见Frame BR,Drayton PR,Bagnaall SV,Lewnau CJ,Bullock WP,Wilson HM,Dunwell JM,Thompson JA和Wang K(1994)Production of fertile transgenic maize plants by siliconcarbide whisker-mediated transformation,The Plant Journal6:941-948)和病毒转化技术(例如，见Meyer P,Heidmann I和Niedenhof I(1992)The use of cassava mosaicvirus as a vector system for plants,Gene110:213-217)。

关于植物转化的另外教导可见于EP-A-0449375。

可以根据熟知的组织培养方法培养和维持植物细胞，如通过在补充有必需生长因子如氨基酸、植物激素、维生素等的合适培养基中培养细胞。

在又一个方面，本发明涉及一个携带本发明核苷酸序列或构建体并且能够将该核苷酸序列或构建体引入生物(如植物)的基因组中的载体系统。该载体系统可以包含一种载体，但是它也可以包含两种载体。在两种载体的情况下，该载体系统通常称作双元载体系统。双元载体系统更详细地描述于Gynheung An等人,(1980),Binary Vectors,PlantMolecular Biology Manual A3,1-19。

一个广泛用于转化植物细胞的系统使用了来自根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti质粒或来自发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri质粒(An等人,(1986),Plant Physiol.81,301-305和Butcher D.N.等人,(1980),Tissue CultureMethods for Plant Pathologists,编者：D.S.Ingrams和J.P.Helgeson,203-208)。在植物中分别引入所需的本发明启动子或构建体或核苷酸序列后，可能需要存在和/或插入其他DNA序列。如果，例如，为了转化，使用植物细胞的Ti质粒或Ri质粒，可以连接Ti质粒和Ri质粒T-DNA的至少右边界并且然而经常连接其右边界和左边界，作为所引入基因的侧翼区。T-DNA用于转化植物细胞的用途已经被充分研究并且描述于EP-A-120516；Hoekema，引自：TheBinary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B.,Alblasserdam,1985,第V章；Fraley等人,Crit.Rev.Plant Sci.,4:1-46和An等人,EMBO J.(1985)4:277-284。

如本文所用的术语GIF意指GRF相互作用因子(GIF，一个编码与人SYT转录辅助激活物同源的蛋白质的小基因家族(Horiguchi等人，2005；Kim和Kende，2004)。

GIF1(Kim和Kende，2004)又称作ANGUSTIFOLIA3(AN3)。

在一个实施方案中，根据本发明使用的GIF优选地是GIF1。GIF1也可以在本文中称作AtGIF1。

在一个实施方案中，根据本发明使用的GIF可以是GIF1，其中GIF1i)包含本文中作为以下显示的氨基酸或与之具有至少80％同一性的氨基酸序列：MQQHLMQMQPMMAGYYPSNVTSDHIQQYLDENKSLILKIVESQNSGKLSECAENQARLQRNLMYLAAIADSQPQPPSVHSQYGSAGGGMIQGEGGSHYLQQQQATQQQQMTQQSLMAARSSMLYAQQQQQQQPYATLQHQQLHHSQLGMSSSSGGGGSSGLHILQGEAGGFHDFGRGKPEMGSGGGGEGRGGSSGDGGETLYLKSSDDGN(SEQ ID No.95)；或

ii)由以下核苷酸序列编码：

ATGCAACAGCACCTGATGCAGATGCAGCCCATGATGGCTGGTTACTACCCCAGCAATGTTACCTCTGATCATATCCAACAGTACTTGGACGAAAACAAATCGTTGATTCTGAAGATTGTTGAGTCTCAAAACTCTGGAAAGCTTAGCGAATGCGCCGAGAATCAAGCAAGGCTTCAACGCAACCTAATGTACCTAGCTGCAATAGCAGATTCTCAGCCTCAGCCACCAAGTGTGCATAGCCAGTATGGATCTGCTGGTGGTGGGATGATTCAGGGAGAAGGAGGGTCACACTATTTGCAGCAGCAACAAGCGACTCAACAGCAACAGATGACTCAGCAGTCTCTAATGGCGGCTCGATCTTCAATGTTGTATGCTCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCCTTACGCGACGCTTCAGCATCAGCAATTGCACCATAGCCAGCTTGGAATGAGCTCGAGCAGCGGAGGAGGAGGAAGCAGTGGTCTCCATATCCTTCAGGGAGAGGCTGGTGGGTTTCATGATTTTGGCCGTGGGAAGCCGGAAATGGGAAGTGGTGGTGGCGGTGAAGGCAGAGGAGGAAGTTCAGGGGATGGTGGAGAAACCCTTTACTTGAAATCATCAGATGATGGGAATTGA(SEQ ID No.39)；或

iii)由与SEQ ID No.39至少70％、优选地80％、更优选地90％、甚至更优选地95％相同的核苷酸序列编码；或

iv)由严谨条件下与SEQ ID No.39杂交的核苷酸序列编码。

如可以从图9看出，来自拟南芥和稻的许多GIF序列聚类在一起。可以理解，可以根据本发明使用这些GIF的任一种。因此，根据本发明使用的GIF可以是可获自(优选地获自)稻的命名为Os11g40100、Os12g31350、Os03g52320的一种或多种GIF或是可获自(优选地获自)拟南芥的命名为AtGIF1、AtGIF2或AtGIF3的一种或多种GIF。

在一个实施方案中，本发明使用的GIF可以是AtGIF2，其中AtGIF2i)包含本文中作为以下显示的氨基酸或与之具有至少80％同一性的氨基酸序列：MQQQQSPQMFPMVPSIPPANNITTEQIQKYLDENKKLIMAIMENQNLGKLAECAQYQALLQKNLMYLAAIADAQPPPPTPGPSPSTAVAAQMATPHSGMQPPSYFMQHPQASPAGIFAPRGPLQFGSPLQFQDPQQQQQIHQQAMQGHMGIRPMGMTNNGMQHAMQQPETGLGGNVGLRGGKQDGADGQGKDDGK(SEQ ID No.96)；或

ii)由以下核苷酸序列编码：

ATGCAGCAGCAGCAGTCTCCGCAAATGTTTCCGATGGTTCCGTCGATTCCCCCTGCTAACAACATCACTACCGAACAGATCCAAAAGTACCTTGATGAGAACAAGAAGCTGATTATGGCCATCATGGAAAACCAGAATCTCGGTAAACTTGCTGAGTGCGCCCAGTACCAAGCTCTTCTCCAGAAGAACTTGATGTATCTTGCTGCAATTGCTGATGCTCAACCCCCACCACCTACGCCAGGACCTTCACCATCTACAGCTGTCGCTGCCCAGATGGCAACACCGCATTCTGGGATGCAACCACCTAGCTACTTCATGCAACACCCACAAGCATCCCCTGCAGGGATTTTCGCTCCAAGGGGTCCTTTACAGTTTGGTAGCCCACTCCAGTTTCAGGATCCGCAACAGCAGCAGCAGATACATCAGCAAGCTATGCAAGGACACATGGGGATTAGACCAATGGGTATGACCAACAACGGGATGCAGCATGCGATGCAACAACCAGAAACCGGTCTTGGAGGAAACGTGGGGCTTAGAGGAGGAAAGCAAGATGGAGCAGATGGACAAGGAAAAGATGATGGCAAGTGA(SEQ ID No.90)，或

iii)由与SEQ ID No.90至少70％、优选地80％、更优选地90％、甚至更优选地95％相同的核苷酸序列编码；或

iv)由严谨条件下与SEQ ID No.90杂交的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，本发明使用的GIF可以是AtGIF3，其中AtGIF3i)包含本文中作为以下显示的氨基酸或与之具有至少80％同一性的氨基酸序列：MQQSPQMIPMVLPSFPPTNNITTEQIQKYLDENKKLIMAILENQNLGKLAECAQYQALLQKNLMYLAAIADAQPQPPAATLTSGAMTPQAMAPNPSSMQPPPSYFMQQHQAVGMAQQIPPGIFPPRGPLQFGSPHQFLDPQQQLHQQAMQGHMGIRPMGLNNNNGLQHQMHHHETALAANNAGPNDASGGGKPDGTNMSQSGADGQGGSAARHGGGDAKTEGK(SEQ IDNo.97)；或

ii)由以下核苷酸序列编码：

ATGCAGCAATCTCCACAGATGATTCCGATGGTTCTTCCTTCATTTCCGCCCACCAATAATATCACCACCGAACAGATCCAAAAGTATCTTGATGAGAACAAGAAGCTGATAATGGCGATCTTGGAAAATCAGAACCTCGGTAAACTTGCAGAATGTGCTCAGTATCAAGCTCTTCTCCAGAAGAATTTGATGTATCTCGCTGCAATTGCGGATGCTCAACCTCAGCCACCAGCAGCTACACTAACATCAGGAGCCATGACTCCCCAAGCAATGGCTCCTAATCCGTCATCAATGCAGCCACCACCAAGCTACTTCATGCAGCAACATCAAGCTGTGGGAATGGCTCAACAAATACCTCCTGGGATTTTCCCTCCTAGAGGTCCATTGCAATTTGGTAGCCCGCATCAGTTTCTGGATCCGCAGCAACAGTTACATCAACAAGCTATGCAAGGGCACATGGGGATTAGACCAATGGGTTTGAATAATAACAACGGACTGCAACATCAAATGCACCACCATGAAACTGCTCTTGCCGCAAACAATGCGGGTCCTAACGATGCTAGTGGAGGAGGTAAACCGGATGGGACCAATATGAGCCAGAGTGGAGCTGATGGGCAAGGTGGCTCAGCCGCTAGACATGGCGGTGGTGATGCAAAAACTGAAGGAAAATGA(SEQ IDNo.91)，或

iii)由与SEQ ID No.91至少70％、优选地80％、更优选地90％、甚至更优选地95％相同的核苷酸序列编码；或

iv)由严谨条件下与SEQ ID No.91杂交的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，本发明使用的GIF可以是命名为Os11g40100的GIF，其中，Os11g40100i)包含本文中作为以下显示的氨基酸或与之具有至少80％同一性的氨基酸序列：

