JP7174375B2 - 茎枯病抵抗性クサスギカズラ属植物の作出方法、選抜マーカー及び選抜方法 - Google Patents
茎枯病抵抗性クサスギカズラ属植物の作出方法、選抜マーカー及び選抜方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、茎枯病抵抗性クサスギカズラ属植物の作出方法、選抜マーカー及び選抜方法に関する。
アスパラガス茎枯病は、ホモプシス・アスパラギ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ａｓｐａｒａｇｉ）により引き起こされ、西南暖地の露地産地を壊滅状態に追い込んだ難防除病害である。これまで、茎枯病に対する抵抗性を有するアスパラガス品種は見つかっておらず、アスパラガス近縁種で茎枯病に対する抵抗性を有するアスパラガス・デンシフロルス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒｕｓ）、クサナギカズラ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ａｓｐａｒａｇｏｉｄｅｓ）、アスパラガス・ビルガタス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｖｉｒｇａｔｕｓ）、アスパラガス・マコワニー（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｍａｃｏｗａｎｉｉ）は、いずれも商業上重要なアスパラガス・オフィシナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）との交配が不可能であった。そのため、アスパラガス茎枯病に対しては、薬剤防除を中心に総合的な防除対策を講じる他なかった。
近年、アスパラガス品種の近縁種である野生種ハマタマボウキ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｋｉｕｓｉａｎｕｓ）が、茎枯病抵抗性を有することが発見され、交配により、茎枯病に対して罹病性であるアスパラガス品種に、茎枯病に対する抵抗性を付与することが期待された（非特許文献１、非特許文献２）。しかしながら、茎枯病に対して罹病性であるアスパラガス品種とハマタマボウキから得られた後代植物から、抵抗性を有する後代植物を選抜するための有効な方法は報告されておらず、その開発が求められていた。
Iwato, M. et al. "Stemblight resistance of Asparagus kiusianus and its hybrid with A. officinalis.",Adv. Hort. Sci. 28, 202-207 (2014)
Abdelrahman, M. et al., "Comparativede novo transcriptome profiling of Asparagus officinalis and A. kiusianusduring the early stage of Phomopsis asparagi infection.", ScientificReports, 7, 2608 (2017)
本発明は、茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物と、抵抗性であるハマタマボウキの交配により得られた後代植物から、抵抗性を有する後代植物を効率的に選抜し、茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物を作出する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、抵抗性を有するクサスギカズラ属植物を効率的に選抜するためのマーカーを提供することを目的とする。さらに、本発明は、抵抗性を有するクサスギカズラ属植物を効率的に選抜する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物と抵抗性であるハマタマボウキの特定のゲノムＤＮＡにおける違いに基づき、効率的に抵抗性を有するクサスギカズラ属植物を選抜できることを見出すとともに、その選抜に適したマーカーを開発した。
すなわち本発明は、以下の［１］～［１４］を提供する。
［１］ 茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物を作出する方法であって、
茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物と、抵抗性であるハマタマボウキ又はハマタマボウキに由来する植物を交配する交配ステップと、
得られた後代植物において、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来である場合に、上記後代植物を選抜する選抜ステップと
を含む、作出方法。
［２］ 選抜ステップにおいて、罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、
得られた後代植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別することを含む、［１］に記載の作出方法。
［３］ 上記ヌクレオチドの塩基の多型が、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２１番目に対応するヌクレオチドの塩基の多型である、［２］に記載の作出方法。
［４］ 配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２１番目に対応するヌクレオチドの塩基がアデニンである場合に、得られた後代植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であると判断することを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の作出方法。
［５］ 茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物が、アスパラガス・オフィシナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、キジカクシ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｓｃｈｏｂｅｒｉｏｉｄｅｓ）、クサスギカズラ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、タチテンモンドウ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ． ｐｙｇｍａｅｕｓ）、タマボウキ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｏｓ）、オオミドリボウキ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｐｌｕｍｏｓｕｓ）、アスパラガス・アキュティフォリウス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ａｃｕｔｉｆｏｌｉｕｓ）、シャタバリ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）、アスパラガス・シュードスカベル（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｐｓｅｕｄｏｓｃａｂｅｒ）、アスパラガス・マルチマス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）、アスパラガス・ダウリクス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｄａｕｒｉｃｕｓ）、アスパラガス・ベルチシタラス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ）及びアスパラガス・スティプラリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｓｔｉｐｕｌａｒｉｓ）並びにこれらに由来する植物からなる群から選択される、［１］～［４］のいずれかに記載の作出方法。
［６］ 茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物が、アスパラガス・オフィシナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）又はアスパラガス・オフィシナリスに由来する植物である、［１］～［５］のいずれかに記載の作出方法。
［７］ 選抜ステップが、マーカーを使用することにより、得られた後代植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別することを含む、［１］～［６］のいずれかに記載の作出方法。
