CN111500604A

CN111500604A - 铁皮石斛DcCSLA8基因及其在促进植物多糖的合成中的应用

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Publication number: CN111500604A
Application number: CN202010362294.8A
Authority: CN
Inventors: 陈东红; 高雅倩; 刘京晶; 斯金平
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2020-04-30
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2020-08-07

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛DcCSLA8基因，所述基因的序列如下:(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或(b)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的核苷酸序列。本发明还提供了铁皮石斛DcCSLA8基因在促进植物多糖的合成中的应用。通过在植物中提高铁皮石斛DcCSLA8基因，可促进植物多糖的合成。

Description

铁皮石斛DcCSLA8基因及其在促进植物多糖的合成中的应用

技术领域

本发明涉及铁皮石斛DcCSLA8基因及其在促进植物多糖的合成中的应用。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium catenatum)为兰科石斛属多年生草本植物，以茎入药，具有滋阴清热、益胃生津等功效。葡甘聚糖是铁皮石斛茎中主要的活性多糖，对提高免疫、抗肿瘤、调节血糖、改善记忆衰退等方面具有重要作用。

在多种植物中，类纤维合成酶A(cellulose synthase like A，CSLA)基因参与1，4-β-葡甘聚糖的生物合成，是调控植物体内葡甘聚糖骨架合成的关键酶基因。例如，在拟南芥中，CSLA2、CSLA3以及CSLA9共同调控茎中葡甘聚糖的生物合成，CSLA7参与胚胎中葡甘聚糖的生物合成；在魔芋曲霉中AkCSLA3具有葡甘露糖甘露糖基和葡萄糖基转移酶活性；杨树CSLA1编码葡甘聚糖合成酶。

在铁皮石斛中，已报道有到8个DcCSLA基因，大部分CSLA基因在茎中表达量高于叶片和根部，其中DcCSLA6基因对甘露糖的合成有促进作用，而其他DcCSLA基因的功能未见报道。因此，克隆DcCSLA8基因，构建过表达载体，对转基因植株多糖含量进行测定与分析，可探讨研究铁皮石斛DcCSLA8基因的功能。

发明内容

本发明的目的揭晓铁皮石斛DcCSLA8基因的功能应用，并提供铁皮石斛DcCSLA8基因及其在促进植物多糖合成中的应用。

本发明提供了一种铁皮石斛DcCSLA8基因，所述基因的序列如下:

(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或

(b)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述铁皮石斛DcCSLA8基因的序列为SEQ ID NO：1。

本发明还提供了上述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。

在一个实施方案中，所述重组菌为将上述基因插入表达载体得到的重组菌。

本发明还提供了一种铁皮石斛DcCSLA8基因在促进植物多糖的合成中的应用，所述基因的序列如下:

(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或

在一个实施方案中，所述植物为拟南芥或烟草。优选情况下，所述植物为拟南芥。

在一个实施方案中，所述应用还包括：将包含铁皮石斛DcCSLA8基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。

本发明提供了铁皮石斛DcCSLA8基因在促进植物多糖的合成中的应用。通过在植物中提高铁皮石斛DcCSLA8基因，可促进植物多糖的合成。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为铁皮石斛DcCSLA8基因PCR扩增电泳结果(M：DL5000 DNA Mareker)；

图2为T1-DcCSLA8菌落PCR扩增电泳结果(M：DL2000 DNA Mareker；1～8：不同的单克隆)；

图3为eHGFP双酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果(M：DL5000 DNA Mareker；1：eHGFP双酶切；2：对照(未进行双酶切的eHGFP)；3：T1-DcCSLA8质粒双酶切)；

图4为eHGFP-DcCSLA8转化大肠杆菌PCR扩增结果(M：DL2000 DNA Mareker 1～5：不同单克隆的PCR结果)；

图5为eHGFP-DcCSLA8转化农杆菌菌落PCR扩增结果(M：DL2000 DNA Mareker)；

图6为转基因拟南芥的潮霉素抗性筛选；

图7为T3代纯合DcCSLA8转基因拟南芥观察；

图8为野生型拟南芥和DcCSLA8过表达拟南芥的多糖含量测定。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1.实验方法

