CN110499390B - 用于烟草抗斑萎病rtsw基因辅助选择的分子标记引物、辅助选择的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

用于烟草抗斑萎病RTSW基因辅助选择的分子标记引物、辅助选择的方法及其应用，所述引物由引物1和引物2的两条单链DNA组成。本发明所开发的分子标记检测的基因位点位置明确，鉴定方便。本发明还提供了一种利用所述分子标记检测烟草抗斑萎病RTSW基因的分子标记方法，以及所述分子标记在烟草分子定位、克隆和烟草抗斑萎病RTSW基因辅助选择中的应用。引物辅助选择通过检测抗斑萎病基因位点来预测烟草对斑萎病的抗性，可以在烟草的实生苗阶段进行淘汰选择，不仅节省生产成本而且大大提高抗烟草斑萎病基因RTSW品种的筛选效率，极大地缩短抗病烟草品种的育种周期，提高育种效率。

Description

用于烟草抗斑萎病RTSW基因辅助选择的分子标记引物、辅助 选择的方法及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及烟草抗斑萎病基因位点RTSW 的分子标记及其在烟草RTSW抗病基因辅助选择、克隆或选育烟草抗斑萎病品种中的应用。

背景技术

烟草斑萎病是由正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)病毒的侵染所造成的烟草病害。该属病毒是寄主范围最广、发生最为严重的一类植物病毒，其美洲型代表种番茄斑萎病毒(Tomato Spotted Wilt Virus,TSWV)已对我国云南烟区的烟叶生产构成了较大的威胁。最近几年从云南各地(州、市)县采集样品检测结果看，云南全省烟草上TSWV均有分布并有扩大和加重的趋势。而更让人忧虑的是目前云南省的烤烟主栽品种均不抗TSWV，田间调查发现现有的主栽烤烟品种K326、红花大金元、云烟87等均能被TSWV侵染，成为TSWV流行、爆发的潜在因素。烟草斑萎病常用的防治手段主要依赖防治传毒介体蓟马，但由于蓟马具有发育历期短、个体小易隐蔽、对杀虫剂极易产生抗药性等的特点，所以现有的防治措施难以取得理想的控制效果，因而，选育抗斑萎病的烤烟品种是最经济、最有效的手段。

野生烟草资源含有丰富的抗性基因。研究表明花烟草(Nicotiana alata)对 TSWV具有很好的抗性。接种TSWV仅在接种叶表现过敏性坏死症状，在系统叶中检测不到病毒的存在。经过一系列的常规杂交和回交转育，研究人员已将该抗性基因从花烟草抗性转育至烤烟品种中，育成抗病育种中间材料Polalta。 Nicotiana alata和Polalta对TSWV的抗性是由显性的单基因(命名为RTSW) 位点控制。

但令人遗憾的是，抗病基因RTSW尚未被克隆。在短时间内无法克隆抗病基因的情况下，开发和抗病基因紧密连锁的分子标记成为烟草斑萎病抗病育种的重要手段。迄今为止，国际上仅有H.Moon和J.S.Nicholson(2007)开发了相应的分子标记，但其AFLP标记存在和抗性基因遗传距离较远，连锁不紧密，而开发的SCAR标记在实际应用中存在容易产生假阳性的问题，限制了这些标记的大规模应用。CAPs(cleaved amplification polymorphismsequence-tagged sites)标记技术又称为限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术，其基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此项技术大大提高了标记的稳定性、可靠性与特异性，而且方法简便，分型时间短。因此，开发利用酶切扩增多态性序列(CAPS) 标记建立一种简便、快速、准确、灵敏的鉴定烟草抗斑萎病基因的方法，可弥补现有技术的不足。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种用于烟草抗斑萎病 RTSW基因辅助选择的分子标记引物、辅助选择的方法及其应用，将所述分子标记引物用于筛选含有RTSW抗病基因位点的资源和育种单株，达到简便、快速、准确、灵敏的鉴定烟草抗斑萎病基因位点方法的效果，为选育出高抗斑萎病的烟草育种材料提供技术手段。