［８］ ［１］～［７］のいずれかに記載の方法により作出された、茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物。
［９］ クサスギカズラ属植物において、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別するためのマーカー。
［１０］ 罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、クサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別するためのマーカー。
［１１］ クサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、茎枯病に対して抵抗性であるハマタマボウキ由来である場合に、上記クサスギカズラ属植物を選抜する方法。
［１２］ 罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別することを含む、［１１］に記載の方法。
［１３］ 茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物を作出する方法であって、
茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物に、配列番号１で示される遺伝子に対応するハマタマボウキにおける遺伝子を導入するステップを含む、作出方法。
［１４］ 配列番号１で示される遺伝子に対応するハマタマボウキにおける遺伝子を導入したクサスギカズラ属植物。
［１］ 茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物を作出する方法であって、
茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物と、抵抗性であるハマタマボウキ又はハマタマボウキに由来する植物を交配する交配ステップと、
得られた後代植物において、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来である場合に、上記後代植物を選抜する選抜ステップと
を含む、作出方法。
［２］ 選抜ステップにおいて、罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、
得られた後代植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別することを含む、［１］に記載の作出方法。
［３］ 上記ヌクレオチドの塩基の多型が、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２１番目に対応するヌクレオチドの塩基の多型である、［２］に記載の作出方法。
［４］ 配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２１番目に対応するヌクレオチドの塩基がアデニンである場合に、得られた後代植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であると判断することを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の作出方法。
［５］ 茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物が、アスパラガス・オフィシナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、キジカクシ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｓｃｈｏｂｅｒｉｏｉｄｅｓ）、クサスギカズラ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、タチテンモンドウ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ． ｐｙｇｍａｅｕｓ）、タマボウキ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｏｓ）、オオミドリボウキ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｐｌｕｍｏｓｕｓ）、アスパラガス・アキュティフォリウス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ａｃｕｔｉｆｏｌｉｕｓ）、シャタバリ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）、アスパラガス・シュードスカベル（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｐｓｅｕｄｏｓｃａｂｅｒ）、アスパラガス・マルチマス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）、アスパラガス・ダウリクス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｄａｕｒｉｃｕｓ）、アスパラガス・ベルチシタラス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ）及びアスパラガス・スティプラリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｓｔｉｐｕｌａｒｉｓ）並びにこれらに由来する植物からなる群から選択される、［１］～［４］のいずれかに記載の作出方法。
［６］ 茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物が、アスパラガス・オフィシナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）又はアスパラガス・オフィシナリスに由来する植物である、［１］～［５］のいずれかに記載の作出方法。
［７］ 選抜ステップが、マーカーを使用することにより、得られた後代植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別することを含む、［１］～［６］のいずれかに記載の作出方法。
［８］ ［１］～［７］のいずれかに記載の方法により作出された、茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物。
［９］ クサスギカズラ属植物において、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別するためのマーカー。
［１０］ 罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、クサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別するためのマーカー。
［１１］ クサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、茎枯病に対して抵抗性であるハマタマボウキ由来である場合に、上記クサスギカズラ属植物を選抜する方法。
［１２］ 罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別することを含む、［１１］に記載の方法。
［１３］ 茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物を作出する方法であって、
茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物に、配列番号１で示される遺伝子に対応するハマタマボウキにおける遺伝子を導入するステップを含む、作出方法。
［１４］ 配列番号１で示される遺伝子に対応するハマタマボウキにおける遺伝子を導入したクサスギカズラ属植物。
本発明によれば、茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物とハマタマボウキの交配により得られた後代植物から、抵抗性を有する後代植物を効率的に選抜し、茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物を作出する方法を提供することができる。また、本発明によれば、抵抗性を有するクサスギカズラ属植物を効率的に選抜するためのマーカーを提供することができる。さらに、本発明によれば、抵抗性を有するクサスギカズラ属植物を効率的に選抜する方法を提供することができる。