1.1实验材料与试剂

1.1.1植物材料

供试铁皮石斛取自浙江农林大学国家重点实验室药用植物遗传育种团队组培室(培养温度为25℃，光照时间为16h·d^-1)。用于遗传转化的拟南芥品种为Col型。

1.1.2主要试剂

表1试验所需主要试剂

1.1.3主要仪器

Biometra PCR仪、Lanyan恒温金属浴、Sigma台式高速冷冻离心机、Thermonanodrop 2000分光光度计、AB104-N电子分析天平、DK-S24型电热恒温水浴锅、D-37520型高速离心机、GENSYS 10S UV-Vis紫外分光光度仪、DHG-9070HA精密性强制对流干燥箱、ALPHA 1-2LD Plus冻干机、AB104-N电子分析天平、光吸收酶标仪SpectraMax 190等。

1.1.4主要缓冲液配方

1.1.4.1 RNA提取缓冲液制备

1)DEPC水：ddH2O加0.1％DEPC原液，摇床过夜，灭菌待用。

2)1mol/L Tris:12.11g Tris溶于60ml灭菌的DEPC水中，用浓HCl调节PH 8.0定容至100ml。

3)50mM EDTA：18.61Na2EDTA.H2O加入80ml灭菌的DEPC水，搅拌溶解，用NaOH调节PH8.0定容至100ml。

4)10mol/L LiCl：42.4gLiCl，100ml灭菌的DEPC水溶解即可。

5)提取缓冲液：2gCTAB、2gPVP、10ml 1mol/L Tris、5ml 500mM的EDTA、11.7gNaCl定容至100ml。

6)4％β-巯基乙醇。

7)氯仿/异戊醇(24：1)。

8)SSTE：2.9gNaCl、0.25g SDS、0.5ml 1mol/L Tris、100μL500 mM EDTA，调至PH8.0，定容至50ml。

将上述配好的试剂于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min两次备用。

1.1.4.2 LB培养基

混匀后121℃高压灭菌20min，冷却后于4℃保存。液体LB培养基无需加入琼脂

1.1.4.3拟南芥转化渗透液(pH＝5.7～5.8)

混匀后121℃高压灭菌20min，冷却后于4℃保存。使用时加入0.05％Silwet-77。

1.1.4.4拟南芥遗传转化筛选培养基(pH＝5.7～5.9)

混匀后121℃高压灭菌20min，冷却至60℃时加入500mg/L的潮霉素，混匀后分装。

1.1.4.5抗生素母液配制

1)氨苄青霉素(50mg/ml)

氨苄青霉素(Amp) 500mg

ddH2O(灭菌) 10mL

溶解定容后，0.22μm滤膜过滤除菌，小份分装，于-20℃保存。

2)卡那霉素(50mg/ml)

卡那霉素(Kan) 500mg

ddH2O(灭菌) 10mL

溶解定容后，0.22μm滤膜过滤除菌，小份分装，于-20℃保存。

3)利福平(50mg/ml)

卡那霉素(rif) 500mg

二甲基亚砜(DMSO) 10mL

溶解定容后，0.22μm滤膜过滤除菌，小份分装，于-20℃保存。

1.2实验方法

1.2.1铁皮石斛总RNA的提取

1.2.1.1实验用具准备

1)用锡箔纸将研钵研杵和药匙包好，180℃高温烘烤4h。

2)将离心管、枪头于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min灭菌两次。之后于烘箱中烘干。

1.2.1.2总RNA的提取步骤

1)将1ml CTAB提取液，20μLβ-巯基乙醇于2ml离心管中，摇匀后置于65℃水浴20min。

2)用液氮冷却研钵和研杵，取200g左右的铁皮石斛材料(根、茎、叶)迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中材料融化，用药匙将研磨好的粉末立即加入到预热好的提取缓冲液中，均匀搅拌。