在本发明的上下文中，术语“抗斑萎病基因位点RTSW”是指包含烟草斑萎病抗病基因(RTSW基因)野生烟染色体片段的位点。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案。

用于烟草抗斑萎病RTSW基因辅助选择的分子标记引物，所述引物由引物1 和引物2的两条单链DNA组成；

所述引物1序列号为Seq ID No.1：

RTSWmarker1_EcoRIF 5’-CATGCTCATTCCACTAACTGAATCTGC-3’；

所述引物2序列号为Seq ID No.2：

RTSWmarker1_EcoRIR 5’-ACCTGAAGAAGGAGAAGGAGACCAATA-3'。

采用本发明所述分子标记引物用于烟草抗斑萎病RTSW的抗病基因辅助选择的方法，其步骤如下：分别以待鉴定烟草、烟草斑萎病抗源Polalta与斑萎病感病品种K326的基因组DNA为模板，用由引物1和引物2的两条单链DNA组成的PCR引物进行PCR扩增，将扩增的PCR产物利用限制性核酸内切酶EcoRI进行酶切，通过电泳检测扩增产物，按照如下方法确定待鉴定烟草对TSWV的抗性：

(1)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经酶切后的电泳条带有与Polalta带型相同的条带，且大小为306bp、414bp和720bp则待鉴定烟草为抗斑萎病烟草或候选为抗斑萎病烟草；

(2)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经酶切后的电泳条带产生和K326带型相同的条带，仅有720bp的条带，则待鉴定烟草为非抗斑萎病烟草为或为候选非抗斑萎病烟草。

本发明通过群体构建，将烟草斑萎病抗源Polalta(♂)与主栽感病品种 K326(♀)杂交及回交、自交获得的BC6F3后代进行抗性鉴定及分子遗传连锁分析，获得与抗斑萎病基因RTSW紧密连锁的分子标记RTSWmarker1。

本发明所述是烟草抗斑萎病RTSW的抗病基因的分子标记引物可应用于烟草 TSWV抗病基因辅助选择、克隆或选育烟草抗TSWV品种。

进一步地，本发明提取待鉴定烟草DNA时，可采用烟草的种子、叶片、根、花器任意一个部位或几个部位的组织。

更进一步地，本发明所述的用由引物1、引物2的两条单链DNA组成的PCR 引物进行PCR扩增，PCR的反应体系如下：分别以待鉴定烟草、烟草斑萎病抗源Polalta与斑萎病感病品种K326的基因组DNA为模板，PCR扩增体系：2× Premix Ex TaqMix PCR Buffer 12.5μL，10μmol/L引物1和引物2各0.5μL， 50ng/μL模板DNA 1μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL；所述的PCR反应程序：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。

本发明所述由引物1、引物2两条单链DNA组成的PCR引物包含在Seq ID No.1或SeqID No.2的5’端或3’端分别增加1～30个碱基扩增得到的基本相同DNA片段的引物。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明的引物是与RTSW基因位点紧密连锁的标记，采用本发明所述引物所建立的分子标记方法是基于PCR和酶切技术产生的CAPs标记，可靠且使用方便，与以往的抗斑萎病标记相比，具有与目标基因RTSW紧密连锁、准确性高、成本低廉、检测效率高等优点，具体如下：

1.紧密连锁：实验证明，利用本发明方法对烟草育种材料辅助鉴定的结果与抗性鉴定结果完全一致，而利用以往的抗斑萎病AFLP和SCAR标记，有部分结果和抗性鉴定不一致，表明该方法能够用于烟草抗斑萎病育种的分子标记辅助选择。

2.准确性高:利用本发明方法对烟草育种材料辅助鉴定的结果，条带清晰，带型差别明显，而以往的抗斑萎病SCAR标记扩增片段在100-200bp之间，极易和引物二聚体所在的条带位置产生混淆。与以往的抗斑萎病标记相比，该检测方法克服了假阳性高、稳定性差等问题，准确率达100％。