アスパラガスの茎枯病は、糸状菌の一種であるホモプシス・アスパラギ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ａｓｐａｒａｇｉ、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ａｓｐａｒａｇｉ）により引き起こされる。発病は、茎の下部に紡錘状の小斑点を生じ、しだいに紡錘状の病斑となる。やがて近接する病斑が融合して、茎全周に及ぶと茎が乾燥し、枯死する。病斑上に形成された黒色小粒点から分生子が放出されることにより、２次伝染が起こり、感染が拡大する。
＜茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物の作出方法＞
本実施形態に係る茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物の作出方法（以下「本作出方法」ともいう）は、茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物と、抵抗性であるハマタマボウキ又はハマタマボウキに由来する植物を交配する交配ステップと、得られた後代植物において、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来である場合に、上記後代植物を選抜する選抜ステップとを含む。
本実施形態に係る茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物の作出方法（以下「本作出方法」ともいう）は、茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物と、抵抗性であるハマタマボウキ又はハマタマボウキに由来する植物を交配する交配ステップと、得られた後代植物において、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来である場合に、上記後代植物を選抜する選抜ステップとを含む。
茎枯病に対して抵抗性であるハマタマボウキは、ホモプシス・アスパラギに感染しても、茎において上記のような病斑形成もしくは病斑拡大が認められることなく、ホモプシス・アスパラギの感染も拡大しない。ハマタマボウキに由来する植物とは、例えば、ハマタマボウキを使用して交配により作出した植物（例えば、超雄系統）、葯培養により作出した半数体を倍加した植物及び遺伝子組み換え技術等により作出した植物等であって、茎枯病に対して抵抗性を示し、かつ配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡを有するものを意味する。
ハマタマボウキに由来する植物は、ハマタマボウキにおける配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡをホモ型に有する植物であってもよい。そのような植物を作出する方法としては、例えば、茎枯病抵抗性を示す雌株及び茎枯病抵抗性を示す雄株を用いた交配により得られた後代植物からマーカー等を用いて選抜する方法、並びに茎枯病抵抗性を示す雄株から葯培養により上記ゲノムＤＮＡを有する半数体を作出し、倍化する方法等が挙げられる。
クサスギカズラ属植物は、キジカクシ科に属する植物の一群である。茎枯病に対して抵抗性のクサスギカズラ属植物としては、例えば、ハマタマボウキ、アスパラガス・デンシフロルス、クサナギカズラ、アスパラガス・ビルガタス及びアスパラガス・マコワニーが挙げられる。本発明においてハマタマボウキ又はハマタマボウキに由来する植物と交配する、茎枯病に対して罹病性のクサスギカズラ属植物は、ハマタマボウキ又はハマタマボウキに由来する植物と交配した際に種子を形成し得る植物であり、例えば、アスパラガス・オフィシナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、キジカクシ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｓｃｈｏｂｅｒｉｏｉｄｅｓ）、クサスギカズラ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、タチテンモンドウ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ． ｐｙｇｍａｅｕｓ）、タマボウキ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｏｓ）、オオミドリボウキ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｐｌｕｍｏｓｕｓ）、アスパラガス・アキュティフォリウス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ａｃｕｔｉｆｏｌｉｕｓ）、シャタバリ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）、アスパラガス・シュードスカベル（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｐｓｅｕｄｏｓｃａｂｅｒ）、アスパラガス・マルチマス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）、アスパラガス・ダウリクス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｄａｕｒｉｃｕｓ）、アスパラガス・ベルチシタラス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ）及びアスパラガス・スティプラリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｓｔｉｐｕｌａｒｉｓ）並びにこれらに由来する植物が挙げられる。これらに由来する植物とは、例えば、これらの植物を使用して交配により作出した植物（例えば、超雄系統）、及び遺伝子組み換え技術等により作出した植物等であって、茎枯病に対して罹病性のクサスギカズラ属植物を意味する。本発明においてハマタマボウキ又はハマタマボウキに由来する植物と交配する、茎枯病に対して罹病性のクサスギカズラ属植物としては、アスパラガス・オフィシナリス又はアスパラガス・オフィシナリスに由来する植物が好ましい。
クサスギカズラ属植物の交配方法は特に限定されることなく、当業者が通常用いる方法により行うことができる。ハマタマボウキは雌雄異株種であるが、交配においてはハマタマボウキの雌株を用いても、雄株を用いてもよい。茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物とハマタマボウキ又はハマタマボウキに由来する植物を交配する交配ステップは、抵抗性を有するクサスギカズラ属植物を作出する過程でいずれかの段階で行われていればよく、最初の交配である必要はない。
また、より優れた形質を有する後代植物を得るために、例えば、近親交配、戻し交配及び連続戻し交配等を行ってもよい。例えば、ハマタマボウキとアスパラガス・オフィシナリスの後代植物について、茎枯病抵抗性を有する植物体を選抜しながらアスパラガス・オフィシナリスとの戻し交配を行うことで、茎枯病抵抗性を有しつつ、形質はアスパラガス・オフィシナリスにより近い後代植物を得ることができる。
後代植物は、茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物とハマタマボウキ又はハマタマボウキに由来する植物との交配により得られた雑種第１代（Ｆ１）であってもよく、さらなる交配により得られた雑種第２代（Ｆ２）以降の植物であってもよく、例えば、Ｆ１を罹病性であるクサスギカズラ属植物と戻し交配をした第１代（ＢＣ１）であってもよく、さらに戻し交配をした第２代（ＢＣ２）以降の植物であってもよい。
後述するアスパラガス・オフィシナリスとハマタマボウキ間のＱＴＬ解析により見出された、茎枯病抵抗性形質に関与する一塩基多型（ＳＮＰ（Ｓ１＿１２３４３３４５））は、アスパラガス・オフィシナリスの第１染色体上に存在するＧｅｎｅＩＤ：１０９８５０２６１の遺伝子（Ｇｅｎｅ ｓｙｍｂｏｌ：ＬＯＣ１０９８５０２６１ ｓｅｃ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＡＴＢ， ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ）の配列（配列番号１）上に存在する。ＳＮＰ（Ｓ１＿１２３４３３４５）は、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２１番目のヌクレオチドの塩基の多型であり、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２１番目のヌクレオチドの塩基がチミンであるのに対し、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するハマタマボウキのゲノムＤＮＡにおいて、上記第１２１番目のヌクレオチドの塩基はアデニンである（図４参照）。