3)65℃水浴20min后，4℃12000rpm离心10min。

4)取上清至新的2ml离心管中，加入等体积的10mol/L LiCl混合摇匀，4℃放置过夜。

5)将SSTE放置于40℃中水浴锅中水浴，离心机4℃预冷。

6)将前一天的样品于离心机中4℃12000rpm离心20min。

7)弃上清，加入500μL 75％乙醇清洗沉淀，使离心管壁上的RNA游离即可，4℃12000rpm离心5min。

8)重复步骤7)。

9)弃上清，加入500μLSSTE，剧烈震荡，使RNA溶解。

10)于上述离心管中加入800μL的trisol，摇匀后加入200μL氯仿，摇匀后，4℃12000rpm离心5min。

11)取上清于新的2.0ml离心管中，然后加入等体积的氯仿：异戊醇，涡旋混匀，4℃12000rpm离心10min。

12)取上清于新的1.5ml离心管中，然后加入等体积异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱内沉淀至少20min后，4℃12000rpm离心10min。

13)弃上清，添加500μL 75％乙醇，摇出RNA，4℃12000rpm离心5min。

14)重复步骤13)。

15)弃上清，用白枪头将剩余酒精尽可能吸干，置于无菌操作台上，吹干。

16)干燥后的沉淀添加20-30μLDEPC水，反复吹打，待沉淀溶解后，置于-80℃保存。

1.2.2铁皮石斛总RNA检测

制备新的电泳缓冲液以及琼脂糖凝胶，取适量总RNA样品点样后电泳10min左右，检测RNA的完整性，在此过程中，操作尽量迅速以最大程度的避免RNA的降解。取1μL总RNA样品用分光光度计测量A230/A260、A260/A280以及RNA的浓度。

1.2.3 cDNA第一链的合成

第一阶段：总RNA的变性裂解

1)添加1.0μL 50mM Oligo(dT)于RNA样本(5ng-5μg)中，使用RNase-free H2O补齐最终体积11.5μL.

2)70℃加热3min，立即置于冰上。

第二阶段：逆转录反应

1)简短离心片刻后，添加以下试剂：

5xFrist Buffer 4μL

dNTP Mix 2μL

100mM 2μL

2)用移液枪反复吸打混匀，添加0.5mL SMART MMLV RT，混匀。

3)42℃孵育60min。

4)于72℃中15min终止反应。

1.2.4 DcCSLA8基因的克隆

1.2.4.1 DcCSLA全长引物设计

从NCBI获得的DcCSLA8基因的CDS序列利用引物设计软件Primer5.0版本设计出全长引物，并由杭州有康生物科技有限公司合成，引物如下:

表2铁皮石斛CSLA8基因克隆所用引物

注：ggatcc和gtcgac分别是在上游和下游引物中加入的BamHⅠ和SalⅠ酶切位点。

1.2.4.2以铁皮石斛cDNA为模板进行PCR扩增

PCR反应体系如下：

PCR反应程序：预变性：98℃3min；变性：98℃10s；35个循环(变性：98℃10s；退火：55℃10s；延伸：72℃40s)；终延伸：72℃5min。

1.2.4.3琼脂糖凝胶电泳

1)量取一定量的1×TAE电泳缓冲液，加入一定量琼脂糖，混匀后，置于微波炉中加热，充分溶解琼脂糖，待溶液稍微冷却，加入适量核酸染料，制成1％(g/L)的凝胶。

2)安放电泳板与大孔梳子，将琼脂糖溶液缓慢的导入到电泳板中，静置。

3)待凝胶完全凝固后，轻轻取出梳子，电泳板外侧的凝胶刮出干净，将凝胶(附带电泳板)放入到电泳槽中。

4)在电泳槽中加入电泳缓冲液，是电泳缓冲液覆盖再琼脂糖脚面之上月1-2mm。

5)取上一实验制备的PCR反应产物，用移液枪将样品小心的加入到不同的点样孔中，再在第一个孔中点2000DNA marker，作为对照。

6)接通电源，在120V下电泳适当时间，当溴酚蓝颜料迁移至凝胶的三分之二处时，停止电泳。

7)取出凝胶，在凝胶成像仪下扫面拍摄电泳图片，根据目的基因大小确定相对正确的条带。

1.2.4.4 PCR产物凝胶回收

首次使用前，向Buffer WB中添加56ml的100％乙醇。试剂中含有变性剂，操作时应佩戴手套等防护用具。

1)在紫外灯下切除含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸干凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。将胶块置于1.5ml离心管中。

注：切胶时请注意不要讲DNA长时间暴露一紫外灯下，以防DNA损伤。

2)向胶块中加入600μL的溶解液Buffer GM。

3)置于37℃，此时应间断震荡，使胶块充分溶解。

4)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

5)将上述溶液转移至Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液。

6)将700μL的Buffer WB加入Spin Column中，室温12000rpm离心30s，弃滤液。

7)重复步骤6)。

8)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12000rpm离心1min。

9)将Spin Column安置于新的1.5ml离心管上，静置两分钟，待S品Column中的酒精挥发完全。

10)在Spin Column膜中央处加入30μL Elution Buffer,室温静置1min.

