CN112195185B - 一种番茄叶型调控基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种番茄叶型调控基因及应用，将所述SlTCP29基因通过基因编辑产生突变体，所述SlTCP29基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变体包括在SlTCP29基因片段中产生碱基对缺失或增加或碱基对序列改变。与现有技术相比，利用基因编辑的方法获得复叶突变体植株较传统的获得突变体的方法更经济、有效，丰富了种质资源的类型；与已有研究相比，本发明的突变体植株在叶型方面更加复杂，此基因在调控叶型方面有重要作用，为番茄叶型调控又提供了一个新的基因。

Description

一种番茄叶型调控基因及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种番茄叶型调控基因及应用。

背景技术

植物叶片是植物进行光合作用的主要场所，不同植物的叶片类型和大小是不一样的，并且在同一物种、不同个体所产生的叶片也是有区别的。植物叶片与农作物的产量密切相关，同时，植物叶片的形态结构在抗逆境胁迫应答中发挥十分重要的作用。植物叶片总体上分为单叶和复叶，单叶有一个完整的、连续的叶片，而复叶由多个称为小叶的亚基组成，每个亚基类似于单叶。在发育的时间尺度上，单叶分化和展平的速度较快，而复叶在某些方面处于侧枝和单叶之间的中间形态。番茄具有典型的复叶，其叶片类型由简单到复杂，是研究复叶发育的模式植物。

植物叶片的形态建成是一个十分复杂的生理生化过程，受到激素以及多种功能基因和转录因子的调控，可分为三个方面的调控：细胞内调控、细胞间调控、细胞外调控。植物叶片发育的过程包括叶原基分生组织的形成和分化，以及由叶原基最终发育成成熟叶片的整个过程。基于植物叶片的形态建成的复杂性，为能更为方便的研究植物的叶片发育，从基因工程控制叶片形态成为重要的手段。

然而，在基因层面，在目前的研究阶段发现叶片起始过程中主要受到KNOXI家族转录因子、AIL/PLT基因、YABBY家族基因等基因的调控，其中KNOXI蛋白在明确SAM上不同区域的过程中协调多种植物激素的活性，使SAM功能的持续和器官启动之间达到平衡；叶片极性建立的过程中，HD-ZIP超级基因家族发挥了十分重要的功能，HD-ZIP超级基因家族的3个成员REVOLUTA基因、PHAVOLUTA和PHABULOSA基因相互协调表达共同调控了叶原基中腹性分生细胞的发育进程；最终叶片的延展过程，WOX转录因子起着核心作用，这些基因对番茄叶片的复杂性均有不同程度的调控，但番茄复叶发育是一个十分复杂的过程，这其中还有很多重要的调控因子。因此，为了更简单直接的获得番茄复叶体，需要进一步的探究。

发明内容

为更简单直接的控制番茄叶型，本发明提供一种番茄叶型调控基因及应用。

具体技术方法如下：

SlTCP29基因在番茄叶型调控中的应用。

上述SlTCP29基因在番茄叶型调控中的应用，其不同之处在于，将所述SlTCP29基因通过基因编辑产生突变体，所述SlTCP29基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变体包括在SlTCP29基因片段中产生碱基对缺失或增加或碱基对序列改变。

一种番茄叶型调控基因，其不同之处在于，所述番茄叶型调控基因的序列如SEQID NO.2所示或如SEQ ID NO.3所示，所述番茄叶型调控基因通过上述的SlTCP29基因通过基因编辑制备而得。

一种重组载体，其不同之处在于，所述重组载体包括选自上述SlTCP29基因的SlTCP29基因第一靶点片段及SlTCP29基因第二靶点片段，所述SlTCP29基因第一靶点片段序列如SEQ ID NO.4所示，SlTCP29基因第二靶点片段序列SEQ ID NO.5所示。

一种制备上述重组载体的方法，其不同之处在于，所述制备重组载体的方法包括：

利用靶点引物扩增出含有所述SlTCP29基因第一靶点片段及所述SlTCP29基因第二靶点片段的待转入基因片段，将所述待转入基因片段插入线性化的转入载体中，进行连接后，转入大肠杆菌，经过抽提后得到所述重组载体。

进一步，所述SlTCP29基因第一靶点片段的引物序列如SEQ ID NO.6所示，所述SlTCP29基因第二靶点片段的引物序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步，所述转入载体为PTX041质粒，使用BsaI将PTX041质粒酶切进行线性化处理。