MQQQMAMPAGAAAAAVPPAAGITTEQIQKYLDENKQLILAILENQNLGKLAECAQYQAQLQKNLLYLAAIADAQPPQNPGSRPQMMQPGATPGAGHYMSQVPMFPPRTPLTPQQMQEQQQQQLQQQQAQALAFPGQMLMRPGTVNGMQSIPVADPARAADLQTAAPGSVDGRGNKQDATSEPSGTESHKSAGADNDAGGDIAEKS(SEQ ID No.98)；或

ii)由以下核苷酸序列编码：

ATGCAGCAGCAGATGGCCATGCCGGCGGGGGCCGCCGCCGCCGCGGTGCCGCCGGCGGCCGGCATCACCACCGAGCAGATCCAAAAGTATTTGGATGAAAATAAACAGCTAATTTTGGCCATCCTGGAAAATCAAAACCTAGGGAAGTTGGCTGAATGTGCTCAGTACCAAGCTCAGCTTCAAAAGAATCTCTTGTATCTGGCTGCCATTGCAGATGCCCAACCACCTCAGAATCCAGGAAGTCGCCCTCAGATGATGCAGCCTGGTGCTACCCCAGGTGCTGGGCATTACATGTCCCAAGTACCGATGTTCCCTCCAAGAACTCCCTTAACCCCACAACAGATGCAAGAGCAGCAGCAGCAGCAACTCCAGCAACAGCAAGCTCAGGCTCTAGCCTTCCCCGGCCAGATGCTAATGAGACCAGGTACTGTCAATGGCATGCAATCTATCCCAGTTGCTGACCCTGCTCGCGCAGCCGATCTTCAGACGGCAGCACCGGGCTCGGTAGATGGCCGAGGAAACAAGCAGGATGCAACCTCGGAGCCTTCCGGGACCGAGAGCCACAAGAGTGCGGGAGCAGATAACGACGCAGGCGGTGACATAGCGGAGAAGTCCTGA(SEQID No.92)，或

iii)由与SEQ ID No.92至少70％、优选地80％、更优选地90％、甚至更优选地95％相同的核苷酸序列编码；或

iv)由严谨条件下与SEQ ID No.92杂交的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，根据本发明使用的GIF可以是命名为Os12g31350的GIF，其中，Os12g31350i)包含本文中作为以下显示的氨基酸或与之具有至少80％同一性的氨基酸序列：

MQQQPMPMPAQAPPTAGITTEQIQKYLDENKQLILAILENQNLGKLAECAQYQAQLQKNLLYLAAIADTQPQTTISRPQMVPHGASPGLGGQYMSQVPMFPPRTPLTPQQMQEQQLQQQQAQLLSFGGQMVMRPGVVNGIPQLLQGEMHRGADHQNAGGATSEPSESHRSTGTENDGGSDFGDQS(SEQ ID No.99)；或

ii)由以下核苷酸序列编码：

ATGCAGCAGCAGCCGATGCCGATGCCCGCGCAGGCGCCGCCGACGGCCGGAATCACCACCGAGCAGATCCAAAAGTATCTGGATGAAAACAAGCAGCTTATTTTGGCTATTTTGGAAAATCAGAATCTGGGAAAGTTGGCAGAATGTGCTCAGTATCAAGCGCAGCTTCAGAAGAATCTCTTGTACTTGGCTGCAATTGCTGATACTCAACCGCAGACCACTATAAGCCGTCCCCAGATGGTGCCGCATGGTGCATCGCCGGGGTTAGGGGGGCAATACATGTCGCAGGTGCCAATGTTCCCCCCCAGGACCCCTCTAACGCCCCAGCAGATGCAGGAGCAGCAGCTGCAGCAACAGCAAGCCCAGCTGCTCTCGTTCGGCGGTCAGATGGTTATGAGGCCTGGCGTTGTGAATGGCATTCCTCAGCTTCTGCAAGGCGAAATGCACCGCGGAGCAGATCACCAGAACGCTGGCGGGGCCACCTCGGAGCCTTCCGAGAGCCACAGGAGCACCGGCACCGAAAATGACGGTGGAAGCGACTTCGGCGATCAATCCTAA(SEQ ID No.93)，或

iii)由与SEQ ID No.93至少70％、优选地80％、更优选地90％、甚至更优选地95％相同的核苷酸序列编码；或

iv)由严谨条件下与SEQ ID No.93杂交的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，根据本发明使用的GIF可以是命名为Os03g52320的GIF，其中，Os03g52320i)包含本文中作为以下显示的氨基酸或与之具有至少80％同一性的氨基酸序列：

MQQQHLMQMNQGMMGGYASPTTVTTDLIQQYLDENKQLILAILDNQNNGKVEECARNQAKLQHNLMYLAAIADSQPPQTAAMSQYPSNLMMQSGARYMPQQSAQMMAPQSLMAARSSMMYAQPALSPLQQQQQQQAAAAHGQLGMGSGGTTSGFSILHGEASMGGGGGGGGAGNSMMNAGVFSDFGRGGGGGGKEGSTSLSVDVRGANSGAQSGDGEYLKGTEEEGS(SEQID No.100)；或

ii)由以下核苷酸序列编码：

ATGCAGCAGCAACACCTGATGCAGATGAACCAGGGCATGATGGGGGGATATGCTTCCCCTACCACCGTCACCACTGATCTCATTCAGCAGTATCTGGATGAGAACAAGCAGCTGATCCTGGCCATCCTTGACAACCAGAACAATGGGAAGGTGGAAGAGTGCGCTCGGAACCAAGCTAAGCTCCAGCACAATCTCATGTACCTCGCCGCCATCGCCGACAGCCAGCCGCCGCAGACGGCCGCCATGTCCCAGTATCCGTCGAACCTGATGATGCAGTCCGGGGCGAGGTACATGCCGCAGCAGTCGGCGCAGATGATGGCGCCGCAGTCGCTGATGGCGGCGAGGTCTTCGATGATGTACGCGCAGCCGGCGCTGTCGCCGCTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGCGGCGGCGGCGCACGGGCAGCTGGGCATGGGCTCGGGGGGCACCACCAGCGGGTTCAGCATCCTCCACGGCGAGGCCAGCATGGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGCCGGTAACAGCATGATGAACGCCGGCGTGTTCTCCGACTTCGGACGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCAAGGAGGGGTCCACCTCGCTGTCCGTCGACGTCCGGGGCGCCAACTCCGGCGCCCAGAGCGGCGACGGGGAGTACCTCAAGGGCACCGAGGAGGAAGGCAGCTAG(SEQ IDNo.94)，或

iii)由与SEQ ID No.94至少70％、优选地80％、更优选地90％、甚至更优选地95％相同的核苷酸序列编码；或

iv)由严谨条件下与SEQ ID No.94杂交的核苷酸序列编码。

另外，发明人已经证实，GIF1、GIF2和GIF3的过量表达促进细胞增殖和叶尺寸，并且GIF2和GIF3蛋白是GIF1的功能等同物(见图43连同图9)。

先前，Horiguchi等人(2005)已经证实GIF1/AN3基因的过量表达也刺激细胞增殖，导致叶扩大约20％。

这些结果表明，全部GIF基因均以冗余方式作为细胞增殖的正调节物发挥作用，因而决定植物器官尺寸。

因此本发明涉及本发明的任何GIF基因的用途。

此外，本发明还涉及GIF基因的组合。

在一个方面，序列优选地处于分离的形式。术语“分离的”意指该序列至少基本上不含至少一种其他组分，所述其他组分与所述序列在自然界中天然连接并且如自然界中所找到那样的。

在一个方面，序列优选地处于纯化的形式。术语“纯化”意指该序列处于相对纯的状态-例如至少约90％纯度、或至少约95％纯度或至少约98％纯度。

如本文所用，术语“核苷酸序列”或“核酸”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，及其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。核苷酸序列可以是基因组来源或合成来源或重组来源的，它可以是双链或单链的，无论代表有义或反义链。

对于本发明而言，术语“核苷酸序列”或“核酸”包括基因组DNA、cDNA、合成性DNA和RNA。优选地，它意指DNA，更优选地意指编码本发明的cDNA序列。

在一个优选实施方案中，当涉及本发明自身范围并且由其涵盖时，核苷酸序列不包括这样的本发明天然核苷酸序列，此时所述天然核苷酸序列处于其天然环境中和与其天然结合的序列连接，所述天然结合的序列也处于其天然环境中。为便于参考，这个优选的实施方案应当称作“非天然核苷酸序列”或“非天然核酸”