したがって、本作出方法は、クサスギカズラ属植物とハマタマボウキ又はハマタマボウキに由来する植物との交配により得られた後代植物において、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来である場合に、その後代植物を選抜することで効率よく茎枯病抵抗性を有する植物を選抜することができる。上記対応するゲノムＤＮＡがハマタマボウキ由来であるか否かを判別する方法としては、当業者が通常用いる方法を用いることができるが、後述する多型に基づく方法の他に、例えば、対応するゲノムＤＮＡに対するプローブを用いてハイブリダイゼーションを行う方法、及び対応するゲノムＤＮＡをクローニングし、ハマタマボウキの配列と比較する方法等が挙げられる。
アスパラガス・オフィシナリスとハマタマボウキとの雑種第１代は、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキ由来の対応するゲノムＤＮＡをヘテロ型に有するが、茎枯病抵抗性を示す。したがって、後代植物において、ハマタマボウキ由来の対応するゲノムＤＮＡがホモ型に存在するか、ヘテロ型に存在するかを判別する必要はなく、いずれかの染色体上にハマタマボウキ由来の対応するゲノムＤＮＡが存在している場合には、その後代植物を選抜すればよい。
本作出方法は、罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別することを含むことができる。ヌクレオチドの塩基の多型に基づいて判別する方法としては、当業者が通常用いる方法を用いることができるが、例えば、増幅断片多型法（ＲＡＰＤ法）、制限酵素切断断片長多型法（ＲＦＬＰ法）、ＣＡＰＳ（Ｃｌｅａｖｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）法、ＳＳＬＰ（ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、増幅断片長多型法（ＡＦＬＰ法）及びＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法等が挙げられる。また、当業者であれば、例えば、配列番号１の配列を参考にして各種操作（プライマー設計、シーケンス解析等）により、罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡの配列を見出し、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡの配列との比較から、両ＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型を見出すこともできる。
ヌクレオチドの塩基の多型は、ＳＮＰであってもよい。既知のＳＮＰに基づいて判別する方法としては、当業者が通常用いる方法を用いることができるが、例えば、ＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ）マーカー及びＳＮＰマーカー等のＤＮＡマーカーを使用した方法が挙げられる。ＤＮＡマーカーを使用する場合には、既知のＳＮＰを含む領域の配列に基づいて適宜プライマー／プローブを設計し、例えば、蛍光標識したプローブによりＳＮＰの塩基タイプを確認する方法、ＰＣＲ等のＤＮＡ増幅法により増幅の有無を確認する方法、及び増幅産物を特定の制限酵素により処理した際の切断の有無を確認する方法（ＣＡＰＳマーカー等）が挙げられる。増幅産物を特定の制限酵素により処理する場合であって、ＳＮＰが制限酵素認識部位に含まれない場合には、制限酵素認識部位を付加するｄＣＡＰＳ（Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｌｅａｖｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）マーカーのプライマーを設計して使用してもよい。
また、本作出方法は、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２１番目に対応するヌクレオチドの塩基の多型（ＳＮＰ）に基づき、後代植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別することを含むことができる。また、本作出方法は、後代植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２１番目に対応するヌクレオチドの塩基がチミン以外の塩基である場合に、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であると判断することを含むことができる。さらに、本作出方法は、後代植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２１番目に対応するヌクレオチドの塩基がアデニンである場合に、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であると判断することを含むことができる。
配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２１番目に対応するヌクレオチドの塩基のＳＮＰに基づいて判別する方法は、既知のＳＮＰに基づいて判別する方法として上述した方法等を用いることができ、例えば、上記ＳＮＰを認識するプローブを用いてもよく、上記ＳＮＰを含む領域のＤＮＡ断片の増幅の有無により確認してもよい。配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２１番目に存在するＳＮＰを認識するためのマーカーとしては、例えば、以下のようなｄＣＡＰＳマーカーのプライマーが設計できる（図４も参照）。
（１）Ｓ１＿１２３４３３４５＿２＿Ｆ
ＣＡＡＧＡＡＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＴＡＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧ（配列番号２）
（２）Ｓ１＿１２３４３３４５＿２＿Ｒ
ＧＣＧＴＧＴＴＴＧＡＴＧＣＴＡＡＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＴＴＧＡ（配列番号３）
（１）Ｓ１＿１２３４３３４５＿２＿Ｆ
ＣＡＡＧＡＡＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＴＡＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧ（配列番号２）
（２）Ｓ１＿１２３４３３４５＿２＿Ｒ
ＧＣＧＴＧＴＴＴＧＡＴＧＣＴＡＡＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＴＴＧＡ（配列番号３）
プライマー（１）の下線部により制限酵素ＢｓｍＡＩの認識部位（ＧＴＣＴＣ）が付与されるため、アスパラガス・オフィシナリスのゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマー（１）及び（２）を用いて増幅させた断片は、ＢｓｍＡＩにより切断される。一方、ハマタマボウキのゲノムＤＮＡを鋳型として同様のプライマーを用いて増幅させた断片はＢｓｍＡＩにより切断されない。したがって、マーカーは、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２１番目の塩基Ｔを含むようにＢｓｍＡＩの認識部位を付与するように設計されたプライマーのセットであってもよく、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２０番目に対応するヌクレオチドの塩基をＣからＧに変更するプライマーを含んでもよい。また、マーカーは、配列番号２に記載の塩基配列と９８％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上又は８０％以上の配列相同性を有するプライマーを含んでよく、配列番号３に記載の塩基配列と９８％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上又は８０％以上の配列相同性を有するプライマーを含んでよい。上記ｄＣＡＰＳマーカーはＢｓｍＡＩを利用した例であるが、ＢｓｍＡＩに限られず、他の制限酵素認識部位を付加するｄＣＡＰＳマーカーを設計して用いてもよい。
本作出方法は、得られたクサスギカズラ属植物が茎枯病抵抗性を有するか否かを判定するステップをさらに含んでもよい。茎枯病抵抗性を有するか否かを判定する方法としては、当業者が通常用いる方法を用いることができるが、例えば、交配により得られたクサスギカズラ属植物を人工的にホモプシス・アスパラギに感染させ、同様にホモプシス・アスパラギに感染させた罹病性のクサスギカズラ属親植物（Ｍｏｃｋ）と比較して、病徴が弱まれば抵抗性を有し、病徴が同等であれば抵抗性を有さない（罹病性である）と判定する方法が挙げられる。より具体的には、例えば、ＤＳＧ０（病徴なし）、ＤＳＧ１（小型病斑形成（長さ１ｃｍ未満））、ＤＳＧ２（拡大病斑形成（長さ１ｃｍ以上で茎の半分未満の病斑））、ＤＳＧ３（大型病斑形成（茎の半分以上に病斑、全枯死はしていない））及びＤＳＧ４（地上部枯死）と病徴の程度により段階的に分類し、ＤＳＧ０～２を抵抗性、ＤＳＧ３～４を罹病性と判定することもできる。
