CN110878314B - 一种调控番茄茸毛的hl-2基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控番茄茸毛的hl‑2基因及其应用。该调控番茄茸毛的hl‑2基因，所述hl‑2基因的序列如SEQ ID NO：1所示。本发明经过研究发现hl‑2基因影响番茄植株表皮毛的发育。本发明利用克隆的hl‑2基因在番茄中的超量表达，可以增强番茄的抗虫性和抗病毒能力，对于番茄育种具有重要的意义。

Description

一种调控番茄茸毛的hl-2基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控番茄茸毛的hl-2基因及其应用。

背景技术

表皮毛广泛存在于各种植物器官的表面，是一种由表皮细胞特化而成的毛状结构，是研究细胞命运决定、细胞周期调控和细胞形态发生的经典模式。表皮毛的形态多种多样，根据物种不同可以分为单细胞表皮毛或多细胞表皮毛；腺体毛或非腺体毛；分支或不分支。表皮毛作为植物表皮的第一层屏障，可以帮助植物抵御病虫及微生物的危害，减少紫外线的伤害，降低水分蒸腾速率，促进植株对水分和营养的吸收，减少机械损伤，维持植物体表温度，对植物抵御各种生物逆境和非生物逆境具有积极地作用。

番茄具有七种类型的表皮毛，其腺体毛在抗虫方面具有重要作用。I型和IV型腺体毛分泌的酰基糖可以驱避棉铃虫、甜菜夜蛾、烟粉虱、蚜虫等害虫；VI型腺体毛可以分泌甲基酮化合物和萜类化合物，对植食性甲虫、蓟马等具有抗性。目前，腺毛化学分子工程已被成功地应用于害虫防治。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种新的调控番茄茸毛的hl-2基因及该基因的应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明利用番茄无毛突变体hairless-2(hl-2)3-417与醋栗番茄LA1589杂交构建遗传分离群体，以该群体为基础，通过对番茄表皮毛性状进行遗传分析，利用图位克隆的方法首次分离鉴定了hl-2基因，该基因的序列如SEQ ID NO：1所示。为了研究hl-2的表达模式，分别提取Ailsa Craig不同组织的RNA，包括根、茎、茎表皮、叶、花和果，进行表达量分析。实验结果表明，该基因在各个组织中都能表达，为组成型表达；在花中的表达量最高，对相应组织进行GUS组织化学染色，结果表明，hl-2在番茄幼苗的茎尖、茎、叶腋、幼叶和成熟叶均有表达；其中在叶腋、茎尖、幼茎和幼叶基部等幼嫩部位表达量较高，由此得出：hl-2不仅影响表皮毛的发育，还可能在番茄植株的生长发育过程中起作用。

在验证该基因功能的过程中我们还对突变体3-417和AC相同部位的茎杆进行了比较，发现突变体和AC植株茎秆粗细存在较大的差异，因此推测该基因可能存在着能够影响植株机械强度及纤维素表达量的功能。通过观察手折茎杆的实验，我们发现AC的茎杆能够折到弯曲，但不断；相反，突变体3-417的茎杆极易折断。经过测定，突变体植株茎杆的折断力仅为AC茎杆折断力的30％，下降了70％。植株整体也发生了变化，突变体的株高明显降低、茎杆变细。

为了确定hl-2突变体茎的脆性是否是由于组织细胞产生变化引起的，我们对突变体3-417和AC相同部位的茎杆进行了组织切片和扫描电镜分析。石蜡切片结果所示：突变体和AC植株茎杆的细胞层数差异不大，而突变体植株茎杆的细胞明显小于AC的细胞，说明造成两者茎杆粗细差异的主要原因是茎杆细胞体积的大小。相比AC，突变体维管组织中不能形成完整的导管。在扫描电镜下两者细胞结构变化也很明显。扫描电镜观察结果表明，hl-2突变体的维管组织是一种中空的网状结构，而对照组AC的维管组织表现为坚固的实心结构。最终得到：hl-2突变影响机械组织和导管组织的形成。

植物细胞壁是由各种化学成分构成的，纤维素是植物细胞壁最重要的组成成分。为了进一步明确hl-2突变体机械强度的降低是否与细胞壁中成分的改变有关，我们测定了hl-2突变体、对照组AC和转基因材料茎杆中晶体纤维素的含量。最终得到：hl-2突变直接或者间接影响纤维素的合成，是造成植株机械强度降低的主要原因。

本发明经过研究发现hl-2基因不仅影响番茄植株表皮毛的发育，而且影响植株机械组织和导管组织的形成以及细胞壁中纤维素的含量，是造成植株机械强度降低的主要原因。本发明利用克隆的hl-2基因在番茄中的超量表达，可以增强番茄的抗虫性和抗病毒能力，同时显著增强番茄植株的机械强度，对于番茄育种具有重要的意义。

附图说明

图1为光学显微镜观察AC和hl-2的叶片、茎和下胚轴的表皮毛。箭头表示I型表皮毛；标尺，1毫米。

图2为根据H-pool1和NH-pool1极端混合池计算得到的Δ(SNP-index)图。(A)横轴代表番茄的12条染色体，竖轴代表所有SNP的Δ(SNP-index)平均值；(B)横轴代表番茄第2号染色体物理距离。

图3为hl-2基因的定位及克隆。(A)hl-2基因的定位，hl-2基因被定位于分子标记NH9和NH8之间74.7Kb的区间内，标记下面的数字表示标记与hl-2基因之间发生的重组交换单株数；(B)该区间有11个候选基因；(C)hl-2基因结构。

