CN101250532B - 蝴蝶兰PhAGCu基因编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体为一种在蝴蝶兰中表达的AGAMOUS-like基因家族的PhAGCu基因的核苷酸编码序列及其在改变花发育，成花转变和形态构建方面的应用。本发明涉及的蝴蝶兰PhAGCu基因具有特定序列的DNA分子，全长950bp，包括一个717bp开放读框，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。本发明还包含上述基因的重组表达载体，转基因植株，获得此基因的核苷酸引物系列，用于检测内源表达模式的寡核苷酸探针序列，以及对蝴蝶兰此内源基因的表达模式进行分析鉴定的方法。将本发明所说基因转入烟草，所获得的转基因植株的花的形状及结的种子都发生明显变化，表明该基因可影响植株有性器官的发育。

Description

蝴蝶兰PhAGCu基因编码序列及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种在蝴蝶兰中表达的PhAGCu基因的核苷酸编码序列，包含上述基因的重组表达载体，转基因植株，以及对蝴蝶兰此基因的表达模式进行分析鉴定的所使用的方法。

背景技术

兰科属于世界性四个特大科之一，起源古老，进化速率极其不同步，是种子植物系统发育在单子叶植物中的一个高峰，具有典型性和代表性(吴征镒，2003)。

兰花结构高度特化，其花被的高度变异(如似花瓣的萼片和唇瓣)及合蕊柱的出现为研究ABC功能基因提供了新的平台和视角，并可能会拓展经典ABC功能基因概念的外延。

1990年以来，越来越多不同种属植物中的A、B、C类基因相继被克隆。这些花器官特性基因中的绝大多数属于一个古老的基因家族，MADS-box家族。MADS-box基因家族得名于最先鉴定出来的四个成员的首字母：酵母的MCM1基因、拟南芥的AGAMOUS基因、金鱼草的DEFICIENS基因和人的SRF基因。这一基因家族编码包括动、植物、真菌在内的几乎所有真核生物中的转录因子，在生物体的发育控制以及信号转导过程中均发挥作用。其在植物发育中的重要作用尤为引人注目，参与了植物根、叶、花和果实的发育，以及营养生长向生殖生长转变过程的调节。

其中首先在拟南芥中分离得到的AGAMOUS基因，其功能不仅限于轮III、轮IV的原基发育，还具有和A类基因相互拮抗，并使花芽发育具有确定性的作用。虽然单子叶植物中分离得到的第一个MADS基因来自兰花(Lu et al.，1993)，但十几年来大部分的研究都集中在水稻、玉米上，有关兰科花发育的分子研究仍比较初步，主要集中在蝴蝶兰和石斛兰上。目前，有关蝴蝶兰的A、B、C和D族基因均有报道，而尤以B族基因的研究最为详细。

本研究通过分离蝴蝶兰C类基因，即AGAMOUS-like基因家族的PhAGCu基因，对其时空表达模式进行了确定，同时还进行了部分转基因的工作，希望为确立兰科植物花发育的遗传机制提供一定的依据，并对经典的ABC模型作出进一步的补充。另一方面，通过转基因技术，为蝴蝶兰的分子育种提供一定的思路，为蝴蝶兰的观赏园艺方面作出有益的贡献，从而又具有一定的经济价值。

发明内容

本发明的目的在于提出一种从蝴蝶兰中克隆出的PhAGCu基因，其编码序列和应用。

本发明的一方面提供一种新的蝴蝶兰基因，记为PhAGCu，已注册于GenBank/EMBL/DDBJ，登陆号为：DQ534013。为具有特定序列的DNA分子，全长950bp，包括一个717bp的开放读框(ORF)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供上述基因编码翻译出的蛋白质分子，有239个氨基酸残基，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了用于调取获得蝴蝶兰样品中PhAGCu基因的一对核苷酸引物PAGF和B₂₅。该引物根据PhAGCu基因保守区域设计。使用此对引物对蝴蝶兰样品cDNA进行PCR扩增可获得长950bp的基因片段。具体的引物序列信息参见SEQ ID NO.3。

