CN112921112B - 鉴定万寿菊瓣型的caps分子标记、检测引物及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鉴别万寿菊瓣型的CAPS分子标记、检测引物及检测试剂盒。本发明利用BSR‑seq技术获取与万寿菊瓣型紧密连锁的SNP位点筛选并转化为CAPS标记Marker 67，其在单瓣万寿菊的序列为SEQ ID NO:1所示，其在复瓣万寿菊的序列为SEQ IDNO:2所示；应用该分子标记能对万寿菊复瓣与单瓣进行准确区分，在万寿菊单复瓣F2分离群体中检测效率达98.96％，在70份万寿菊商业品种和自交系中检出率达85.71％。本发明还提供了CAPS分子标记Marker 67的检测引物以及鉴定万寿菊瓣型的PCR检测试剂盒。本发明在苗期对万寿菊的实生苗进行分子标记辅助育种，有效提高了育种效率。

Description

鉴定万寿菊瓣型的CAPS分子标记、检测引物及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及植物品质性状的分子标记，尤其涉及鉴定万寿菊瓣型的CAPS分子标记及其应用，属于万寿菊瓣型的CAPS分子标记领域。
背景技术
万寿菊(Tagetes erecta)是菊科万寿菊属植物，因花色艳丽、花型饱满、花期持久而成为重要的花坛花卉。菊科花卉有着与众不同的头状花序，外围是两侧对称的舌状花，中间是辐射对称的管状花。以万寿菊为例，外围只有一轮舌状花则为单瓣，外围有多轮舌状花则为复瓣。
花卉的观赏性主要集中在花上，相比于单瓣花，复瓣花的花型更加饱满，因而有着更强的观赏性。万寿菊的瓣型很容易分辨，在传统育种中可作为一种形态标记，但必须在花开放之后才能进行鉴定。目前还没有对万寿菊瓣型相关基因进行遗传定位的研究。
测序技术的迅速发展，为花卉的分子育种提供了极大的技术支持。BSR-seq(bulked segregant RNA-seq)是一种利用BSA(bulked segregant analysis，混合分组分析法)和RNA-seq结合进行的测序方法，即在分离群体中选择极端性状的个体构建两个混池，提取两个池的总RNA进行转录组测序，最终获得大量SNP位点，可用于开发与目标性状连锁的分子标记，进而进行目标基因的遗传定位。因为BSR-seq只对mRNA测序，去除了大量的重复序列和无用序列，因而具有成本低、效率高的优势，目前已被广泛应用于分子标记的开发和遗传图谱的构建中。将BSR-seq和比较基因组学结合，开发与万寿菊瓣型相关的分子标记，能够在苗期对万寿菊的单瓣与复瓣进行高效选择，极大地克服了传统育种的不足、有效提高育种的效率。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种鉴定万寿菊瓣型的CAPS分子标记；
本发明的目的之二是提供扩增所述分子标记的引物；
本发明的目的之三是将所述的分子标记或引物应用于万寿菊瓣型的鉴定。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供一种鉴定万寿菊瓣型的CAPS分子标记，命名为Marker 67，其在单瓣万寿菊的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，其在复瓣万寿菊的核苷酸序列为SEQ IDNO:2所示。
本发明的CAPS分子标记Marker 67，在单瓣和复瓣万寿菊中的序列的380bp处存在一个A→G的SNP位点不同，本发明对比了大量万寿菊品种的CAPS分子标记Marker 67，结果证明其与瓣型性状紧密连锁，显示本发明提供的特异性分子标记Marker 67可用来鉴定万寿菊的瓣型是单瓣还是复瓣。
本发明进一步提供了扩增所述分子标记Marker 67的检测引物。
作为一种优选的实施方案，所述检测引物由SEQ ID NO.3所示的上游检测引物和SEQ ID NO.4所示的下游检测引物组成。
上述引物组可作为扩增CAPS分子标记的引物组，进而用于鉴定万寿菊瓣型，因此，所述引物组在鉴定万寿菊瓣型单瓣或复瓣中的应用在本发明的保护范围内。而且，包含上述的引物组、用于鉴定万寿菊瓣型的试剂盒也在本发明的保护范围内。
本发明进一步提供了一种鉴定万寿菊瓣型的PCR检测试剂盒，包括：2×Taq PCRmix(含Taq酶、dNTP、Mg2+)、检测引物；其中，所述的检测引物是以CAPS分子标记Marker 67为靶标设计得到的检测引物；优选的，所述检测引物由SEQ ID NO.3所示和SEQ ID NO.4所示的两条多核苷酸序列组成。
本发明进一步提供应用所述分子标记Marker 67在万寿菊瓣型选育中的应用，包括如下步骤：(1)提取待测样品DNA；(2)利用Marker 67为靶标基因设计上、下游引物对目的片段进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶对扩增产物进行检测；(3)若扩增出514bp的条带则为有效扩增；利用限制性内切酶EcoR V对PCR扩增产物进行酶切，若酶切产物为514bp的一条电泳条带或者是分别514pb、380bp和134pb的三条电泳条带，则该万寿菊样本为复瓣品种；若酶切产物是380bp和134bp的两条电泳条带，则该万寿菊样本为单瓣品种。
作为本发明一种优选的具体实施方案，所述PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCRMix12.5μL、DNA模板1μL、上游引物1μL、下游引物1μL，去离子水9.5μL。