图4为hl-2序列分析。(A)和(B)突变体3-417的cDNA序列存在100个碱基的插入；(C)突变体3-417与Ailsa Craig之间部分氨基酸序列比对，红线表示在突变体中插入的核苷酸序列。

图5为hl-2基因在CRISPR/Cas9中的突变。(A)hl-2基因双靶点示意图，红色箭头代表靶位点，黑色箭头代表PCR检测引物；(B)Cas9编辑后T0代基因型检测；(C)获得编辑的T0代测序分析。横线代表缺失的碱基，下划线标注的碱基为突变碱基。

图6为hl-2基因的转基因表型及表达量分析。(A)突变体3-417；(B)35S::hl-2转基因植株；(C)AC；(D)hl-2-CR；(E)35S::hl-2转基因植株的表达量分析；(F)hl-2-CR敲除系表达量分析。

图7为hl-2的表达模式分析。(A)hl-2在不同组织中的表达量分析；(B)至(G)hl-2基因启动子驱动GUS活性分析，在茎尖，叶片和茎中表达。B、C和D为阴性对照；E、F和G为转基因材料。

图8为正常植株AC、hl-2突变体和敲除转基因植株的表皮毛观察。AC(A、B和C)；hl-2突变体(D、E和F)；敲除转基因植株(G、H和I)；(A、D和G)叶片正面；(E和H)叶片反面；(C、F和I)茎表皮。

图9为hl-2影响茎的机械强度和植株发育。(A)突变体3-417与对照AC茎杆的机械强度比较；(B)AC和突变体3-417茎杆折断力的测定；(C)AC和突变体3-417株高的比较；(D)AC和突变体3-417茎粗的比较；数据表示10个生物学重复的均值和标准误，图中的*P<0.05和**P<0.01根据t检验所得。

图10为突变体3-417和对照AC茎秆细胞结构的比较。(A)对照AC和突变体3-417茎杆横切石蜡切片细胞的比较；(B)扫描电镜观察对照AC和突变体3-417茎杆的横切面；(C)对照AC、突变体3-417和转基因植株茎杆中结晶纤维素的测定。数据表示3个生物学重复的均值和标准误，图中**P<0.01根据t检验所得。

图11为pHellsgate8载体图谱；

图12为pMV2-GUS-GFP载体图谱；

图13为pTX041的结构图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1分离群体构建

本研究所用到的番茄材料有常规栽培品种Ailsa Craig(AC)，醋栗番茄LA1589，hairless-2(hl-2)突变体3-417，突变体引自于番茄遗传资源中心(TGRC)。3-417为无毛突变体且茎杆脆易折断，LA1589为醋栗番茄。通过对突变体3-417和AC材料的形态学观察发现，突变体3-417在叶片、茎杆和茎尖等部位呈现无毛性状；AC材料则表现出肉眼可见的表皮毛性状，参见图1。

以无毛突变体3-417为母本，醋栗番茄LA1589为父本进行杂交，获得F1代杂交材料，F1代自交获得F2代分离群体用于H1-2基因的定位。以3-417和LA1589为亲本配置的F1群体植株均表现为有毛性状，表明3-417的无毛性状为隐性突变。F2分离群体中，正常有毛单株有1662株，无毛单株有526株，经卡方检验符合孟德尔遗传分离比3:1。结果表明，3-417的无毛性状为单基因调控的隐性性状。

表1 hl-2基因的遗传分析

a:χ²(0.05,1)＝3.84

实施例2 DNA样品的采集、提取和BSR-seq分析

将F2分离群体播种于穴盘，待番茄幼苗长到两叶一心，表皮毛表型清晰可辨时进行表型统计，筛选用于定位的表型植株进行DNA样品的采集。DNA提取采用CTAB小量法和“快速提取法”。将所有单株DNA浓度稀释到相同浓度，–20℃保存备用。

使用BSR-seq方法对F2分离群体的表皮毛性状进行遗传分析。从F2群体中挑选正常有毛单株30株个体的幼苗等量样品混合构建正常有毛极端池YTH-pool；选择无毛缺失单株30株个体混合构成无毛极端池NTY-pool；用RNAiso plus RNA extraction kit(Takara，大连)提取两极端池的叶片组织的总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop2000检测RNA质量，由诺禾公司进行RNA-seq测序。RNA-seq测序工作在Illumina HiSeq2000/2500平台完成，每个样品获得约5Gb的clean data数据。BSR-seq的分析过程由本实验室建立，具体流程如下：过滤原始数据，去掉测序的接头和低质量的测序数据，采用HISAT程序将测序数据比对到番茄参考基因组，产生BAM格式的文件用于下一步分析；⑵进行SNP calling分析，主要采用SAMtools软件包以番茄无毛表型的遗传与分子机理及本实验室编写的perl脚本实现。测序数据中，排除读取深度小于30×(read depths<30×)，比对质量值小于20(mapquality value<20)以及碱基质量值小于20(base quality value<20)的低质量SNPs；⑶按照Takagi描述的方法计算ΔSNP index，即有毛极端池中SNP index值减去无毛极端池中SNP index值。设定窗口大小(window size)和移动步距(step size)两个参数，对番茄全染色体进行扫描，计算平均ΔSNP index值并作图。

