CN106011105B - 水稻核糖核酸酶H大亚基A编码基因OsRNaseH2 A及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻OsRNaseH2 A基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因研究对水稻叶片形态、衰老调控及叶绿体发育的影响，可用于彩色稻观赏，解决杂交稻育种过程中杂种的剔除问题，调控水稻叶片的衰老形态。

Description

水稻核糖核酸酶H大亚基A编码基因OsRNaseH2 A及其用途

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻OsRNaseH2 A基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因研究对水稻叶片形态、衰老调控及叶绿体发育的影响，可用于彩色稻观赏，解决杂交稻育种过程中杂种的剔除问题，调控水稻叶片的衰老形态。

背景技术

RNase H能特异的水解RNA/DNA杂合双链或DNA-RNA-DNA/DNA嵌合底物中的RNA，普遍存在于各种原核生物、真核生物及病毒中。根据氨基酸序列及空间结构相似性，RNase H可被分为1型和2型，1型包括细菌的RNase H I和真核生物的RNase H1；2型包括细菌的RNase H II和RNase H III、古细菌的RNase H II及真核生物的RNase H 2。RNase H是一类严格依赖金属离子才有活性的酶，偏爱Mg²⁺和Mn²⁺作为辅助因子，其他二价阳离子不能支持其活性，两个金属离子一个在底物的援助下实施亲和进攻并负责产物释放；另一个参与磷酸基团的转移反应。从目前的研究来看，RNase H在生物体的功能包括以下几个方面：复制过程中DNA滞后链中RNA引物的切除；切除错误掺入基因组DNA的单个核糖并维持基因组的稳定性；转录功能等。2007年Fukushima S等研究发现在枯草芽孢杆菌中RNase H的缺失会导致细胞生长速率缓慢，细胞表现出SOS应激反应及温敏特性，这可能是由于DNA复制中滞后链的RNA引物的切除受阻所致。酵母基因敲除实验证明单独敲除RNase H35对其生长影响不大，只是在S期有所堆积，可能是细胞受到复制压力的表型，而RNase H35和RAD27(核酸酶)双缺失则严重影响酵母的存活。Lazzaro F等进一步敲除了酵母中RNase H的多个亚基，证明RNase H与复制后修复机制(PRR)相关，共同保护细胞的DNA免遭核糖核酸掺入，因此RNase H的存在对于维持基因组的稳定与完整具有重要生理意义。逆转录酶的RNase H活性对于逆转录过程是必需的，任何能将RNase H失活的突变都会抑制逆转录，目前医学上研究最多的就是以艾滋病病毒(HIV)的逆转录酶RNase H为靶点设计HIV药物，通过抑制RNase H的活性阻断HIV病毒的复制。

除了在病毒和微生物中的研究外，鉴于RNase H功能的重要性，近年来哺乳动物中的生理功能相关的报道也越来越多。人的RNase H2发生突变会导致自身炎症性遗传疾病(AGS)，与自身免疫性疾病“系统性红斑狼疮”有免疫相似性，是由于在细胞内累积了核酸进而引发的免疫系统疾病。总体来说RNase H对于细胞的生长，尤其是DNA的复制、修复等有重要影响，缺失RNase H将使哺乳动物致病或死亡，但并不会使单细胞生物死亡。植物中关于RNase H的研究极少，直到2014年才首次在拟南芥中发现了RNase H2突变体。RNase H2缺陷可回补WEE1蛋白激酶缺陷株的表型，提高基因组的同源重组率，但拟南芥的RNase H2突变体与野生型比较，并没有肉眼可见的表型，只有通过DNA合成抑制剂的处理才能显现其影响。到目前为止RNase H在生物体内确切的生理功能仍不清楚，尤其是当生物体内同时含有两种不同的RNase H时，仍有诸多谜团待解，如二者如何分工？是共同合作还是互为替补？是竞争还是合作？除了参与DNA复制、修复外，人们对RNase H2所执行的生物学功能在植物生理水平产生何种影响一无所知，其与植物叶片衰老、叶片形态及叶绿体发育的关系从未被发现。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种与水稻叶片形态变异相关的蛋白质及其基因，以及由此获得的转基因植物细胞，和利用所述基因对水稻叶片形态进行改造的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻核糖核酸酶H大亚基A编码基因OsRNase H2 A编码的蛋白质，该蛋白质为SEQ ID No：3所示的氨基酸序列。