3.成本低廉：本发明使用的限制性内切酶EcoRI属于普通分子生物学实验室常用的六碱基内切酶，可有效降低高通量检测成本。

4.检测效率高：与以往的抗斑萎病AFLP标记相比，本发明只采用一次普通电泳分析，克服了以往检测需要聚丙烯凝胶电泳的缺点，可极大地提高检测效率。

5.操作简单：本发明通过对烟草抗斑萎病基因的定位，开发出与其紧密连锁的分子标记方法，操作简单，可以在烟草的实生苗阶段进行淘汰选择，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而加速烟草抗斑萎病育种进程。

附图说明

图1是本发明以分子标记RTSWmarker1为引物的扩增产物电泳检测结果, 泳道M为marker，其为100bp DNA Ladder,泳道1为抗病亲本Polalta，泳道2 为烟草斑萎病抗源Polalta(♂)与主栽感病品种K326(♀)杂交F1单株；泳道3 为感病亲本K326；

图2为本发明以RTSWmarker1为引物利用烟草斑萎病抗源Polalta(♂)与主栽感病品种K326(♀)杂交后代BC6F3分离群体210个单株扩增产物经EcoRI酶切电泳检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

用于烟草抗斑萎病RTSW的抗病基因辅助选择的引物，所述引物由引物1和引物2的两条单链DNA组成；

所述引物1序列号为Seq ID No.1：

RTSWmarker1_EcoRIF 5’-CATGCTCATTCCACTAACTGAATCTGC-3’；

所述引物2序列号为Seq ID No.2：

RTSWmarker1_EcoRIR 5’-ACCTGAAGAAGGAGAAGGAGACCAATA-3'。

采用所述引物进行烟草抗斑萎病RTSW基因辅助选择的方法，其步骤如下：分别以待鉴定烟草、烟草斑萎病抗源Polalta与斑萎病感病品种K326的基因组 DNA为模板，用由引物1和引物2的两条单链DNA组成的PCR引物进行PCR扩增，将扩增的PCR产物利用限制性核酸内切酶EcoRI进行酶切，通过电泳检测或测序扩增产物，按照如下方法确定待鉴定烟草对TSWV的抗性：

(1)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经酶切后的电泳条带有与Polalta带型相同的条带，且大小为306bp、414bp和720bp则待鉴定烟草为抗斑萎病烟草或候选为抗斑萎病烟草；

(2)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经酶切后的电泳条带产生和K326带型相同的条带，仅有720bp的条带，则待鉴定烟草为非抗斑萎病烟草为或为候选非抗斑萎病烟草。

提取待鉴定烟草DNA时，可以采用烟草的种子、叶片、根、花器任意一个部位或几个部位的组织。对烟草DNA的提取方法为本领域常规的提取方法，可以为CTAB法、SDS提取法、ROSE一管法、TPS提取法等，也可以直接采用商用试剂盒进行DNA的提取。对本领域技术人员而言，可以理解，除了通过PCR扩增和酶切的方法获得本发明的分子标记外，还可以通过化学合成获得本发明的分子标记。

所述的用由引物1、引物2的两条单链DNA组成的PCR引物进行PCR扩增， PCR的反应体系如下：分别以待鉴定烟草、烟草斑萎病抗源Polalta与斑萎病感病品种K326的基因组DNA为模板，PCR扩增体系：2×Premix Ex TaqMix PCR Buffer 12.5μL，10μmol/L引物1和引物2各0.5μL，50ng/μL模板DNA 1 μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL。PCR反应程序如下：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。

本发明所述用于烟草抗斑萎病RTSW基因辅助选择的分子标记引物，以及分子标记引物用于烟草抗斑萎病RTSW基因辅助选择的方法，可应用于烟草TSWV 抗病基因定位、克隆或选育烟草抗TSWV品种。本发明可用于抗病基因的图位克隆和分子标记辅助选择，通过检测抗斑萎病基因位点来预测烟草对斑萎病的抗性。本发明所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用由引物1、引物2的两条单链DNA组成的PCR引物进行PCR扩增。所述检测还可以通过高通量测序方法检测是否含有本发明所述引物序列及扩增产物。