本发明还提供了一种用于检测样品中蝴蝶兰PhAGCu基因拷贝数的方法，其使用前述核苷酸序列SEQ ID NO.1，其中的特异区段3’UTR约250bp作为探针，对蝴蝶兰基因组DNA样品进行Southern杂交，然后检测目的片段的有无。样品为蝴蝶兰的基因组DNA，经限制性内切酶酶切后的核苷酸片段。

本发明还提供了一种用于检测PhAGCu基因在蝴蝶兰原植株组织中表达分布状况的方法。取小块组织材料，经多聚甲醛处理和梯度脱水，包埋于石蜡组织中。实验检测时取复水和蛋白酶K处理过的切片与事先制备的DNA探针分子在杂交液中混合杂交，显色后观察拍照。而杂交使用的DNA探针分子为包含于PhAGCu基因的某特异区段(3’UTR，约25bp)的DNA序列。

本发明还提供了一种将上述的编码具有蝴蝶兰PhAGCu基因转入烟草以改变成花过程和形态建成的方法，具体步骤如下：

(1)将编码蝴蝶兰PhAGCu基因的核苷酸序列可操作的连接植物表达载体，形成含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，并将菌液与烟草叶片混合培养。

(3)通过抗生素筛选，PCR鉴定，获得转化细胞并再生转基因植株。

附图说明

图1 PhAGCu基因和其它AG-like基因的系统进化分析。利用PAUP软件，依据这些基因保守区的核苷酸序列，构建最大简约树。PhAGCu属于C族基因，并且与单子叶植物类群具有更近的亲缘关系。其他的C类基因如PLE、pMADS3、FBP6等构成了双子叶类群。其余AG-like基因则形成D族基因，同样的，也聚类为单子叶植物以及双子叶植物两大类。

图2蝴蝶兰中PhAGCu基因的Southern blot分析。B、D分别为消化基因组DNA用的两种市售的酶BglII和DraI，右边数字代表分子量大小(kb，千碱基对)。

图3 RT-PCR显示PhAGCu在蝴蝶兰各器官中的表达模式。图中各字母简写分别代表如下：0，负对照；PLB，原球茎；R，根；St，茎；Le，叶；B，花蕾；P，花瓣；L，唇瓣；C，合蕊柱；Pe，花梗；Ov，胚珠；M，marker。

图4蝴蝶兰PhAGCu基因的原位杂交结果。A，花器官原基都开始发育的花蕾；B，第一个花原基开始萌出的花序分生组织群；C，其中一个花序分生组织；D，花器官都具备的花蕾；F，受精的子房(×40)；E，正义探针杂交结果，为负对照。b，苞片；im，花序分生组织；fm，花芽分生组织；fp，花原基；se，萼片；pe，花瓣；c，合蕊柱；p，花粉块；1，唇瓣；lpj，唇瓣突起；r，蕊喙；o，胚珠；ow，子房壁。

图5转基因植株的潮霉素抗性基因(HYG)和目的基因(AG)的PCR鉴定。AG(4)，AG(8)为PhAGCu转基因烟草株系编号。

图6转基因烟草的部分表型。A为转基因烟草的花序；B为转基因烟草叶片褶皱；C转基因烟草正常结实；D转基因烟草的花瓣正常；E对照烟草花序；FG转基因烟草柱头外露；H对照烟草的花瓣。

具体实施方式

下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如Sambrook等分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor Labortary Press，1989)中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。

实施例1

蝴蝶兰PhAGCu基因的克隆

1蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrida)品种Formosa rosa来自上海农业科学院蔬菜园艺研究所；生长条件为光周期16h/8h(L/D)，25℃。

2 RNA提取。取100毫克左右新鲜的材料，液氮充分研磨。加1mL TriBlue试剂，用力摇15s，室温放置5min。加0.2mL氯仿，去蛋白，上清转移至新的离心管，加等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min。用DEPC配制的75％乙醇1mL洗涤沉淀，重复一次。室温干燥5～10min，溶于20μL DEPC水中，测OD值，电泳检测。