注：将Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。

11)室温12000rpm离心1min洗脱DNA。

1.2.4.5目的基因与克隆载体的连接

连接体系如下：

轻轻混合，室温(20℃～37℃)反应5分钟。反应结束后，将离心管置于冰上。

1.2.4.6大肠杆菌的转化

1)从－80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，置于冰上溶解。

2)取上述5μL的连接产物，加入50μL感受态细胞中，用指尖轻弹混匀，冰浴30min。

3)42℃热激60s。

4)迅速将管置于冰浴中，冷却2-3min。

5)加入200μLLB液体培养基，37℃摇床缓慢震荡培养1h。

6)4000rpm离心2min，倒掉部分上清液。

7)在超净工作台上，将剩余的菌液涂布于含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB固体平板上，吹干，倒置培养于37℃中培养过夜大量扩增。

1.2.4.7筛选阳性克隆

用灭过菌的白枪头挑取少许上述平板上的单菌落(切忌全部挑完)进行PCR验证。

PCR反应体系：

PCR反应程序：同1.2.4.2。

挑取上述菌落电泳条带正确的剩余单菌落放入5mL LB液体培养基(含50mg/mLAmp)于37℃摇床震荡培养12～16h。

1.2.4.8阳性克隆的测序

吸取上述菌液1mL送至杭州有康生物科技有限公司进行测序验证。

1.2.4.9阳性克隆质粒的提取

首次使用前，在溶液P1中加入RNase A(将试剂盒中提供的RNase A全部加入)混匀，置于4℃冰箱中保存。

1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的非也，将吸附柱重新放回到收集管中。(请使用当天处理过的柱子)

2)取上述剩余的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，3000rpm离心5min，尽量吸除上清。

3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，使用移液枪悬浮细菌沉淀，将悬浮液转移置1.5ml离心管中。

4)向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

5)向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min。

6)将上一步收集的上清液用移液枪转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入到收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7)向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。

8)向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

重复步骤8)。

9)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

10)将吸附柱CP3置于新的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

11)将质粒保存在-20℃，以防DNA降解。

1.2.5植物过表达载体的构建

1.2.5.1酶切

植物过表达载体eHGFP是由35S启动子驱动的GFP绿色荧光蛋白载体，使用时需要用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切得到线性化载体。将提取的重组质粒pEASY-DcCSLA8和植物过表达载体eHGFP同时进行双酶切，酶切体系如下：

