CN110964731B

CN110964731B - 番茄茸毛调控基因的克隆及应用

Info

Publication number: CN110964731B
Application number: CN201911359832.1A
Authority: CN
Inventors: 叶志彪; 解庆敏; 杨长宪; 张俊红; 张余洋; 王涛涛; 欧阳波; 李汉霞; 卢永恩
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN110964731A

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种番茄茸毛调控基因的克隆和应用。该番茄茸毛调控的基因的序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示，SEQ ID NO：1所示序列与其背景材料TS212相比发生了单碱基的突变，由胞嘧啶(C‑1676)变成了腺嘌呤(A)；与SEQ ID NO：2相比，突变体LA3127存在两个突变位点，第436位由G突变为A，第1676位由C突变为A；与LA1589相比，LA3127发生了多个位点的突变，其中第1676位同样由C突变为A。Ln基因的编码区由胞嘧啶(C‑1676)变成了腺嘌呤(A)，导致了丙氨酸(Ala‑559)到谷氨酸(Glu)的转变，进而诱导腺体毛的显著增加。本发明所克隆的Ln基因能够诱导腺体毛的显著增加，利用克隆的Ln基因的超量表达，可以增强番茄的抗虫性和抗病毒能力，对于番茄育种具有重要的意义。

Description

番茄茸毛调控基因的克隆及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种番茄茸毛调控基因的克隆和应用。

背景技术

表皮毛广泛存在于各种植物器官的表面，是一种由表皮细胞特化而成的毛状结构，是研究细胞命运决定、细胞周期调控和细胞形态发生的经典模式。表皮毛的形态多种多样，根据物种不同可以分为单细胞表皮毛或多细胞表皮毛；腺体毛或非腺体毛；分支或不分支。表皮毛作为植物表皮的第一层屏障，可以帮助植物抵御病虫及微生物的危害，减少紫外线的伤害，降低水分蒸腾速率，促进植株对水分和营养的吸收，减少机械损伤，维持植物体表温度，对植物抵御各种生物逆境和非生物逆境具有积极地作用。

番茄具有七种类型的表皮毛，其腺体毛在抗虫方面具有重要作用。I型和IV型腺体毛分泌的酰基糖可以驱避棉铃虫、甜菜夜蛾、烟粉虱、蚜虫等害虫；VI型腺体毛可以分泌甲基酮化合物和萜类化合物，对植食性甲虫、蓟马等具有抗性。

番茄腺体毛存在广泛，具有重要的抗虫防止病毒的作用，虽然目前关于番茄腺体毛形成的关键调控基因研究获得一定的进展，比如克隆了Wo基因、H基因、SlCycB2等基因。但是，番茄腺体毛形成的调控机理仍不明确，需要克隆更多的调控基因，完善番茄腺体毛形成的分子机理，同时对于番茄育种具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种番茄茸毛调控的基因及该基因的应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明利用(Ln)突变体LA3127与IL3-2杂交，得到F1代及F2代，通过对F1代和F2代的表型进行分析，得到Ln基因为单基因不完全显性遗传，利用图位克隆的方法首次分离鉴定了Ln基因，该基因的序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。本发明所克隆的Ln基因与其背景材料TS212相比发生了单碱基的突变，由胞嘧啶(C-1676)变成了腺嘌呤(A)；与AC相比，突变体LA3127存在两个突变位点，第436位由G突变为A，第1676位由C突变为A；与LA1589相比，LA3127发生了多个位点的突变，其中第1676位同样由C突变为A。氨基酸比对结果显示，与突变体LA3127相比，AC、TS212和LA1589在559位的氨基酸同时发生了突变，由此我们推测(AC、TS212和LA1589)第1676位碱基C突变为A，造成了丙氨酸(Ala-559)到谷氨酸(Glu)的转变，最终导致了该表型的出现。该基因ORF全长2202bp，包含10个外显子，9个内含子；编码734aa，包含四个保守结构域，分别为HD box、bZipmotif、START domain和SAD domain。

本发明所克隆的Ln基因能够诱导腺体毛的显著增加，利用克隆的Ln基因的超量表达，可以增强番茄的抗虫性和抗病毒能力，对于番茄育种具有重要的意义。

本发明同时克隆得到了其隐性等位基因ln，该基因的序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的氨基酸的序列如SEQ ID NO：4所示，该基因的克隆对于番茄育种研究具有重要的意义。

附图说明

图1为对照材料AC与多毛突变体LA3127表型肉眼观察图。

图2为对照材料AC(A和B)和LA3127(C和D)表皮毛扫描电镜图；其中A和C：叶片；B和D：茎。

图3为Ln基因在番茄不同图谱中的相对位置；其中左边：IL图谱、中间：分子遗传图谱、右边：经典图谱。

图4为Ln基因的图位克隆；其中(A)为3号染色体各渐渗系图谱；(B)为Ln基因的粗定位；(C)为Ln基因的精细定位；(D)为Ln基因的候选基因。

图5为ORF7氨基酸序列多态性分析；方框表示AC、TS212和LA1589共同的氨基酸突变位点，三角表示LA1589的氨基酸突变位点。

图6为转基因植株中Ln基因的表达量分析。

图7为Ln基因转基因植株表型图；其中(A)和(E)：AC；(B)：LA3127；(C)和(F)：35S::Ln转基因植株；(D)：Ln-CR转基因植株。

图8为Ln基因在AC和LA3127不同组织中的表达量分析。

图9为AC、LA3127、TS212、LA1589基因序列的比对示意图；

图10为pHellsgate8载体的图谱；

图11为pTX041载体示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1分离群体构建

本研究所用到的番茄材料有常规栽培品种Ailsa Craig(AC)，Lanata(Ln)突变体LA3127，潘那利番茄(S.pennellii)/栽培番茄(S.lycopersicum)M82杂交成的渐渗系IL3-2，LA1589为醋栗番茄，突变体引自于番茄遗传资源中心(TGRC)。