本作出方法により、クサスギカズラ属植物とハマタマボウキ又はハマタマボウキに由来する植物との交配により得られた後代植物から、効率的に茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物を作出することができる。
＜クサスギカズラ属植物の判別マーカー＞
本実施形態に係るクサスギカズラ属植物の判別マーカー（以下「本判別マーカー」ともいう）は、クサスギカズラ属植物において、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別するためのマーカーである。本判別マーカーを使用することにより、当業者は容易にハマタマボウキ由来である対応するゲノムＤＮＡを含むクサスギカズラ属植物を選抜でき、抵抗性を有する後代植物を効率的に選抜できる。
本実施形態に係るクサスギカズラ属植物の判別マーカー（以下「本判別マーカー」ともいう）は、クサスギカズラ属植物において、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別するためのマーカーである。本判別マーカーを使用することにより、当業者は容易にハマタマボウキ由来である対応するゲノムＤＮＡを含むクサスギカズラ属植物を選抜でき、抵抗性を有する後代植物を効率的に選抜できる。
また、本判別マーカーは、罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別するマーカーであってもよい。
また、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２１番目に対応するヌクレオチドの塩基の多型に基づき、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別するためのマーカーであってよく、上記対応するＤＮＡにおける第１２１番目に対応するヌクレオチドの塩基がチミン以外のときにハマタマボウキ由来であると判別するマーカーであってよく、上記対応するＤＮＡにおける第１２１番目に対応するヌクレオチドの塩基がアデニンのときにハマタマボウキ由来であると判別するマーカーであってもよい。
本判別マーカーはＣＡＰＳマーカー及びｄＣＡＰＳマーカー等のＤＮＡマーカーであってよい。ＤＮＡマーカーについては＜茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物の作出方法＞において記載したとおりである。
＜クサスギカズラ属植物の選抜方法＞
本実施形態に係るクサスギカズラ属植物の選抜方法（以下「本選抜方法」ともいう）は、クサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、茎枯病に対して抵抗性であるハマタマボウキ由来である場合に、前記クサスギカズラ属植物を選抜する方法である。本選抜方法により、茎枯病抵抗性を有する可能性の高い、ハマタマボウキ由来である対応するゲノムＤＮＡを含むクサスギカズラ属植物を選抜することができ、抵抗性を有する後代植物を効率的に選抜することができる。
本実施形態に係るクサスギカズラ属植物の選抜方法（以下「本選抜方法」ともいう）は、クサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、茎枯病に対して抵抗性であるハマタマボウキ由来である場合に、前記クサスギカズラ属植物を選抜する方法である。本選抜方法により、茎枯病抵抗性を有する可能性の高い、ハマタマボウキ由来である対応するゲノムＤＮＡを含むクサスギカズラ属植物を選抜することができ、抵抗性を有する後代植物を効率的に選抜することができる。
また、本選抜方法は、罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、クサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別することを含んでもよい。
本選抜方法は、＜茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物の作出方法＞に記載した、本作出方法における選抜ステップと同様に行うことができる。
＜抵抗性遺伝子導入による茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物の作出方法及び抵抗性遺伝子が導入されたクサスギカズラ属植物＞
本実施形態に係る茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物の作出方法は、茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物に、配列番号１で示される遺伝子に対応するハマタマボウキにおける遺伝子を導入するステップを含む。
本実施形態に係る茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物の作出方法は、茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物に、配列番号１で示される遺伝子に対応するハマタマボウキにおける遺伝子を導入するステップを含む。
茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物については上述したとおりである。
配列番号１で示される遺伝子とは、上述したアスパラガス・オフィシナリスのＧｅｎｅＩＤ：１０９８５０２６１の遺伝子（Ｇｅｎｅ ｓｙｍｂｏｌ：ＬＯＣ１０９８５０２６１ ｓｅｃ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＡＴＢ， ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ）である。配列番号１で示される遺伝子に対応するハマタマボウキにおける遺伝子とは、上記ＧｅｎｅＩＤ：１０９８５０２６１の遺伝子のハマタマボウキにおける対立遺伝子を意味する。
罹病性であるクサスギカズラ属植物へ遺伝子を導入する方法は、当業者が通常用いる方法を用いることができるが、例えば、アグロバクテリウム法及び交配による導入等が挙げられる。また、遺伝子を導入する形態は特に制限されず、例えば、ゲノムＤＮＡを使用してもよく、ｃＤＮＡを使用してもよい。遺伝子が導入されたクサスギカズラ属植物を＜クサスギカズラ属植物の選抜方法＞に記載した方法及び接種試験等により選抜してもよい。
上記方法により、配列番号１で示される遺伝子に対応するハマタマボウキにおける遺伝子を導入したクサスギカズラ属植物を作出することができる。
［ＲＡＤ－ｓｅｑ解析］
（１）ＤＮＡ抽出
アスパラガス・オフィシナリス、ハマタマボウキ、両種の種間雑種第１代（以下「Ｆ１」ともいう）及びアスパラガス・オフィシナリス×Ｆ１（以下「ＢＣ１」ともいう）の若い地上茎（擬葉）から酢酸カリウム法によりＤＮＡを抽出した。３０ｍｇの新鮮な若い地上茎を３個の１／８サイズのステンレスビーズ（ＡｓＯＮＥ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を用いてマルチビーズショッカー（Ｙａｓｕｉ Ｋｉｋａｉ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）で磨砕した。その後、７ＵのＲＮａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む抽出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、５００ｍＭ ＮａＣｌ及び１％ ＳＤＳ）中で混和させ、６５℃で１．５時間インキュベートした。抽出バッファーの１／３量の５Ｍ 酢酸カリウムを加え、氷上で１０分間静置した。遠心分離機を用いて分離させた上澄みに等量のイソプロパノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、７０％エタノールでリンス後に５０μＬのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解させた。Ｍ×３０００Ｐ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＱＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用い、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ ＴＭ ｄｓＤＮＡシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）によりＤＮＡ濃度を２０ｎｇ・μＬ－１に調整した。