作为本发明一种优选的具体实施方案，所述PCR扩增的反应程序为：94℃4min；94℃30sec，56℃30sec，72℃1min，共35个循环；72℃10min；20℃保温5min。
在单瓣和复瓣万寿菊的核苷酸序列中，本发明的特异性CAPS分子标记Marker 67存在一个SNP位点变化(A→G)，纯合的复瓣万寿菊DNA扩增产物无法被EcoR V酶切，表现为1条长度为514bp的条带；纯合的单瓣万寿菊DNA扩增产物完全被EcoR V酶切，表现为2条长度分别为380bp和134bp的条带；杂合的复瓣万寿菊DNA的扩增产物可以被EcoR V酶切，表现为3条长度分别为514、380和134bp的条带。所以，上述特异性CAPS分子标记Marker 67还可以用来检测万寿菊材料关于瓣型性状基因型的纯合度，本发明所述特异性CAPS分子标记Marker 67在鉴定万寿菊单瓣或复瓣性状基因型纯度中应用在本发明的保护范围内。
本发明与现有技术相比，主要有如下优点：
本发明通过构建万寿菊单复瓣型状的F2分离群体、BSR-seq测序和比较基因组学的方法，对测序结果进行关联性分析，筛选出与万寿菊瓣型较为紧密的SNP位点所在的基因序列，共计100个，其中只有47处存在酶切位点，针对较为常见的酶切位点设计了33对引物。结果发现，分子标记Marker 67能有效区分万寿菊的瓣型，单瓣万寿菊能被完全酶切成2条带(380bp+134bp)，而复瓣万寿菊仍保留原扩增产物514bp的条带。该分子标记在万寿菊单复瓣F2分离群体中检测效率达98.96％，在70份万寿菊商业品种和自交系中检出率达85.71％。运用该标记对万寿菊幼苗进行单复瓣型状的辅助选择，有效克服了常规育种的不足，大大提高了育种效率。
本发明涉及关键术语定义和缩略语
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。
CAPS：酶切扩增多态性序列。
SNP：单核苷酸多态性。
附图说明
图1万寿菊在向日葵基因组上的同源基因位置。
图2分子标记Marker 67应用在万寿菊单重瓣组合中的酶切电泳图。
图3复瓣和单瓣瓣型的万寿菊。
图4分子标记Marker 67应用在70份万寿菊种质资源中的酶切电泳图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1与万寿菊瓣型相关连锁分子标记的筛选及鉴定
1.万寿菊单复瓣型状分离群体的构建
在本实施例中，以复瓣万寿菊‘9906’作为母本，单瓣万寿菊‘F8’作为父本杂交得到F1，F1自交得到F2分离群体。
2.万寿菊单复瓣群体遗传规律分析
对万寿菊单复瓣F2群体进行性状统计，复瓣花有503个单株，单瓣花有171个单株，根据卡方检验，复瓣：单瓣＝3:1，符合孟德尔遗传定律。推测单基因控制了万寿菊的瓣型，其中复瓣为显性性状，单瓣为隐性性状。
3.混池构建及BSR-seq测序
通过体视显微镜和石蜡切片，分别观察亲本‘9906’和‘F8’不同时期花蕾的发育情况，发现1mm花蕾的舌状花与管状花均未开始分化，确定1mm为BSR-seq采样时间点。
选取父本和母本各14株，每株4个1mm花蕾，分别构成‘9906’与‘F8’混池；选取F2代中复瓣单株和单瓣单株各24株，每株3个1mm花蕾，构成‘DP’与‘SP’混池，样品进行测序。
利用Illumina NovaSeq 6000平台进行测序，共获得349.08Mb reads数据。测序后各样品所获的clean reads数目在77643176-94660428范围内，测序质量Q30 99.52％-99.60％，说明测序碱基错误率低，所获数据合格。测序获得的GC含量均为42％。
4.与万寿菊瓣型连锁的分子标记的开发
利用万寿菊三代转录组数据与向日葵基因组进行比对，依据序列的相似性，找到万寿菊在向日葵基因组上的同源基因位置并绘图(即图1中灰色点)，筛选delta SNP index值大于0.3，且各混池reads的测序深度总和均大于50的点。通过比对发现，万寿菊混池间的差异基因多汇集在向日葵9号染色体上。
根据以上筛选条件，共过滤出100个包含与性状高度连锁的SNP位点的基因，利用SnapGene软件查找酶切位点，其中只有47处SNP存在酶切位点。挑选其中能被常规限制性内切酶酶切的SNP位点，利用Primer Premier 5.0软件设计CAPS引物，在与万寿菊复瓣型显著关联的11个SNP位点共设计33组引物。
表1与万寿菊瓣型紧密连锁的SNP标记
Figure BDA0002997049430000061
Figure BDA0002997049430000071
说明：碱基后面的数字表示该碱基的测序深度。
PCR反应体系共25μL，含100ng/μL模板DNA 1μL、2×Taq PCR mix 12.5μL(含Taq酶、dNTP、Mg 2+)、10μmol/L上游引物和下游引物各1μL、去离子水9.5μL。PCR反应程序为94℃预变性4min；94℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min；20℃保温5min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
酶切体系共15μL，含PCR扩增产物5μL、去离子水8.5μL、限制性内切酶0.5μL、10×FastDigest Green Buffer 1μL。酶切反应条件为37℃孵育2h。利用1.5％琼脂糖凝胶检测酶切产物。