作为本发明的水稻核糖核酸酶H大亚基A编码基因OsRNaseH2 A编码的蛋白质的改进，氨基酸序列还包括在SEQ ID No：3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

本发明还同时提供了一种编码上述蛋白质的基因，该基因具有SEQ ID No：1、SEQID No：2所示的核苷酸序列。

备注说明：SEQ ID NO：1为cDNA全长，SEQ ID NO：2为gDNA全长。

作为本发明的基因的改进：所述核苷酸序列还包括在SEQ ID No：1、2所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

本发明还同时提供了含有上述基因的质粒。

本发明还同时提供了含有上述基因的植物表达载体。

本发明还同时提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述基因序列。细胞例如为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

本发明还同时提供了上述基因的用途，其特征在于：用于构建转基因水稻，所述转基因水稻的叶片颜色得以改良用于观赏及高产品种的培育。

本发明还同时提供了一种改良水稻叶片形态、影响叶绿素含量的方法：包括用具有SEQ ID No：1、2所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。

进一步具体说明：本发明的目的是提供一种从水稻斑马叶突变体中克隆的新基因RH2，具有如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的DNA序列，也包括与SEQ ID No：1和SEQ IDNo：2所示的DNA序列至少有70％同源性的基因序列。本发明中的SEQ ID No：3所示的蛋白质属于铁硫蛋白，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID No：1和SEQ ID No：2中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。

本发明的另一个目的是提供一种用RH2基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的序列的基因或基因部分片段的载体，其中，如图4所示的pCAMBIA1300-RH2，该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。

本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻叶片形态的方法。具体地是利用植物表达载体转化植物细胞以影响水稻叶片形态的方法。

本发明可用于彩色稻观赏(突变体具有明显的斑马叶表型，大量种植后白绿相间，有一定的观赏价值，根据不同景观设计可以产生多种植物景观)，解决杂交稻育种过程中杂种的剔除问题，调控水稻叶片的衰老形态。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、水稻斑马叶突变体rh2的表型观察和遗传分析：

本发明的水稻斑马叶突变体rh2来自日本晴EMS(Ethyl Methyl Sulfonate)诱变产生的突变(图1A,B)。rh2通过与野生型水稻的反交实验，证明该突变体受隐性单基因控制。光照强度实验结果表明突变体rh2的斑马表型受高光强诱导(图1C)。进一步观察发现突变体斑马性状主要是由于叶片部分区段叶片早衰造成叶绿体降解和叶片内卷(图1D,F)。二氨基联苯胺(DAB)染色结果也表明突变体斑马区段的细胞中有大量的过氧化氢积累(图1E)，说明突变体目的基因的突变造成细胞中超氧化物的大量积累从而启动了细胞的衰老。

二、图位克隆控制水稻斑马叶性状的RH2基因：

1)、RH2基因的初步定位：

为了分离RH2基因，本发明首先组建了一个定位群体，由rh2与籼稻品种TN1(Indica)杂交组配成F₂定位群体，再通过图位克隆的方法，利用STS、SSR等分子标记对RH2位点进行初步定位，将其初步定位在第11染色体的长臂端，并介于RM286和B11-5两标记之间，见图2。

2)、RH2基因的精细定位与预测：

通过对RM286和B11-5两个标记之间的BAC序列分析，发展新的SSR、STS标记将RH2精确定位于BAC OSJNBb0030I09上ZY12711-20与ZY12711-21标记之间60-kb范围之内(图3)，通过分析此区段开放阅读框(ORF)推测候选基因。

3)、RH2基因的鉴定和功能分析：

为了验证候选基因功能，构建了如图4所示的互补载体，通过转基因技术，将互补载体转入到突变体rh2中，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻(图5)，证明本发明正确克隆了RH2基因，氨基酸序列分析表明RH2编码核糖核酸酶H大亚基A(OsRNaseH2 A)。此外，由于该基因被预测与DNA合成相关，我们还构建了如图6所示亚细胞定位载体，通过水稻原生质体转化技术证明OsRNaseH2 A蛋白在细胞中定位于细胞核。

本发明利用水稻斑马叶突变体rh2，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了OsRNaseH2 A基因，该基因编码核糖核酸酶H大亚基A，在水稻中影响叶片形态、叶绿体的降解及光合效率。通过对OsRNaseH2 A基因的功能解读，不仅丰富了叶片形态、叶绿体发育及光合效率的分子调控机制，对于阐明DNA复制与叶片形态、叶绿体发育的作用关系也具有重要理论意义。