实施例3基因的粗定位和精细定位

(1)基因的粗定位

由于hl-2基因在番茄染色体上的位置尚不清楚，为了减少定位过程的工作量，我们采用BSR-seq方法对该基因进行位点分析。以LA1589为父本，hl-2突变体3-417为母本构建F2遗传分离群体(F1代自交得到F2代)。通过F1及F2分离群体对该基因的遗传规律进行分析，利用F2分离群体分离出的无毛单株进行初步定位。首先，从F2群体中挑选正常有毛单株30株个体的幼苗等量样品混合构建正常有毛极端池YTH-pool；选择无毛缺失单株30株个体混合构成无毛极端池NTY-pool，对极端池进行BSR-seq分析，YTH-pool和NTH-pool分别获得31,465,399读数(reads)和27,960,905读数(reads)。两个极端混池之间获得大量SNPs，计算每个SNP的Δ(SNP-index)值，绘制Δ(SNP-index)图，如图2所示，在第二号染色体上存在一个Δ(SNP-index)值较高的区域，表明这个区域存在控制无毛性状的基因。将第二号染色体的Δ(SNP-index)图放大，hl-2的目标区域位于该染色体上的37-41Mb(图2B)。利用之前设计的Indel标记H2和H14(表2)，对极端混池YTH-pool和NTH-pool中的单株进行基因型的鉴定，结果表明组成有毛极端池YTH-pool中的大多数个体与LA1589的基因型相同，无毛极端池NTH-pool中大多数个体与突变体3-417的基因型相同，且少量成杂合状态。以上结果表明，该区域确实存在控制无毛性状的基因，即初步确定hl-2基因位于第2号染色体上，命名为Hairless-2(hl-2)。

(2)基因的精细定位

a.分子标记的开发

本研究中用到了CAPS和Indel两种类型的分子标记。通过分析两极端混池中的SNPs位点，利用perl脚本Enzyme_ParaFly.pl，扫描两极端混池中的SNPs位点的酶切位点，开发CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)分子标记。具体方法如下：获得两个极端混池之间SNPs的VCF文件，通过Enzyme_ParaFly.pl程序，筛选出具有酶切位点的SNPs位点；调取酶切位点的SNPs上下游600bp的序列，设计CAPS标记。通过比较番茄参考基因组Heizl1706、潘那利S.pennellii和醋栗番茄LA1589之间序列的插入或缺失开发Indel分子标记，通过primer 3.0设计引物，在两亲本间验证CAPS和Indel分子标记，在两亲本中呈现稳定多态性的分子标记才能用于基因的定位。

采用本实验室开发的一套Indel标记(以番茄Heiz1706和醋栗番茄LA1589参考基因组序列差异开发得到)，在第二号染色体物理位置为37-41Mb的区间内，获得了4个在两亲本间具有多态性的分子标记。利用BSR-seq获得的大量SNPs，对该区段两亲本间的SNPs位点进行酶切位点扫描，开发了6个表现稳定具有多态性的CAPS标记。

表2用于定位hl-2基因的分子标记

b.hl-2基因的精细定位

为了进一步精细定位hl-2基因，将F2分离群体扩大种植。播种F2分离群体，于两叶一心时去除有毛单株，筛选出526株隐性无毛单株并提取DNA。利用H11，H13，NH3，NH7，NH8和NH9对526个无毛单株进行遗传连锁分析，结果表明hl-2与标记H11在526个单株中发生了8个交换，与标记H13发生了23个交换，与标记NH3发生了6个交换，与标记NH7发生了4个交换，与标记NH8发生了5个交换，与标记NH9发生了1个交换。根据以上分析，hl-2基因被定位于NH9和NH8之间，物理距离为74.7Kb，具体参见图3所示。

根据番茄基因组注释，该区间内包含11个预测基因的开放阅读框(ORFs)，见表3所示。为了确认结果的准确性，我们利用基因预测软件FGENESH(http://softberry.com)和GENESCAN(http://genes.mit.edu/)对该区间内的基因进行预测。预测结果显示其结果与番茄参考基因组提供的预测一致。对11个可能基因编码的氨基酸序列进行Protein BLAST分析，发现Solyc02g068720与拟南芥GRL基因具有较高的同源性。GRL可以影响拟南芥表皮毛发育，我们将该Solyc02g068720即ORF5作为候选基因。ORF5注释为Nck-associatedprotein 1，ORF5全长基因组序列为17,176bp，包括23个外显子和22个内含子，如图3C所示。利用primer 5设计全长引物(FW:5'ATGACTAAACCGAGGCAGCA 3'，见SEQ ID NO：22；RV：5'TCACTTGTAAGATATAGGAC 3'，见SEQ ID NO：23)，以无毛突变3-417和有毛的常规栽培品种Ailsa Craig的cDNA为模板扩增获得全长基因；PCR反应体系为50μL，包含2×Phantabuffer 25μL、dNTPs 1μL、正反向引物(10μM)各2μL、Phanta enzyme 1μL、模板2μL、无菌水17μL。反应程序为95℃预变性3min、95℃15s、56℃15s、72℃2min 30s，35个循环，72℃延伸5min。序列比对(如图3)显示无毛突变体3-417在第658位和659位两个碱基之间插入了一个100bp的片段，该突变造成了编码区移码突变，氨基酸翻译提前终止，该基因编码一个NACK蛋白，是WAVE复合体的一部。

表3候选区域基因注释

实施例4 hl-2基因的功能验证及表型分析

为了验证是否是由于hl-2基因的突变导致了突变体3-417畸形表皮毛的表型，我们进行了转基因的功能互补实验和Cas9敲除实验，观察功能互补的转基因植株的表型，从而确定其功能。