（１）ＤＮＡ抽出
アスパラガス・オフィシナリス、ハマタマボウキ、両種の種間雑種第１代（以下「Ｆ１」ともいう）及びアスパラガス・オフィシナリス×Ｆ１（以下「ＢＣ１」ともいう）の若い地上茎（擬葉）から酢酸カリウム法によりＤＮＡを抽出した。３０ｍｇの新鮮な若い地上茎を３個の１／８サイズのステンレスビーズ（ＡｓＯＮＥ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を用いてマルチビーズショッカー（Ｙａｓｕｉ Ｋｉｋａｉ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）で磨砕した。その後、７ＵのＲＮａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む抽出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、５００ｍＭ ＮａＣｌ及び１％ ＳＤＳ）中で混和させ、６５℃で１．５時間インキュベートした。抽出バッファーの１／３量の５Ｍ 酢酸カリウムを加え、氷上で１０分間静置した。遠心分離機を用いて分離させた上澄みに等量のイソプロパノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、７０％エタノールでリンス後に５０μＬのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解させた。Ｍ×３０００Ｐ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＱＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用い、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ ＴＭ ｄｓＤＮＡシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）によりＤＮＡ濃度を２０ｎｇ・μＬ－１に調整した。
（２）アダプターの調整
２種類の制限酵素によって消化した断片の両末端に正逆両方向のアダプターを付加させライブラリ作成に用いた。バーコードを付加した正方向アダプターはＫｐｎＩの認識末端でデザインし、逆方向末端はＭｓｐＩ認識末端でデザインした。ＫｐｎＩ認識末端にバーコードを付加させた９６種類のアダプターについては、Ｂａｒ Ｃｏｄｅｄ Ａｄａｐｔｅｒ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（http://www.deenabio.com/services/gbs-adapters）で作成した。逆方向のアダプターは、Ｙ－ａｄａｐｔｅｒとしてデザインした。９５℃１分間でアダプターをアニールさせ、１分で１℃ずつ低下させながら６５サイクル行った。ライゲーション後、Ｍ×３０００Ｐ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＱＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｍｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用い、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ ＴＭ ｄｓ ＤＮＡシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりアダプター濃度を測定した後に、０．１μＭに調整した。
２種類の制限酵素によって消化した断片の両末端に正逆両方向のアダプターを付加させライブラリ作成に用いた。バーコードを付加した正方向アダプターはＫｐｎＩの認識末端でデザインし、逆方向末端はＭｓｐＩ認識末端でデザインした。ＫｐｎＩ認識末端にバーコードを付加させた９６種類のアダプターについては、Ｂａｒ Ｃｏｄｅｄ Ａｄａｐｔｅｒ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（http://www.deenabio.com/services/gbs-adapters）で作成した。逆方向のアダプターは、Ｙ－ａｄａｐｔｅｒとしてデザインした。９５℃１分間でアダプターをアニールさせ、１分で１℃ずつ低下させながら６５サイクル行った。ライゲーション後、Ｍ×３０００Ｐ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＱＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｍｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用い、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ ＴＭ ｄｓ ＤＮＡシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりアダプター濃度を測定した後に、０．１μＭに調整した。
（３）ＲＡＤライブラリ作成
ＲＡＤｓｅｑライブラリ作成はＰｏｌａｎｄらの方法（Poland, J. A. etal., PLoS ONE. 7: e32253.(2012)）に従った。２００ｎｇのゲノムＤＮＡを、８ＵのＫｐｎＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、８ＵのＭｓｐＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を加えた２０μＬの処理液で制限酵素処理した。処理は３７℃２時間行い、その後６５℃２０分で酵素を失活させた。消化したＤＮＡにＩｌｌｕｍｉｎａ ｆｌｏｗ ｃｅｌｌに結合するアダプターをライゲーションさせ、各サンプルにアダプター（０．１ｐｍｏｌの正方向アダプターと１５ｐｍｏｌの逆方向アダプター）、ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＡＴＰ（最終濃度１ｍＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、２００ＵのＴ４リガーゼを加え、２２℃２時間でライゲーションを行った後に６０℃２０分間で停止させた。ライゲーションさせたサンプルを１本のチューブにプールし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。９５℃３０秒で熱変成した後に、９５℃－３０秒、６２℃－３０秒、６８℃－３０秒の増幅反応を１６サイクル行い、７２℃－５分で処理を終了させた。ＰＣＲ後に再度ライブラリを精製した。
ＲＡＤｓｅｑライブラリ作成はＰｏｌａｎｄらの方法（Poland, J. A. etal., PLoS ONE. 7: e32253.(2012)）に従った。２００ｎｇのゲノムＤＮＡを、８ＵのＫｐｎＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、８ＵのＭｓｐＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を加えた２０μＬの処理液で制限酵素処理した。処理は３７℃２時間行い、その後６５℃２０分で酵素を失活させた。消化したＤＮＡにＩｌｌｕｍｉｎａ ｆｌｏｗ ｃｅｌｌに結合するアダプターをライゲーションさせ、各サンプルにアダプター（０．１ｐｍｏｌの正方向アダプターと１５ｐｍｏｌの逆方向アダプター）、ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＡＴＰ（最終濃度１ｍＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、２００ＵのＴ４リガーゼを加え、２２℃２時間でライゲーションを行った後に６０℃２０分間で停止させた。ライゲーションさせたサンプルを１本のチューブにプールし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。９５℃３０秒で熱変成した後に、９５℃－３０秒、６２℃－３０秒、６８℃－３０秒の増幅反応を１６サイクル行い、７２℃－５分で処理を終了させた。ＰＣＲ後に再度ライブラリを精製した。
（４）ＲＡＤシークエンシングとＳＮＰ検出