番茄表皮存在七种类型的表皮毛，包括腺体毛和非腺体毛。其中，Ⅰ型腺体毛最长，肉眼可见。Ln突变体LA3127的叶片和茎上附有一层浓密的表皮毛，叶片呈现白色，表皮毛数量明显增多(图1)。为了进一步确定Ln突变体是哪种类型的表皮毛增多，我们对突变体LA3127和对照材料Alisa Craig(AC)进行了扫描电镜的观察。结果发现：与对照材料AC相比，突变体LA3127的表皮毛形态没有发生变化，多为单茸毛，叶片和茎上具有高密度的Ⅰ型腺体毛，且有少数簇状腺体毛产生，即一个基部产生2根或3根Ⅰ型腺体毛(图2)。

渐渗系IL3-2表现出肉眼可见的表皮毛性状。

AC材料表现出肉眼可见的表皮毛性状。

LA1589为醋栗番茄。

Ln突变体相对于正常番茄植株表皮毛明显增多，差异显著，作为形态学标记Ln基因被定位于第三条染色体。通过分析番茄第三条染色体的ILs图谱(S.pennellii/S.lycopersicum var.M82)与番茄高密度分子遗传连锁图谱，进一步明确了Ln位于第三条染色体的短臂区域(图3)。因此，我们利用突变体LA3127为母本，IL3-2为父本进行杂交构建了F2分离群体，用于Ln基因的定位和遗传性分析。

LA3127与IL3-2杂交得到F1，F1植株表皮毛数量明显增多。该F2分离群体中，表皮毛性状表现为3种类型，与突变体LA3127完全相同的浓密多毛类型，与F1植株表现相同的多毛类型以及与亲本IL3-2相同的普通茸毛类型。根据孟德尔遗传理论得出，纯合浓密多毛基因型LnLn相对于普通茸毛类型基因型lnln，该基因为单基因不完全显性遗传。F2分离群体基因型理论分离比为LnLn：Lnln：lnln＝1：2：1，145株F2分离群体中，浓密多毛类型：多毛类型：普通茸毛类型＝30：78：37(χ2＝1.51,P>0.05)，经χ2测验表明，该基因理论分离比与实际分离比符合孟德尔遗传规律，Ln基因为单基因不完全显性遗传。

实施例2分子标记的开发

根据番茄经典图谱和高密度分子遗传图谱，Ln基因被定位于三号染色体短臂上，IL3-2对应区段在TG517与TG366两标记之间(图3)。为了方便开发分子标记，我们根据番茄Heizl1706和LA1589及S.pennellii参考基因组序列的差异设计Indel分子标记。根据TG517与TG366之间相对应的物理位置，设计这段区间内的Indel标记，筛选出两亲本之间具有稳定多态性的分子标记10对，用于Ln基因定位，定位标记信息见表1。

表1 Ln基因定位分子标记信息

实施例3 Ln基因的定位

从LA3127和IL3-2构建的F2分离群体中筛选出116株正常表皮毛的单株。利用在TG517与TG366之间开发出的具有稳定多态性的Indel标记对116株单株进行基因型分析，结果表明Ln基因定位于分子标记LMP-4和LMP-8之间(图4B)，分别有4个和2个交换。根据两标记LMP-4和LMP-8的物理位置，Ln基因定位于三号染色体2642776和5097282之间约为2.35Mb的范围内。

鉴于初步定位的结果，Ln基因定位于分子标记LMP-4和LMP-8之间。由于LA3127和IL3-2构建的F2分离群体所收种子较少，因此，我们采用以LA3127为母本和LA1589为父本构建的F2分离群体对Ln基因进行进一步定位。

从LA3127和LA1589构建的F2分离群体中分离出的1243株单株，利用粗定位的两个侧翼标记LMP-4和LMP-8对1243个单株进行基因型检测，筛选出基因型发生重组交换的单株。结果表明Ln基因与LMP-4标记之间发生了45个交换，与LMP-8标记之间发生了21个交换，共筛选出66个重组交换单株。为了进一步确定Ln基因所在区段，根据Heizl1706和LA1589的参考序列在第三号染色体LMP-4(2642776)和LMP-8(5097282)的区段内开发分子标记，筛选出6对在LA1589和LA3127之间具有稳定多态性的分子标记，其中包括5个Indel标记和1个CAPS标记，分别为LM-3，LM-4，LM-5，LM-6，LMP-12和LM-11(表1)。利用LM-3，LM-4，LM-5，LM-6，LMP-12和LM-11对66个重组交换单株进行基因型分析，结果发现Ln基因被定位于LMP-12和LM-5两标记之间，其中与标记LMP-12之间发生了5个交换，与标记LM-5之间发生了2个交换，与分子标记LM-11共分离(图4C)，即Ln基因被定位于三号染色体LMP-12和LM-5两标记之间约为136Kb的范围内。