本领域技术人员可以理解，利用本发明的引物，以待检测的烟草基因组DNA 为模板进行PCR并利用EcoRI酶切，可以得到检测烟草中是否含有烟草抗斑萎病基因位点RTSW。所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用引物1 和引物2的引物进行PCR扩增后利用EcoRI酶切。

本领域技术人员熟知，在Seq ID No.1或Seq ID No.2序列中，可在其5’端或3’端分别增加1～30个碱基，所增加的碱基类型可根据烟草基因组DNA上与Seq ID No.1或SeqID No.2相匹配区域的碱基类型并依据碱基配对原则来确定，由此得到的引物与Seq IDNo.1或Seq ID No.2的扩增产物基本相同(上游和下游引物之间的DNA序列相同)。因此，上述在Seq ID No.1或Seq ID No.2 的5’端或3’端分别增加1～30个碱基并能扩增得到基本相同DNA片段的引物，均包括在本发明的引物中。

本发明利用了包含RTSW抗斑萎病基因位点的抗TSWV烟草材料：花烟草(N.alata)、Polalta，未包含RTSW抗斑萎病基因位点的感TSWV材料K326以及烟草斑萎病抗源Polalta(♂)与主栽感病品种K326(♀)杂交及回交、自交获得的 BC6F3后代。以上烟草材料均为常见的烟草种质资源，公众可从烟草种质资源保存单位或云南省烟草农业科学研究院获得。

N.tobacum(K326)的参考基因组序列已在(Edwards et al.,2017,A referencegenome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous lociimplicated in nitrogen utilization efficiency.Bmc Genomics 18,448.)中公开，公众可从 https://solgenomics.net/organism/Nicotiana_tabacum/genome获得。限制性内切酶、卡拉霉素、壮观霉素，Taq DNA聚合酶2×Premix Ex TaqMix均购自大连宝生物公司。其他化学试剂均为市售产品。

本发明的分子标记序列(引物1和引物2)是通过以下技术方案获得的：利用高通量测序技术，对将烟草斑萎病抗源Polalta(♂)与主栽感病品种K326(♀) 杂交及回交、自交获得的BC6F3后代进行TSWV抗病性鉴定，并更加具体的，所述抗病性鉴定方法参见中国专利申请201710414755.X(一种利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法)。根据抗病性鉴定结果，各选取抗病单株和感病单株40株分别构建抗/感混池进行转录组测序，将转录组获得的数据比对至K326 参考基因组，共发现抗/感池之间Dealta值大于0.4的SNP共计6047个，利用这些SNP所在的基因组序列进行酶切位点搜索，共获得含有常用酶切位点的24 个序列用于开发抗斑萎病相关的CAPs标记。利用烟草抗斑萎病亲本材料Polalta 与感斑萎病亲本材料K326筛选出双亲间的多态性标记，并利用F2分离群体210 个单株对多态性标记进行验证，获得了扩增抗斑萎病基因连锁标记的引物(引物1和引物2组成的引物对)。利用该引物在抗病和感病亲本中均能扩增得到的片段大小为720bp的PCR产物；所述的从感病亲本PCR扩增获得的720bp片段，其序列为SEQ ID No.3，并在303-308bp处的序列为GAATCC，不能被内切酶EcoRI识别，不能被EcoRI酶切；所述从抗病亲本PCR扩增获得的720bp 片段，其序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.3的混合物，SEQ ID No.4在303-308 bp处的序列为GAATTC，能被内切酶EcoRI识别，EcoRI酶切产生306bp和414 bp的条带。

