CN101492742B - 获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物。本发明提供的获取与牡丹花型性状相关的分子标记的专用引物，包括如下引物对甲：序列表的序列1所示的DNA序列和序列表的序列2所示的DNA序列。本发明提供的方法是应用所述专用引物对待测牡丹基因组DNA进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳带型确定与待测牡丹花型性状相关的分子标记。本发明提供的分子标记可以用于检测牡丹的花型性状，可以提高牡丹选择育种的准确性和效率，缩短育种周期，为牡丹针对花型的育种提供了一种有效的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物。
背景技术
牡丹属于芍药属的木本类群，是中国特有的传统名花，素有“花王”之称。传统的杂交育种法周期长，无法早期筛选目标性状，严重限制了培育新品种的速度。分子标记技术能够将标记与植物性状相联系，为牡丹育种提供了一种新手段。利用DNA标记辅助选择育种将给传统的杂交育种带来革命性的变化。传统的育种选择是对表型性状的变异进行选择，但有些重要性状(如花色、花型等与观赏品质密切相关的性状)无法在早期检测出来，分子标记技术就可以利用种子以及幼苗进行DNA多态性检测，根据与目的基因相关的标记进行选择，能提高选择的准确度，缩短育种周期，提高育种效率和选择的可靠性，相当简便。
简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)标记是目前最常用的微卫星标记之一。SSR标记具有重复性好、多态性高、呈共显性遗传、数量丰富和遍布整个基因组等优点，广泛应用于植物的遗传图谱构建、基因标定、标记辅助育种、品种鉴定、遗传多样性研究方面。为了有效利用牡丹的丰富资源，需要建立牡丹的SSR分子标记技术体系，并寻找牡丹的观赏性状与标记的关联。
发明内容
本发明涉及获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物。
本发明提供了获取与牡丹花型性状相关的分子标记的专用引物，包括如下引物对甲：序列表的序列1所示的DNA序列和序列表的序列3所示的DNA序列。
所述专用引物还可包括如下引物对乙和/或引物对丙和/或引物对丁：
引物对乙：序列表的序列2所示的DNA序列和序列表的序列3所示的DNA序列；
引物对丙：序列表的序列1所示的DNA序列和序列表的序列4所示的DNA序列。
引物对丁：序列表的序列2所示的DNA序列和序列表的序列4所示的DNA序列。
本发明提供的获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法，可包括如下步骤：
1)提取牡丹的基因组DNA；
2)以基因组DNA为模板，利用所述专用引物进行PCR扩增；
3)将PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳带型确定与待测牡丹花型性状相关的分子标记。
步骤1)中，所述牡丹的基因组DNA可来自牡丹的任何器官，优选来自叶片，最优选来自幼嫩叶片。
步骤2)中，所述PCR扩增中，退火温度为53.5-57.4℃，循环数个数为32-36。
步骤3)中，电泳采用4-6.5％的变性聚丙烯酰胺凝胶。4-6.5％指的是凝胶浓度T(％)，即凝胶溶液中单体丙烯酰胺和交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的总质量浓度。
应用所述方法得到的分子标记也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种获取与牡丹花型性状相关的分子标记的试剂盒，含有所述专用引物。
所述试剂盒还包括PCR反应的常规试剂、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的常规试剂和银染的常规试剂；所述试剂盒优选包括聚丙烯酰胺、DNA聚合酶和Mg2+离子。
所述专用引物或所述试剂盒在获取与牡丹花型性状相关的分子标记中的应用也属于本发明的保护范围。