一种调控番茄叶型的方法，其不同之处在于，所述调控番茄叶型的方法包括：

步骤S1：将上述的的重组载体转入至农杆菌；

步骤S2：将转入所述重组载体的农杆菌浸染番茄苗子叶。

进一步，所述番茄苗子叶由番茄种子经无菌培养后，切取7d～8d苗龄无菌苗子叶而得。

一种杉树番茄叶型调控基因在调控番茄功能基因中的应用，其不同之处在于，所述番茄功能基因包括TCP2、pts、tf、goblet、mouse ear/curl、JERF3以及AN2中的一种或多种。

进一步，所述番茄叶型调控基因调控TCP2转录水平降低，调控pts、tf、goblet、mouse ear/curl、JERF3以及AN2转录水平升高。

与现有技术相比，利用基因编辑的方法获得复叶突变体植株较传统的获得突变体的方法更经济、有效，丰富了种质资源的类型；与已有研究相比，本发明的突变体植株在叶型方面更加复杂，此基因在调控叶型方面有重要作用，为番茄叶型调控又提供了新的基因。

附图说明

图1重组载体构建过程；

图2阳性苗PCR检测结果；

图3阳性苗测序比对结果。

图4为叶片表型图；

图5为复叶发育相关基因在转基因T0代以及对照中的表达；

图6为复叶发育相关基因在转基因T0代以及对照中的表达。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

基因编辑首先根据基因芯片注释的(部分)基因信息(Http://solgenomics.net/tomato/)，在(http://www.rgenome.net/)上对SlTCP29的cDNA进行Cas9靶点分析，设计双靶点的引物。

利用GENESCAN对该基因序列分析，结果表明，该基因序列全长包含1312个核苷酸，翻译成蛋白质后包含326个氨基酸，序列见SEQ ID NO：8。该基因含2个内含子。具有TCP转录因子的保守结构域(见序列表SEQ ID NO.1)。利用BLAST软件(程序)在SGN数据库上进行搜索，发现本发明基因序列与SlTCP24同源性很高，达到89.9％。

从中选择SlTCP29基因第一靶点片段及SlTCP29基因第二靶点片段，所述SlTCP29基因第一靶点片段序列如SEQ ID NO.4所示，SlTCP29基因第二靶点片段序列SEQ ID NO.5所示。

第一个靶点的引物序列如SEQ ID NO.6和第二个靶点的引物如SEQ ID NO.7所示，通过PCR的方法，从pCBC_DT1T2_SlU6p质粒(来自中国农科院蔬菜花卉研究所崔霞课题组，Song J,Zhang S,Wang X,et al.Variations in Both FTL1and SP5G,Two Tomato FTParalogs,Control Day-Neutral Flowering[J].MolecularPlant,2020,13(7))中扩增出一条长608bp的序列。扩增方法是用小量法提取pCBC_DT1T2_SlU6p质粒(试剂盒购自OMEGA公司，具体程序见说明书)，以质粒为模板，采用一步法扩增，将扩增产物用回收试剂盒(购自OMEGA公司，具体程序见说明书)回收目的片段。

扩增反应体系如下：

反应程序如下：

变性、退火及延伸过程进行35个循环。

实施例2

重组载体制备

用BsaI(NEB)将PTX041质粒(由中国科学院遗传与发育生物研究所李传友所在课题组提供，即Deng,L.,Wang,H.,Sun,C.,Li,Q.,Jiang,H.,Du,M.,Li,C.-B.and Li,C.(2018)Efficient generation of pink-fruited tomatoes using CRISPR/Cas9system.Journal of Genetics and Genomics,45,51-54.)酶切(37℃，>3h)，酶切产物1.0％琼脂糖胶检测并用回收试剂盒切胶回收PTX041(18K)大片段，带有两个靶点的片段与载体以1:1的比例混合，加入Exnase II 1μL，5X CE II Buffer 2μL，线性化克隆载体25ng～100ng，插入片段扩增产物10ng～100ng，无菌水补充体积至10μL。37℃连接30min，全部连接产物用热激法转化大肠杆菌TransT1，Kan抗性LB平板筛选阳性克隆，挑斑摇菌，对液体菌液进行PCR检测。检测所用前引物PTX-FW为：AGCGGATAACAATTTCACACAGGA，检测所用后引物PTX-RV为GCAGGCATGCAAGCTTATTGG，PCR产物用1.0％琼脂糖胶检测，空载片段大小为1820bp，而具有双靶点的载体为1169bp。将检测具有双靶点的菌液送公司测序(天一辉远)。进行序列比对，将菌液小摇，用小量法提取质粒。载体构建过程见图1。