(1)超量表达载体的构建

超量表达载体的构建采用同源重组的方法将目的基因连接到pHellsgate8载体上。利用Primer premier 5设计全长基因引物(FW:5'ATGACTAAACCGAGGCAGCA 3'，见SEQ IDNO：22；RV：5'TCACTTGTAAGATATAGGAC 3'，见SEQ ID NO：23)，在正反向引物的5’端分别添加同源重组臂(Fw：5'CATTTGGAGAGGACACGCTCGAG3'，见SEQ ID NO：24；RV：5'TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGA3'，见SEQ ID NO：25)，以AC(正常有毛材料)的cDNA分别作为模板，扩增hl-2的候选基因，包含2×Phanta buffer 25μL、dNTPs 1μL、正反向引物(10μM)各2μL、Phanta enzyme 1μL、模板2μL、无菌水17μL。反应程序为95℃预变性3min、95℃15s、56℃15s、72℃2min 30s，35个循环，72℃延伸5min。将超量表达载体pHellsgate8用XhoI和XbaI进行双酶切，双酶切反应体系为50μL，XhoI和XbaI各2μL，pHellsgate8质粒20μL，Buffer 10μL，无菌水16μL，37℃孵育2小时，PCR产物回收纯化。

利用同源重组试剂盒(

ⅡOne Step Cloning Kit)将回收产物与线性载体重组连接，10μL重组连接体系中加入5×CE II Buffer 2μL，hl-2片段1μL，pHellsgate8载体片段1μL，重组酶Exnase II 1μL，5μL无菌水，混匀后37℃连接30min，热激法转化大肠杆菌Transone T1(全式金，北京)，挑取单克隆，PCR扩增检测并测序，选择正确的单克隆进行扩繁并抽提质粒。通过电激法将质粒转入农杆菌感受态C58中，挑单克隆检测并保存，用于后续遗传转化。

(2)CRISPR/Cas9系统双源表达载体的构建

利用在线软件CCTop-CRISPR/Cas9 target online predictor(http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/)设计hl-2基因的sgRNA靶标序列(hl-2-Cas9 FW:5'GAATCTAACAGTGTAGTTTGATGGGAAGGACCAGCTAGGGTTTT AGAGCTAGAAATAGC 3'，见SEQ ID NO：26；hl-2-Cas9 RV:5'GCTATTTCTAGCTCTAAAACTCAGCTACTT GAGTGAGTTCAAACTACACTGTTAGATTC3'，见SEQ ID NO：27)，靶点设计尽量处于该基因的第一个外显子上，靶点长度为19-21bp，其后紧随“NGG”即PAM，靶位点和PAM不能横跨两段外显子，选择两个特异性高的靶位点序列，以减少脱靶。

CRISPR/Cas9双元表达载体的引物设计和载体构建的具体方法参考了Deng Lei实验室。以043载体为模板，使用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增获得双sgRNA产物，反应体系为50μL，包含2×Phanta buffer 25μL、dNTPs 1μL、正反向引物(10μM)各2μL、Phanta enzyme1μL、模板2μL、无菌水17μL。反应程序为95℃预变性3min、95℃15s、56℃15s、72℃30s，35个循环，72℃延伸5min。将CRISPR/Cas9双元表达载体pTX041用BsaI酶切(37℃，>3h)，酶切体系为50μL，BsaI 2μL，pTX041质粒30μL，Buffer 10μL，无菌水8μL，37℃孵育4小时，PCR产物回收纯化。利用同源重组酶将回收产物与pTX041线性载体重组连接，10μL重组连接体系中加入5×CE II Buffer 2μL，双sgRNA产物片段1μL，pTX041线性载体4μL，重组酶Exnase II1μL，2μL无菌水，混匀后37℃连接30min，热激法转化大肠杆菌Transone T1，挑取单克隆进行测序，选择正确的单克隆进行扩繁抽提质粒。通过电激法将质粒转入农杆菌感受态C58中，挑单克隆检测并保存，用于后续遗传转化。

(3)GUS融合表达载体的构建

根据SGN数据库调取hl-2基因起始密码子上游3000bp左右序列，利用Primerpremier 5设计特异性引物PHl-2-GUS(PHl-2-GUS-FW:5'TGCATCCAACGCGTTGGGAGCTCCCCCTTGTTGGTTTTGATTTT 3'，见SEQ ID NO：28,PHl-2-GUS-RV:5'GCCTTCGCCATTCTAGACTCGAGTGTGAGCACCCAAAGGACAG 3'，见SEQ ID NO：29)。以AC番茄的gDNA为模板，用高保真酶扩增得到全长为2068bp的启动子片段。PCR扩增体系为2×Phanta buffer 25μL、dNTPs1μL、正反向引物(10μM)各2μL、Phanta enzyme 1μL、模板2μL、无菌水17μL。反应程序为95℃预变性3min、95℃15s、56℃15s、72℃1min 30s，35个循环，72℃延伸5min。植物表达载体pMV2-GUS-GFP用NotI和XhoI进行双酶切，双酶切反应体系为50μL，NotI和XhoI各2μL，pMV2-GUS-GFP质粒20μL，Buffer 10μL，无菌水16μL，37℃孵育2小时，PCR产物回收纯化。通过同源重组反应将启动子片段连接到pMV2-GUS-GFP载体上，10μL重组连接体系中加入5×CE II Buffer 2μL，hl-2启动子片段1μL，pMV2-GUS-GFP载体片段1μL，重组酶Exnase II 1μL，5μL无菌水，混匀后37℃连接30min，热激法转化大肠杆菌Transone T1(全式金，北京)，挑取单克隆，PCR扩增检测并测序，选择正确克隆抽提质粒电激转入农杆菌C58，PCR检测后用50％甘油保存。