实施例4 Ln基因的候选基因

Ln基因被定位于番茄三号染色体136K的范围内，根据番茄基因组注释信息，该区间共有14个预测基因的ORFs(Open Reading Frames)(表2)。同时，我们利用基因预测软件FGENESH(http://softberry.com)和GENESCAN(http://genes.mit.edu/)对该区间内的基因进行预测，预测结果显示其结果与番茄基因组注释一致。14个预测基因中，ORF9编码一个未知蛋白。其他13个基因分别为ABC转运体FeS组装蛋白、Genomic DNA chromosome 5 P1clone MBG8、RNA结合蛋白45、β-葡萄糖苷酶、磷酸盐转运蛋白、液泡分拣蛋白、亮氨酸拉链蛋白ATHB-14、镁转运蛋白1、木葡聚糖内切葡聚糖酶/水解酶1、翻译起始因子SUI1、酪胺酰基-DNA磷酸二酯酶和锌脂蛋白等。将该区间中的14个候选基因进行蛋白比对分析，发现ORF7与番茄Woolly基因具有较高的同源性，因此我们将ORF7作为可能的候选基因。

表2 Ln基因的候选基因

实施例5 Ln基因序列的多态性分析

为了验证ORF7为目的基因Ln，我们在突变体LA3127、AC、LA1589和TS212(Ln突变体的背景材料，为正常表型，来源于番茄遗传资源中心(TGRC))等材料中进行cDNA全长序列扩增。经过测序和序列比对分析发现，突变体LA3127相对于背景材料TS212发生了单碱基的突变，由胞嘧啶(C-1676)变成了腺嘌呤(A)；与AC相比，突变体LA3127存在两个突变位点，第436位由G突变为A，第1676位由C突变为A；与LA1589相比，LA3127发生了多个位点的突变，其中第1676位同样由C突变为A(图9)。氨基酸比对结果显示LA1589发生了多个氨基酸位点的突变，与突变体LA3127相比，AC、TS212和LA1589在559位的氨基酸同时发生了突变，由此我们推测(AC、TS212和LA1589材料中)第1676位碱基C突变为A，造成了丙氨酸(Ala-559)到谷氨酸(Glu)的转变，最终导致了该表型的出现。该基因ORF全长2202bp，包含10个外显子，9个内含子；编码734aa，包含四个保守结构域，分别为HD box、bZipmotif、START domain和SADdomain(图5)。

实施例6 Ln候选基因的功能互补验证及表型分析

为了验证ORF7控制番茄多毛的表型，我们进行了转基因的功能互补实验和Cas9敲除实验，通过观察功能互补的转基因植株的表型，从而确定其功能。

(1)超量表达载体的构建

超量表达载体的构建采用同源重组的方法将目的基因连接到pHellsgate8载体(图10所示)上。利用高保真酶以多毛突变体LA3127的cDNA为模板扩增获得ORF7基因，超量引物Ln-OE(Ln-OE-FW:5'CATTTGGAGAGGACACGCTCGAGATGTTTCAGCCAAATATGTT 3'，见SEQ IDNO：27,Ln-OE-RV:5'TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGATCATAAAGCACTGTCACAAGCT 3'，见SEQ IDNO：28)以35S(35S:5'ACGCACAATCCCACTATCCTTC 3'，见SEQ ID NO：29)进行驱动，构建超量表达载体35S::Ln。

PCR扩增体系包括2×Phanta buffer 25μL、dNTPs 1μL、正反向引物(10μM)各2μL、Phanta enzyme 1μL、模板2μL、无菌水17μL。反应程序为95℃预变性3min、95℃15s、56℃15s、72℃1min 20s，35个循环，72℃延伸5min。将超量表达载体pHellsgate8用XhoI和XbaI进行双酶切，双酶切反应体系为50μL，XhoI和XbaI各2μL，pHellsgate8质粒20μL，Buffer 10μL，无菌水16μL，37℃孵育2小时，PCR产物回收纯化。

利用同源重组试剂盒(

ⅡOne Step Cloning Kit)将回收产物与线性载体重组连接，10μL重组连接体系中加入5×CE II Buffer 2μL，Ln片段1μL，pHellsgate8载体片段1μL，重组酶Exnase II 1μL，5μL无菌水，混匀后37℃连接30min，热激法转化大肠杆菌Transone T1(全式金，北京)，挑取单克隆，PCR扩增检测并测序，选择正确的单克隆进行扩繁并抽提质粒。通过电激法将质粒转入农杆菌感受态C58中，挑单克隆检测并保存，用于后续遗传转化。

(2)CRISPR/Cas9系统双源表达载体的构建

利用CRISPR/Cas9系统，通过破坏Ln基因获得相应的敲除株系。利用在线软件CCTop-CRISPR/Cas9 target online predictor(http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/)设计Ln基因的sgRNA靶标序列Ln-Cas9-FW:5'GAATCTAACAGTGTAGTTTGGGCTGGTAGGAGGAAGATTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC 3',见SEQ ID NO：30；Ln-Cas9-RV:5'GCTATTTCTAGCTCTAAAACTATGGATTACAGGCCCAGACAAACTACACTGT TAGATTC 3'，见SEQ ID NO：31，通过同源重组反应构建CRISPR/Cas9系统双元表达载体pTX041。使用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增获得双sgRN A产物，反应体系为50μL，包含2×Phanta buffer 25μL、dNTPs 1μL、正反向引物(10μM)各2μL、Phanta enzyme 1μL、模板2μL、无菌水17μL。反应程序为95℃预变性3min、95℃15s、56℃15s、72℃30s，35个循环，72℃延伸5min。将pTX041用BsaI酶切(37℃，>3h)，酶切体系为50μL，BsaI 2μL，pTX041质粒30μL，Buffer 10μL，无菌水8μL，37℃孵育4小时，PCR产物回收纯化。利用同源重组酶将回收产物与pTX041线性载体重组连接，10μL重组连接体系中加入5×CE II Buffer2μL，双sgRNA产物片段1μL，pTX041线性载体4μL，重组酶Exnase II1μL，2μL无菌水，混匀后37℃连接30min，热激法转化大肠杆菌Transone T1，挑取单克隆进行测序，选择正确的单克隆进行扩繁抽提质粒。通过电激法将质粒转入农杆菌感受态C58中，挑单克隆检测并保存，用于后续遗传转化。