实验证明，本发明对由抗、感斑萎病亲本Polalta和K326杂交产生的F2 分离群体210个单株对抗斑萎病的分子检测及抗性统计实验结果表明，采用本发明所提供的引物对(引物1和引物2)，待检测烟草的PCR扩增产物经EcoRI 酶切后的电泳条带有与Polalta带型相同的条带，且大小为306bp、414bp 和720bp目的条带的烟草全部表现出抗斑萎病，则待鉴定烟草为抗斑萎病烟草或候选为抗斑萎病烟草。而采用本发明所提供的引物对(引物1和引物2)，如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经EcoRI酶切后的电泳条带产生和K326带型相同的条带，且仅有720bp条带的烟草全部表现出感斑萎病，则待鉴定烟草为非抗斑萎病烟草为或为候选非抗斑萎病烟草。由此可见，本发明所提供的检测烟草对斑萎病抗性的方法可靠、简便、实用，在烟草种质资源评价和育种标记的辅助选择中具有重要应用前景，同时为培育对斑萎病高抗的烟草品种提供了参考依据。

本发明通过群体构建，将烟草斑萎病抗源Polalta(♂)与主栽感病品种K32 6(♀)杂交及回交、自交获得的BC6F3后代进行抗性鉴定及分子遗传连锁分析，获得了与抗斑萎病基因RTSW紧密连锁的分子标记RTSWmarker1。

本发明的一个具体的操作实例如下：

1、利用分离群体烟草抗性鉴定构建抗感池及转录组测序。

取将烟草斑萎病抗源Polalta(♂)与主栽感病品种K326(♀)杂交及回交、自交获得的BC6F3后代210株，利用无毒基因浸润的方法进行TSWV抗病性鉴定。 4～5片叶时，选取完全展开的顶部叶片，在同一张叶片上选取三个位置分别接种pK2-35S-NSm、pK2-35S-NSs、pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw -5b。其中pK2-35S-NSs作为阴性对照，pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw- 5b为阳性对照，阳性对照在所有的烟草上都会产生过敏性坏死。烟苗接种后20～28℃的光照培养室中培养72h，调查观察待检测烟草叶片上pK2-35S-NSm引起的过敏坏死(HR反应)。210株中有160株产生H R反应，为抗性单株，50株没有HR反应，为感病单株。结果见表1

从160株抗性单株和50株感病单株中分别随机选择40株构建抗性池(R-pool)和感性池(S-pool)，其构建方法为分别从选取的抗病 40株单株单株中每株取0.1g叶片，共计4g混合后构建抗性池(R-po ol)，碾磨成粉末后送样进行转录组测序。利用相同的方法构建感性池 (S-pool)并送样测序。

转录组测序选用华大基因的BGI500测序平台进行，抗/池每个样品测序获得12Gb的测序数据。

2、抗性连锁分子标记的筛选。

将转录组获得的抗/感池数据分别比对至K326参考基因组，通过 SNP分型，共发现抗/感池之间Dealta值大于0.4的SNP位点共计60 47个，利用这些SNP所在的基因组序列进行酶切位点搜索，共获得含有常用酶切位点的24个序列用于开发抗斑萎病相关的CAPs标记。提取烟草抗斑萎病亲本材料Polalta、感斑萎病亲本材料K326、烟草斑萎病抗源Polalta(♂)与主栽感病品种K326(♀)杂交F1的基因组DN A，根据获得的24个序列设计引物，进行PCR扩增后利用相应的酶切验证，筛选双亲间的多态性标记。

PCR扩增体系：2×Premix Ex TaqMix PCR Buffer 12.5μL，10 μmol/L引物1和引物2各0.5μL，25ng/μL模板DNA 2μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。

酶切体系：取PCR产物10μL、10×Customer缓冲液2.5μL、内切酶1.0μL、加ddH2O6.5μL补足25μL进行酶切，酶切反应程序为37℃2h、65℃10min，酶切结束取酶切反应产物10μL，以1％琼脂糖凝胶电泳检测验证。