为了进一步明确hl-2基因的表达模式，本研究构建了hl-2基因启动子驱动GUS的融合表达载体Phl-2::GUS来分析其在不同组织中的表达情况。以hl-2起始密码子上游设计特异引物进行扩增，获得全长为2068bp的启动子片段。通过同源重组将该片段与PMV2载体连接，形成融合表达载体Phl-2::GUS。将融合表达载体Phl-2::GUS，转化Ailsa Craig得到转基因植株。

(4)遗传转化

本研究中采用农杆菌介导的遗传转化方法，转化受体材料为Ailsa Craig(AC)和番茄无毛突变体3-417。具体转化流程可参考欧阳波老师等建立的番茄高效遗传转化体系。基本过程总结：番茄成熟种子用水浸泡几小时，75％酒精消毒30s，经50％84消毒液处理15min(于摇床中进行)，播种于1/2MS培养基上，切取6-8d苗龄无菌苗的子叶，暗环境中培养一天。以农杆菌悬浮液重悬收集的农杆菌(过表达载体转化无毛突变体3-417、敲除载体转化AC、GUS载体转化AC，得到三类不同的转基因株系)浸染外植体4min，黑暗条件下共培养2d。将外植体转移到筛选培养基I进行诱导分化，愈伤组织形成后转移到筛选培养基II。抗生素筛选后将具有生长点的幼苗，转入生根培养基中诱导生根，将生根的组培苗转移到基质中驯化培养，最后移至温室中栽培。

(5)转基因植株的检测

本研究中选择35S正向引物和基因反向引物(35S:5'ACGCACAATCCCACTATCCTTC3'，见SEQ ID NO：30；RV：5'TCACTTGTAAGATATAGGAC 3'，见SEQ ID NO：31)对超量转基因植株进行阳性检测。检测过程中分别设置阴性及阳性对照，防止污染。PCR反应体系为20μL，包含10×Taq buffer 2μL、10mM dNTPs 0.4μL、正反向引物(10μM)各0.4μL、Taq polymerase0.2μL、模板1μL、无菌水15.6μL。反应程序为94℃预变性3min、94℃30s、56℃30s、72℃4min，35个循环，72℃延伸5min。

基因敲除转基因植株的检测，首先以PTX正、反引物(pTX-Fw：5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3'，见SEQ ID NO：32；pTX-RV：5'GCAGGCATGCAAGCTTATTGG 3'，见SEQ ID NO：33)进行检测，确定表达载体在植株中表达。根据hl-2的拷贝序列，利用软件设计涵盖sgRNA靶标序列的测序引物hl-2-Cas9-CX(hl-2-Cas9-CX-FW:5'TGGAGTTTCGGCTGAGAGTT 3'，见SEQ ID NO：34；hl-2-Cas9-CX-RV:5'TCCATGGTTCCAAGCTTTGC3'，见SEQ ID NO：35)。以转基因番茄叶片DNA为模板，用Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase(Vayzme,China)高保真酶扩增相应的PCR片段，进行测序，获得其编辑位点。PCR反应体系为25μL，包含2×Phanta buffer 12.5μL、dNTPs 0.5μL、正反向引物(10μM)各1μL、Phanta enzyme 0.5μL、模板1μL、无菌水8.5μL。反应程序为95℃预变性3min、95℃15s、56℃15s、72℃1min，35个循环，72℃延伸5min。如图5C中所示，获得的产物片段发生了不同程度的大小变化(只放了部分检测结果)，说明该基因受到了不同程度的编辑，测序分析发现CR-3、CR-8和CR-9都发生了较大片段的缺失，分别为101bp、107bp和95bp的缺失；其中CR-5发生了4bp的较小片段的缺失，CR-6中有8bp片段的缺失，且发生了多个碱基的替换；CR-1、CR-2和CR-4也有大片段的缺失，表现为杂合状态。

(六)转基因植株的表型观察及表达量分析

对F2分离群体的遗传分析得到该性状是由隐性基因控制。如果我们候选正确，在茸毛突变体3-417中超量表达ORF5能够恢复无毛表型，而在Ailsa Craig中敲除ORF5会使表皮毛减少。观察发现，超量表达的阳性植株都可以使突变体3-417表皮毛恢复正常；转基因敲除系植株表皮毛均减少，表型与突变体相同。结果表明，ORF5为hl-2基因。

利用primer3在线设计hl-2的qRT-PCR引物Hl-2-QPCR(Hl-2-QPCR-FW:5'TAGCCAACAAACAGAACCCCA 3'，见SEQ ID NO：36,Hl-2-QPCR-RV:5'AAGTGAATTCCGTCTCGCGAT3'，见SEQ ID NO：37)，对其转基因阳性植株进行表达量分析。结果显示，与突变体3-417相比，超量表达植株目的基因提高了2-3倍，Cas9敲除表达株系中目的基因的表达量降低明显(图6)。