(3)遗传转化

本研究中采用农杆菌介导的遗传转化方法，以Ailsa Craig为受体材料，进行超量表达载体35S::Ln和CRISPR载体Ln-Cas9的遗传转化。具体转化流程可参考欧阳波老师等建立的番茄高效遗传转化体系。基本过程总结：番茄成熟种子用水浸泡几小时，75％酒精消毒30s，经50％84消毒液处理15min(于摇床中进行)，播种于1/2MS培养基上，切取6-8d苗龄无菌苗的子叶，暗环境中培养一天。以农杆菌悬浮液重悬收集的农杆菌(过表达载体和敲除载体均转化AC，得到两类不同的转基因株系)浸染外植体4min，黑暗条件下共培养2d。将外植体转移到筛选培养基I进行诱导分化，愈伤组织形成后转移到筛选培养基II。抗生素筛选后将具有生长点的幼苗，转入生根培养基中诱导生根，将生根的组培苗转移到基质中驯化培养，最后移至温室中栽培。

(4)转基因植株的获得及表达分析

本研究中选择35S正向引物和基因反向引物(35S:5'ACGCACAATCCCACTATCCTTC3'，见SEQ ID NO：32；Ln-RV：5'TCATAAAGCACTGTCACAAGCT 3'，见SEQ ID NO：33)对超量转基因植株进行阳性检测获得8株超表达阳性植株。检测过程中分别设置阴性及阳性对照，防止污染。PCR反应体系为20μL，包含10×Taq buffer 2μL、10mM dNTPs 0.4μL、正反向引物(10μM)各0.4μL、Taq polymerase 0.2μL、模板1μL、无菌水15.6μL。反应程序为：94℃预变性3min、94℃30s、56℃30s、72℃4min，35个循环，72℃延伸5min。

基因敲除转基因植株的检测，以PTX正、反向引物(引物序列：pTX-Fw：5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3'，见SEQ ID NO：34；pTX-RV：5'GCAGGCATGCAAGCTTATTGG 3'，SEQ ID NO：35)对Cas9敲除株系进行阳性检测，获得阳性植株20株。根据Ln的拷贝序列，利用软件设计涵盖sgRNA靶标序列的测序引物Ln-Cas9-CX(Ln-Cas9-CX-FW:5'TCGATGAGCAACATTTGAGG 3'，SEQ ID NO：36；Ln-Cas9-CX-RV:5'CAATGCCTCGAGGAAAAGTC 3'，SEQ ID NO：37)。以转基因番茄叶片DNA为模板，用Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase(Vayzme,China)高保真酶扩增相应的PCR片段，进行测序，获得其编辑位点。PCR反应体系为25μL，包含2×Phanta buffer 12.5μL、dNTPs 0.5μL、正反向引物(10μM)各1μL、Phanta enzyme 0.5μL、模板1μL、无菌水8.5μL。反应程序为95℃预变性3min、95℃15s、56℃15s、72℃1min，35个循环，72℃延伸5min。进一步对阳性植株进行测序，分析Cas9的敲除位点。

设计ORF7的qRT-PCR引物Ln-qPCR(Ln-qPCR-FW:5'AATCTTCCTCCTACCAGCCC 3'，SEQID NO：38；Ln-qPCR-RV:5'AAGGTCACCAGCACTGTACA 3'，SEQ ID NO：39)，对部分转基因阳性植株进行表达量分析。反应体系为10μL,包括SYBR Green I Master Mix 5μL、正反向引物(10μM)各0.5μL、模板4μL。反应程序：95℃5min，95℃5sec，58℃15sec，72℃20sec，共40个循环。实验所产生的数据由LightCycler 480Real-time PCR检测系统输出后于Excel中进行计算分析。

结果显示，与AC相比，超量表达植株目的基因提高的倍数高低不一，超量表达倍数越高，其表型越明显，Cas9敲除表达株系中目的基因的表达量显著降低(图6)。

(5)转基因植株的表型观察

Ln基因的多毛性状由显性单基因控制。如果基因候选正确，在正常番茄AilsaCraig中超量表达ORF7获得的转基因植株表皮毛会增多，而在Ailsa Craig中敲除该基因会使表皮毛减少。观察发现，8株超量表达阳性植株中有4株表皮毛显著增多且叶片呈现白色，另外4株相对于受体材料，表皮毛同样增多；20株敲除转基因植株T₀代中有3株双链同时被编辑的植株的表皮毛显著减少(图7)，8株只有单链进行了编辑的植株在自交后分离获得的纯合T1代植株的皮毛均显著减少，结果表明，ORF7即为Ln基因。

(6)Ln基因特征分析

为了探究Ln基因的表达模式，我们分别提取Ailsa Craig和突变体LA3127不同组织的RNA，包括根、茎、茎表皮、叶、花和幼果，进行实时荧光定量分析。实验结果表明，该基因在各个组织中均有表达，属于组成型表达模式，在突变体LA3127中叶片表达最高，茎表皮、花和幼果中次之，在根中的表达量相对较低，AC中叶片和茎表皮中的表达量最高，茎次之，根、花和幼果中的表达量相对较低(图8)。突变体LA3127的花和幼果表面附有一层浓密的茸毛，造成了其组织表达水平显著高于AC。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 番茄茸毛调控基因的克隆及应用