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いＭｉｓｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によりライブラリのシークエンスを行った。各末端の８６ｂｐのシークエンスを行い、ｔａｓｓｅｌ ｐｉｐｅｌｉｎｅを用いて生データ画像から配列を決定した。その後、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（ＢＷＡ）を用いて配列情報をアスパラガスリファレンスゲノム(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=asparagus)と照合した。塩基配列の再調整とＳＮＰ遺伝子の決定はＪａｖａ（登録商標）のカスタムスクリプト(http://www.maizegenetics.net/tassel)により行った。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いＭｉｓｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によりライブラリのシークエンスを行った。各末端の８６ｂｐのシークエンスを行い、ｔａｓｓｅｌ ｐｉｐｅｌｉｎｅを用いて生データ画像から配列を決定した。その後、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（ＢＷＡ）を用いて配列情報をアスパラガスリファレンスゲノム(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=asparagus)と照合した。塩基配列の再調整とＳＮＰ遺伝子の決定はＪａｖａ（登録商標）のカスタムスクリプト(http://www.maizegenetics.net/tassel)により行った。
［連鎖地図作成とＱＴＬ解析］
ＲＡＤシークエンシング解析結果に基づき、遺伝子連鎖解析ソフトウェアＪｏｉｎＭａｐ(https://www.kyazma.nl/index.php/JoinMap/)及びＭａｐＱＴＬ（https://www.kyazma.nl/index.php/MapQTL/）を用いて連鎖地図作成とＱＴＬ解析を行った。その結果、染色体数と同一の１０種類の連関群（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １～１０）を作成でき、その中のＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １中にアスパラガス茎枯病抵抗性形質に関与（ＬＯＤ＞３）するＳＮＰ（Ｓ１＿１２３４３３４５）が検出された（図１～図４）。アスパラガスリファレンスゲノム情報を用いた分析により、上記ＳＮＰ（Ｓ１＿１２３４３３４５）の位置を特定すると、アスパラガス・オフィシナリスの第１染色体上に存在するＧｅｎｅＩＤ：１０９８５０２６１の遺伝子（Ｇｅｎｅ ｓｙｍｂｏｌ：ＬＯＣ１０９８５０２６１ ｓｅｃ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＡＴＢ， ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ）の配列（配列番号１）上であること、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２１番目に対応するヌクレオチドであることが明らかとなった。
ＲＡＤシークエンシング解析結果に基づき、遺伝子連鎖解析ソフトウェアＪｏｉｎＭａｐ(https://www.kyazma.nl/index.php/JoinMap/)及びＭａｐＱＴＬ（https://www.kyazma.nl/index.php/MapQTL/）を用いて連鎖地図作成とＱＴＬ解析を行った。その結果、染色体数と同一の１０種類の連関群（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １～１０）を作成でき、その中のＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １中にアスパラガス茎枯病抵抗性形質に関与（ＬＯＤ＞３）するＳＮＰ（Ｓ１＿１２３４３３４５）が検出された（図１～図４）。アスパラガスリファレンスゲノム情報を用いた分析により、上記ＳＮＰ（Ｓ１＿１２３４３３４５）の位置を特定すると、アスパラガス・オフィシナリスの第１染色体上に存在するＧｅｎｅＩＤ：１０９８５０２６１の遺伝子（Ｇｅｎｅ ｓｙｍｂｏｌ：ＬＯＣ１０９８５０２６１ ｓｅｃ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＡＴＢ， ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ）の配列（配列番号１）上であること、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２１番目に対応するヌクレオチドであることが明らかとなった。
［ｄＣＡＰＳマーカー作成］
作成した連鎖地図とＱＴＬ解析により抵抗性形質への関与が示されたＳＮＰ（Ｓ１＿１２３４３３４５）について、容易に多型を検出するためのｄＣＡＰＳ化を行った（Ｓ１＿１２３４３３４５＿２）。上述の配列番号２に示されるプライマー（１）及び配列番号３に示されるプライマー（２）を設計した。プライマー（１）及び（２）を用いてアスパラガス・オフィシナリスのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片は、制限酵素ＢｓｍＡＩにより切断される。一方、ハマタマボウキを鋳型としてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片は、ＢｓｍＡＩにより切断されない。上記プライマー（１）、（２）及びＢｓｍＡＩを用いてＢＣ１集団のスクリーニングを行った。
作成した連鎖地図とＱＴＬ解析により抵抗性形質への関与が示されたＳＮＰ（Ｓ１＿１２３４３３４５）について、容易に多型を検出するためのｄＣＡＰＳ化を行った（Ｓ１＿１２３４３３４５＿２）。上述の配列番号２に示されるプライマー（１）及び配列番号３に示されるプライマー（２）を設計した。プライマー（１）及び（２）を用いてアスパラガス・オフィシナリスのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片は、制限酵素ＢｓｍＡＩにより切断される。一方、ハマタマボウキを鋳型としてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片は、ＢｓｍＡＩにより切断されない。上記プライマー（１）、（２）及びＢｓｍＡＩを用いてＢＣ１集団のスクリーニングを行った。
［ｄＣＡＰＳマーカーによる選抜効果の検証］
ＢＣ１集団６６個体に対してｄＣＡＰＳマーカーによるスクリーニングを行った結果を表１に示す。ヘテロタイプは、増幅断片がＢｓｍＡＩにより切断されるものと切断されないものが混在しており、アスパラガス・オフィシナリス由来の遺伝子（ＧｅｎｅＩＤ：１０９８５０２６１）及びハマタマボウキ由来の対立遺伝子をヘテロ型に有すると推測される個体である。アスパラガスタイプは、増幅断片のすべてがＢｓｍＡＩにより切断され、アスパラガス・オフィシナリス由来の遺伝子（ＧｅｎｅＩＤ：１０９８５０２６１）をホモ型に有すると推測される個体である。
ＢＣ１集団６６個体に対してｄＣＡＰＳマーカーによるスクリーニングを行った結果を表１に示す。ヘテロタイプは、増幅断片がＢｓｍＡＩにより切断されるものと切断されないものが混在しており、アスパラガス・オフィシナリス由来の遺伝子（ＧｅｎｅＩＤ：１０９８５０２６１）及びハマタマボウキ由来の対立遺伝子をヘテロ型に有すると推測される個体である。アスパラガスタイプは、増幅断片のすべてがＢｓｍＡＩにより切断され、アスパラガス・オフィシナリス由来の遺伝子（ＧｅｎｅＩＤ：１０９８５０２６１）をホモ型に有すると推測される個体である。
上記集団に２ × １０６ ｓｐｏｒｅｓ・ｍＬ－１のホモプシス・アスパラギを人工接種し、接種５週間後の病徴を確認し、ＤＳＧ０（病徴なし）、ＤＳＧ１（小型病斑形成（長さ１ｃｍ未満））、ＤＳＧ２（拡大病斑形成（長さ１ｃｍ以上で茎の半分未満の病斑））、ＤＳＧ３（大型病斑形成（茎の半分以上に病斑、全枯死はしていない））及びＤＳＧ４（地上部枯死）のうちＤＳＧ０～２を抵抗性、ＤＳＧ３～４を罹病性と判定した。その結果、マーカーを利用しない場合には抵抗性と罹病性の個体が３４：３２でほぼ５０％ずつ出現するが、ハマタマボウキ由来の遺伝子が伝達されているヘテロタイプの個体を選抜すると、２９個体中２３個体（約８０％）が抵抗性を示した。これにより、ＳＮＰ（Ｓ１＿１２３４３３４５）に基づき、抵抗性を示す個体を効率的に選抜できることが示された。
ＧｅｎｅＩＤ：１０９８５０２６１の遺伝子のゲノム配列情報に基づき、アスパラガス及びハマタマボウキの当該遺伝子のＤＮＡをクローニングした。アスパラガス及びハマタマボウキの当該遺伝子のＤＮＡ配列を比較解析した結果、ＳＮＰ（Ｓ１＿１２３４３３４５）以外にも複数のＳＮＰが存在することを発見した。このＳＮＰを利用したＣＡＰＳマーカーを作成し、ＳＮＰ（Ｓ１＿１２３４３３４５）に関してプライマー（１）及び（２）を用いて行ったスクリーニングと同様に抵抗性形質の主動遺伝子支配を示唆する系統を用いてスクリーニングを行った結果、ＳＮＰ（Ｓ１＿１２３４３３４５）と同一の結果が得られた。これにより、ＧｅｎｅＩＤ：１０９８５０２６１の遺伝子内の他のＳＮＰに基づいても、抵抗性を示す個体を効率的に選抜できることが示された。