叶绿体是植物进行光合作用的重要场所，广泛分布在叶片绿色组织细胞中。斑马叶突变典型特征是叶绿体发育异常，大部分斑马叶突变体白色部分缺乏叶绿素，植物斑马叶突变产生机制非常复杂，涉及光合电子传递、核-质基因组互作、质体基因及基因与环境的互作等过程，目前对斑马叶的分子机理研究还仅停留在叶绿素代谢的层面，更为复杂的调控模式还不清楚。本发明获得的斑马叶突变体，是众多斑马叶突变体中较为特殊的一类，其相关基因编码蛋白可能是通过影响高光强引起的DNA损伤修复，进而对叶片形态、叶绿体的降解和光合效率产生影响。通过图位克隆技术本发明首次在水稻中克隆了相关基因OsRNaseH2 A，该基因编码核糖核酸酶H大亚基A，在水稻中影响叶片形态、叶绿体的降解及光合效率。通过对OsRNaseH2 A基因的功能解读，将为深入研究叶片形态调控、叶绿体发育机制，阐明植物高光强引起的DNA损伤修复与叶片形态调控、叶绿体降解的关系，进而为水稻高光合育种奠定基础。

本发明的有益效果主要体现在：

光合色素载体——叶绿体是进行光合作用的重要场所，广泛分布在叶片绿色组织细胞中，与此同时所有体内、体外逆境对植物造成的伤害都会首先对叶绿体的发育造成影响，最快速、直接的反应植物的生理状态。本发明利用水稻斑马叶突变体zb3，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了OsRNaseH2 A基因，该基因编码核糖核酸酶H大亚基A，在水稻中影响叶片形态及叶绿体的降解。通过对OsRNaseH2 A基因的功能解读，进一步明确了OsRNaseH2 A对水稻叶片形态、叶绿体降解及光合效率的影响，同时为深入揭示高光强引起的DNA损伤修复与叶片形态及叶绿体降解的关系奠定基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为水稻斑马叶突变体rh2与野生型WT苗期、分蘖期表型及DAB染色结果；

A：水稻斑马叶突变体rh2与野生型WT苗期表型；

B：水稻斑马叶突变体rh2与野生型WT分蘖期表型；

C：不同光照强度条件下野生型WT与突变体rh2的表型；

D：水稻斑马叶突变体rh2与野生型WT叶片特写；

E：突变体rh2斑马部位及野生型WT叶片二氨基联苯胺(DAB)染色；

F：突变体rh2斑马部位及野生型WT叶片纵切面。

图2为OsRNaseH2 A基因(RH2基因)在水稻第11染色体上的初步定位图。

图3为OsRNaseH2 A基因(RH2基因)的精细定位及突变位点示意图；

(A)代表OsRNaseH2 A基因在水稻第11染色体上的精细定位图；

(B)代表OsRNaseH2 A基因定位区间候选基因预测图；

(C)代表OsRNaseH2 A基因定位区间目的基因结构分析及突变位点测序；

(D)代表OsRNaseH2 A基因序列及蛋白编码序列在突变体和野生型间的差异比较。

图4为互补载体pCAMBIA1300-RH2图谱。

图5为功能互补实验T0转基因水稻植株表型及测序验证；

A：从左到右依次为野生型(WT)、突变体、及转互补载体的rh2突变体转基因回复单株；

野生型(WT)、突变体、及转互补载体的rh2突变体转基因回复单株叶片的特写；

B：转互补载体的rh2突变体转基因回复单株测序验证，箭头所指为突变位点。

图6为OsRNaseH2 A亚细胞定位载体的构建及原生质体转化结果；

A：OsRNaseH2 A与GFP融合表达载体示意图；

B：荧光共聚焦显微镜观察转化OsRNaseH2 A亚细胞定位载体的水稻原生质体，结果表明OsRNaseH2 A定位于细胞核中。

图7为突变体rh2不同表型部位与对照日本晴光合色素含量测定。

图8为透射电镜分析突变体RNaseH2 A(rh2)与对照日本晴叶绿体形态的变化；

上图为野生型不同放大倍数条件下叶肉细胞中叶绿体形态；

中图为突变体绿色部分不同放大倍数条件下叶肉细胞中叶绿体形态；

下图为突变体白色部分不同放大倍数条件下叶肉细胞中叶绿体形态。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、