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2202

<212> DNA

<213> Ln基因(Solanum lycopersicum)

<400> 1

atgtttcagc caaatatgtt tgagagccac catcatttac ttgatatgtc acataaatca 60

ccagaaaatg atttggattt acttagagat aatgatgaat ttgagagcaa atcaatggca 120

gatattatgg aaaataaccc ttgtgatgat gatcaagaag ttgatcctaa tcaacgtcca 180

aacaaaaaga aacgttatca tcgtcataca caattacaaa ttcaagaaat ggaatcgttt 240

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atgactagaa aaagtattga tgatccaggg agacctcctg gtattgttct cagtgaagcc 1680

acttcatttt ggcttcctgt tcctcccaag agagtctttg attttctccg cgatgagaac 1740

tctagaagtg agtgggatat actttcgaat ggggggctag ttcaagaaat ggcacatata 1800

gcaaatggtc gtgatccagg aaactgtgta tctctgcttc gtgttaatag tggaaattcg 1860

agtcagagca acatgctaat actccaagag agttcaacag actcaacagg atcttatgtt 1920

atttacgctc cagttgatat tgtcgcaatg aatgttgtgt tgagcggtgg tgatcctgac 1980

tatgttgctc tactaccatc tggattcgct atacttccag atggtggcgg aggaattaat 2040

gttggtaccg gtggatcgct tctcactgtt gcatttcaga ttttggttga ttctgttccc 2100

actgcaaaac tctctcttgg atctgttgca actgtcaata gtcttatcaa atgcactgtt 2160

gaaaggatca aaacagctgt agcttgtgac agtgctttat ga 2202

<210> 2

<211> 2202

<212> DNA

<213> ln基因(Solanum lycopersicum)

<400> 2

atgtttcagc caaatatgtt tgagagccac catcatttac ttgatatgtc acataaatca 60

ccagaaaatg atttggattt acttagagat aatgatgaat ttgagagcaa atcaatggca 120

gatattatgg aaaataaccc ttgtgatgat gatcaagaag ttgatcctaa tcaacgtcca 180

aacaaaaaga aacgttatca tcgtcataca caattacaaa ttcaagaaat ggaatcgttt 240

tttaaagagt gccctcatcc agatgataaa caaagaaaag aattaggaaa aagattaggg 300

ttagagcctt tgcaagtgaa attttggttc caaaacaagc gtactcaaat gaaggcgcaa 360

catgaacgcc atgagaactc agaattgaga gctgaaaatg agaaacttcg cgctgataat 420

ataaggtata aagaaacact tggaaatgct acttgcccta attgtggagg ccctgcttcc 480

attggggaaa tgtcattcga tgagcaacat ttgaggatcg agaacgctcg tcttagagaa 540

gagattgata gaatatcagg aattgctgca aaatatgttg ggaagcccat gcttacatat 600

cctaatcttc ctcctaccag cccgacccgt tcactcgata tcggtgttgg tagttttggg 660

cctcaaacgg gccttgttgg agaaatgtac agtgctggtg accttttaag gtcagtttca 720

ggcccaatag atgctgataa gcccatgatc attgaacttg ctgtagcagc tatggaagaa 780

cttgtaagaa tggcccaaac tggagagccc ttatggatta caggcccaga cccaggccca 840

ggcccagata gttctatcga aacgctatgt gaagaggaat atgttcggac ttttcctcga 900

ggcattgggc ctaagccttt gggcctaaca actgaagcct cacgagaatc tgctgtcgtt 960

attatgaatc acatcaattt agtcgaaatc ctaatggacg tgaaccaatg gacaaatgtt 1020

tttgctggac tagtatcaag agcattgaca ttagatgtct tatcaactgg agtagctgga 1080

aattacaatg gagctttaca agtgatgaca gctgagttcc aggtcccttc accattggtt 1140

ccaacgcgcg aaaattattt tgtgagatat tgtaagcacc atgctgatgg aacatgggct 1200

gttgttgatg tctccttgga caatttacga cctacttcag tgtcgcgttg tagaagaagg 1260

ccatcgggtt gtttaattca agaattacct aatggttact ccaaggttac atggatcgag 1320

cacgttgaag tggatgatag aggtgttcat aacatctata aacctcttgt caattcaggc 1380

ctcgcgtttg gggctaaacg ttgggtagct gtgttggata gacaatgtga acgactagca 1440

agtgcgatgg ctaataacat cccaacaggg gatattggag tcataacgag tcctgaaggc 1500

cggaaaagca tgttaaaact tgctgagagg atggtgatga gtttttgcgc tggtgttggc 1560

gcctcaacgg ctcatacatg gactacatta tctggaagtg gtgctgatga tgttagagtt 1620

atgactagaa aaagtattga tgatccaggg agacctcctg gtattgttct cagtgcagcc 1680

acttcatttt ggcttcctgt tcctcccaag agagtctttg attttctccg cgatgagaac 1740

tctagaagtg agtgggatat actttcgaat ggggggctag ttcaagaaat ggcacatata 1800

gcaaatggtc gtgatccagg aaactgtgta tctctgcttc gtgttaatag tggaaattcg 1860

agtcagagca acatgctaat actccaagag agttcaacag actcaacagg atcttatgtt 1920

atttacgctc cagttgatat tgtcgcaatg aatgttgtgt tgagcggtgg tgatcctgac 1980

tatgttgctc tactaccatc tggattcgct atacttccag atggtggcgg aggaattaat 2040

gttggtaccg gtggatcgct tctcactgtt gcatttcaga ttttggttga ttctgttccc 2100

actgcaaaac tctctcttgg atctgttgca actgtcaata gtcttatcaa atgcactgtt 2160

gaaaggatca aaacagctgt agcttgtgac agtgctttat ga 2202

<210> 3

<211> 733

<212> PRT

<213> Ln基因氨基酸序列(Solanum lycopersicum)

