CN114480709A - 检测小麦抗叶锈病基因Lr47的分子标记、检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测小麦抗叶锈病基因Lr47的分子标记、检测方法及其应用。本发明借助于经过诱导的小麦‑拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病短片段易位系，结合小麦和拟斯卑尔脱山羊草的参考序列，开发了与抗叶锈病基因Lr47紧密连锁的分子标记Pku1176。利用该分子标记可以准确快速的检测不同小麦背景下易位的短片段7S染色体，实现抗叶锈病基因Lr47的早期分子辅助选择，提高小麦抗病育种效率。解决了现有技术中检测小麦抗锈病基因难度大的问题，适用于分子遗传育种领域。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传育种领域，具体而言，涉及一种检测小麦抗叶锈病基因Lr47的分子标记、检测方法及其应用。
背景技术
小麦叶锈病(Leaf rust)是由小麦叶锈菌(Puccinia triticina)侵染而引起的一种气传性真菌病害，具有分布范围广、传播速度快和危害损失大等特点。近年来，随着气候变化、耕作制度的改变以及新的叶锈菌生理小种的出现，小麦叶锈病的危害日益严重，已成为严重威胁我国小麦安全生产的重要病害。因此，防治小麦叶锈病成为小麦生产上的一个重要任务。
培育和使用抗病品种是防治小麦叶锈病最经济、安全和有效的方法。小麦抗叶锈病基因Lr47来自小麦近缘物种拟斯卑尔脱山羊草(Aegilops speltoides，基因组为SS)，但它的最初供体材料并不清楚。Dubcovsky等在1998年利用ph1b突变体，结合染色体C显带技术、限制性片段长度多态性(RFLP)标记和叶锈病表型鉴定，将含有Lr47的一段20-30cM(centimorgan，遗传学上重组交换单位)长的7S染色体易位到普通小麦7A染色体。该7S易位染色体的基因型鉴定只能依靠连锁的RFLP标记，但RFLP标记实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，不适于大规模的分子育种，因此迫切需要开发一个快速、直接、高通量的新型分子标记。
近年来的抗谱鉴定发现，抗性基因Lr47对我国主要流行的叶锈菌生理小种都表现出近免疫的抗性，是为数不多的优异抗叶锈病基因之一，在小麦抗叶锈病育种中具有重大的应用前景。由于在正常小麦中存在Ph1基因，该基因的主要功能是促进同源染色体之间的配对，同时限制部分同源染色体之间的配对。因此，Ph1基因会限制携带Lr47基因的7S染色体与普通小麦7A染色体之间的重组交换，所以常规的杂交或回交方法基本上不能缩小外源7S染色体片段。总的来说，由于缺少简单有效的分子标记，并且因为连锁累赘问题，造成了Lr47基因无法在小麦育种中大规模利用。因此，创制含有Lr47的短片段易位系，并且开发简单、高效的检测拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病基因Lr47的分子标记是本领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种检测小麦抗叶锈病基因Lr47的分子标记、检测方法及其应用，以解决现有技术中检测小麦抗锈病基因难度大的问题。
为了实现目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种检测小麦抗叶锈病基因Lr47的分子标记，分子标记为Pku1176；
用于扩增分子标记的引物包括具有SEQ ID NO：1所示的上游引物Pku1176-F和具有SEQ ID NO：2所示的下游引物Pku1176-R。
为了实现目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种检测小麦抗叶锈病基因的试剂盒，该试剂盒包括引物，引物包括上游引物Pku1176-F和下游引物Pku1176-R。
为了实现目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种小麦抗叶锈病基因的检测方法，该检测方法包括：对分子标记，或试剂盒进行扩增，并对扩增的产物进行酶切和检测。
进一步地，检测方法包括：a)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物进行PCR扩增；b)使用限制性内切酶MspI对PCR扩增产物进行酶切；c)对酶切产物进行检测，判断酶切产物的碱基序列长度，若碱基序列长度为672bp，则待测小麦不含小麦抗叶锈病基因；若碱基序列长度包括300bp和372bp，则待测小麦含有小麦抗叶锈病基因。
进一步地，c)中，若碱基序列长度包括300bp、372bp和672bp，则待测小麦为含有小麦抗叶锈病基因的杂合子；若碱基序列长度包括300bp、372bp且不包括672bp，则待测小麦为含有小麦抗叶锈病基因的纯合子；优选地，c)中的检测包括琼脂糖凝胶电泳；优选地，a)中的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