实施例3

遗传转化

对获得的重组克隆利用电转化仪在1800V的电压下转化农杆菌GV3101，用含Rif100mg/L，Km 50mg/L的LB固体平板筛选，挑选阳性克隆，28℃、200r/min振荡培养过夜，取1μL农杆菌液作为模板，以载体引物PTX-FW及PTX-RV进行PCR检测。

番茄种子Ailsa Craig(简称A57，为美国番茄遗传资源中心的产品)，经次氯酸钠消毒15min(其中有效氯为2％)，播种于1/2MS培养基上(pH＝5.8)，于25±2℃，黑暗条件下培养直至种子发芽，转入光照强度为1800lx，16h光/8h暗的光周期条件下进行培养。切取7-8d苗龄无菌苗子叶预培养2d(培养基为MS，pH＝5.8)。MS0重悬至OD600≈0.5的农杆菌液浸染3-5min，用灭菌滤纸吸干多余菌液，重新置回预培养基上，黑暗条件下共培养2d，转入到筛选培养基1.0ZR(MS+ZR(玉米素核苷)1.0mg/L+Cef(头孢霉素)400mg/L+Km(卡拉霉素)100mg/L)上进行抗性筛选，每两周继代一次，抗性芽出现后将外植体转入0.2ZR+Cef(头孢霉素)200mg/L+Km(卡拉霉素)100mg/L培养基中。于20～30d后切下抗性芽，插入到生根培养基(RM)中诱导生根，根系发达的植株移栽花钵。具体培养基配方见表1。

表1番茄遗传转化培养基配方

注：以上培养基中除MS0外均含琼脂7.4g/L，所有培养基pH＝5.8

实施例4

阳性苗检测及基因编辑检测

通过遗传转化，得到了6棵转化的苗子，对其进行阳性检测及基因编辑检测，具体操作方法如下：首先CTAB法提取番茄的gDNA，通过PCR的方法检测他们的阳性，以番茄gDNA为模板，以PTX-FW为前引物，以PTX-RV为后引物扩增，发现6棵植株均出现了1169bp的条带，说明他们均是阳性苗。PCR检测结果见图2，图中1～8为转基因T0代编号。

接着扩增包括两个靶点在内的485bp，前引物为5'TCCAAGAATGAGTAACAAGG 3'，后引物为5'AAAGTGACAATCCAGAACC 3'，1％琼脂糖凝胶检测，PCR产物送测序，测序比对发现有五株均有基因编辑存在。

测序比对结果见图3，得到两种突变体基因，其序列分别如SEQ ID NO.2及SEQ IDNO.3所示，其中，带有SEQ ID NO.2突变基因植株命名为TCP29-CR-3(简称CR-3)，带有SEQID NO：3突变基因植株命名为TCP29-CR-6(简称CR-6)。

实施例5

基因功能鉴定

基因功能鉴定步骤如下：

RNA 提取及反转录

用Trizol一步法提取叶片总RNA。用PrimeScript TM RT Reagent Kit反转录成cDNA，具体操作参照试剂盒说明书。反转录后用β-actin正反向引物做PCR检测反转录是否成功。然后用Nanodrop 2000测定cDNA浓度，并将浓度统一调至100ng/ul左右，-20℃保存备用。

β-actin正向引物为5’ATGGCAGACGGAGAGGATATTCA 3’，

反向引物为5’GCCTTTGCAATCCACATCTGCTG 3’；

Real-time PCR

Real-time PCR反应体系为：SYBR Mix 5ul，正反向引物(10nmol/L)各0.5ul，样品cDNA4ul；反应程序为：95℃30s，95℃5s，55℃10s，72℃15s，共45个循环(若溶解曲线起峰时间晚于30个循环，另外增加10个循环)，40℃冷却10s，之后进行溶解曲线的采集与分析，每个样品进行三次技术重复，以番茄内源actin基因(GenBank accession no.BT013524)作为内参。得到的数据用ΔΔCt方法进行分析，检测结果如下：

5.1基因编辑植株的表型鉴定

为了验证调控基因在番茄叶片发育方面的功能，申请人对基因被编辑植株和对照植株(基因未编辑植株A75)的成熟叶片进行比较，发现被编辑植株与对照植株相比，其小叶增加，叶型更加复杂。且由于叶片持续发育，果实成熟相对落后。叶片表型见图4。