<400> 3

Met Phe Gln Pro Asn Met Phe Glu Ser His His His Leu Leu Asp Met

1 5 10 15

Ser His Lys Ser Pro Glu Asn Asp Leu Asp Leu Leu Arg Asp Asn Asp

20 25 30

Glu Phe Glu Ser Lys Ser Met Ala Asp Ile Met Glu Asn Asn Pro Cys

35 40 45

Asp Asp Asp Gln Glu Val Asp Pro Asn Gln Arg Pro Asn Lys Lys Lys

50 55 60

Arg Tyr His Arg His Thr Gln Leu Gln Ile Gln Glu Met Glu Ser Phe

65 70 75 80

Phe Lys Glu Cys Pro His Pro Asp Asp Lys Gln Arg Lys Glu Leu Gly

85 90 95

Lys Arg Leu Gly Leu Glu Pro Leu Gln Val Lys Phe Trp Phe Gln Asn

100 105 110

Lys Arg Thr Gln Met Lys Ala Gln His Glu Arg His Glu Asn Ser Glu

115 120 125

Leu Arg Ala Glu Asn Glu Lys Leu Arg Ala Asp Asn Ile Arg Tyr Lys

130 135 140

Glu Thr Leu Gly Asn Ala Thr Cys Pro Asn Cys Gly Gly Pro Ala Ser

145 150 155 160

Ile Gly Glu Met Ser Phe Asp Glu Gln His Leu Arg Ile Glu Asn Ala

165 170 175

Arg Leu Arg Glu Glu Ile Asp Arg Ile Ser Gly Ile Ala Ala Lys Tyr

180 185 190

Val Gly Lys Pro Met Leu Thr Tyr Pro Asn Leu Pro Pro Thr Ser Pro

195 200 205

Thr Arg Ser Leu Asp Ile Gly Val Gly Ser Phe Gly Pro Gln Thr Gly

210 215 220

Leu Val Gly Glu Met Tyr Ser Ala Gly Asp Leu Leu Arg Ser Val Ser

225 230 235 240

Gly Pro Ile Asp Ala Asp Lys Pro Met Ile Ile Glu Leu Ala Val Ala

245 250 255

Ala Met Glu Glu Leu Val Arg Met Ala Gln Thr Gly Glu Pro Leu Trp

260 265 270

Ile Thr Gly Pro Asp Pro Gly Pro Gly Pro Asp Ser Ser Ile Glu Thr

275 280 285

Leu Cys Glu Glu Glu Tyr Val Arg Thr Phe Pro Arg Gly Ile Gly Pro

290 295 300

Lys Pro Leu Gly Leu Thr Thr Glu Ala Ser Arg Glu Ser Ala Val Val

305 310 315 320

Ile Met Asn His Ile Asn Leu Val Glu Ile Leu Met Asp Val Asn Gln

325 330 335

Trp Thr Asn Val Phe Ala Gly Leu Val Ser Arg Ala Leu Thr Leu Asp

340 345 350

Val Leu Ser Thr Gly Val Ala Gly Asn Tyr Asn Gly Ala Leu Gln Val

355 360 365

Met Thr Ala Glu Phe Gln Val Pro Ser Pro Leu Val Pro Thr Arg Glu

370 375 380

Asn Tyr Phe Val Arg Tyr Cys Lys His His Ala Asp Gly Thr Trp Ala

385 390 395 400

Val Val Asp Val Ser Leu Asp Asn Leu Arg Pro Thr Ser Val Ser Arg

405 410 415

Cys Arg Arg Arg Pro Ser Gly Cys Leu Ile Gln Glu Leu Pro Asn Gly

420 425 430

Tyr Ser Lys Val Thr Trp Ile Glu His Val Glu Val Asp Asp Arg Gly

435 440 445

Val His Asn Ile Tyr Lys Pro Leu Val Asn Ser Gly Leu Ala Phe Gly

450 455 460

Ala Lys Arg Trp Val Ala Val Leu Asp Arg Gln Cys Glu Arg Leu Ala

465 470 475 480

Ser Ala Met Ala Asn Asn Ile Pro Thr Gly Asp Ile Gly Val Ile Thr

485 490 495

Ser Pro Glu Gly Arg Lys Ser Met Leu Lys Leu Ala Glu Arg Met Val

500 505 510

Met Ser Phe Cys Ala Gly Val Gly Ala Ser Thr Ala His Thr Trp Thr

515 520 525

Thr Leu Ser Gly Ser Gly Ala Asp Asp Val Arg Val Met Thr Arg Lys

530 535 540

Ser Ile Asp Asp Pro Gly Arg Pro Pro Gly Ile Val Leu Ser Glu Ala

545 550 555 560

Thr Ser Phe Trp Leu Pro Val Pro Pro Lys Arg Val Phe Asp Phe Leu

565 570 575

Arg Asp Glu Asn Ser Arg Ser Glu Trp Asp Ile Leu Ser Asn Gly Gly

580 585 590

Leu Val Gln Glu Met Ala His Ile Ala Asn Gly Arg Asp Pro Gly Asn

595 600 605

Cys Val Ser Leu Leu Arg Val Asn Ser Gly Asn Ser Ser Gln Ser Asn

610 615 620

Met Leu Ile Leu Gln Glu Ser Ser Thr Asp Ser Thr Gly Ser Tyr Val

625 630 635 640

Ile Tyr Ala Pro Val Asp Ile Val Ala Met Asn Val Val Leu Ser Gly

645 650 655

Gly Asp Pro Asp Tyr Val Ala Leu Leu Pro Ser Gly Phe Ala Ile Leu

660 665 670

Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ile Asn Val Gly Thr Gly Gly Ser Leu Leu