为了实现目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种易位系小麦育种方法，该育种方法包括：(1)将中国春ph1b突变体材料与携带小麦抗叶锈病基因Lr47的抗病亲本进行杂交，获得F1植株；(2)F1植株自交获得F2植株，在F2植株群体中，选择携带纯合ph1b突变基因，同时携带7S/7A染色体的杂合单株，进行自交，获得F3植株；(3)利用上述分子标记、或上述试剂盒、或上述检测方法，对F3植株及其自交后代家系的基因型进行确定，并进行叶锈病表型鉴定，得到携带小麦抗叶锈病基因Lr47及外源7S短片段的纯合的重组体小麦；(4)将携带小麦抗叶锈病基因Lr47及外源7S短片段的纯合的重组体小麦回交转育到无抗性小麦中，得到携带小麦抗叶锈病基因Lr47及外源7S短片段的纯合的易位系小麦；其中，外源7S短片段指与短于携带小麦抗叶锈病基因Lr47的抗病亲本中的外源7S片段的长度的片段。
进一步地，利用无抗性小麦对重组体小麦进行多次回交后的子代进行自交，利用上述分子标记、或上述试剂盒、或上述检测方法进行检测，从而得到携带小麦抗叶锈病基因及外源7S短片段的纯合的易位系小麦；进一步地，所述无抗性小麦包括扬麦21；优选地，携带Lr47基因的抗病亲本包括抗病亲本Kern Lr47。
为了实现目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种分子标记，或试剂盒，或检测方法，或易位系小麦育种方法，在小麦育种中的应用。
为了实现目的，根据本发明的第六个方面，提供了一种分子标记，或试剂盒，或检测方法，在克隆小麦抗叶锈病基因、鉴定或辅助鉴定小麦抗叶锈病表型性状、或筛选拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病品系、或在小麦-拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病种质资源及其衍生品种或品系中的应用。
应用本发明的技术方案，提供了一种检测小麦抗叶锈病基因的分子标记Pku1176，利用上游引物Pku1176-F和下游引物Pku1176-R，能够扩增该分子标记，该分子标记与抗叶锈病基因Lr47紧密连锁，从而后续根据该分子标记的PCR扩增产物片段是否能被MspI酶切来检测待检小麦材料是否含有拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病基因Lr47，该分子标记为一种CAPS标记，有无抗叶锈病基因的两种小麦材料酶切后的片段长度差异较大，因而检测难度低。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明实施例1的示意图，为Kern Lr47、CSph1b、抗病F3单株和感病F3单株接种叶锈病生理小种PHQS培养12天后的表型。
图2示出了根据本发明实施2的小麦7A染色体示意图，其中，7AL表示7A染色体的长臂，7AS表示染色体的短臂，(a)为Kern Lr47小麦的7A染色体示意图，携带的外源7S染色体约150Mb，如图(a)中黑色长方形所示；(b)为重组体F284的7A染色体示意图，携带的外源7S染色体约40Mb，如图(b)中黑色长方形所示。
图3示出了根据本发明实施例2和3中的检测重组体F284自交F2代单株中小麦抗叶锈病基因的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为DL2000 marker，泳道2-13为重组体F284自交F2代分离群体部分单株，泳道14为抗病亲本Kern Lr47，泳道15为感病亲本CSph1b；M表示DNA分子量标准，H表示抗性杂合子植株，A表示抗性纯合子植株，B表示无抗性植株。
图4示出了根据本发明实施例4中检测不同种小麦中抗叶锈病基因的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为DL2000 marker，泳道2-5为四倍体小麦品种(Langdon、Svevo、Khapli、PI 480460)，泳道6-11为六倍体品种(PI 660057、Cadenza、PI 430067、PI 189747、PI182527、PI 178759)，泳道12-17为Lr47姊妹系(Kern Lr47、Kern、UC1041 Lr47、UC1041、RSI5 Lr47和RSI5)，M表示DNA分子量标准。
图5示出了根据本发明实施例4中检测不同种小麦中抗叶锈病基因的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1-48为图4外更多被检测的四倍体小麦品种；泳道49-87为图4外更多被检测的六倍体小麦品种；M表示DNA分子量标准；阳性对照Kern Lr47和阴性对照Kern。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