一般，使用重组DNA技术(即重组DNA)制备由本发明范围涵盖的核苷酸序列或核酸。然而，在本发明的可选实施方案中，可以使用本领域熟知的化学方法完全或部分地合成核苷酸序列或核酸(见Caruthers MH等人,(1980)Nuc Acids Res Symp Ser215-23和HornT等人,(1980)Nuc Acids ResSymp Ser225-232)。

由于遗传密码中的简并性，可以容易地产生这些核苷酸序列，其中对于原始核苷酸序列编码的一些或全部氨基酸，已经改变了三联体密码子使用，因而产生与原始核苷酸序列具有低同源性，但编码如原始核苷酸序列所编码相同的氨基酸序列或变体的核苷酸序列。例如，对于大部分氨基酸，遗传密码的简并性在三联体密码子中的第三位置(摇摆位置)处(文献参见Stryer,Lubert,Biochemistry,第3版,Freeman Press,ISBN0-7167-1920-7)，因此，其中全部三联体密码子已经在第三位置内“摇摆”的核苷酸序列将与原始核苷酸序列相同约66％。然而，修订的核苷酸序列将编码与原始核苷酸序列相同或变异的一级氨基酸序列。

因此，本发明在一些实施方案中还涉及任何核苷酸序列，所述核苷酸序列具有至少一个编码氨基酸的三联体密码子的可选三联体密码子使用，但是编码与原始核苷酸序列编码的多肽序列相同的或变异的多肽序列。

另外，特定生物一般对于使用何种三联密码子来编码氨基酸具有偏好。优选的密码子使用表是广泛地可获得的，并且可以用来制备密码子优化的基因。这类密码子优化技术常规地用来优化转基因在异源宿主中的表达。

本发明还涵盖与本发明序列具有同一性或相似性的序列的用途。

这里，术语“同一性”意指与氨基酸序列和核苷酸序列具有某种同一性的实体。同一性意指与另一个序列比较时，一个序列中相同的氨基酸或碱基的百分数。

这里，术语“相似性”意指具有相似化学特性/功能的实体。因此，术语“相似性”考虑保守性变化。

在本发明中，具有某个同一性或相似性百分数的序列意在包括可以与本发明序列(主题序列)相同至少90％、优选地相同至少95％、96％、97％、98％或99％的序列。一般，该序列将包含与主题序列相同的活性部位等的编码序列。

同一性或相似性比较可以通过肉眼或更常见地借助可容易获得的序列比较程序进行。可获得的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的同一性百分数和相似性百分数。

同一性百分数可以在连续序列内计算，即，将一个序列与另一个序列比对并且将一个序列中的每个氨基酸与另一个序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称作“无空位”比对。一般，这类无空位比对仅在数目相对小的残基内进行。

尽管这是非常简单且稳定的方法，但是它没有考虑到如在其它方面相同的成对序列中，一个插入或缺失将导致随后的氨基酸残基无法比对，因此可能造成在进行整体比对时的同源性％大大降低。因此，大部分序列比较方法设计成产生最佳比对结果，所述的最佳比对结果考虑了可能的插入和缺失，而没有过度地罚除总体同源性评分。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。

然而，这些更复杂的方法向比对中出现的每个空位赋予“空位罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽量少缺口的序列比对(反映了两个比较的序列间更高的相关性)将比具有更多缺口的序列比对达到更高的得分。一般使用“仿射空位成本”，它对缺口的存在处以较高罚分，而对缺口中的每个后续残基处以较低罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然将产生具有更少空位的优化比对。大多数比对程序允许修正空位罚分。然而，使用这种软件用于序列比较时，优选使用默认值。例如，使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位罚分是空位-12和每个延伸-4。

因此，最大同一性％的计算首先要求在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适合用于开展此类比对的计算机程序有GCG Wisconsin Bestfit软件包(Devereux等人,1984Nuc.Acids Research12第387页)。可以执行序列比较的其他软件的例子包括但不限于BLAST软件包(见Ausubel等人，1999Short Protocols in Molecular Biology,第4版-第18章)、FASTA(Altschul等人，11990J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具软件包。BLAST和FASTA均可用于离线检索和在线检索(见Ausubel等人,1999,Short Protocols inMolecular Biology,第7-58页至第7-60页)。

然而，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。称作BLAST2Sequence的一种新工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(见FEMS Microbiol Lett1999174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett1999177(1):187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。

尽管可以就同一性方面测定最终的同一性％，然而比对过程本身一般不基于全是或全非的成对比较。相反，通常使用比例相似性评分矩阵，该评分矩阵基于化学相似性或进化距离对每个成对比较分配评分。此种常使用的矩阵的例子是BLOSUM62矩阵-即用于程序BLAST套装的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或所提供的定制符号比较表(关于进一步细节，见用户手册)。对于一些应用，优选使用GCG软件包的公共默认值，或在其他软件的情况下，优选使用默认矩阵，如BLOSUM62。

或者，也可以基于与CLUSTAL类似的算法(Higgins DG和Sharp PM(1988),Gene73(1),237-244)，使用DNASIS^TM(Hitachi Software)中的多重比对特征计算同一性百分数。

通常，在至少50个、优选地至少100个、优选地至少200个连续碱基或残基范围内计算同一性百分数。优选地，使用全长序列计算同一性百分数。

一旦软件已经产生最佳比对，则可能计算序列同一性％。该软件一般将此作为序列比较的一部分并产生数值结果。

序列也可以具有产生沉默改变并且产生功能性等同物的氨基酸残基的缺失、插入或置换。可以基于氨基酸特性(如残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质)方面的相似性进行谨慎的氨基酸取代，并且因此有用的是将氨基酸按官能团归集在一起。氨基酸可以单独基于其侧链特性归集在一起。然而更有用的是还包括突变数据。因此出于结构性原因，导出的氨基酸集合可能是保守的。这些集合可以按Venn简图形式描述(Livingstone C.D.和Barton G.J.(1993)"Protein sequence alignments:a strategyfor the hierarchical analysis of residue conservation"Comput.Appl Biosci.9:745-756)(Taylor W.R.(1986)"The classification of amino acid conservation"J.Theor.Biol.119；205-218)。可以例如根据描述普遍接受的氨基酸Venn简图分组的下表，产生保守性置换。

用于本发明中的核苷酸序列可以在它们内部包括合成的或修饰的核苷酸。许多不同类型的寡核苷酸修饰法是本领域已知的。这些修饰包括甲基磷酸酯主链和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3'末端和/或5'末端添加吖啶或聚赖氨酸链。出于本发明目的，应当理解可以通过本领域可获得的任何方法修饰本文所述的核苷酸序列。可以实施这类修饰以增强本发明核苷酸序列的体内活性或寿命。

本发明还涵盖与本文中提出的序列互补的核苷酸序列或其任何衍生物、片段或衍生物的用途。如果该序列与其片段互补，则这个序列可以用作探针以鉴定其他生物等中相似的编码序列。

可以通过许多方式获得与本发明序列不是100％相同但是落于本发明范围内的多核苷酸。本文所述序列的其他变体可以通过例如探测由一系列个体(如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得。此外，可以获得其他同源物并且这类同源物及其片段通常能够选择性地与本文序列表中所显示的序列杂交。可以通过以下方式获得这类序列：探测从其他物种产生的cDNA文库或来自其他物种的基因组DNA文库，并在中等至高严谨性条件下用包含所附序列表中任一个序列的全部或部分的探针探测这类文库。相似的考虑事项适用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。

也可以使用简并PCR获得变体和株系/物种直向同源物，所述简并PCR将使用针对变体和同源物内部靶序列所设计的引物，所述靶序列编码本发明序列内部的保守氨基酸序列。可以例如通过比对来自几个变体/同源物的氨基酸序列预测保守的序列。可以使用本领域已知的计算机软件执行序列比对。例如广泛地使用GCG Wisconsin PileUp程序。

简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置并且将在下述严格性条件使用，所述严格性条件比采用针对已知序列的单个序列引物而克隆序列的那些条件更低。

或者，可以通过已表征序列的定点诱变来获得所述多核苷酸。例如当需要沉默密码子序列的改变以优化其中正在表达多核苷酸序列的特定宿主细胞的密码子偏好时，这可能是有用的。可能需要其他序列变化以便引入限制性酶识别位点或改变多核苷酸编码的多肽的性能或功能。

本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可以用来产生引物，例如PCR引物、可可选扩增反应的引物，探针，例如使用放射性或非放射性标记物通过常规手段用显示性标记物标记的探针，或可以将多核苷酸克隆入载体。这类引物、探针及其他片段的长度至少是15个核苷酸，优选地至少20个核苷酸，例如至少25、30或40个核苷酸，并且也涵盖在本文所用的术语本发明多核苷酸。

可以重组地、合成地或通过本领域技术人员可获得的任何手段产生本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针。它们也可以通过标准技术克隆。

通常而言，引物通过合成手段产生，包括逐步产生所需核酸序列，一次一个核苷酸。使用自动化方法实现这一点的技术是本领域可容易获得的。

较长的多核苷酸通常使用重组手段，例如使用PCR(聚合酶链反应)克隆技术产生。引物可以设计成含有合适的限制性酶识别位点，从而可以将所扩增的DNA克隆入合适的克隆载体中。