37℃酶切40min后，分别回收相应大小的片段。

1.2.5.2连接

将上述双酶切产物连接起来，连接体系如下：

轻轻混合，25℃反应1h(于PCR仪中进行)。反应结束后，将离心管置于冰上。

1.2.5.3大肠杆菌的转化

同1.2.4.6。

1.2.5.4筛选阳性克隆

同1.2.4.7。

1.2.5.5阳性克隆的测序

同1.2.4.8。

1.2.5.6阳性克隆质粒的提取

同1.2.4.9。

1.2.5.7农杆菌的转化

1)将农杆菌感受态细胞置于冰上融化。

2)取1μLeHGFP-DcCSLA重组质粒，加入50μLAgl1农杆菌感受态细胞，用手指轻弹混匀。

3)分别于冰浴5min，液氮5min，37℃5min，冰浴5min。

4)于离心管中加入无抗LB 700μL。

5)于28℃摇床培养2-3h。

6)4000rpm离心2min，倒掉部分上清液。

7)在超净工作台上，将剩余的菌液涂布于含Kan和Amp(50μg/ml)抗性的LB体平板上，吹干，倒置培养于28℃中培养2-3d大量扩增。

1.2.5.8筛选阳性菌落

同1.2.4.7。

1.2.5.9阳性菌落的扩大培养

1)挑上述平板上的阳性单克隆菌落加入含5ml Kan和Amp(50μg/ml)抗性的液体LB的50ml离心管中震荡培养1d。

2)取600μL上述培养的菌液加入600μL 50％甘油于1.5mL离心管中，液氮速冻，保存至-80℃冰箱备用。

3)取适量上述剩余菌液转移至100ml锥形瓶中，加入50ml含Kan和Amp(50μg/ml)抗性的液体LB，扩大培养。

1.2.6拟南芥的种植及遗传转化

1.2.6.1拟南芥的种植

1)种子消毒：于含有少许拟南芥种子的1.5mL离心管中，添加1mL 70％乙醇，上下颠倒混匀10min，而后将70％乙醇吸出，添加95％乙醇，继续上下颠倒混匀10min，最后将种子铺在无菌的滤纸上，吹干。

2)将消毒后的种子均匀的点在含有固体MS培养基的平板中，封口。

3)将平板于4℃冰箱春化2d。

4)将上述平板转移至人工气候室中进行萌发生长。

5)萌发后10～15d后，选取健壮、生长一致的移栽到事先用自来水浸过的营养土中，其上覆盖保鲜膜，到苗生长正常后揭去，并继续培养。

1.2.6.2拟南芥的遗传转化

1)拟南芥开花时，剪去最先开花的花序以便后期花序的增多，待开花最为繁盛时准备转化。

2)将准备好的菌液于4℃3000rpm离心25min。

3)倒掉培养液，使用转化渗透液重悬菌体，使OD600在0.8左右。

4)剪去用于转化的拟南芥植株上所生成的荚果。

5)将上述重悬液转移至干净的小喷壶中进行喷洒，主要对象是花和花苞。喷洒完后，用黑色不透明盖子保湿一天。

6)侵染一周后，可以进行第二次侵染，适时浇水。

7)收集种子，干燥后于室温保存。

1.2.7转基因拟南芥的鉴定

1.2.7.1转基因拟南芥的筛选

1)种子消毒：同2.2.6.1。

2)将消毒后的种子均匀的点在含有固体MS培养基(含有50mg/L潮霉素)的平板中，封口。

3)～4)同2.2.6.1。

5)萌发后10～15d后，选取健壮、生长一致的移栽到事先用自来水浸过的营养土中，其上覆盖保鲜膜，到苗生长正常后揭去，并继续培养，待植株长至相应大小后进行后续检测。

1.2.7.2 PCR鉴定

提取上述抗性拟南芥叶片的DNA，以该DNA为模板进行扩增，检测目的基因在拟南芥叶片中的表达情况。

使用植物基因组DNA提取试剂盒(北京擎科新业生物技术有限公司)提取拟南芥叶片DNA，具体操作如下：

1)将Spin Column置于Collection Tube中，加入250μl Buffer BL 12,000×g离心1min，活化硅胶膜。

2)取植物新鲜组织(不大于100mg)或干重组织(不大于20mg)，加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5ml离心管中，加入400μl Buffer gP1，涡旋振荡1min，65℃水浴10～30min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解(容易裂解的水稻大豆等作物10min，绿萝等花卉或蔬菜30min)。

注：如需消化RNA，可在此步加入5μl高浓度RNase A(100mg/ml)。

3)加入150μl Buffer gP2，涡旋振荡1min，冰浴5min。

4)12,000×g离心5min，将上清转移至新的离心管中。

5)加入上清等体积的无水乙醇(例如500μl的上清液加500μl无水乙醇)，立即充分振荡混匀，液体全部转入Spin Column中，12,000×g离心30s，弃废液。

6)向Spin Column中加入500μl Buffer PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000×g离心30s，弃废液。

7)向Spin Column中加入500μl Wash Buffer(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000×g离心30s，弃废液。

8)重复操作步骤7)。

9)将Spin Column放回Collection Tube中，12,000×g离心2min，开盖晾干1min。

10)取出Spin Column，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50～100μlTE Buffer(65℃预热TE Buffer洗脱效果更佳)，20～25℃放置2min，12,000×g离心2min。