このことから、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡがハマタマボウキ由来か否かに基づいて、効率的に茎枯病抵抗性を有する個体を選抜できることが分かった。
Claims (18)
- 茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物を作出する方法であって、
茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物と、抵抗性であるハマタマボウキ又はハマタマボウキに由来する植物を交配する交配ステップと、
得られた後代植物において、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来である場合に、前記後代植物を選抜する選抜ステップと
を含む、作出方法。 - 選抜ステップにおいて、罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、
得られた後代植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別することを含む、請求項１に記載の作出方法。 - 選抜ステップにおいて、罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、
得られた後代植物における配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別することを含む、請求項１に記載の作出方法。 - 前記ヌクレオチドの塩基の多型が、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２７番目に対応するヌクレオチドの塩基の多型である、請求項３に記載の作出方法。
- 配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２７番目に対応するヌクレオチドの塩基がアデニンである場合に、得られた後代植物における配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であると判別することを含む、請求項３又は４に記載の作出方法。
- 茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物が、アスパラガス・オフィシナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、キジカクシ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｓｃｈｏｂｅｒｉｏｉｄｅｓ）、クサスギカズラ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、タチテンモンドウ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ． ｐｙｇｍａｅｕｓ）、タマボウキ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｏｓ）、オオミドリボウキ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｐｌｕｍｏｓｕｓ）、アスパラガス・アキュティフォリウス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ａｃｕｔｉｆｏｌｉｕｓ）、シャタバリ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）、アスパラガス・シュードスカベル（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｐｓｅｕｄｏｓｃａｂｅｒ）、アスパラガス・マルチマス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）、アスパラガス・ダウリクス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｄａｕｒｉｃｕｓ）、アスパラガス・ベルチシタラス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ）及びアスパラガス・スティプラリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｓｔｉｐｕｌａｒｉｓ）並びにこれらに由来する植物からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の作出方法。
- 茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物が、アスパラガス・オフィシナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）又はアスパラガス・オフィシナリスに由来する植物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の作出方法。
- 選抜ステップが、マーカーを使用することにより、得られた後代植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡ又は配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別することを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の作出方法。
- クサスギカズラ属植物において、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別するためのマーカー。
- 罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別するためのマーカー。
- 罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別するためのマーカー。
- 前記ヌクレオチドの塩基の多型が、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２７番目に対応するヌクレオチドの塩基の多型である、請求項１１に記載のマーカー。
- クサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、茎枯病に対して抵抗性であるハマタマボウキ由来である場合に、前記クサスギカズラ属植物を選抜する方法。
- 罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、クサスギカズラ属植物における配列番号１に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別することを含む、請求項１３に記載の方法。
- 罹病性であるクサスギカズラ属植物における配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、ハマタマボウキにおける対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、クサスギカズラ属植物における配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であるか否かを判別することを含む、請求項１３に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドの塩基の多型が、配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２７番目に対応するヌクレオチドの塩基の多型である、請求項１５に記載の方法。
- 配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡの第１２７番目に対応するヌクレオチドの塩基がアデニンである場合に、クサスギカズラ属植物における配列番号４に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡが、ハマタマボウキ由来であると判別することを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
- 茎枯病抵抗性を有するクサスギカズラ属植物を作出する方法であって、
茎枯病に対して罹病性であるクサスギカズラ属植物に、配列番号１で示される遺伝子に対応するハマタマボウキにおける遺伝子を導入するステップを含む、作出方法。
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