试验结果表明，番茄SlTCP29基因在番茄复叶发育过程中功能显著，是一个可望在番茄上应用的叶型功能基因。

5.2番茄叶型调控基因互作基因预测

5.2.1预测的互作基因在突变体以及对照中的表达分析

在十个预测的蛋白中，检测出了其中八个基因的表达(见图5)。与对照相比，其中仅JERF3以及AN2两个基因的转录水平有明显的升高，其余基因的的转录水平无明显差别，JERF3是是一个茉莉酸与乙烯的响应因子，在番茄中它能被茉莉酸、乙烯、低温、盐、ABA诱导(Hui Wang et al.,2004)。说明被编辑植株中的茉莉酸或者乙烯等含量可能发生改变。AN2是一个R2R3MYB转录因子，已报道它能够促进番茄果实中花青素的积累并且能提高番茄挥发性香气的产生(Wei Jian et al.,2019)，另外还能调控番茄的耐热性(Xia Meng etal.,2015)。

5.2.2已报道的调控番茄复叶发育的基因在基因编辑植株以及对照中的表达分析

目前已报道的调控番茄复叶发育的基因有：potato leaf、mouse ear/curl、lyrate、goblet、pts、bip、la、tf、clau。

经过qPCR发现，potato leaf、lyrate的转录水平没有检测出来，可能是因为这两个基因在所取的样品中本体转录水平低。BIP的转录水平在基因编辑植株和对照中没有显著差别。与对照相比，TCP2在基因编辑植株中的转录水平降低，pts、tf、goblet、mouse ear/curl等基因的转录水平显著上调，而这五个基因的转录水平的变化均与之前报道吻合，即与表型是吻合的(见图6)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种番茄叶型调控基因及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1312

<212> DNA

<213> 番茄(Tomato)

<400> 1

tgaaagttgt gctagtatgg agatgtaaga gaaggagtgc aaatttccaa gaatgagtaa 60

caaggaggat gagcagtatg atgttggaga agtcaaaaag agtggtgacc taggtggtgg 120

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tgtatctttt gtcttttaaa cttcaatcag ttatataatc tatactcttt tc 1312

<210> 2

<211> 1313

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaaagttgt gctagtatgg agatgtaaga gaaggagtgc aaatttccaa gaatgagtaa 60

caaggaggat gagcagtatg atgttggaga agtcaaaaag agtggtgacc taggtggtgg 120

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ataacaacaa taacaagact agtgttaatg atgaccaaaa cacaccgaga caatggtcta 720

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tagttccagt tgtgacaagt agtaataacg agtataattt gaacttcagc atttcttctt 900

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gttatcagag gtacggatca tatcttggtt ccacaactgg atatgacaac cagcattcag 1020

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ttatactagg gaagctccat agttgaaagt tgaattacaa aaatatccct aatcattttt 1200

aaaataatta ctttgtcctg atcatttaac taatgtatca aacttttcct attacaatat 1260

ttgtatcttt tgtcttttaa acttcaatca gttatataat ctatactctt ttc 1313

<210> 3

<211> 1311

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgaaagttgt gctagtatgg agatgtaaga gaaggagtgc aaatttccaa gaatgagtaa 60