番茄体表存在七种类型的表皮毛，包括Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ型腺体毛和Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ型非腺体毛。Ⅰ型腺体毛由多细胞的基部、多细胞颈部和一个顶端小腺体组成；Ⅳ型腺体毛由单细胞的基部和一个小腺体组成，比Ⅰ型腺体毛短；Ⅵ型腺体毛的颈部较短，顶端腺体由四个细胞组成；Ⅶ型腺体毛由单细胞基部、单细胞颈部和一个4-8细胞的腺体组成，是表皮毛类型中最短的一种。Ⅱ型和Ⅲ型表皮毛为非腺体毛，长度相似，但前者的基部为多细胞；Ⅴ型表皮毛更短，有一个多细胞的基部和颈部。番茄hl-2突变体3-417表皮毛减少，该基因突变后影响了哪些类型的表皮毛从而导致无毛性状的出现？为了进一步了解突变体3-417的表型是由哪种类型的表皮毛发生改变导致的，我们对3-417、AC材料及转基因株系的叶片和茎表皮进行了扫描电镜的观察。

观察结果如图8所示，突变体3-417叶片和茎表面的表皮毛形态发生了改变，茎表皮中Ⅰ型腺毛弯曲、缩短，颈部细胞畸形膨大，叶片中Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ颈部细胞均发生了不同程度的膨大和弯曲，腺体毛顶端细胞并没有发生变化(图8)。Cas9转基因敲除系的表皮毛观察结果与突变体表型一致。转基因超量表株系的表皮毛与正常番茄植株Ailsa Craig表型相同，即该基因超量表达后可以使突变体中的畸形表皮毛恢复正常。由此推断，突变体3-主要是由于Ⅰ型腺体毛弯曲、颈部细胞发育畸形引起的，并不是Ⅰ型表皮毛的减少，所以hl-2基因在Ⅰ型腺体毛的形成发育中发挥着重要作用。

(七)hl-2在不同组织中的表达

基因的表达模式与该基因的生物学功能有着密切的联系。为了研究hl-2的表达模式，分别提取Ailsa Craig不同组织的RNA，包括根、茎、茎表皮、叶、花和果，进行表达量分析。实验结果表明，该基因在各个组织中都能表达，为组成型表达；在花中的表达量最高(图7)。对相应组织进行GUS组织化学染色，结果表明，hl-2在番茄幼苗的茎尖、茎、叶腋、幼叶和成熟叶均有表达；其中在叶腋、茎尖、幼茎和幼叶基部等幼嫩部位表达量较高(图7)，这表明hl-2不仅影响表皮毛的发育，还可能在番茄植株的生长发育过程中起作用。

(八)hl-2影响植株发育和茎的机械强度

hl-2除了影响表皮毛的发育，对植株的发育和茎的机械强度也有一定影响。通过观察手折茎杆的实验，我们发现AC的茎杆能够折到弯曲，但不断；相反，突变体3-417的茎杆极易折断(图9A)。为了准确描述突变体的机械强度的变化情况，我们测定了突变体3-417和AC材料的折断力。分别选取三个月苗龄的突变体3-417和AC第二节位的茎杆，剪切成相等的长度。经过测定，突变体植株茎杆的折断力仅为AC茎杆折断力的30％，下降了70％(图9B)。植株整体也发生了变化，突变体的株高为84.8±2.64cm，AC植株的株高为126.8±2.61cm，株高明显降低(图9C)。突变体的茎杆直径为8.31±0.19cm，AC植株的茎杆直径为10.75±0.22cm，突变体茎杆变细(图9D)。

为了确定hl-2突变体茎的脆性是否是由于组织细胞产生变化引起的，我们对突变体3-417和AC相同部位的茎杆进行了组织切片和扫描电镜分析。石蜡切片结果如图10A所示：突变体和AC植株茎杆的细胞层数差异不大，而突变体植株茎杆的细胞明显小于AC的细胞，说明造成两者茎杆粗细差异的主要原因是茎杆细胞体积的大小。相比AC，突变体维管组织中不能形成完整的导管。在扫描电镜下两者细胞结构变化也很明显。扫描电镜观察结果表明，hl-2突变体的维管组织是一种中空的网状结构，而对照组AC的维管组织表现为坚固的实心结构(图10B)。这些结果表明hl-2突变影响机械组织和导管组织的形成。综上所述，hl-2突变体表皮细胞体积变小，维管组织细胞结构发生变化，可能直接影响突变体的机械强度和植株形态。

植物细胞壁是由各种化学成分构成的，纤维素是植物细胞壁最重要的组成成分。为了明确hl-2突变体机械强度的降低是否与细胞壁中成分的改变有关，我们测定了hl-2突变体、对照组AC和转基因材料茎杆中晶体纤维素的含量。突变体hl-2、CR-3和CR-8中的晶体纤维素含量降低，总量仅为对照组AC的55％-60％左右(图10C)，说明hl-2突变直接或者间接影响纤维素的合成，是造成植株机械强度降低的主要原因。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种调控番茄茸毛的hl-2基因及其应用

<160> 37

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4158

<212> DNA

<213> hl-2(Solanum lycopersicum)