PCR反应体系：

PCR反应程序：同2.2.4.2。

表3 DcCSLA转基因拟南芥验证所用引物

1.2.7.3 T3代纯合转基因拟南芥的筛选和表型观察

选取35粒饱满的T2代种子均匀的点播在含有相应抗性的MS平板上进行筛选，培养两周左右后观察。将筛选出来的纯合株系于野生型拟南芥做对比观察。

1.2.8转基因植物多糖含量的测定

1.2.8.1总多糖提取液的制备

本试验参考《中国药典》铁皮石斛含量测定方法提取总多糖，具体步骤为：精密称量拟南芥粉末0.3g，加入25mL蒸馏水，称重，于水浴锅中提取2h。冷却至室温，用蒸馏水补齐至先前重量。离心60min，将上清液转移至新的离心管中。取5mL上述提取液，加入4倍体积无水乙醇，混匀，于4℃冰箱中沉淀静置过夜。将静置过的多糖溶液于离心机中6000rpm离心60min，弃去上清液。加入20mL 80％的乙醇，于离心机中6000rpm离心30min。弃去上清液，重复加80％乙醇一次。弃去上清，最后将沉淀用蒸馏水溶解，于容量瓶中定容至50mL。

1.2.8.2葡萄糖标准曲线的制备

配制浓度为0.00～0.15mg·mL-1的葡萄糖标准液，采用苯酚-硫酸法显色，于488nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.8.3多糖含量的测定

精密吸取1mL多糖溶液加入1mL 5％苯酚，最后精密加入5mL浓硫酸，混匀，冰水中静置5min，沸水浴20min，取出于冰水中冷却。以1mL水位空白，于488nm处测定吸光度，试验平行三次，计算总多糖含量以无水葡萄糖计。

2.实验结果

2.1目的基因的获得

PCR产物由琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。从电泳结果可知，PCR反应得到的片段大小约为1700bp左右，所以认为得到的DNA片段为铁皮石斛DcCSLA8基因。

2.2 T1-DcCSLA8转化子菌落的获得

将克隆得到的DcCSLA8片段回收后，连接至T1载体上。随机选取7个单菌落，进行菌落PCR检测个片段是否插入至载体中。结果(图2)显示，扩增出的目的条带与预期的大小相符，将阳性菌落过夜摇菌培养，之后进行序列测定。

2.3植物过表达载体的构建

2.3.1 eHGFP线性载体的获得

eHGFP载体大小约为12kb，因为未酶切过的eHGFP的超螺旋形式在电场中泳动比线性载体速度快，因此双酶切后的线性eHGFP载体条带比环状eHGFP载体条带在电泳图中大(如图3)，表明已将环状eHGFP载体切割完全。

2.3.2 eHGFP-DcCSLA8转化子菌落的获得

挑取5个单菌落，进行菌落PCR检测目的片段是否插入。结果如图4所示，挑取3个PCR检测为阳性的菌株，过夜培养，而后进行序列测定。

2.3.3测序已验证插入基因序列

基因测序结果显示SEQ ID NO：1基因序列。

2.3.4超表达载体转化农杆菌

将构建好的eHGFP-DcCSLA8超表达载体转化至农杆菌Agl1中后，随机挑取8个单菌落，进行菌落PCR，结果如图5所示，将条带较亮的单菌落摇菌备用。

2.4 DcCSLA8在拟南芥中的异源转化

2.4.1转基因拟南芥的鉴定

待将从潮霉素抗性培养基上(图6)筛选得到的培养至两周左右，移栽至基质中进行培养，留作备用。

2.4.2 T₀代转基因拟南芥DNA水平检测

将上述潮霉素筛选得到的转基因苗，随机挑取6株(Line1～Line6)转基因植株和野生型拟南芥提取DNA后，进行PCR验证，显示的DNA片段大小1700bp左右，与铁皮石斛DcCSLA8基因大小一致。

2.4.4 T3代纯合转基因拟南芥观察

将T3代纯合转基因拟南芥和col野生型拟南芥种子，均匀的播种在含MS培养基的培养皿中，待其长至两周左右，观察其外部形态。结果如图7所示(本文只列出3个Line)，DcCSLA8过表达转基因苗与野生型拟南芥在外观形态上无明显差异。