3基因的克隆。以逆转录的蝴蝶兰花芽cDNA第一链为模板，利用正向引物PAGF和反向引物B₂₅进行PCR，获得基因全长。具体序列信息参见SEQ ID NO.3。

实施例2

蝴蝶兰PhAGCu基因的拷贝数分析

用CTAB法抽取蝴蝶兰基因组，取10μgDNA分别用BglII(B)和DraI(D)两种市售的酶消化，37℃酶切过夜。以0.8％琼脂糖凝胶将酶切产物进行电泳分离，结果如图2所示。转移DNA并固定于尼龙膜上。探针杂交(由于MADS-box基因家族MADS盒的高度保守性，因此我们选择蝴蝶兰PhAGCu基因的特异区段3’UTR，约250bp)作为探针。确定其为单拷贝。

实施例3

蝴蝶兰PhAGCu基因表达模式分析

分别提取蝴蝶兰植株的根、叶片、花梗、花蕾以及花器官(花萼、翼瓣、唇瓣和蕊柱)的总RNA。测定OD₂₆₀后定量取出1μg RNA，反转录.以特异引物进行PCR。反应产物以1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结果如图3所示。从电泳图中可以看出，基因PhAGCu只在植物生长的生殖器官表达，而在营养器官中没有表达。进一步对花蕾的各个器官分别检测，发现其在子房与合蕊柱中有表达。推测该基因与生殖器官的发育有着密切的关系，而不参与营养器官生长的调控。

实施例4

原位杂交

1取得较小的组织材料，以4％的多聚甲醛固定12小时。再以乙醇梯度脱水，包埋于石蜡块当中。

2将载玻片和盖玻片浸于铬酸洗液中2天，然后蒸馏水漂洗。再以多聚赖氨酸(PLL，1mg/ml)浸泡或涂片，7℃或42℃烘干备用。

3特异性探针分子为基因3’末端非转录区域一段特异的长约250bp的DNA序列。

4石蜡样品切片后脱腊，复水并以蛋白酶消化组织蛋白。经预杂交后与事先变性处理的探针分子在杂交液中50℃共浴16h。

5杂交后，以血清封闭探针，利用特异性抗体与杂交上的探针分子结合，并予染色。

6水溶性封片剂封片，显微观察并照相。

结果显示，在花发育的初期，PhAGCu在所有花器官原基中均有表达，不仅在合蕊柱中，在花瓣、唇瓣甚至萼片中也有表达(图4-A，B)。在花发育的稍后阶段，PhAGCu继续在合蕊柱和唇瓣中表达，其在胚珠中也有信号产生(图4-D，F)，而在萼片和花瓣中消失。

实施例5

蝴蝶兰PhAGCu基因在烟草细胞中进行真核表达及转基因植株的表型鉴定

1含目的基因(蝴蝶兰PhAGCu基因)表达载体的构建

根据以蝴蝶兰PhAGCu基因全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反向引物上分别引入限制性内切酶识别位点(视选用的载体而定)，以便构建表达载体。

以实施例1中获得的扩增产物为模板，在5’端和3’端分别加入PstI和XbaI酶切位点。经XbaI和PstI双酶切的PCR产物与经过同样双酶切的pHB植物表达载体连接，转化，测序，确保开放读框正确。将其转入农杆菌中。利用叶圆盘法技术转化模式植物烟草。

2利用叶盘法转化烟草

●用灭菌牙签挑取YEB选择培养基上的阳性克隆，接种于2mlYEB液体(利福平40mg/L，卡那霉素50mg/L，庆大霉素100mg/L)，28℃200rpm振荡培养24-36h；

●室温下4000g离心10min；

●弃上清，菌体用1/2MS液体培养基重悬，稀释到原体积的5-20倍，使OD₆₀₀＝0.5左右；

●取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去其叶主脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；

●将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；

●将侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48h；

●将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+潮霉素50mg/L+cef250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天见愈伤组织形成；

●约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基上(1/2MS+NAA(0.5mg/L+潮霉素50mg/L+cef 250mg/L)；