本发明还涵盖与本发明核酸序列互补的序列，或者能够与本发明序列或本发明序列的互补序列杂交的序列。

如本文中所用，术语“杂交”应当包括一条核酸链通过碱基配对作用与互补链结合的过程，以及如聚合酶链反应(PCR)技术中所实施的扩增过程。

优选地，在严谨条件下(例如50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH7.0})确定杂交。

适当地，可以在高严谨条件下(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH7.0})确定杂交。

本发明还涉及可以与本发明的核苷酸序列(包括本文提出的那些核苷酸序列的补序序列)杂交的核苷酸序列。

技术人员理解，可以从任何植物可获得修饰型GRF3直向同源物。在一个优选实施方案中，GRF3直向同源物从选自以下的一种或多种植物可获得，优选地从其中获得：拟南芥、稻、玉蜀黍、大豆、蒺藜苜蓿、毛果杨、桃、番木瓜、普通小麦(Triticum aestivum)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、陆地棉(Gossypium hirstutum)、甘蔗(accharum spp.)、柳枝稷(Panicum virgatum)、向日葵(Helianthis annus)、甜菜(Beta vulgaris)和芸苔属(Brassica)物种。

在一个甚至更优选的实施例中，GRF3直向同源物从选自以下的一种或多种植物可获得，优选地从其中获得：拟南芥、稻、玉蜀黍、大豆、蒺藜苜蓿、毛果杨、桃、番木瓜。

可以将本发明的核酸、载体或构建体转化入任何(宿主)植物。

本发明的植物、植物细胞或植物组织可以是单子叶(monocot)植物或双子叶(dicot)植物。

在一个实施方案中，本发明的植物、植物细胞或植物组织可以是双子叶植物。

单子叶植物植物可以例如选自以下科：棕榈科(Arecaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)或禾本科(Poaceae)。例如，该植物可以是禾谷作物，如小麦、稻、大麦、玉米、燕麦、高粱、黑麦、洋葱、韭菜、谷子、荞麦、草坪草、意大利黑麦草、柳枝稷、芒属植物、牧草蔗、假燕麦草、羊茅、百慕大草(Bermuda grass)、雀麦草、草原草(heath grass)、草场草类(例如天然混合型草地草皮、野茅(orchard grass)、黑麦草、梯牧草)或羊茅属(Festuca)物种。

双子叶植物植物可以选自包括但不限于以下的科：菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)(例如欧洲油菜(Brassica napus))、藜科(Chenopodiaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、豆科(Leguminosae)(苏木科(Caesalpiniaceae)、Aesalpiniaceae、含羞草科(Mimosaceae)、蝶形花科(Papilionaceae)或蝶形花科科(Fabaceae))、锦葵科(Malvaceae)、蔷薇科(Rosaceae)或茄科(Solanaceae)。例如，植物可以选自莴苣(lettuce)、向日葵、拟南芥、菠菜、西瓜、南瓜、菜籽油菜(包括卡诺拉油菜)、卷心菜、花茎甘蓝、羽衣甘蓝、蔓青、芜菁甘蓝(swede)、番茄、马铃薯、辣椒、烟草、棉花、豆科植物、糖料甜菜(sugar beet)、秋葵、苹果、玫瑰、草莓、苜蓿(紫花苜蓿)、鸟足豆、菜豆、大豆、蚕豆、豌豆、兵豆、花生、鹰嘴豆、咖啡、可可、杏、苹果、梨、桃、葡萄藤或柑橘物种。

还包括生物燃料作物和生物能源作物如甘蔗、菜籽油菜/油菜(oil-seed rape)、亚麻、麻风树、油棕、干椰子肉和柳、桉、杨、杂交杨。芒属植物或裸子植物，如火炬松。还包括饲用作物(例如饲草物种或饲用玉米青贮)、放牧或草料作物(牧场草、车轴草、杂车轴草、红车轴草、地下车轴草、白车轴草、sanfoin、苜蓿)、纤维植物(例如棉花、亚麻)、建筑材料用植物(例如松、橡树)、制浆植物(例如杨)、化学工业用输入原料植物(例如高芥酸油菜、亚麻)、橡胶植物和愉悦目的用作物(例如体育或表面美化用草坪草)、用于公共和私人花园的装饰植物(例如香彩雀属(Angelonia)、海棠属(Begonia)、长春花属(Catharanthus),大戟属(Euphorbia)、勋章菊属(Gazania)、凤仙花属(Impatiens)、烟草属(Nicotiana)、天竺葵属(Pelargonium)、碧冬茄属(Petunia)、蔷薇属(Rosa)、马鞭草属(Verbena)和堇菜属(Viola)的物种)和用于切花市场的任何植物的花(如郁金香，玫瑰、水仙、百合、stallion、非洲菊、康乃馨、菊花、鸢尾、唐菖蒲、六出花、金盏花、甜豌豆、香雪兰、罂粟牡丹(anemone poppy))。

优选地，植物、植物细胞或植物组织或宿主植物是作物植物。作物植物意指以商业规模培育用于人类或动物消费或用于其他非食品/饲料用途的任何植物。优选的植物是谷物(玉米)、谷子、小麦、硬粒小麦、稻、菜籽油菜(或卡诺拉油菜)、高粱、甘蔗、大豆、向日葵、马铃薯、番茄、大麦、黑麦、燕麦、豌豆、菜豆、蚕豆、糖料甜菜、油棕、落花生、花生、木薯、苜蓿、车轴草、干椰子肉、葡萄干、咖啡、棉花、莴苣、香蕉、花茎甘蓝或其他蔬菜用芸薹属植物。

在一个实施方案中，植物、植物细胞或植物组织或宿主植物是芸苔属(Brassica)植物，合适地是甘蓝，例如花茎甘蓝或其他蔬菜用芸薹属植物。

植物可以是树如桉、杨或松柏类如云杉属(Picea)物种(例如云杉)或松属(Pinus)物种(松树)、阔叶树物种如茶、农庄树如橡胶(橡胶树属(Hevea))、棕榈树(枣椰树或油棕)或麻风树或果园果树(如李、桃、苹果和梨)。

实施例

尽管总体描述了本文中公开的发明，并且本领域技术人员基于所公开的内容能够实施包括最佳模式的本发明，但仍提供以下实施例满足支持和公开充分。然而，这些实施例的详细内容是非限制的。对于对本发明范围的理解，应当提及所附权利要求及其等同物。

转基因

关于所用双元质粒的清单，见表1。

表1

^a粗体突出显示(黄色)：与miR396复性的核苷酸。加下划线：诱变的残基。斜体突出显示(红色)：上游和下游密码子。

表达分析

首先，用RQ1无RNA酶的DNA酶(Promega)处理0.5-1.0μg总RNA。随后，使用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)实施第一链cDNA合成。使用SYBR GreenI(Roche)监测双链(ds)DNA合成，在Mastercycler ep realplex热循环仪(Eppendorf)中进行PCR反应。针对至少三个生物学重复，来实施每种基因的定量性(q)PCR，其中每个生物学重复具有两个技术重复。确定每份样品的相对转录物水平，使用蛋白质磷酸酶2A cDNA水平归一化(Czechowski等人，2005)。表2中给出引物序列。

表2.RT-qPCR中使用的相关基因座ID和寡核苷酸引物

小RNA分析

使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取RNA。在17％聚丙烯酰胺凝胶上在变性条件(7M脲)下解析总RNA。使用针对miR396设计的放射性标记或洋地黄甙末端标记的锁核酸(LNA)寡核苷酸探针(Exiqon，丹麦)杂交印迹物。

或者，如先前所描述(Chen等人，2005)，通过茎-环RT-qPCR确定miR396水平。使用的寡核苷酸的序列是：逆转录茎-环寡聚物，5'-GTCTCCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGGAGACMA GTTC-3'；PCR正向引物，5'-GGCGGTTCCACAGCTTTCTT-3'；和PCR反向引物，5-'TGGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'。

微阵列分析

使用RNeasy植物微量制备试剂盒(QIAGEN)，从平板上培育10日的籽苗的地上部分提取总RNA。如所述(Schmid等人，2005)，使用Affymetrix ATH1平台对两个生物学重复进行微阵列分析。使用由logit-T计算(Lemon等人，2003)的每个基因的方差，鉴定差异表达的基因。使用gcRMA(www.bioconductor.org)(稳健多阵列分析(RMA)算法改进形式)(Irizarry等人，2003)，通过表达估计量获得转录物的相应倍数变化。使用GSEA-P2.0，通过基因集合富集分析评估基因群表达(Subramanian等人，2007；Subramanian等人，2005)。

显微镜观察

将组织固定在FAA中并包埋在石蜡中。用Toluidine蓝对10μm厚的切片染色。

为了获得栅状细胞的水平视图，如所述(Horiguchi等人，2005)，将叶用FAA固定并用水合氯醛溶液清洁。使用微分干涉差(DIC)显微镜观察叶栅状细胞。

原位杂交

使用GRF2和组蛋白H4的克隆cDNA作为模板，通过用T7或SP6RNA聚合酶转录连同DIG RNA标记试剂盒(SP6/T7)(Roche)，合成DIG-标记的有义探针和反义探针。对于miR396探针，用DIG寡核苷酸3'端标记试剂盒(Roche)对LNA寡核苷酸(Exiqon)作末端标记。对来自短光周期下培育的15日龄植物的苗尖进行切割并在FAA中固定。将石蜡包埋的材料切成8μm厚度。杂交和检测如先前所描述进行(Palatnik等人，2003)。