应用本发明的专用引物对牡丹基因组进行PCR扩增，得到的电泳图带型清晰且具有多态性，在该位点得到11个等位基因。使用单因素方差分析和相关分析，与牡丹花型有关的B类基因的第7个等位基因(375bp处)和花型关联。单因素方差分析中P＝0.027(显著性水平小于0.05)。相关分析中的相关系数是0.296，P＝0.027(显著性水平小于0.05)。本发明提供的分子标记可以用于检测牡丹的花型性状，可以提高牡丹选择育种的准确性和效率，缩短育种周期，为牡丹针对花型的育种提供了一种有效的方法。
本发明通过一系列的优化步骤建立了牡丹的SSR分子标记技术体系，获得了一个花型性状和标记的关联，为牡丹花型的育种提供了一种有效的方法，并且为牡丹连锁遗传图谱构建、基因标定、品种鉴定、分子标记辅助育种奠定了技术基础。
附图说明
图1为1％琼脂糖凝胶电泳图a。牡丹样本从左至右依次是：卵叶牡丹、黄牡丹、紫牡丹、矮牡丹、紫斑牡丹、狭叶牡丹、凤丹、大花黄牡丹、‘皇嘉门’、‘太阳’、‘岛锦’、‘海黄’、‘金阁’、‘白王狮子’、‘芳纪’、‘金岛’、‘寒桜狮子’、‘初乌’、‘红冠玉配’、‘中川粉’、‘花和尚’、‘火焰’、‘藕断丝连’、‘喜庆’、‘大瓣粉’、‘轻罗’、‘凤丹’、‘垫单2’、‘垫重3’；M是100bp plus DNA ladder marker，从上到下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，购自北京全式金生物技术有限公司。
图2为1％琼脂糖凝胶电泳图b。牡丹样本从左至右依次是：‘彭州太平红’、‘胭脂图’、‘雪莲’、‘黑花魁’、‘琉璃贯珠’、‘小叶紫’、‘冠世墨玉’、‘湖蓝’、‘富贵红’、‘青龙戏桃花’、‘蓝月’、‘秀群芳’、‘红荷’、‘水晶白’、‘古城春色’、‘少女裙’、‘青龙镇宝’、‘黄丽’、‘葵花红’、‘丝绒红’、‘五彩蝶’、‘洛阳红’、‘首案红’、‘豆绿’、‘姚黄’、‘二乔’、‘锦袍红’；M是100bp plus DNA ladder marker，从上到下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，购自北京全式金生物技术有限公司。
图3为1％琼脂糖凝胶电泳-大花黄牡丹、‘海黄’。牡丹样本从左至右依次是：大花黄牡丹(引物对丙)、‘海黄’(引物对丁)；M是100bp plus DNA ladder marker，购自北京全式金生物技术有限公司。
图4为1％琼脂糖凝胶电泳-黄牡丹、‘藕断丝连’。牡丹样本从左至右依次是：黄牡丹(引物对乙)、黄牡丹(所用引物对丁)、‘藕断丝连’(引物对乙)、‘藕断丝连’(引物对丁)；M是100bp plus DNA ladder marker，购自北京全式金生物技术有限公司。
图5为56个牡丹样本的电泳图。牡丹样本从左至右依次是：‘葵花红’、‘黄丽’、‘青龙镇宝’、‘少女裙’、‘古城春色’、‘水晶白’、‘红荷’、‘秀群芳’、‘蓝月’、‘青龙戏桃花’、‘富贵红’、‘湖蓝’、‘锦袍红’、‘二乔’、‘姚黄’、‘豆绿’、‘首案红’、‘洛阳红’、‘五彩蝶’、‘丝绒红’、‘冠世墨玉’、‘小叶紫’、‘琉璃贯珠’、‘黑花魁’、‘雪莲’、‘胭脂图’、‘彭州太平红’、‘垫重3号’、‘垫单2号’、‘凤丹’、‘轻罗’、‘大瓣粉’、‘喜庆’、‘藕断丝连’、‘火焰’、‘花和尚’、‘中川粉’、‘红冠玉配’、‘初乌’、‘寒桜狮子’、‘金岛’、‘芳纪’、‘白王狮子’、‘金阁’、‘海黄’、‘岛锦’、‘太阳’、‘皇嘉门’、大花黄牡丹、杨山牡丹、狭叶牡丹、紫斑牡丹、矮牡丹、紫牡丹、黄牡丹、卵叶牡丹；M是pBR322 DNA/Msp1 marker(DNA片段从上到下依次是622bp，527bp，404bp，309bp，242bp，238bp，217bp，201bp，190bp，180bp，160bp，147bp，123bp，110bp，90bp，76bp，67bp，34bp，26bp)，购自天根生化科技(北京)有限公司。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