电泳结果见图1，所示结果表明，利用引物1和引物2标记引物对上述Polalta、K326及F1材料进行PCR扩增，所有材料都得到扩增，没有假阴性结果出现，表明本研究所验证的PCR反应体系完全正常，符合检测要求。将抗病亲本Polalta和感病亲本K326特异条带的PCR产物回收，送宝生物公司测序。获得包含本发明的分子标记序列(Se q ID No.3和Seq IDNo.4)。

PCR产物利用EcoRI酶切后进行电泳比较分析，泳道1、泳道2 分别在306bp、414bp的位置出现目标条带，泳道3为感病亲本在相应位置没有出现目标条带，表明双亲间利用此标记存在多态性。

实施例3利用烟草斑萎病抗源Polalta(♂)与主栽感病品种K326 (♀)杂交及回交、自交获得的BC6F3后代分离群体210个单株对多态性标记进行验证。

分别提取210个不同单株的DNA样品，按照传统的核酸提取方法CTAB法，以纯化后的基因组DNA作为模板，利用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增体系：2×Premix Ex TaqMixPCR Buffer 12.5μL，1 0μmol/L引物1和引物2各0.5μL，25ng/μL模板DNA 2μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。

酶切体系：取PCR产物10μL、10×Customer缓冲液2.5μL、内切酶1.0μL、加ddH2O6.5μL补足25μL进行酶切，酶切反应程序为37℃2h、65℃10min，酶切结束取酶切反应产物10μL进行电泳检测验证。

所述引物1为：

RTSWmarker1_EcoRIF 5’-CATGCTCATTCCACTAACTGAATCTGC-3’； (Seq ID No.1)

所述引物2为：

RTSWmarker1_EcoRIR 5’-ACCTGAAGAAGGAGAAGGAGACCAATA-3 '；(Seq ID No.2)

电泳结果见图2，图2为本研究所建立的快速鉴定烟草抗斑萎病基因位点RTSW的分子标记的电泳分析。从分析结果来看，条带亮度高，条带清晰易辨认，未酶切条带和酶切后的条带大小差别明显。

表1 BC6F3群体抗性鉴定及标记检测结果统计

通过将本研究所建立的快速鉴定烟草抗斑萎病基因位点RTSW的分子标记结果和抗性鉴定结果对比后发现，210个样品的抗性鉴定结果完全一致，表明该方法结果稳定可靠准确性极高，没有出现假阳性结果(见表1)。

实施例中未注明的具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。以上实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 用于烟草抗斑萎病RTSW基因辅助选择的分子标记引物、辅助选择的方法及其应用

<141> 2019-09-29

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> RTSWmarker1_EcoRIF

<400> 1

catgctcatt ccactaactg aatctgc 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> RTSWmarker1_EcoRIR