●待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，温室中培养。

3转基因植株的分子鉴定

以SDS方法小量抽提部分转基因植株的基因组DNA，根据载体上潮霉素抗性基因和目的基因序列设计引物，进行PCR检测(部分结果)，检测结果如图5所示。PCR结果都表明携带有外源蝴蝶兰PhAGCu基因的表达质粒已经插入到烟草基因组中。

4转基因植株进行表型鉴定

与转空载的烟草花相比转基因烟草的花序多且小，叶片多褶皱。柱头长，伸出花筒之外。花瓣形状正常，能够正常结实，但种子少。相比下，转空载烟草花序正常，大，花型与结实均正常。转基因烟草的部分表型如图6所示。根据结果推测外源PhAGCu基因在宿主烟草中实现了超量表达，影响了转基因植株柱头、雄蕊等的发育。试验结果表明，实施例1中得到的蝴蝶兰PhAGCu基因为有功能的基因，可以影响植株有性器官的发育。

序列表

SEQ ID NO.1：

ATGGACTCTTCAAGCATGGAGCCGAAGGAGAAGATGGGGAGGGGGAAGATAGAGATCAAGAGAATAGAGAACA

CAACAAACAGACAAGTCACCTTTTGCAAGCGCCGTAATGGCCTCCTGAAGAAGGCTTATGAGCTCTCTGTTCTGTGT

GATGCTGAGGTTGCCCTAATCATCTTCTCTACCCGTGGCCGCCTCTATGAATATGCAAACAACAGCGTGAAAGGAAC

CATTGAACGATACAAAAAGGCAAGCACTGATAATTCCAACACTGGATCAATATCTGAAGCAAATTCGCAGTATTACC

AACAAGAGGCCACAAAACTGCGTCAGCAAATTACAAACTTACAGAATTCCAACAGGAATTTGCTGGGTGATGCTCTC

ACCACCATGAGCCTGAGGGACCTGAAGCAACTGGAAACAAGATTGGAGAAAGGCATCAACAAAATAAGAGCTAAGAA

GAATGAACTGCTGCATGCTGAGATTGACTACATGCAGAAAAGGGAAATGGAACTCCAAACTGACAACATGTTTCTGC

GCAATAAGATATCTGATAATGAAAGAGCACAGCAGCAGCATCAGCATATGAGCATATTGCCATCAACAAGCACAGAG

TATGAAGTGATGCCTCCATTTGATTCCAGAAGCTTTCTTCATGTCAATCTAATGGATCCCAATGACCGTTATTCCCA

CCAGCAGCAAACAGCTCTGCAACTTGGGTGATGGGGAGGTTGCTGCAACTATAGTAGTTGTGATGGCATTCTGAAGT

ATGAGAAGGAAATATATTTGGTATGTTTTGTAAGAAGATGTGTAATAGAGTTTTATATGTATTATTATATGGAACAT

TGATCAGTTGGAAGCTGTGGTGTTTTAGGGTTGTTGGATGTTGAGACTTTATATATTGTTAAGCATATTAATATATA

AACATAACCTTAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO.2：

MDSSSMEPKEKMGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIIFSTRGRLYEYANNSV

KGTIERYKKASTDNSNTGSISEANSQYYQQEATKLRQQITNLQNSNRNLLGDALTTMSLRDLKQLETRLEKGINKIR

AKKNELLHAEIDYMQKREMELQTDNMFLRNKISDNERAQQQHQHMSILPSTSTEYEVMPPFDSRSFLHVNLMDPNDR

YSHQQQTALQLG

SEQ ID NO.3：

正向引物PAGF：5’-ATGGACTCTTCAAGCATGGAGCCGA-3’；

反向引物为依B26设计的B25：5’-GACTCGAGTCGACATCGA-3’

Claims (1)

1.一种将编码具有蝴蝶兰PhAGCu基因转入烟草以改变花发育的方法，具体步骤如下：

(1)将编码蝴蝶兰PhAGCu基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1可操作的连接于植物表达载体，形成含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，并将菌液与烟草叶片混合培养；

(3)通过抗生素筛选，PCR鉴定，获得转化细胞并再生转基因植株。

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