1、水稻材料：

水稻(Oryza sativa L.)突变体rh2，原始野生材料为粳稻品种“日本晴”。

水稻斑马叶突变体rh2来自日本晴EMS(Ethyl Methyl Sulfonate)诱变产生的突变(如图1所示)，该突变体是在中国浙江省境内获得。

光强实验：

挑选饱满的野生型和突变体种子各50粒，30℃避光浸种48小时，沥干水分30℃避光催芽48小时，挑选发芽整齐，胚芽健壮的种子播种在铺有营养土的容器中，把已发芽的突变体和日本晴的种子分为两组，分别种植在光强为250μmol photons m-2s-1和900μmolphotons m-2s-1的光照培养箱中(Snijders,MD1400)，温度均为昼/夜28℃/24℃，光照时长14h，观察并记录叶片表型，用于鉴定突变体的光强敏感性。

DAB染色：

染色液配方为：1mg/ml的二氨基联苯胺(diaminobenzine,DAB,Sigma)水溶液，pH调节至3.8。

具体染色步骤为：将野生型和rh2苗期叶片轻轻加入染色液中，25℃光照下染色8h；除去染色液，加入95％的乙醇，脱色12h-24h；水悬浮，镜检，拍照。

rh2通过与野生型品种(即，籼稻品种TN1)的反交实验，证明该突变体受隐性单基因控制。实验的结果为：在M₂代群体中随机选择85个单株进行遗传分析，66株为野生型表型，19株为突变型表型，卡平方检测结果(χ²＝0.29<χ² 0.05＝3.84)，分离比符合3：1，说明该突变表型由单隐性核基因控制。以籼稻品种TN1为父本，rh2为母本进行反交所得的F1代植株全部表现为正常表型，F2代种子播种四周后，随机选380个单株其中281株表现为野生型表型，99株表现为突变型表型。卡平方检测结果(χ²＝0.22<χ² 0.05＝3.84)，正常植株表型和突变体植株表型分离比符合3：1；进一步证明该突变表型受隐性单隐性核基因控制。

2、分析和定位群体：

纯合的rh2突变体和野生型品种籼稻品种TN1进行杂交，F₁代自交，得到F₂群体。并从中选出1273株斑马叶rh2突变个体作为定位群体。在三叶期期每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA。

3、SSR和STS标记定位OsRNaseH2 A基因

采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约0.2g水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于150μl超纯水中。每一个PCR反应用2μl DNA样品。

OsRNaseH2 A基因的初步定位：在RNaseH2 A与TN1组合的F₂群体中选取30个隐性个体，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，经5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测PCR产物的多态性，将OsRNaseH2 A初步定位在第3号染色体长臂端RM286和B11-5两STS标记之间(如图2所示)。

OsRNaseH2 A基因的精细定位：选取rh2与TN1组合的F₂群体中共1273株隐性个体，在初定位的基础上进一步设计SSR和STS标记，最终将OsRNaseH2 A精确定位于BAC号为OSJNBb0030I09上60-kb范围之内(图3A)，两边的分子标记为ZY12711-20与ZY12711-21引物序列为：

ZY12711-20：F：CACAGGGACTACAGTTAAGTC，R：AGTCTTTTCCATACGCCTTAC；

ZY12711-21：F：AGTACAGTTCACCGAGTAAGT，R：TGATAAGCTCAATAACAATTG；上文中涉及的OsRNaseH2 A基因的定位标记序列具体如表1所示。

表1、OsRNaseH2 A基因的定位标记序列

4、基因预测和比较分析：

根据精细定位的结果，在60-kb范围内根据Rice Automated Annotation System(http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp)的预测，发现在此区间内共有17个候选基因(图3B)。根据两标记剩余的重组个体数，我们设计了各基因的测序引物，采用PCR方法分别从rh2和野生型品种基因组中扩增出候选基因进行测序分析。发现rh2突变体在LOC_Os11g05570的第3个外显子发生1个碱基的替换突变，由C突变为T，使对应的氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸(图3C，D)。将此用不同的突变单株及群体中突变表型的单株，各重复验证三次，突变位点稳定存在(测序引物序列见表2)。根据BAC克隆OSJNBb0030I09序列的基因注释信息(NCBI)，预测此基因编码putative ribonuclease H2large subunit(OsRNaseH2 A)，该基因编码区全长2532bp，包含8个外显子和7个内含子，水稻中的OsRNaseH2 A基因与拟南芥中编码RNASEH2 A蛋白的基因有69％的同源率。