caaggaggat gagcagtatg atgttggaga agtcaaaaag agtggtgacc taggtggtgg 120

gattgggaaa ttatatggtt ggcctacatc aagaattgtt agagtttctc gtgcatctgg 180

aggaaaagat aggcatagca aagtattgac ttcaaagggg ttaagagaca gacgtgttcg 240

tctttctgtc aatactgcta tacagttcta tgatttgcaa gacctcttgg ctgtgatcag 300

cccagcaagg ttgtagagtg gttgttaaaa gcagccgctc cttcaatcgc tgagcttcca 360

cctcttgagg atcttcaaga tacactgcag ctcagcaatg agaaaagatc aagtgagcat 420

ggttttgatt cagctgatgt tgaaatggat gatgatctta attataataa tcagcaacaa 480

ccaagttgta gcaattctga gactagcaaa ggttctggat tgtcactttc cagatctgat 540

agtcgagtca aggcacggga gcgagcaagg gaaagggcta cagagaaagt tgctaatcat 600

caccgaaata tgcaccctag ctcatcattt acggagctat tgactggtgg tatgagcgat 660

aacaacaata acaagactag tgttaatgat gaccaaaaca caccgagaca atggtctaca 720

aatcccttgg agtattttac tgacggacaa atttatttgg gaaatacatt aagaccagtg 780

tctccaccaa tgtttagcat tacaggtgag atgcagcatt tcccattcgg cggcgaccta 840

gttccagttg tgacaagtag taataacgag tataatttga acttcagcat ttcttcttca 900

tcgtcatctg gtttcaatag ggggaccctt cagtccaatt cttcctctac tttgcctcgt 960

tatcagaggt acggatcata tcttggttcc acaactggat atgacaacca gcattcagat 1020

cagaaaggaa aagaaaagaa gtaacttcaa gttccatctg gtaattctaa atggaagcag 1080

cctcaaagtc ccaaaggaag cacccatata tgcttttctc tgctacaggc ttatcatatt 1140

atactaggga agctccatag ttgaaagttg aattacaaaa atatccctaa tcatttttaa 1200

aataattact ttgtcctgat catttaacta atgtatcaaa cttttcctat tacaatattt 1260

gtatcttttg tcttttaaac ttcaatcagt tatataatct atactctttt c 1311

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 番茄(Tomato)

<400> 4

ttagagtttc tcgtgcatct gg 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 番茄(Tomato)

<400> 5

atgatttgca agaccgtctt gg 22

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaatctaaca gtgtagtttg ttagagtttc tcgtgcatcg ttttagagct agaaatagc 59

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctatttcta gctctaaaac agacggtctt gcaaatcatc aaactacact gttagattc 59

<210> 8

<211> 330

<212> PRT

<213> 番茄(Tomato)

<400> 8

Met Ser Asn Lys Glu Asp Glu Gln Tyr Asp Val Gly Glu Val Lys Lys

1 5 10 15

Ser Gly Asp Leu Gly Gly Gly Ile Gly Lys Leu Tyr Gly Trp Pro Thr

20 25 30

Ser Arg Ile Val Arg Val Ser Arg Ala Ser Gly Gly Lys Asp Arg His

35 40 45

Ser Lys Val Leu Thr Ser Lys Gly Leu Arg Asp Arg Arg Val Arg Leu

50 55 60

Ser Val Asn Thr Ala Ile Gln Phe Tyr Asp Leu Gln Asp Arg Leu Gly

65 70 75 80

Cys Asp Gln Pro Ser Lys Val Val Glu Trp Leu Leu Lys Ala Ala Ala

85 90 95

Pro Ser Ile Ala Glu Leu Pro Pro Leu Glu Asp Leu Gln Asp Thr Leu

100 105 110

Gln Leu Ser Asn Glu Lys Arg Ser Ser Glu His Gly Phe Asp Ser Ala

115 120 125

Asp Val Glu Met Asp Asp Asp Leu Asn Tyr Asn Asn Gln Gln Gln Pro

130 135 140

Ser Cys Ser Asn Ser Glu Thr Ser Lys Gly Ser Gly Leu Ser Leu Ser

145 150 155 160

Arg Ser Asp Ser Arg Val Lys Ala Arg Glu Arg Ala Arg Glu Arg Ala

165 170 175

Thr Glu Lys Val Ala Asn His His Arg Asn Met His Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Phe Thr Glu Leu Leu Thr Gly Gly Met Ser Asp Asn Asn Asn Asn Lys

195 200 205

Thr Ser Val Asn Asp Asp Gln Asn Thr Pro Arg Gln Trp Ser Thr Asn

210 215 220

Pro Leu Glu Tyr Phe Thr Asp Gly Gln Ile Tyr Leu Gly Asn Thr Leu

225 230 235 240

Arg Pro Val Ser Pro Pro Met Phe Ser Ile Thr Gly Glu Met Gln His

245 250 255

Phe Pro Phe Gly Gly Asp Leu Val Pro Val Val Thr Ser Ser Asn Asn

260 265 270

Glu Tyr Asn Leu Asn Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Phe

275 280 285

Asn Arg Gly Thr Leu Gln Ser Asn Ser Ser Ser Thr Leu Pro Arg Tyr

290 295 300

Gln Arg Tyr Gly Ser Tyr Leu Gly Ser Thr Thr Gly Tyr Asp Asn Gln

305 310 315 320

His Ser Asp Gln Lys Gly Lys Glu Lys Lys

325 330

Claims (1)

1.番茄SlTCP29基因突变体在增加番茄叶型复杂度中的应用，所述番茄SlTCP29基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或如SEQ ID NO.3所示。

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