<400> 1

atgactaaac cgaggcagca gtttcaagcg gaagatgtat tgtcgacatc gccaactgca 60

gtgcgcccaa gagaatggga aggaccagct aggtggactg agtacttggg tcctgatata 120

tcttcaacaa ttggtcctaa ggcttctaga aatggtagct ctgatggtag tgcccatagc 180

tctagcgggt caactaataa aggcttgaac atgcaatggg taaaccaact cactcaagta 240

gctgaagggc tgatggcaaa aatgtatagg tttaatcaga tattagatta ccctgatgtc 300

attggacatg cattctctga agcattttgg aagtctggtg tgtttccaaa tcatccaaaa 360

atctgtattt tactatcaaa gaagtttccg gagcaccaca gcaagttaca attagaaaga 420

attgacaaat ttgctttgga tgctatgaat gatggtgctg aagttcattt gcaaagcttg 480

gaaccatgga ttcaaatgct tcttgacctg atggcatttc gagaacacgc cttgcgtcta 540

atattggatc taagcagtac agtgattacc ttgttgcctc accagaactc tctcatactg 600

catgcgttta tggacctttt ttgtgctttt gttcgtgtaa atatattttc agaaaagata 660

ccaaggaaaa tgatgttgca aacatacaat ttgcttcatg ccatggcaag aaatgatagg 720

gactgcgatt tttatcacag gttaatccag tttgttgatt cctacgatcc acccttgaag 780

ggtctgcatg aagacctgaa ttttgtcagc cctcgtattg gagaggtatt agaggctgtt 840

ggtcccatta tattcttatc aactgataca cgaaagctca gaaatgaggg tttcttaagt 900

cctttccatc cccgataccc tgatatactg acaaattcag ctcatccaat gagagcccaa 960

gacctagcca atgttacatc atatagggaa tgggtgttat ttggttatct tgtctgtcct 1020

gatgagcttc ttagggtcac cagcattgat attgcttcga ttgtactcaa ggaaaatcta 1080

gtccttcctc tgttcaggga cgagtacata ttgctgcatg aggattatca gttatacgtc 1140

ttaccacgga tactggagtc gaagaagatg gcaaaatctg gacggacgaa acaaaaagaa 1200

gcggatctag agtatagtgt agccaaacag gttgagaaaa tgataagtga agtgcatgac 1260

caagcattat attactgtga tgccatacat cgtgaaagaa gaatattctt aaaacaggag 1320

attggaagaa tggtactttt tttctctgac cagcccagct tgttggcacc taatattcag 1380

atggtttatt cggccttagc ctttgctcaa agtgaggttc tatggtattt ccaacatgta 1440

ggaatagctt catcgaagtc aagagctgcc agaacggttc cggtagaaat ggatccaagt 1500

gatccaacga ttggcttctt gttggatgga atggatcgtc tttgttgcct agtgcgcaag 1560

tatattgctg ctattagagg atacgcctta tcatatctat catcctgtgc tggtagaatc 1620

cgatttttgt tgggtacccc tggcatggtt gctctcgact tggatgctac tctgaaagga 1680

cttttccaga agatagttca acatcttgag aatataccca agccacaggg tgaaaatatt 1740

tctgccatca catgtgattt atcagagttg cgcaaagatt ggttatctat attgatggtt 1800

gttacttctg ctcgttcttc tataaacatc cgacatttgg aaaaggctac agtgtctact 1860

ggaaaggaag ggctattatc ggaaggaaat tctgcataca actggtccag gtgtgttgat 1920

gagcttgaat acctgttatc taaacatggg agtctaaaga agctttactt ctatcaccaa 1980

caccttacaa cagttttccg taatactatg tttggtccag aaggtcgtcc acaacattgc 2040

tgtgcatggc ttggtgtcgc cagtagtttt cctgaatgcg cttcttcaat agtccccgaa 2100

gaggtaacta aaattggtcg tgatgcggtt ctttatgttg aatccctgat tgaatctatc 2160

atgggaggtc tggaagggtt gataaatatt ctcgactcgg aagggggatt tggctcttta 2220

gagttgcagc tttttccaga gcaggcggca catctcatga atttgacttc tagaatttct 2280

gctccttctg caaagtcccc aagagccatg tcgggctatc atttaccagg ctacgagagc 2340

taccctgaaa atgataattc cataaaaatg ttagaagctg caatgcagag gttgaccaac 2400

ctttgctcag ttttaaatga catggagcct atatgtgttc taaaccacgt cttcgttctg 2460

agggagtaca tgagagaatg tatccttggg aacttcagaa ggagactgct tgctgttctg 2520

aaaactgata atgatcttca gcgtcctact gtcttggaag cactgatacg cagacataca 2580

gctattgtcc atctagcaga acaacacatc agcatggacc tgactcaagg tatccgggag 2640

atattactaa cagagacatt ctgtggtcca gtttcatctt tgcacttgtt tgagaaagct 2700

acagagcagc atactggatc agccactgaa acagtatgta actggtacat tgaaaacgtg 2760

gtcaaggatg tatcaggtgc aggtatcctc tttgcgcccc ggcacagatg cttcaagagc 2820

acgaggccgg ttggtggata ttttgctgag tcagtgacag atctcaggga actgaaagca 2880

tttgtccgtg tttttggtgg ttatggagtt gacaggttag atagaatgat gaaagagcac 2940

acagctgcac tcttgaactg tattgacaca tcattacggg caaaccgaga taatctggag 3000

gctgttgctg gaagcatgca ttctggtgac cgaatagata gagacacaaa tatcaagcaa 3060

attgttgatt tggacactat ggttgggttc tgtattcagg ctggacaggc tgttgctttt 3120

gaccgccttc ttgcagaggc tggtacagct gttcttgaag aaggtgctcc tttgatacat 3180

tcattactga cagcggctgc taagcattta cctgatgaaa tacctgagaa aaaggagatt 3240

agaaggttga aaagagtagc aaacaatttt aatatagcta gtgaccatga cgctgagtgg 3300

gtcagatcca tactagaaga ggttggaggt gcaaatgatg cttcctggag cttgttgcct 3360

tatttgtttg ccactctaat gacatcaaat atatggaata gtagtggctt taatgtggat 3420

actgggggtt tcagcaacaa catctattgc ttggcaaggt gcatttctgc agtaattgca 3480

ggaagtgaat ttgttagact tgaaagagag catcacatga gacaatcttt ttcaaatggt 3540

catgtcggtg aaacattgga tcctgaaaca cacaaccaaa taacagttga gacaaacata 3600

aaatccacaa tgcagctctt tgtgaagttt tcctctggaa ttattctaga ctcttggagc 3660

gagaatacca gatctcatct tgtgtcaaag ctcattttcc tggaccagtt ttgtgagatc 3720