首先用33对引物对2个亲本和20个F2群体单株的gDNA进行扩增、酶切，结果表明Marker 67能较好地区分万寿菊的瓣型，即酶切后有514bp或514bp、380bp和134bp三条扩增条带则为复瓣万寿菊，而只能检测出380bp和134bp的两条带则为单瓣万寿菊(图2)。该标记在万寿菊单复瓣F2群体中进行验证，503个复瓣中499个单株酶切后有514bp或514bp、380bp和134bp三条扩增条带，171个单瓣中有168个单株被完全酶切成2条带(380bp+134bp)，检测效率高达98.96％。
试验例1应用万寿菊瓣型连锁分子标记Marker 67对万寿菊单复瓣进行鉴定的试验
(1).取4-5片新鲜的万寿菊嫩叶，采用2×CTAB法提取其基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶检测DNA质量，使用紫外分光光度计检测DNA纯度。再将提取的DNA稀释至100ng/ul待用。
(2).以待检测万寿菊基因组DNA为模板，以Marker 67为靶标设计上下游引物，其碱基序列分别为：
Marker 67-F(上游引物)：TTCGTCAGAAATAATACTCCGCCTC；
Marker 67-R(下游引物)：ATCTCTTTTCTTTCACAGCCTTACC；
(3).PCR反应体系为：100ng/μL的DNA模板1μL、2×Taq PCRMix 12.5μL(含Taq酶、dNTP、Mg2+)、上游引物1μL、下游引物1μL、去离子水9.5μL。
PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min；20℃保温5min。
(4).用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若出现一条514bp的条带则为有效扩增。随后再利用限制性内切酶EcoR V对PCR产物进行酶切，酶切体系共15μL：PCR扩增产物5μL、去离子水8.5μL、限制性内切酶EcoR V 0.5μL、10×FastDigest Green Buffer 1μL。酶切反应条件为37℃孵育2h。利用1.5％琼脂糖凝胶检测酶切产物，若只能检测出380bp和134bp两条带则为单瓣万寿菊，若即酶切后有514bp或514bp、380bp和134bp三条扩增条带则为复瓣万寿菊。利用Marker 67标记对万寿菊商业品种进行验证，图4是Marker 67应用在70份万寿菊种质资源中的酶切电泳图，70个品种中有60个单株的瓣型性状与该分子标记结果是吻合的，检测效率达85.71％。
表2万寿菊品种及性状
Figure BDA0002997049430000081
Figure BDA0002997049430000091
SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学
<120> 鉴别万寿菊瓣型的CAPS分子标记、检测引物及检测试剂盒
<130> HB-1004-210202A
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<170> PatentIn version 3.5
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Claims (6)

1. 鉴定万寿菊瓣型的CAPS分子标记Marker 67，其特征在于，其在单瓣万寿菊的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，其在复瓣万寿菊的核苷酸序列为SEQ IDNO:2所示。
2.扩增权利要求1所述CAPS分子标记Marker 67的检测引物；所述检测引物由核苷酸序列为SEQ ID NO .3所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO .4所示的下游引物组成。
3.一种鉴定万寿菊瓣型的PCR检测试剂盒，包括：Taq酶、dNTP、Mg2+、检测引物；其特征在于，所述的检测引物是权利要求2所述的检测引物。
4.权利要求2所述的检测引物在万寿菊瓣型的选育中的应用；包括：（1）以CAPS分子标记Marker 67为靶基因设计获得权利要求2所述的检测引物；（2）提取待检测样品的DNA，建立PCR检测体系对待检测的样品进行PCR扩增；并利用琼脂糖凝胶对扩增产物进行检测；（3）若扩增出514bp的条带则为有效扩增；利用限制性内切酶EcoR V对PCR扩增产物进行酶切，若酶切产物为514bp的一条电泳条带或者是分别514pb、380bp和134pb的三条电泳条带，则该万寿菊样本为复瓣品种；若酶切产物是380bp和134bp的两条电泳条带，则该万寿菊样本为单瓣品种。
5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：2×TaqPCRMix12.5μL、 DNA 模板1μL、上游引物1μL、下游引物1μL，去离子水9.5μL。
6.按照权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃4min；94℃30sec，56℃30sec，72℃1min，共35个循环；72℃10min；20℃保温5min。
CN202110333119.0A 2021-03-29 2021-03-29 鉴定万寿菊瓣型的caps分子标记、检测引物及检测试剂盒 Active CN112921112B (zh)

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