GUS测定法

为了使报道物的活性可视化，根据Donnelly等人，将转基因植物进行GUS染色(Donnelly等人，1999)。将染色的组织作石蜡包埋、切片并封装在加拿大香胶中。

登录号

表2中提供相关AGI基因座识别码的清单。用于微阵列实验的登录号是GSE11250。

表3 通过Affymetrix微阵列所估计的，与野生型相比35S:miR396b植物中的GRF表达

实施例1

miR396抗性形式的GRF3增加了植物尺寸和生物量积累

转录因子GRF家族在拟南芥中包含9个成员。其中7个(包括GRF3)具有miR396的靶位点(Jones-Rhoades和Bartel，2004)。已经显示GRF功能丧失或miR396过量表达降低了拟南芥叶中的细胞数目(Horiguchi等人，2005；Kim等人，2003；Kim和Kende，2004；Liu等人,2003)。

为研究miR396在限制GRF3表达方面的重要性，将两个GRF3基因组片段引入拟南芥植物中。它们中的一个含有野生型GRF3基因(图1，顶部小图)，而第二个携带修饰型GRF3序列，在所述修饰型GRF3序列中，通过阻止miR396靶向的同义突变改变了miRNA靶向基序(命名为rGRF3，图1，中部小图)。

GRF3的野生型序列含有以高相互作用能量(ΔG＝-33.9kcal/mol)与miR396互补的区域。相比之下，修饰型GRF3序列(rGRF3)，其包括5个不同于野生型序列的变化(A->U、G->A、U->A、G->A和A->G修饰)，没有清晰的miR396相互作用位点，原因是相互作用能量从-33.9kcal/mol减少至-14.4kcal/mol。图21和图22中详述GRF3的完整序列。图35中详述rGRF3的完整序列。所用双元载体(命名为RER32，见表1)的全序列和图谱可分别见于图40和图42。

与野生型或表达受miR396调节的GRF3序列的转基因植物相比，表达rGRF3的转基因拟南芥植物具有更大的叶和莲座丛(图3、5、13和17)。如通过叶和莲座丛的鲜重和干重判定，它们还积累更多的生物量(图6)。通常而言，观察到相对于野生型植物，rGRF3几乎使第一叶的尺寸和重量加倍(图3)。rGRF3的FFD结构域增加了该蛋白质的活性(图54)。

与野生型植物相比，表达rGRF3的植物还具有更粗的茎，较高的干重和生长速度(图12)。观察到相对于野生型，rGRF3植物中茎直径增加20％(图12)。

材料和方法

使用拟南芥Columbia(Col-0)登录号作为野生型。全部转基因均为Col-0背景。将植物在23℃以长光周期(16小时光照/8小时黑暗)或以短光周期(8小时光照/16小时黑暗)培育。关于生成的一系列双元质粒和关于如何制备转基因植物的细节，见表1。使用位点定向诱变试剂盒(Stratagene)在克隆的AtGRF3野生型基因组片段中引入同义突变，改变AtGRF3中的miRNA靶基序。

全部构建体均克隆在双元载体pCHF3中(Jarvis等人，1998)。将T-DNA构建体引入根癌农杆菌菌株ASE中并且通过花浸染法获得拟南芥转基因植物。

通过以下方式测量叶面积：首先对剥离的全展叶拍照，并且随后用NIH软件ImageJ测量叶面积。

为确定生物量积累，将完整莲座丛或单独叶称重以测量鲜重。随后，使组织在60℃在2日期间干燥并测量干重。为确定茎生长，测量伸长，在10日期间始于5cm长的茎直至达到完全伸展。从伸长曲线计算最大伸长速度。通过测量10cm长完全伸长的茎段的干重，估计茎生物量积累。最后，在高于莲座丛0.5cm的茎的下部分测量茎直径。

使用定点诱变试剂盒(Stratagene)在克隆的AtGRF3cDNA中引入突变，从而改变AtGRF3中的FFD基序。将编码FFDDW的rGRF3cDNA天然序列“TTC TTT GAC GATTGG”诱变成编码AADDA的“GCT GCT GAC GAT GCT”，从而在FFD基序中将全部芳族氨基酸替换为丙氨酸。将wt(rGRF3(FFD))基因和诱变的(rGRF3(AAD))基因置于AtGRF3启动子下。

结论

-与野生型植物或表达带miR396结合位点的GRF3序列的转基因植物相比，用miR396抗性形式的GRF3(命名为rGRF3)转化的转基因拟南芥植物在叶尺寸和生物量积累方面显示出显著的增加。

-rGRF3也促进其他组织(如茎)的生长。

-FFD结构域提高rGRF3的活性。

实施例2

GIF1的过量表达增强了rGRF3的作用

转录因子GRF家族在拟南芥中包含9个成员(Kim等人，2003)。它们中7个具有miR396的靶位点(Jones-Rhoades和Bartel，2004)。已经显示不同GRF中的突变或miR396过量表达减少了拟南芥叶中的细胞数目(Horiguchi等人,2005；Kim和Kende,2004；Rodriguez等人,2010)。GRF与GRF-相互作用因子(GIF)相互作用，GIF是一个包含3个成员(GIF1、GIF2和GIF3)的小基因家族，所述成员编码的蛋白质与人SYT转录辅助激活物同源(Kim和Kende，2004)。GIF1(也称作ANGUSTIFOLIA3(AN3))的失活产生更窄的叶，原因在于细胞增殖以类似于GRF缺陷型植物的方式减少(Horiguchi等人，2005)。

制备从35S病毒启动子过量表达GIF1(图1和2)的转基因植物(命名为35S:GIF1)。所用双元载体(命名为JD16，见表1)的全序列和图谱可分别见于图39和图41。这些植物类似于野生型植物。之后，将35S:GIF1与表达rGRF3(实施例#1中描述的对miR396不敏感的GRF3)的植物杂交。对共过量表达rGRF3和GIF1的所得植物(命名为rGRF3x35S:GIF1)进行了更详细地分析(图1和图2)。

当分析这些植物的生物量生产率时，发现rGRF3与GIF1过量表达组合产生的植物与野生型植物相比具有更大的叶并且积累超过两倍的鲜重和干重(图3和图13)。rGRF3xGIF的性能好于单独的rGRF3。

材料和方法

使用拟南芥Columbia(Col-0)登录号作为野生型。全部转基因均处于Col-0背景。将植物在23℃以长光周期培育(16小时光照/8小时黑暗)或以短光周期(8小时光照/16小时黑暗)。关于生成的一系列双元质粒和关于怎样制备转基因植物的细节，见表1。使用定点诱变试剂盒(Stratagene)在克隆的AtGRF3野生型基因组片段中引入同义突变，改变AtGRF3中的miRNA靶基序。全部构建体均克隆在双元载体pCHF3中(Jarvis等人，1998)。将T-DNA构建体引入根癌农杆菌菌株ASE中并且通过花浸染法获得拟南芥转基因植物。

为了通过RT-PCR分析表达，从短光周期下培育的20日龄植物(包含小于3mm的正在发育的叶)制备RNA。用RQ1无RNA酶的DNA酶(Promega)处理0.5至1.0μg总RNA。随后，使用SuperScript TM III逆转录酶(Invitrogen)实施第一链cDNA合成。使用SYBRGreen I(Roche)监测dsDNA合成，在ep realplex热循环仪(Eppendorf)中进行PCR反应。针对每个基因，在至少3个生物学重复上进行qPCR，其中针对每个生物学重复，采用两个技术重复。确定每份样品的相对转录物水平，使用蛋白质磷酸酶2A cDNA水平归一化(Czechowski等人，2005)。

按照实施例1进行叶面积以及鲜重和干重测量。

结论

-可以通过GIF1共过量表达增强rGRF3在植物生产率方面的表现。

实施例3

rGRF3植物的延迟的叶衰老和增加的抗旱性

如实施例1中所示，rGRF3植物与野生型植物相比产生较大的叶，积累更多的生物量。这种效果通过共过量表达rGRF3和GIF1(rGRF3x35S:GIF1)而增强(关于进一步细节，见实施例2)。此外，发明人观察到rGRF3和rGRF3/35S:GIF1维持绿色的时间比野生型植物长(图4)。

为检验rGRF3和rGRF3x35S:GIF1转基因植物中是否存在叶衰老延迟，进行黑暗诱导的衰老实验。脱离的叶在黑暗下的温育诱导了衰老并且这种方法之后可以接着测量光系统II(PSII)光化学的最大效率(Fv/Fm)的下降，如先前所描述(Baker，2008；Schommer等人，2008)。为此，收集野生型、rGRF3、35S:GIF1和rGRF3x35S:GIF1的第五叶并保持在黑暗下，并且每日测量Fv/Fm。如图4中详述，在野生型和35S:GIF1植物之间不存在差异。然而，rGRF3叶中的衰老始于野生型叶后2日。有趣地，共过量表达高水平rGRF3和GIF1的叶在Fv/Fm衰减方面显示甚至更多的延迟，这表明GIF1的过量表达甚至进一步增强了rGRF3植物的衰老延迟。

另外，测定了在剥夺水的情况下转基因植物的性能(图14)。对35S:miR396、野生型、rGRF3、35S:GIF1和rGRF3x35S:GIF1的25日龄植物剥夺水2周。随后，将植物一周灌溉一次。截止水剥夺结束时及随后，MiR396过量表达者、野生型和35S:GIF1在它们的生长方面受严重影响(图14)。相比之下，rGRF3和rGRF3x35S:GIF1品系在水剥夺后恢复且发育良好(图14)。