tccccttacc taccaagaag cacgctggat gcgtatgttc cttactccat tatccgctca 3780

atctacagtc aatactatgg aagttcatct cctgcgccac tggcactact tggtgattca 3840

ccccgtcatt caccggctgt atctctggca cattcgtccc ctgcaatgag gcagcatcgc 3900

aatgattcca ctcctcagtc aaattctaac gattcaggtt atttcaagcc atcctcaagc 3960

catgcccagg atcaactata tgatacagaa agtggaagca ttgaaaatag gcctcgaaat 4020

gttaggcgtt ctggaccatt ggaatacagt gcaactcgaa aattaaaaca cgtggacagc 4080

tcaacatcag caagcacagg tcccagtcca ttgccaaggt ttgcagtgtc tagatccggt 4140

cctatatctt acaagtga 4158

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> H2-F(人工序列)

<400> 2

tggtagaact aataagggcc att 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> H2-R(人工序列)

<400> 3

ctttgtgtgc atgaccagct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> H11-F(人工序列)

<400> 4

atacttaatg cctaatgctg 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> H11-R(人工序列)

<400> 5

cgaagtgaat ttagaaaggg ta 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> H13-F(人工序列)

<400> 6

cgcggtaaca gtttatgcca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> H13-R(人工序列)

<400> 7

gatccgcgaa ttcagctgtt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> H14-F(人工序列)

<400> 8

gctccgccac tcattgatac 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> H14-R(人工序列)

<400> 9

tgacttctct tttccccttc att 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> NH1-F(人工序列)

<400> 10

agggaagggc tgctttatgt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> NH1-R(人工序列)

<400> 11

tgctcgaacc atcacttcct 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> NH2-F(人工序列)

<400> 12

agaaaggtag agttggtgac ca 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> NH2-R(人工序列)

<400> 13

tatgcgggga tggttgtgat 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> NH3-F(人工序列)

<400> 14

agaagcagat gtcctcgtag a 21

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> NH3-R(人工序列)

<400> 15

gcaggctggc tatataaatc ctc 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> NH7-F(人工序列)

<400> 16

ccgattgtgt gttcaagggg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> NH7-R(人工序列)

<400> 17

gaggagcttg gtgagtggat 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> NH8-F(人工序列)

<400> 18

atggtggatt tcaagcgcag 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> NH8-R(人工序列)

<400> 19

cacaaggcag agcaacaaga 20

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> NH9-F(人工序列)

<400> 20

gtactcgttg cgtgcctc 18

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> NH9-R(人工序列)

<400> 21

gtggatgtgg atgaaacgga 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> FW(人工序列)

<400> 22

atgactaaac cgaggcagca 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> RV(人工序列)

<400> 23

tcacttgtaa gatataggac 20

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 同源重组臂Fw(人工序列)

<400> 24

catttggaga ggacacgctc gag 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 同源重组臂RV(人工序列)

<400> 25

tctcattaaa gcaggactct aga 23

<210> 26

<211> 59

<212> DNA

<213> hl-2-Cas9 FW(人工序列)

<400> 26

gaatctaaca gtgtagtttg atgggaagga ccagctaggg ttttagagct agaaatagc 59

<210> 27

<211> 59

<212> DNA

<213> hl-2-Cas9 RV(人工序列)

<400> 27

gctatttcta gctctaaaac tcagctactt gagtgagttc aaactacact gttagattc 59

<210> 28

<211> 44

<212> DNA

<213> PHl-2-GUS-FW(人工序列)

<400> 28

tgcatccaac gcgttgggag ctcccccttg ttggttttga tttt 44

<210> 29

<211> 43

<212> DNA

<213> PHl-2-GUS-RV(人工序列)

<400> 29

gccttcgcca ttctagactc gagtgtgagc acccaaagga cag 43

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 35S(人工序列)

<400> 30

acgcacaatc ccactatcct tc 22

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> RV(人工序列)

<400> 31

tcacttgtaa gatataggac 20

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> pTX-Fw(人工序列)

<400> 32

agcggataac aatttcacac agga 24

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> pTX-RV(人工序列)

<400> 33

gcaggcatgc aagcttattg g 21

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> hl-2-Cas9-CX-FW(人工序列)

<400> 34

tggagtttcg gctgagagtt 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> hl-2-Cas9-CX-RV(人工序列)

<400> 35

tccatggttc caagctttgc 20

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> Hl-2-QPCR-FW(人工序列)

<400> 36

tagccaacaa acagaacccc a 21

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> Hl-2-QPCR-RV(人工序列)

<400> 37

aagtgaattc cgtctcgcga t 21

Claims (1)

1.调控番茄茸毛的hl-2基因在番茄育种中的应用，其特征在于，所述hl-2基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

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