56个牡丹样本为：‘葵花红’、‘黄丽’、‘青龙镇宝’、‘少女裙’、‘古城春色’、‘水晶白’、‘红荷’、‘秀群芳’、‘蓝月’、‘青龙戏桃花’、‘富贵红’、‘湖蓝’、‘锦袍红’、‘二乔’、‘姚黄’、‘豆绿’、‘首案红’、‘洛阳红’、‘五彩蝶’、‘丝绒红’、‘冠世墨玉’、‘小叶紫’、‘琉璃贯珠’、‘黑花魁’、‘雪莲’、‘胭脂图’、‘彭州太平红’、‘垫重3号’、‘垫单2号’、‘凤丹’、‘轻罗’、‘大瓣粉’、‘喜庆’、‘藕断丝连’、‘火焰’、‘花和尚’、‘中川粉’、‘红冠玉配’、‘初乌’、‘寒桜狮子’、‘金岛’、‘芳纪’、‘白王狮子’、‘金阁’、‘海黄’、‘岛锦’、‘太阳’、‘皇嘉门’、大花黄牡丹、杨山牡丹、狭叶牡丹、紫斑牡丹、矮牡丹、紫牡丹、黄牡丹、卵叶牡丹。
以上材料来自中国科学院植物研究所，以上牡丹种或品种在《中国牡丹品种图志》(王莲英主编，中国林业出版社出版，1997)或《中国牡丹品种图志(西北、西南、江南卷)》(李嘉珏主编，中国林业出版社出版，2005)中均有记载。
实施例1、与牡丹花型性状相关的SSR标记的获得
一、候选引物的设计
本发明人所在实验室根据牡丹的B类MAD-box基因的DNA序列开发了如下引物：
正向引物1(序列表的序列1)：CAAGAAGGTCAACAATAAAC；
正向引物2(序列表的序列2)：CAAGGAGGTCAACAATAAAC；
反向引物1(序列表的序列3)：CACAGAAGCCTCCATATTTT；
反向引物2(序列表的序列4)：CACAGAAGCCTCCATTTTTT。
以上四条引物共有四种组合，所以定义四组引物对如下：引物对甲：正向引物1和反向引物1；引物对乙：正向引物2和反向引物1；引物对丙：正向引物1和反向引物2；引物对丁：正向引物2和反向引物2。
二、引物对的筛选
在植株生长旺盛期将幼嫩叶片采下，自来水冲洗干净，拭干备用提取总DNA。按照Xiaoyan Han et al.(Biochem.Genet.2008，46：162-179)中的方法提取牡丹嫩叶中的总DNA。
①使用引物对甲扩增56个牡丹样本
PCR反应体系(20μL)：3μL DNA模板(10-50ng)、1μL正向引物(10uM)、1μL反向引物(10uM)、10μL 2×Easy Taq PCR SuperMix(不含染料)(购自北京全式金生物技术有限公司)、5.0μL ddH2O。
PCR的反应程序：94℃进行5min，94℃进行30s，55.4℃进行30s，72℃进行1min，共35个循环；72℃进行10min；12℃终止反应。
将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果见图1和图2。黄牡丹、大花黄牡丹、‘海黄’、‘藕断丝连’扩增结果不理想，其它52个样本都有比较理想的扩增产物。
②使用其它引物对扩增牡丹样本
对步骤①中不能扩增出产物的牡丹样本，分别选择引物对乙、引物对丙、引物对丁进行扩增，反应体系同步骤①，反应程序同步骤①。
将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果见图3和图4。大花黄牡丹用引物对丙，‘海黄’用引物对丁，黄牡丹用引物对乙或引物对丁，‘藕断丝连’用引物对乙或引物对丁可以扩增出理想的产物。
三、牡丹花型与标记的关联
在植株生长旺盛期将幼嫩叶片采下，自来水冲洗干净，拭干备用提取总DNA。按照Xiaoyan Han et al.(Biochem.Genet.2008，46：162-179)中的方法提取牡丹嫩叶中的总DNA。
56个牡丹样本进行PCR扩增，反应体系同步骤二的①，反应程序同步骤二的①。其中，黄牡丹、‘海黄’和‘藕断丝连’在PCR扩增时所用的引物对为引物对丁；大花黄牡丹在PCR扩增时所用的引物对为引物对丙；其余52个样本在PCR时所用引物对是引物对甲。
扩增产物使用Bassam银染法进行染色，具体步骤如下：
①将附着胶的长板放入固定液中，摇床上摇40min；
②蒸馏水洗涤胶2-3次，每次2min，然后竖起控水15s；
③将胶板放入染色液中染色30min；
④将染色后的胶板放入蒸馏水中洗2-3s，迅速捞出控水；
④放入显影液中，充分摇动，约3min后会出现带；
⑥捞出胶板放入终止液中，10min后取出；
⑦放到蒸馏水中清洗，捞出胶板自然晾干。
固定液(也是终止液)配方：200ml的冰乙酸加到1.8L蒸馏水中，混匀。