675 680 685

Thr Val Ala Phe Gln Ile Leu Val Asp Ser Val Pro Thr Ala Lys Leu

690 695 700

Ser Leu Gly Ser Val Ala Thr Val Asn Ser Leu Ile Lys Cys Thr Val

705 710 715 720

Glu Arg Ile Lys Thr Ala Val Ala Cys Asp Ser Ala Leu

725 730

<210> 4

<211> 733

<212> PRT

<213> ln基因氨基酸序列(Solanum lycopersicum)

<400> 4

Met Phe Gln Pro Asn Met Phe Glu Ser His His His Leu Leu Asp Met

1 5 10 15

Ser His Lys Ser Pro Glu Asn Asp Leu Asp Leu Leu Arg Asp Asn Asp

20 25 30

Glu Phe Glu Ser Lys Ser Met Ala Asp Ile Met Glu Asn Asn Pro Cys

35 40 45

Asp Asp Asp Gln Glu Val Asp Pro Asn Gln Arg Pro Asn Lys Lys Lys

50 55 60

Arg Tyr His Arg His Thr Gln Leu Gln Ile Gln Glu Met Glu Ser Phe

65 70 75 80

Phe Lys Glu Cys Pro His Pro Asp Asp Lys Gln Arg Lys Glu Leu Gly

85 90 95

Lys Arg Leu Gly Leu Glu Pro Leu Gln Val Lys Phe Trp Phe Gln Asn

100 105 110

Lys Arg Thr Gln Met Lys Ala Gln His Glu Arg His Glu Asn Ser Glu

115 120 125

Leu Arg Ala Glu Asn Glu Lys Leu Arg Ala Asp Asn Ile Arg Tyr Lys

130 135 140

Glu Thr Leu Gly Asn Ala Thr Cys Pro Asn Cys Gly Gly Pro Ala Ser

145 150 155 160

Ile Gly Glu Met Ser Phe Asp Glu Gln His Leu Arg Ile Glu Asn Ala

165 170 175

Arg Leu Arg Glu Glu Ile Asp Arg Ile Ser Gly Ile Ala Ala Lys Tyr

180 185 190

Val Gly Lys Pro Met Leu Thr Tyr Pro Asn Leu Pro Pro Thr Ser Pro

195 200 205

Thr Arg Ser Leu Asp Ile Gly Val Gly Ser Phe Gly Pro Gln Thr Gly

210 215 220

Leu Val Gly Glu Met Tyr Ser Ala Gly Asp Leu Leu Arg Ser Val Ser

225 230 235 240

Gly Pro Ile Asp Ala Asp Lys Pro Met Ile Ile Glu Leu Ala Val Ala

245 250 255

Ala Met Glu Glu Leu Val Arg Met Ala Gln Thr Gly Glu Pro Leu Trp

260 265 270

Ile Thr Gly Pro Asp Pro Gly Pro Gly Pro Asp Ser Ser Ile Glu Thr

275 280 285

Leu Cys Glu Glu Glu Tyr Val Arg Thr Phe Pro Arg Gly Ile Gly Pro

290 295 300

Lys Pro Leu Gly Leu Thr Thr Glu Ala Ser Arg Glu Ser Ala Val Val

305 310 315 320

Ile Met Asn His Ile Asn Leu Val Glu Ile Leu Met Asp Val Asn Gln

325 330 335

Trp Thr Asn Val Phe Ala Gly Leu Val Ser Arg Ala Leu Thr Leu Asp

340 345 350

Val Leu Ser Thr Gly Val Ala Gly Asn Tyr Asn Gly Ala Leu Gln Val

355 360 365

Met Thr Ala Glu Phe Gln Val Pro Ser Pro Leu Val Pro Thr Arg Glu

370 375 380

Asn Tyr Phe Val Arg Tyr Cys Lys His His Ala Asp Gly Thr Trp Ala

385 390 395 400

Val Val Asp Val Ser Leu Asp Asn Leu Arg Pro Thr Ser Val Ser Arg

405 410 415

Cys Arg Arg Arg Pro Ser Gly Cys Leu Ile Gln Glu Leu Pro Asn Gly

420 425 430

Tyr Ser Lys Val Thr Trp Ile Glu His Val Glu Val Asp Asp Arg Gly

435 440 445

Val His Asn Ile Tyr Lys Pro Leu Val Asn Ser Gly Leu Ala Phe Gly

450 455 460

Ala Lys Arg Trp Val Ala Val Leu Asp Arg Gln Cys Glu Arg Leu Ala

465 470 475 480

Ser Ala Met Ala Asn Asn Ile Pro Thr Gly Asp Ile Gly Val Ile Thr

485 490 495

Ser Pro Glu Gly Arg Lys Ser Met Leu Lys Leu Ala Glu Arg Met Val

500 505 510

Met Ser Phe Cys Ala Gly Val Gly Ala Ser Thr Ala His Thr Trp Thr

515 520 525

Thr Leu Ser Gly Ser Gly Ala Asp Asp Val Arg Val Met Thr Arg Lys

530 535 540

Ser Ile Asp Asp Pro Gly Arg Pro Pro Gly Ile Val Leu Ser Ala Ala

545 550 555 560

Thr Ser Phe Trp Leu Pro Val Pro Pro Lys Arg Val Phe Asp Phe Leu

565 570 575

Arg Asp Glu Asn Ser Arg Ser Glu Trp Asp Ile Leu Ser Asn Gly Gly

580 585 590

Leu Val Gln Glu Met Ala His Ile Ala Asn Gly Arg Asp Pro Gly Asn

595 600 605

Cys Val Ser Leu Leu Arg Val Asn Ser Gly Asn Ser Ser Gln Ser Asn

610 615 620

Met Leu Ile Leu Gln Glu Ser Ser Thr Asp Ser Thr Gly Ser Tyr Val

625 630 635 640

Ile Tyr Ala Pro Val Asp Ile Val Ala Met Asn Val Val Leu Ser Gly

645 650 655

Gly Asp Pro Asp Tyr Val Ala Leu Leu Pro Ser Gly Phe Ala Ile Leu

660 665 670

Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ile Asn Val Gly Thr Gly Gly Ser Leu Leu

675 680 685

Thr Val Ala Phe Gln Ile Leu Val Asp Ser Val Pro Thr Ala Lys Leu

690 695 700

Ser Leu Gly Ser Val Ala Thr Val Asn Ser Leu Ile Lys Cys Thr Val

705 710 715 720

Glu Arg Ile Lys Thr Ala Val Ala Cys Asp Ser Ala Leu

725 730

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> LMP-1-F(人工序列)