2.5转基因植物的多糖含量测定

采用苯酚硫酸法测定拟南芥多糖含量结果如图8所示，DcCSLA8基因过表达拟南芥中的多糖含量分别为27.2、28.5、25.6mg·g^-1极显著高于野生型拟南芥的多糖含量20.6mg·g^-1，3个转基因株系平均多糖含量比野生型提高31.4％，表明DcCSLA8对多糖的合成具有明显的促进作用。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 铁皮石斛DcCSLA8基因及其在促进植物多糖的合成中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgttagagt ttgggagttt gtctatcgat ttggaaggta ttgaagaggt gttacttacg 60

aaatggaagc aaataagagt gaatatagtg gcgccattgt tgagagttgc agtgttgatt 120

tgcttgataa tgactctgat gatttttgtg gagaaggtgt ttgtgggatt gatttgtctt 180

gttgtcaagg tgtttaaatt gaagcctgag aagcgttata gatgggagcc aatgagaccc 240

gagacctcag atctagagat tggtgttcta tcttatccaa tggtgcttgt acagatccca 300

atgtacaatg agaaagaggt ttacaagctt tcaataaggg cagtatgcaa tttggattgg 360

ccttctgata ggatgattat tcaagtactg gatgactcca ctgatccagt tgtgaaggat 420

ttggtgggat tggaatgtaa aatatggaag agcagagggt tgaacataaa tcatgaggtc 480

agaaacaaca ggaaagggta caaagctggt gctttgaaag atggaatgct tcattattct 540

gtaaaagatt gtgaatatgt tgccatattt gatgctgatt tccaaccaga atctgatttc 600

ttgaaacgaa cagtcccttt tctcattcat aatccggaga ttgctcttgt tcaagctcga 660

tggaaattcg tgaatgctaa tgaatgcatg atgacaagaa tgcaagagat gtcattagat 720

tatcacttca agattgagca agaagctggg tcatctgcat tttccttctt cggttttaat 780

ggaactgccg gcgtttggcg catatcaacc attgctgatg ctggaggatg gaaggatagg 840

acgacggttg aagacatgga tttggctgtt cgttcaagtc ttgatggttg gaagtttgtg 900

tatgttggtg atgtcaaggt aaaatgtgaa ttaccaagta ctttcaaggc ctatcgatat 960

cagcaacatc gatggtcttg tggacctgca aaccttttca agaagatgat attggagata 1020

atagctaaca agaaggtttc aacatggaaa aaaatccacc taatctataa cttcttcttt 1080

attggaaaga ttgtagctca tacatcagcc tatatattct cctgcattgt gattccacta 1140

tccgttctaa ttcctgaggt cgagattccc ttgtggggag tcgcatacat accaacaatt 1200

attacacttc ttaaatcagt aggaactcca agctctttcc accttgtaat cccttgggtg 1260

ctctttgaaa atgtaatgtc cttgcatcga attaaggcag ctactacagg ttttttagac 1320

gttggccggg ttaatgaatg gatagttaca acaaagttgg gtgatggtag caagacaaag 1380

ccatctatgg aagtgatagt taagaatgca aaagatttaa gagatgctaa agtgatagag 1440

ccgttgcttg gtgattataa gaagcctcaa gttaggacaa ggcaaagatt tcatttggcc 1500

gagctatgga tgggtgtctt catgttttcg gctggattct atgatgtcgc ctacactaaa 1560

aaaggatact tcatttacct ctttatgcaa tcatgtgcat tccttattat tggttttgat 1620

ttcattggca catatgttaa aacttct 1647

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggatccatgt tagagtttgg gagtttgtct a 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcgacagaa gttttaacat atgtgccaat g 31

Claims

1.一种铁皮石斛DcCSLA8基因，其特征在于,所述基因的序列如下:

(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述铁皮石斛DcCSLA8基因的序列为SEQID NO：1。

3.含有权利要求1所述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为将权利要求1所述基因插入表达载体得到的重组菌。

5.一种铁皮石斛DcCSLA8基因在促进植物多糖合成中的应用，其特征在于，所述基因的序列如下:

(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述铁皮石斛DcCSLA8基因的序列为SEQID NO：1。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或烟草。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括：将包含铁皮石斛DcCSLA8基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。