材料和方法

为研究叶衰老，将第五全展叶剥离并贮藏在暗处。黑暗诱导衰老后接着测量光系统II的最大光化学效率(Fv/Fm)，如所述那样(Baker，2008)。在水剥夺测定法中，将植物在23℃以长光周期(16小时光照/8小时黑暗)培育。当植物为25日龄时，对它们剥夺水2周。此后，将植物一周灌溉一次。当植物为50日龄时，拍照。

结论

-rGRF3植物具有叶衰老延迟。这种作用通过GIF1的共过量表达而进一步增强。

-rGRF3植物更耐受水剥夺。

实施例4

来自组织特异性启动子的表达改善rGRF3在植物生产率方面的表现

转录因子GRF家族在拟南芥中包含9个成员(Kim等人，2003)。它们中7个(包括GRF3)具有miR396的靶位点(Jones-Rhoades和Bartel，2004)。miR396以低水平在分生组织和叶原基中表达，并且随后它随叶发育稳定积累，与细胞增殖消退协调一致(Rodriguez等人，2010)。在实施例1和2中证明，拟南芥中消除miR396对GRF3的阻遏使植物的生物量积累显著增加、衰老延迟。

为了研究是否可以进一步改善rGRF3的表现，从组织特异性启动子表达这种miR396抗性形式的GRF3。选择AS1(非对称叶1)和ANT(AINTEGUMENTA)的启动子，已知所述启动子在叶发育的增殖阶段特异性表达(图50)。

用载体AS1:rGRF3和ANT:rGRF3转化的转基因拟南芥植物的叶比野生型植物更大，甚至比从天然GRF3启动子表达rGRF3的植物更大(图18和51)。这些植物还具有更粗的茎(图19)。

有趣地，rGRF3从ANT和AS1启动子的表达仅对叶衰老具有较小影响并且低于从内源启动子表达的rGRF3植物中所观察到的影响(图20和图54)。

rGRF3从ANT和AS1启动子的表达显示类似于野生型植物的顶端优势(图52)。

材料和方法

使用拟南芥Columbia(Col-0)登录号作为野生型。全部转基因均处于Col-0背景。将植物在23℃以长光周期(16小时光照/8小时黑暗)或以短光周期(8小时光照/16小时黑暗)培育。关于生成的一系列双元质粒和关于怎样制备转基因植物的细节，见表1。使用定点诱变试剂盒(Stratagene)在克隆的AtGRF3野生型基因组片段中引入同义突变，从而改变AtGRF3中的miRNA靶基序。

通过以下方式测量叶面积：首先对剥离的全展叶拍照，并且随后用NIH软件ImageJ测量叶面积。最后，在高于莲座丛0.5cm的茎的下部分测量茎直径。通过在全展叶5上的黑暗诱导衰老实验来分析衰老表型。从莲座丛剥离全展叶后(第1日)并将它们在暗处温育6日后(第6日)马上拍照。叶绿素降解是衰老的一个指示(Schommer等人，2008)。

结论

-rGRF3从组织特异性启动子的表达可以改善其在植物生产率方面的表现。

-rGRF3从组织特异性启动子的表达可以脱离GRF3的不同功能，如对叶尺寸和衰老的控制。

实施例5

rGRF3在增加植物尺寸和生物量积累方面表现超过rGRF2

如先前显示，高水平的miR396大幅度缩减叶(Rodriguez等人，2010)。在另一方面，表达miR396抗性形式的GRF2(rGRF2)的植物积累了高水平GRF2，造成叶尺寸轻微下降(Rodriguez等人，2010)。已经在实施例1和2中证明rGRF3植物还积累比野生型植物更多的生物量。这个实施例证明rGRF3在增加植物尺寸和生物量积累方面表现显著超过rGRF2。

为比较rGRF2品系和rGRF3品系中的生物量积累，我们测量了35S:miR396、野生型、rGRF2和rGRF3植物的40日龄莲座丛的鲜重和干重(图6)。具有高水平miR396的植物具有25％的植物生物量减少。rGRF2植物仅具有统计学上不显著的少量生物量积累增加(图6)。与野生型植物相比，rGRF3莲座丛积累了的生物量高约40％，这是是统计学上显著的(图6)。

当比较叶形态时，观察到rGRF2植物和rGRF3植物之间另一个显著差异。rGRF2植物的叶具有向下“卷曲”形状，而rGRF3植物的叶比野生型叶更大，同时叶形态没有大变化(图10)。以下，rGRF3在不影响叶形态的情况下产生具有更大叶的植物。

为了分析rGRF2植物和rGRF3植物中生物量积累和GRF水平之间的相关性，选择每个rGRF转基因系的一个独立品系。随后，通过RT-PCR测量GRF2mRNA水平和GRF3mRNA水平并且测量rGRF2植物和rGRF3植物的1月龄莲座丛的干重。观察到rGRF2植物中GRF2mRNA水平的25倍增加产生了仅30％的生物量增加(图11)。相比之下，与相比，rGRF3植物中GRF3mRNA水平的仅3倍增加产生了约2倍于野生型Col-0的生物量积累(图11)。

作为进一步比较，将rGRF2或rGRF3表达的作用与野生型比较(图55)。表达rGRF3的植物中的叶面积几乎是野生型的两倍并且与rGRF2相比增加(图55)。当rGRF2置于GRF3启动子的控制下时，叶面积的增加不如表达rGRF3的植物中那样显著，这表明rGRF3和rGRF2的差异活性是由它们不同的一级序列造成的，而不是由启动子强度和/或表达水平引起的(图55)。

材料和方法

使用拟南芥Columbia(Col-0)登录号作为野生型。全部转基因均处于Col-0背景。将植物在23℃以长光周期(16小时光照/8小时黑暗)或以短光周期(8小时光照/16小时黑暗)培育。关于生成的一系列双元质粒和关于怎样制备转基因植物的细节，见表1。使用定点诱变试剂盒(Stratagene)在克隆的AtGRF3野生型基因组片段中引入同义突变，从而改变AtGRF3或AtGRF2中的miRNA靶基序。

全部构建体均克隆在双元载体pCHF3中(Jarvis等人，1998)。将T-DNA构建体引入根癌农杆菌菌株ASE中并且通过花浸染法获得拟南芥转基因植物。

为确定生物量积累，将完整莲座丛称重以测量鲜重。随后，使组织在60℃在2日期间干燥并测量干重。

为了通过RT-PCR分析表达，从短光周期下培育的20日龄植物(包含小于3mm的正在发育的叶)制备RNA。用RQ1无RNA酶的DNA酶(Promega)处理0.5至1.0μg总RNA。随后，使用SuperScript TM III逆转录酶(Invitrogen)实施第一链cDNA合成。使用SYBRGreen I(Roche)以监测dsDNA合成，在ep realplex热循环仪(Eppendorf)中进行PCR反应。在至少3个生物学重复上进行每个基因的qPCR，同时对每个生物学重复，采用两个技术重复。确定每份样品的相对转录物水平，将其使用蛋白质磷酸酶2A cDNA水平归一化(Czechowski等人，2005)。

结论

-需要高水平的rGRF2以略微地增加植物生物量(例如，比GRF2造成的30％生物量增加高25倍)。

-rGRF3植物中的GRF3表达的中度增加造成生物量积累的高度增加(例如，比GRF3造成的85％生物量增加高2.5倍)。

-高水平的rGRF2影响叶发育。

-与野生型相比，植物中rGRF3的表达导致叶面积增加约2倍。

-与rGRF2相比，rGRF3中增加的叶面积依赖于基因的一级序列并且不因启动子强度所致。

实施例6

拟南芥GRF3和GIF1同源物存在于作物植物中：拟南芥和其他植物物种中的GRF家族

转录因子的生长调节因子(GRF)家族是植物特有蛋白家族，特点在于存在两个高度保守的蛋白质基序QLQ和WRC(Kim等人，2003)。QLQ结构域参与同GRF互作因子蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用，WRC结构域含有功能性核定位信号和由三个保守半胱氨酸和一个组氨酸组成的DNA结合基序(Kim和Kende，2004)。拟南芥中的转录因子GRF家族包含9个成员(Kim等人，2003)(图21和图22)，稻中包含12个成员(Choi等人，2004)(图23和图24)，玉蜀黍中包含14个成员(Zhang等人，2008)(图25和图26)。此外，GRF可以见于许多其他植物物种中(Zhang等人，2011)(见图27至34中所选择的来自大豆、蒺藜苜蓿、桃、番木瓜和毛果杨的例子)。

至少两个其他保守的区域可见于GRF编码序列中。首先，在核苷酸水平，来自每个物种的GRF的仅一个亚组含有miR396-靶位点。例如，拟南芥中存在的9种GRF中仅7种是miR396的靶(图7和8)(Jones-Rhoades和Bartel，2004)。

第二，来自每个物种的GRF的仅一个亚组含有FFD保守基序(图8)。例如，在拟南芥中仅GRF3和GRF4具有FFD基序。另外，含有miR396靶向基序和FFD基序并与拟南芥GRF3具有高度同源性的GRF可见于稻、玉米和许多其他植物物种中(图7，8，22，24，26，31-34，38)。