<400> 2

acctgaagaa ggagaaggag accaata 27

<210> 3

<211> 721

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

catgctcatt ccactaactg aatctgcatc tgaaaacact aacttagtat acaaaggttg 60

tgcaaaacaa gcattatcag atccatctgg tgtttactca caagcacttt caactctttt 120

cggctcactt gtttcacaat cctcaaagtc aaatttttac aaaactacta caggcagtag 180

ccaaacaaca ataactggtc tttttcaatg tagaggtgac ctttcaaatg ttgagtgtta 240

taactgtgtt agtggtttgc caatacttat agacaaactt tgtggcactc ctgttgcagc 300

aagaatccag cttttaggtt gttatatgct atatgaggtt tctggttttc ctcaaatatc 360

aggaatggaa atgttgtata aaacttgtag tggtaaaaat gctcaaggga gtggatttga 420

agagaaaaga gacactgctt tttcttcatt ggaaaatggg atggctagtg ctaccaatgg 480

attttataca actagttatg agtctgttta tgttgtagga caatgtgaag gggatgtagg 540

ctcatctgat tgtgttgagt gtgttaaaag tgctgtccaa aaaactcaag ttgaatgtgg 600

tagttcagtt tctggtcaaa ttttcctaca caagtgcttt gttagtttta gttattatcc 660

aaatggggct cctaaaaaat catcatcttc ttcatattgg tctccttctc cttcttcagg 720

t 721

<210> 4

<211> 721

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

catgctcatt ccactaactg aatctgcatc tgaaaacact aacttagtat acaaaggttg 60

tgcaaaacaa gcattatcag atccatctgg tgtttactca caagcacttt caactctttt 120

cggctcactt gtttcacaat cctcaaagtc aaatttttac aaaactacta caggcagtag 180

ccaaacaaca ataactggtc tttttcaatg tagaggtgac ctttcaaatg ttgagtgtta 240

taactgtgtt agtggtttgc caatacttat agacaaactt tgtggcactc ctgttgcagc 300

aagaattcag cttttaggtt gttatatgct atatgaggtt tctggttttc ctcaaatatc 360

aggaatggaa atgttgtata aaacttgtag tggtaaaaat gctcaaggga gtggatttga 420

agagaaaaga gacactgctt tttcttcatt ggaaaatggg atggctagtg ctaccaatgg 480

attttataca actagttatg agtctgttta tgttgtagga caatgtgaag gggatgtagg 540

ctcatctgat tgtgttgagt gtgttaaaag tgctgtccaa aaaactcaag ttgaatgtgg 600

tagttcagtt tctggtcaaa ttttcctaca caagtgcttt gttagtttta gttattatcc 660

aaatggggct cctaaaaaat catcatcttc ttcatattgg tctccttctc cttcttcagg 720

t 721

Claims (5)

1.用于烟草抗斑萎病RTSW基因辅助选择的分子标记引物，其特征在于，

所述引物由引物1和引物2的两条单链DNA组成；

所述引物1序列号为Seq ID No.1：

RTSWmarker1_EcoRIF 5’-CATGCTCATTCCACTAACTGAATCTGC-3’；

所述引物2序列号为Seq ID No.2：

RTSWmarker1_EcoRIR 5’-ACCTGAAGAAGGAGAAGGAGACCAATA-3'。

2.采用如权利要求1所述分子标记引物用于烟草抗斑萎病RTSW的抗病基因辅助选择的方法，其特征在于，步骤如下：分别以待鉴定烟草、烟草斑萎病抗源Polalta与斑萎病感病品种K326的基因组DNA为模板，用由引物1和引物2的两条单链DNA组成的PCR引物进行PCR扩增，将扩增的PCR产物利用限制性核酸内切酶EcoRI进行酶切，通过电泳检测或测序扩增产物，按照如下方法确定待鉴定烟草对TSWV的抗性：

(1)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经酶切后的电泳条带有与Polalta带型相同的条带，且大小为306bp、414bp和720bp则待鉴定烟草为抗斑萎病烟草或候选为抗斑萎病烟草；

(2)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经酶切后的电泳条带产生和K326带型相同的条带，仅有720bp的条带，则待鉴定烟草为非抗斑萎病烟草为或为候选非抗斑萎病烟草。

3.权利要求1所述分子标记引物在烟草TSWV抗病基因辅助选择、克隆或选育烟草抗TSWV品种中的应用。

4.如权利要求2所述的采用如权利要求1所述分子标记引物用于烟草抗斑萎病RTSW的抗病基因辅助选择的方法，其特征在于，提取待鉴定烟草DNA时，采用烟草的种子、叶片、根、花器任意一个部位或几个部位的组织。

5.如权利要求2所述的采用如权利要求1所述分子标记引物用于烟草抗斑萎病RTSW的抗病基因辅助选择的方法，其特征在于，所述的用由引物1、引物2的两条单链DNA组成的PCR引物进行PCR扩增，PCR的反应体系如下：分别以待鉴定烟草、烟草斑萎病抗源Polalta与斑萎病感病品种K326的基因组DNA为模板，PCR扩增体系：2×Premix Ex TaqMix PCR Buffer12.5μL，10μmol/L引物1和引物2各0.5μL，50ng/μL模板DNA 1μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL；所述的PCR反应程序：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。

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