<400> 5

aatgtactca aaccatggct tgc 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> LMP-1-R(人工序列)

<400> 6

taaaatcgga cagcgagaat 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> LMP-2(人工序列)

<400> 7

agtgatagtg ttcggatgtt gc 22

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> LMP-2(人工序列)

<400> 8

ataccttctc accagctata atatg 25

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> LM-3(人工序列)

<400> 9

tgtcacggag taagatgtac gc 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> LM-3(人工序列)

<400> 10

cagcaacaga gttaggaaat tga 23

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> LM-4(人工序列)

<400> 11

caccactaat actcaaagca atgt 24

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> LM-4(人工序列)

<400> 12

tctctgccct ctcgctctc 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> LM-5(人工序列)

<400> 13

agaaaaggca tggtctatcc 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> LM-5(人工序列)

<400> 14

gaaatcatgt gggctctgc 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> LM-5(人工序列)

<400> 15

tcttgctgaa gtaaaccgcc 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> LMP-4-R(人工序列)

<400> 16

aaccgacttg ttgaggattc c 21

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> LM-6(人工序列)

<400> 17

tcccaacagt cgccgtctt 19

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> LM-6(人工序列)

<400> 18

gccagtcttc cattgccaaa t 21

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> LMP-8(人工序列)

<400> 19

gctaggttta ccaaagacca ctt 23

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> LMP-8(人工序列)

<400> 20

ccgttcacta atgaagacga tt 22

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> LMP-8(人工序列)

<400> 21

tctcattgat gtgattgtag gttg 24

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> LMP-10-R(人工序列)

<400> 22

cggtaaggaa ttgtttaata ggg 23

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> LMP-10-R(人工序列)

<400> 23

ggatagacaa tgtgaacgac 20

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> LM-11(人工序列)

<400> 24

cttagatatt tcataaagca ctg 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> LMP-12(人工序列)

<400> 25

ttgacattta tcagatccat tgc 23

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> LMP-12(人工序列)

<400> 26

tcaaaagatt tccgtgaaaa a 21

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> Ln-OE-FW(人工序列)

<400> 27

catttggaga ggacacgctc gagatgtttc agccaaatat gtt 43

<210> 28

<211> 45

<212> DNA

<213> Ln-OE-RV(人工序列)

<400> 28

tctcattaaa gcaggactct agatcataaa gcactgtcac aagct 45

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 35S(人工序列)

<400> 29

acgcacaatc ccactatcct tc 22

<210> 30

<211> 59

<212> DNA

<213> Ln-Cas9-FW(人工序列)

<400> 30

gaatctaaca gtgtagtttg ggctggtagg aggaagattg ttttagagct agaaatagc 59

<210> 31

<211> 59

<212> DNA

<213> Ln-Cas9-RV(人工序列)

<400> 31

gctatttcta gctctaaaac tatggattac aggcccagac aaactacact gttagattc 59

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 35S(人工序列)

<400> 32

acgcacaatc ccactatcct tc 22

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> Ln-RV(人工序列)

<400> 33

tcataaagca ctgtcacaag ct 22

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> pTX-Fw(人工序列)

<400> 34

agcggataac aatttcacac agga 24

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> pTX-RV(人工序列)

<400> 35

gcaggcatgc aagcttattg g 21

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> Ln-Cas9-CX-FW(人工序列)

<400> 36

tcgatgagca acatttgagg 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> Ln-Cas9-CX-RV(人工序列)

<400> 37

caatgcctcg aggaaaagtc 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Ln-qPCR-FW(人工序列)

<400> 38

aatcttcctc ctaccagccc 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Ln-qPCR-RV(人工序列)

<400> 39

aaggtcacca gcactgtaca 20

Claims

1.一种番茄茸毛调控基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的番茄茸毛调控基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述氨基酸序列由SEQ ID NO：1翻译表达。

3.如权利要求1所述的番茄茸毛调控基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述氨基酸序列由SEQ ID NO：2翻译表达。

4.如权利要求1所述的番茄茸毛调控基因在番茄茸毛调控育种中的应用。