拟南芥和玉蜀黍中的GRF表达模式

通过RT-qPCR在正在发育的叶中分析GRF3表达模式(图15，左侧)。以3日间隔采集第五莲座丛叶，从它首次变得肉眼可见的当日开始(约1mm)，这是播种后(DAS)16日。接着，通过RT-qPCR确定GRF3的水平。观察到这种转录因子在叶发育的早期期间表达(图15，左侧)。拟南芥发育的表达谱(Schmid等人，2005)表明，有丝分裂特异性基因在正在增殖的组织中表达(图15，右侧)。与GRF作为器官生长期间细胞增殖的正调节物的角色一致，它们的表达谱与(图15，右侧中对GRF3显示的)有丝分裂特异性基因的表达谱十分相似。

为证实拟南芥GRF和玉蜀黍GRF之间的功能等价性，使用玉米eFP浏览器分析玉米叶发育期间它们的表达模式(Li等人，2010；Winter等人，2007)。如图16中详述，玉米GRF按照与拟南芥GRF相同的方式与有丝分裂特异性基因共表达。

拟南芥和作物植物中的GRF-相互作用因子

如实施例2中描述，可以通过GRF-相互作用因子1的共过量表达，大幅增强rGRF3在植物生产率方面的表现。这个基因属于小基因家族，在拟南芥中包含三个成员(GIF1、GIF2和GIF3)。另外，在其他植物物种如稻中容易找到GIF1同源物(图9)。拟南芥中的三种GIF是高度冗余的，因为GIF1中的突变体可以通过过量表达GIF2或GIF3补充(图43)(Lee等人，2009)。这些结果表明，通过GIF1过量表达对rGRF3表型的增强也通过共过量表达GIF2和GIF3实现。

材料和方法

从短光周期下培育的20日龄植物(包含小于3mm的正在发育的叶)制备RNA。用RQ1无RNA酶的DNA酶(Promega)处理0.5至1.0μg总RNA。随后，使用SuperScript TM III逆转录酶(Invitrogen)实施第一链cDNA的合成。使用SYBRGreen I(Roche)监测dsDNA合成，在ep realplex热循环仪(Eppendorf)中进行PCR反应。在至少3个生物学重复上进行每个基因的qPCR，同时对每个生物学重复，采用两个技术重复。确定每份样品的相对转录物水平，将其使用蛋白质磷酸酶2A cDNA水平归一化。表2中给出引物序列。

使用文献中提供的登录号，从Genebank获得来自拟南芥，稻和玉蜀黍的GRF序列(Choi等人，2004；Kim等人，2003；Zhang等人，2008)。使用Needleman-Wunche比对算法，用NEEDLE进行配对序列比对以及同一性和相似性百分数的计算(Rice等人，2000)。使用MCOFFE进行蛋白质序列的多重序列比对(Moretti等人，2007)。使用PHYLIP软件包3.67版(Felsenstein，1989)来执行基于JTT距离矩阵的邻接(NJ)树的100次自展重复。使用TreeView1.6.6使树可视化。(Page，1996)。

结论

-GRF普遍存在，GRF3的同源物(直向同源物)特别存在于许多植物物种中。

-GIF也存在于许多植物物种中。

-根据其作为细胞增殖的正调节物的功能，GRF3在拟南芥中在叶发育期间与有丝分裂基因共表达。如对功能等同物基因所预期，玉蜀黍GRF表达还在叶发育期间与有丝分裂基因共表达。

-通过过量表达GIF1对rGRF3表型的增强也可能由来自拟南芥和作物植物的同源物(直向同源物)实现。

实施例7

将rGRF3和rGRF3+GIF引入甘蓝中

材料和方法

植物材料

这项研究中使用遗传上均一的双单倍体甘蓝基因型，DH1012(Sparrow等人，2004)。这个基因型源自快速循环型白花芥蓝(B.oleracea alboglabra)(A12)和意大利甘蓝(B.oleracea italica)Green Duke(GD33)之间的杂交。

细菌菌株

使用根癌农杆菌菌株AGL1实施转化，所述菌株携带有合适的质粒pBRACT114rGRF3和pBRACT114rGRF3:GIF1(见图44)并含有受35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶(nptii)选择标记基因和目的基因(即受其自身启动子驱动的rGRF3；或组合构建体，所述组合构建体同时含有受其自身启动子驱动的rGRF3和受35S启动子驱动的额外的GIF)。

下文描述用来产生转化载体pBRACT114-rGRF3GIF1的克隆方法。pBRACT114-rGRF3GIF1同时含有受其天然启动子驱动的rGRF3基因和由CaMV35S启动子过量表达的GIF1编码区。

用含PvuII(Invitrogen)的适宜缓冲液在20μl总反应体积中对约1.7μgpGRF3:GRF3r DNA的消化，在37℃、水浴中进行1小时。通过凝胶提取法分离含有rGRF3天然启动子、编码区、3'UTR和终止子的4950bp片段。

芸苔转化载体pBRACT114(www.bract.org)基于pGreen(Hellens等人，2000)并且是Gateway^TM(Invitrogen)相容的。将大约1μg pBract114用适宜缓冲液中的限制性酶StuI(Roche)在37℃消化1小时。通过在37℃与虾碱性磷酸酶(SAP)温育另外1小时，使线性化载体去磷酸化。通过加热至65℃持续15分钟，使SAP变性。

过夜连接反应在14℃进行并且以3:1比率分别含有rGRF3片段和线性pBRACT114。在10μl平端连接中使用5单位T4连接酶(Invitrogen)。向50μlccdB感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen)添加2μl连接反应物并通过热休克法转化。将细胞在37℃于250μl SOC培养基中培育1小时并且以200rpm振摇。将20μl和100μl培养物铺展到含有适宜选择剂的固态LB培养基平板(Sambrook和Russel，2001)上并在37℃温育过夜。

通过直接菌落PCR筛选大肠杆菌菌落以确保它们含有其中插入物处于所需方向的pBRACT114。将12个PCR阳性单菌落转移至10ml含有适宜选择剂的液态LB培养基并在37℃以220rpm振摇温育过夜。使用微量制备试剂盒(Qiagen)分离质粒DNA。通过酶消化和插入位点测序证实称作pBRACT114-rGRF3的构建体的完整性。

产生pBRACT-rGRF3GIF1的克隆过程的第二阶段使用Gateway^TM(Invitrogen)系统来重组CaMV35S启动子下游的GIF1编码区。将GIF1的编码区通过使用高保真Platinum^TM聚合酶(Invitrogen)的PCR扩增并以Topo T/A方式克隆到Gateway^TM入门载体TA(Invitrogen)中。向50μl化学感受态大肠杆菌DH5-α细胞(Invitrogen)添加2μl Topo反应物并通过热休克法转化。将细胞在37℃于250μl SOC培养基中培育1小时并且以200rpm振摇。将20μl和100μl培养物铺展到含有适宜选择剂的固态LB培养基平板(Sambrook和Russel，2001)上并在37℃温育过夜。

通过直接菌落PCR筛选大肠杆菌菌落以确保它们含有GIF1扩增子处于所需方向的pCR8。将6个PCR阳性单菌落转移至10ml含有适宜选择剂的液态LB培养基并在37℃以220rpm振摇温育过夜。使用质粒微量制备试剂盒(Qiagen)分离质粒DNA。通过酶消化检查入门载体pCR8-GIF1。对整个GIF1编码区进行测序以确保其完整性。

进行Gateway^TMLR重组反应以将GIF1编码区插入到pBRACT114-rGRF3中位于CaMV35S启动子下游的gateway位点之间。10μlLR反应物含有同TE缓冲液中的约100ngpBRACT114-rGRF3+35ngpCR8-GIF1连同2μlLRClonase^TMII酶mix^TM(Invitrogen)。将LR反应物在室温温育过夜。蛋白酶K处理在37℃进行10分钟。向50μl化学感受态大肠杆菌DH5-α细胞(Invitrogen)添加1μl LR反应物并通过热休克法转化。将细胞在37℃于250μl SOC培养基中培育1小时并且以200rpm振摇。将20μl和100μl培养物铺展到含有适宜选择剂的固态LB培养基平板(Sambrook和Russel，2001)上并在37℃温育过夜。

将12个单菌落转移至10ml含有适宜选择剂的液态LB培养基并在37℃以220rpm振摇温育过夜。使用微量制备试剂盒(Qiagen)分离质粒DNA。通过酶消化和GIF1插入位点测序证实称作pBRACT114-rGRF3GIF1的构建体的完整性。

通过电穿孔法，将质粒pBRACT-rGRF3GIF1连同其辅助质粒pSoup(Hellens等人，2000)一起转化至根癌农杆菌菌株AGL1中。还通过电穿孔法将质粒pGRF3:rGRF3转化根癌农杆菌中。简而言之，将100ng质粒DNA添加至电极开距2mm的预冷电穿孔杯中的40μl电感受态根癌农杆菌细胞中。在GenePulser(Biorad)中按2.50kV、25uFD和400Ohms的设定对细胞作电穿孔。立即添加300μl液态LB培养基以恢复细胞，将这些细胞在室温以180rpm振摇情况下培育6小时。将根癌农杆菌培养物铺展到含有适宜选择剂的固态LB培养基(Sambrook和Russel，2001)上并在28℃温育48小时。选出单菌落并接种至10ml含有适宜抗生素的液态LB培养基，并在28℃以200rpm振摇情况下温育48小时。制备甘油储备物和标准接种物并贮存在-80℃。在着手芸苔转化实验之前通过酶消化再次检查质粒。