该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表的SEQ ID No：3所示。该基因的cDNA全长如SEQ ID NO：1所示，gDNA全长如SEQ ID NO：2所示。

表2、OSRNASEH2 A基因的测序引物序列

实施例2、

植物转化：

以粳稻品种“日本晴”基因组为模板，根据目的基因设计引物F-5’-AAAGGTACCTAATCTACACCAGAGCCACCAACGC-3’和R-5’-AAAGTCGACTGATCCTGTACCGCTATTACAATTTACTCA-3’，PCR扩增体系为：50μL的PCR反应体系：模板DNA 2μL；2×PCR buffer 25μL；2mmol dNTP(罗氏)10μL；KODFX(TOYOBO)酶1μL；10μM PrimerF 3μL；10μM PrimerR 3μL；ddH₂O 6μL；PCR扩增条件为：94℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸8min；共35个循环；68℃下延伸10min，15℃保温。PCR扩增后进行电泳分离，回收得到6062bp的DNA片段，用Kpn I和Sal I酶切pCAMBIA1300(p1300)后连接，获得了互补载体pCAMBIA1300-OsRNaseH2 A，该克隆覆盖了整个ORF的基因组区域(即包含了SEQ ID No：2所示的核苷酸序列)，还包括ATG上游2424-bp启动子序列和TGA下游1106-bp终止子序列(如图4所示)。这个质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中转化水稻。我们利用突变体成熟种子诱导愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有300mg/L潮霉素的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有250mg/L潮霉素预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察发现，与同时期的突变体比较，转基因植株叶色恢复为正常绿色，与转入空载p1300的日本晴表型一致。

通过上述转基因技术，结果表明：本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻(图5)。

说明：上文中所涉及的各种培养基的配方可参考Toki S.,Hara N.,Ono K.,Onodera H.,Tagiri A.,Oka S.,Tanaka H.(2006)Early infection of scutellumtissue with Agrobacterium allows high‐speed transformation of rice.The PlantJournal 47:969-976。

实施例3、

水稻原生质体的转化及OsRNaseH2 A绿色荧光融合蛋白的定位观察:

将RNASEH2 A基因cDNA序列克隆至pCAMBIA1301-S65T中构建GFP融合载体(图6A)

(1)生长15天左右的水稻幼苗用锋利的刀片在塑料培养皿板上切碎幼苗茎叶，移到200ml洗净的锥形瓶中(一般20ml酶解液每次60株左右；预先将酶解液倒入瓶中，根据瓶底大小合理分配酶解液)，每瓶不宜装太多。放入28℃摇床，60-80rpm，4-6小时。

(2)在酶解时间完成之前，配置PEG4000 40％溶液，置于65℃水浴锅中或室温溶解，65℃溶解，中间取出来振荡一次。

(3)酶解完成后，先向酶解完成的瓶中加入约15ml左右的W5。用300目(或400目)的钢制滤网将碎叶片过滤掉，用干净的塑料培养皿收集酶解后的原生质体。然后将原生质体缓慢倒入(或用去枪尖的枪头吸取)50ml离心管中，天平称重平衡后，放入水平离心机，150g，5min，充分收集原生质体,离心完成后，缓慢吸走上清。

(4)向原生质体沉淀中加入1ml W5溶液，缓慢轻轻倾斜混匀重悬，然后用去枪尖的枪头吸移到2ml离心管中。此时50ml离心管中可能还有少量未重悬的原生质体，可再加入1ml W5溶解，吸移到之前的2ml离心管中，150g，3min，移除上清液。

(5)用MMG重悬，具体加多少根据原生质体的量和要转的质粒个数来定，一般最后每个质粒中加入100ul稀释的原生质体。或者用显微镜稍微观察下产量和酶解后完整个体的数目比例，然后根据原生质体的状态来确定MMG用量。

(6)准备转化用质粒10-15ug左右或10ul，于2ml离心管中。

(7)加入100ul的重悬好的原生质体，然后加入PEG 40％110ul，混匀。

(8)28度避光静置15min。

(9)加入足量的W5稀释，混匀，然后离心150g，3min，缓慢移除上清，再用W5洗一次(中间会有损失，但不影响结果)。最后得到的沉淀，用W5重悬(用2ml的管子装满)，轻轻混匀，移到细胞培养板中。用锡箔纸包裹，避光28度静置培养，14小时。