染色液配方：2g硝酸银溶于2L蒸馏水中，用时加入37％甲醛3ml，现用现配。
显影液配方：160g十水碳酸钠(或60g无水碳酸钠)溶于2L蒸馏水中，提前配制，放入-20℃冰箱待用。临用前加入3ml的37％甲醛和400ul的10mg/ml硫代硫酸钠(现用现配)。
实验药品来源：冰乙酸购自北京化工厂，37％甲醛购自北京益利精细化学品有限公司，无水硫酸钠和硫代硫酸钠购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
附着在玻板上的胶晾干后，将胶板放在发出白色灯光的灯箱上，用数码相机拍照，并进行条带的统计。SSR分子量标记选用pBR322 DNA/MspI。
共计出现11个等位基因。首先将质量性状数量化，依据传统的经典分类法，本实验中的56个牡丹样本分别属于8个花型，根据花型从简单到复杂的等级，分别赋值，见表1。然后根据带型的有无，将56个样本划分到组1，组0。第7个等位基因(375bp条带)的分析数据见表2，将表2的数据输入SPSS中，进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和相关分析(Bivariate)。
表1牡丹花型赋值
| 花型 | 赋值 |
| 单瓣型 | 1 |
| 荷花型 | 2 |
| 菊花型 | 3 |
| 蔷薇型 | 4 |
| 托桂型 | 5 |
| 皇冠型 | 6 |
| 绣球型 | 7 |
| 台阁型 | 8 |
表2用于SPSS分析的数据
结果表明，该位点的第7个等位基因(375bp条带)与花型相关联，单因素方差分析中P＝0.027(显著性水平小于0.05)。相关分析中的相关系数是0.296，P＝0.027(显著性水平小于0.05)。
实施例2、参数的优化
以‘冠世墨玉’为供试材料，进行参数的优化。
一、PCR条件的优化
1、退火温度的优化
在植株生长旺盛期将幼嫩叶片采下，自来水冲洗干净，拭干备用提取总DNA。按照Xiaoyan Han et al.(Biochem.Genet.2008，46：162-179)中的方法提取牡丹嫩叶中的总DNA。
以总DNA为模板，用引物对甲进行PCR。分别选择4个退火温度(52.1℃、53.5℃、55.4℃、57.4℃)进行退火温度的优化。
PCR反应体系(20μL)：3μLDNA模板(10-50ng)、1μL正向引物(10uM)、1μL反向引物(10uM)、10μL 2×Easy Taq PCR SuperMix(不含染料)(购自北京全式金生物技术有限公司)、5.0μL ddH2O。
PCR的反应程序：94℃进行5min，94℃进行30s，在预定的退火温度下进行30s，72℃进行1min，共35个循环；72℃进行10min；12℃终止反应。
将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。上样量是10μL(含2μL6×Loadingbuffer，购自北京全式金生物技术有限公司)。电压120V，电泳时间是45min。电泳缓冲液为1×TAE(每升50×TAE中：242g Tris碱，57.1mL冰醋酸，100mL0.5M EDTA，pH值为8.0)。
结果表明：55.4℃是最佳退火温度。
二、胶浓度的筛选
在植株生长旺盛期将幼嫩叶片采下，自来水冲洗干净，拭干备用提取总DNA。按照Xiaoyan Han et al.(Biochem.Genet.2008，46：162-179)中的方法提取牡丹嫩叶中的总DNA。以总DNA为模板，用引物对甲进行PCR。
PCR反应体系(20μL)：3μL DNA模板(10-50ng)、1μL正引物(10uM)、1μL反引物(10uM)、10μL 2×Easy Taq PCR SuperMix(不含染料)(购自北京全式金生物技术有限公司)、5.0μL ddH2O。
PCR的反应程序：94℃进行5min，94℃进行30s，55.4℃进行30s，72℃进行1min，共35个循环；72℃进行10min；12℃终止反应。