将根癌农杆菌划线到含有适宜选择剂的固态LB培养基(Sambrook和Russel，2001)上并在28℃温育48小时。将单菌落转移至10ml含有适宜选择剂的液态LB培养基并转移至28℃摇床持续48小时。将所得细菌悬液的50μl等分试样转移至10ml含选择剂的MGL液体培养基并在28℃摇床中培育过夜。将过夜培养物在室温以3,000rpm离心5分钟，之后重悬于液态MS培养基中。将O.D₆₅₀＝0.3的悬液用于接种(使用液态MS培养基产生稀释物)。

植物转化

将种子在100％乙醇中持续2分钟，在15％次氯酸钠外加0.1％Tween-20中持续15分钟作表面消毒，并在无菌蒸馏水中淋洗3次持续10分钟。使种子在pH5.6含有3％蔗糖和0.8％植物琼脂(Difco)的全浓度MS(Murashige和Skoog，1962)植物盐基质上萌发。在倾倒之前，添加滤器除菌的以下维生素至该培养基：肌醇(100mg/l)、硫胺素-HCL(10mg/l)、吡多醇(1mg/l)和尼克酸(1mg/l)。将种子以每只90mm皮式培养皿15粒种子的密度播种并转移至10℃冷室过夜，之后转移至利用70μmol m^-2sec^-1光照的16小时日长度的23℃培养室。

基于为欧洲油菜所开发(Moloney等人,1989)并由BRACT(www.bract.org)进一步开发的转化方案，将切自4日龄籽苗的子叶柄浸泡至农杆菌过夜悬液中。将外植体维持在共培育培养基(补充有2mg/l6-苄氨基嘌呤的萌发培养基)上，每块平板10个外植体，同时包埋叶柄并确保子叶薄片不接触培养基。将培养物在生长室中以23℃伴在40μmol m^-2sec^-1的散射光下以16小时日长度维持72小时。在72小时后，将外植体转移至选择培养基(补充有160mg/L特美汀(或消除农杆菌的适宜抗生素)和15mg/L卡那霉素作为选择剂的共培育培养基)。在不含卡那霉素的培养基上建立对照，为已经用农杆菌接种和尚未用农杆菌接种的外植体。

苗分离和植物再生

将正在再生的绿苗切下并转移至含有1％蔗糖、0.8％植物琼脂、160mg/l特美汀和50mg/L卡那霉素的Gamborgs B5培养基(Gamborg等人,1968)。在分离浓密多株苗的情况下，在苗伸长后进行进一步继代培养以确保分离主茎，由此减少多茎植株在转移至温室时的逃逸概率及频率。苗在Gamborgs B5培养基上维持直至根发育。随后将小植物转移至无菌泥炭钵(Jiffy7号)以允许进一步根发育，之后转移至温室。

植物维持和种子产生

将转基因植物在密闭照明温室(16小时光周期，+18/12℃昼/夜)中维持并自我授粉，以产生T₁种子。一旦植物开花，就用透明的穿孔的“面包袋”(Cryovac(UK)Ltd)覆盖它们以防止交叉授粉。背景基因型DH1012是自相容性基因型，并且实施每日摇动‘面包袋’以促进授粉。允许荚果在植物上形成直至充分膨大并且当荚果已经干燥并变褐时收获。将收获的荚果在干燥时脱粒，并且种子储存在John Innes中心种子储库中(+1.5℃，7-10相对湿度)。

分子分析

使用来自推定的转基因苗(体外)的叶组织用于初始DNA提取，以PCR检验转基因的存在。

通过多重实时PCR分析拷贝数

使用多重实时PCR(Taqman)测试，通过‘iDNA遗传学’(www.idnagenetics.com)，测量转基因的拷贝数。使用通过Fam标记、Tamra猝灭的探针检测到nptII靶基因，并且同时使用通过Vic标记、Tamra猝灭的探针检测到阳性内对照基因。使用5-20ng来自每份样品的基因组DNA以20μL反应体积实施反应，每份样品分析2次。找到每只管的Fam信号和Vic信号的循环阈值(Ct)，并且计算每份样品的平均ΔCt(CtFam-CtVIC)。样品按ΔCt排序(其中高ΔCt涉及低拷贝数的样品，低ΔCt涉及高拷贝数的样品)。根据(拷贝数已知的)参比样品，将植物样品分类。

初步研究显示，在包含AtrGRF3或AtrGRF3:GIF1的芸苔植物中获得了增强的生长和改善的植物生产率。

图49显示用拟南芥rGRF3转化的甘蓝植物和对照植物(无AtrGRF3)的比较数据。用AtrGRF3转化甘蓝植物显著地改善了这些植物的生长和生产率。例如，与对照植物相比，用AtrGRF3转化的甘蓝植物中开花时土壤层以上10cm的茎宽度和开花时最大茎宽度均显著地更大。使用t-检验(p<0.01)或回归分析(p＝0.008)时，这些结果是显著的。

图56显示用拟南芥rGRF3(rGRF3)转化的甘蓝植物和再生对照(TC)的数据。与对照相比时，rGRF3中的开花时最宽茎宽度增加(图56)。该图还显示与对照相比时，rGRF3中的10cm茎重量增加(图56)。

测量表达拟南芥rGRF3的转基因甘蓝植物的根生长。为此，在垂直MS平板中培育野生型和转基因植物。从播种后4日至7日对每个基因型在至少10株植物中测量根长度(图57，左侧)。从这些线的斜率估计根生长速率(图57，右侧)。

结论

-表达拟南芥rGRF3和rGRF3:GIF1的转基因甘蓝植物显示增强的生长和改善的植物生产率。

-用miR396抗性形式的GRF3(命名为rGRF3)转化的转基因甘蓝植物显示根生长显著增加。

实施例8

自大豆和稻的GRF3直向同源物在拟南芥中的表达还增加了植物生物量

在实施例6中，描述了来自其他物种而非来自拟南芥的GRF。为了检验这些GRF是否以类似于拟南芥rGRF3的方式发挥作用，将选择的序列引入拟南芥中。与At-rGRF3具有最高同源性并含有FFD基序和miR396靶位点的GRF选自稻(图37)和大豆(图36)。如先前对拟南芥GRF3的描述，通过在miRNA结合位点中引入突变，使来自大豆和稻的GRF3脱离miR396控制。

制备从拟南芥GRF3启动子表达这些序列的载体，随后获得拟南芥转基因植物。以类似于表达At-rGRF3的植物的方式，表达Os-rGRF4和Gm-rGRF的转基因拟南芥植物比野生型植物具有更大叶(图46)。表达大豆和稻rGRF3直向同源物的这些转基因植物还具有叶衰老延迟(未显示)。

材料和方法

使用拟南芥Columbia(Col-0)登录号作为野生型对照。全部转基因均处于Col-0背景。将植物在23℃以长光周期(16小时光照/8小时黑暗)或以短光周期(8小时光照/16小时黑暗)培育。关于生成的一系列双元质粒和关于怎样制备转基因植物的细节，见表1。如先前对拟南芥GRF3所描述，使用定点诱变试剂盒(Stratagene)引入突变，从而改变OsGRF4和Gm-GRF中的miRNA靶基序。图37和图36中分别显示Os-GRF4和Gm-GRF中突变的miR396基序。

全部构建体均克隆在双元载体pCHF3中(Jarvis等人，1998)。将T-DNA构建体引入根癌农杆菌菌株ASE中并且通过花浸染法获得拟南芥转基因植物。

通过以下方式测量叶面积：首先对剥离的全展叶拍照，随后用NIH软件ImageJ测量叶面积(如实施例1和上文其他实施例中所述)。

结论

来自除拟南芥物种之外物种(例如至少稻和大豆)的rGRF3直向同源物也能够增加植物尺寸和生物量积累。

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Claims (7)

1.产生植物的方法，所述植物具有增加的茎尺寸、增加的干重、增加的生长速度、增加的叶尺寸、增加的根生长、增加的耐旱性和延迟的衰老，所述方法包括用核酸转化植物，所述核酸编码修饰型生长调节因子AtGRF-3、OsGRF-4或GmGRF，并且所述核酸脱离miR396控制，其中所述修饰型生长调节因子GmGRF由SEQ ID No.16表示。

2.根据权利要求l所述的方法，其中，所述核酸包含突变的miR396靶位点。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸为SEQ ID No.2、SEQ ID No.6或SEQ IDNo.16所示的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在miR396靶位点中包含使所述核酸脱离miR396控制的修饰。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸为SEQ ID No.81、SEQ ID No.82或SEQID No.83所示的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在miR396靶位点中包含使所述核酸脱离miR396控制的修饰。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，脱离miR396调节的所述AtGRF-3与AtGIF1的过量表达的组合，显示出增强的性能。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述修饰型AtGRF-3包含具有以下序列的修饰型miR396靶位点：CGTTCxAGAAAxCCxGTxGAx(SEQ ID No.86)，其中x表示已经修饰的碱基。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述修饰型AtGRF-3包含具有以下序列的修饰型miR396靶位点：CGTTCtAGAAAaCCaGTaGAg(SEQ ID No.38)，其中小写字母表示修饰的碱基。