(10)培养时间完成后，将培养板各孔中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸移到2ml管中，然后离心150g，3min，去除上清，保留100ul左右上清液，重悬原生质体。

(11)共聚焦显微镜观察拍照。

结果显示阳性对照在细胞各个部位均有表达，说明实验的表达系统工作正常，OsRNaseH2 AGFP融合蛋白特异的在细胞核中表达，其他部位未见表达，说明OsRNaseH2 A是定位于细胞核中的蛋白(图6B)。

说明：上文中所涉及的各种溶液的配方可参考Zhang et al.A highly efficientrice green tissue protoplast system for transient gene expression andstudying light chloroplast-related processes.Plant Methods 2011,7:30。

实施例4、

光合色素含量测定：

由于rh2突变体表型与温度没有明显的相关性，因此我们在大田取样，分别测定苗期突变体白色部分(rh2white)和绿色部分(rh2green)及对照叶片(NIP)叶绿素含量，同时测定光合效率。分别取突变体和野生型5叶期叶片去掉主脉，剪成1cm左右的片段，称取0.2g浸泡于10ml 80％丙酮，26℃条件下暗培养48小时。取溶液在紫外分光光度计(DU800,BECKMAN COULTER)663nm、645nm和470nm三种波长下测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的光密度值。3次重复，然后根据Amon(1949)的方法计算出各检测叶片中的叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)的含量,按照Wellburn(1994)计算类胡萝卜素(Car)的含量，计算公式如下：

chl a＝(12.7×OD₆₆₃－2.69×OD₆₄₅)×V/W

chl b＝(22.9×OD₆₄₅－4.68×OD₆₆₃)×V/W

car＝(1000×OD₄₇₀×V/W－3.27×Chl a－104×Chl b)/198

其中：V为提取液体积(10ml)，W为叶片质量0.2g，OD₆₆₃、OD₆₄₅及OD₄₇₀为在分光光度仪上读取的光密度值，单位：mg/g。

结果显示，与野生型相比，突变体绿色部分叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素及Chla/Chlb的值均无明显变化，但白色部分叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素含量均大幅下降，但Chl a/b的比值与野生型差别不大(图7)。这一结果说明，突变体白色部分的表型变化是由于叶绿素和类胡萝卜素缺失引起。

实施例5、

叶绿体透射电镜的制备和观察:

(1)样品：取突变体苗期叶片和对照野生型苗期叶片，切成0.5～1mm3左右的小块；

(2)固定：将切好的样品块放入2ml离心管中，加入2.5％的戊二醛溶液(PH＝7.2)，在抽真空仪器中抽真空直到叶片完全下沉。0.1M磷酸漂洗三次，每15min一次，然后加入1％锇酸固定2～3小时，直至样品变黑；

(3)脱水：先用50％、70％、和90％的乙醇溶液依次脱水，每个浓度处理20分钟，再用乙醇和丙酮(1：1)溶液处理20分钟，以上均在4度冰箱内进行，最后将样品用纯丙酮室温处理20分钟；

(4)渗透：将样品在无水丙酮和包埋剂(3：1)混合液中作用4小时，再在无水丙酮和包埋剂(1：1)混合液处理3小时，最后在纯的包埋剂中作用12小时；

(5)包埋：将上述步骤中的样品挑的包埋盒内，37℃过夜，45℃处理12小时最后60℃处理24小时，获得包埋样品；

(6)切片、拍照：将包埋样品用超薄切片机切成60-70nm左右的超薄片，然后将切片用柠檬酸铅溶液染色10分钟，再有醋酸铀溶液染色30分钟，双蒸水清洗三次后晾干，用Hitachi H-7650型透射电镜观察并且选择清晰地倍数拍照。

结果显示野生型叶片的叶肉细胞中叶绿体数目较多，叶绿体结构完整，叶绿体中基粒片层层次丰富，排列紧密。突变体叶片绿色部分相比野生型叶绿体结构和数量并无明显变化，但突变体白色部分相比野生型叶绿体数量明显减少、叶绿体内部无明显的基粒结构(图8)。观察结果表明目的基因的突变造成了突变体白色部分中叶绿体结构发育缺陷。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.水稻DNA复制相关基因OsRNase H2A的用途，其特征在于：用于改良水稻叶片形态和颜色；所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1或SEQ ID No：2所示；所述基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。

2.一种改良水稻叶片形态和颜色的方法，其特征在于：包括用核苷酸序列如SEQ IDNo：1或SEQ ID No：2所示的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。