PCR产物在94℃变性5min，然后在4-6.5％的变性聚丙烯酰胺凝胶(设置三种聚丙烯酰胺凝胶浓度：4％、5.5％、6.5％)上电泳。上样量5μL(含2.5μL2×变性凝胶加样缓冲液，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)。聚丙烯酰胺胶的大小35cm×45cm，厚度是0.4mm。电泳条件是75W恒功率下预电泳40min，1500V下电泳1h 30min，电泳缓冲液是1×TBE(5×TBE：445mM Tris-CL，445mM硼酸，12mM EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠，调pH值为8.0)。
结果表明，4-6.5％变性聚丙烯酰胺凝胶均可得到分辨率较高的电泳结果。
序列表
<110>中国科学院植物研究所
<120>获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物
<130>CGGNARY92064
<160>4
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
caagaaggtc aacaataaac 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
caaggaggtc aacaataaac 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
cacagaagcc tccatatttt 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
cacagaagcc tccatttttt 20
Claims (9)
1.一种获取与牡丹花型性状相关的分子标记的专用引物，包括引物对甲：SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3。
2.如权利要求1所述的专用引物，其特征在于：所述专用引物还包括引物对乙和/或引物对丙和/或引物对丁；
引物对乙：SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；
引物对丙：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4。
引物对丁：SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4。
3.一种获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法，包括如下步骤：
1)提取牡丹的基因组DNA；
2)以基因组DNA为模板，利用权利要求1或2所述的专用引物进行PCR扩增；
3)将PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳带型确定与待测牡丹花型性状相关的分子标记。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述牡丹的基因组DNA来自牡丹的任何器官；步骤2)中，所述PCR扩增中，退火温度为53.5-57.4℃，循环数个数为32-36；步骤3)中，电泳采用4-6.5％的变性聚丙烯酰胺凝胶。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述牡丹的基因组DNA来自牡丹的叶片。
6.一种获取与牡丹花型性状相关的分子标记的试剂盒，含有权利要求1或2所述的专用引物。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR反应的常规试剂、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的常规试剂和Bassam银染的常规试剂。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括聚丙烯酰胺、DNA聚合酶和Mg2+离子。
9.权利要求1或2所述专用引物在获取与牡丹花型性状相关的分子标记中的应用。
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