术语解释：
易位系：非同源染色体间染色体片段的互换或近缘物种的异源染色体间片段互换所形成的品系。
单核苷酸多态性(SNP，single nucleotide polymorphism)：基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。
CAPS标记：即基于SNP的PCR技术与限制性内切酶技术结合的分子标记技术。
如背景技术所提到的，抗性基因Lr47对我国主要流行的叶锈菌生理小种都表现出近免疫的抗性，是为数不多的优异抗叶锈病基因之一，在小麦抗叶锈病育种中具有重大的应用前景。由于缺少简单有效的分子标记，并且因为连锁累赘问题(与Lr47连锁的不利性状)，造成了Lr47基因无法在小麦育种中大规模利用，加上检测拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病基因Lr47的检测方法复杂，检测成本高、难度大。因而，在本申请中发明人创制了携带抗叶锈病基因Lr47的短片段(约40Mb)易位系并对检测Lr47基因的分子标记进行探究，提供了一种检测小麦抗叶锈病基因的分子标记Pku1176，利用该分子标记能够降低对Lr47基因的检测难度。因而提出了本申请的一系列保护方案。
本发明借助于经过诱导的小麦-拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病短片段易位系，结合小麦和拟斯卑尔脱山羊草的参考序列，开发了与抗叶锈病基因Lr47紧密连锁的分子标记Pku1176。利用该分子标记可以准确快速的检测不同小麦背景下易位的短片段7S染色体，实现抗叶锈病基因Lr47的早期分子辅助选择，提高小麦抗病育种效率。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种检测小麦抗叶锈病基因Lr47的分子标记，分子标记为Pku1176；用于扩增分子标记的引物包括具有SEQ ID NO：1所示的上游引物Pku1176-F和具有SEQ ID NO：2所示的下游引物Pku1176-R。
本申请利用中国春ph1b突变体为工具材料，与携带拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病基因Lr47的小麦材料Kern Lr47进行杂交、自交和回交。同时，利用三份拟斯卑尔脱山羊草PI554292、AE159、AE915；三份携带Lr47的材料Yecora Rojo Lr47、UC1041 Lr47、Kern Lr47和它们的背景材料Yecora Rojo、UC1041、Kern，总共九份材料的转录组和外显子组测序数据，以及所有已经测序小麦的参考基因组，结合生物信息学分析，在外源7S染色体上开发了多个分子标记。利用分子标记辅助选择，结合叶锈病表型鉴定，创制了小麦-拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病短片段易位系，并基于此缩短的7S染色体片段开发了与Lr47基因紧密连锁的分子标记Pku1176。
上述分子标记Pku1176为CAPS标记，利用上游引物Pku1176-F和下游引物Pku1176-R进行PCR扩增。有无小麦抗叶锈病基因，均能扩增得到相同长度的片段，差异在于存在SNPs(即为多个SNP，此处并不意味着除了酶切位点存在SNP之外，不同小麦品种之间就不存在其他SNP了。实质上在不同材料之间还是存在个别SNP的，尤其是普通小麦之间)，通过限制性内切酶MspI，即能区分上述2种小麦扩增得到的片段。在含有抗叶锈病基因Lr47的小麦品种的扩增片段上，有MspI的酶切位点；在不包含小麦抗叶锈病基因Lr47的小麦品种的扩增片段上，没有MspI的酶切位点。该分子标记只是跟Lr47紧密连锁而不在基因内部。因为Lr47位于外源7S染色体上，在正常情况下该染色体不会与小麦染色体发生重组，所以与其紧密连锁的标记可以用于鉴定目标小麦材料是否含有7S染色体，即用于鉴定是否含有Lr47。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种检测小麦抗叶锈病基因的试剂盒，该试剂盒包括上述引物，引物包括上游引物Pku1176-F和下游引物Pku1176-R。
利用上述试剂盒，即利用上述试剂盒中的上游引物和下游引物，以及试剂盒中能够包括的PCR酶、限制性内切酶等组分，能够用于检测样本小麦中是否含有小麦抗叶锈病基因Lr47。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种小麦抗叶锈病基因的检测方法，该检测方法包括：对上述分子标记，或利用上述试剂盒进行扩增，并对扩增的产物进行酶切和检测。
利用上述检测方法，利用上述引物或试剂盒，对待测小麦进行PCR扩增，并对PCR扩增的产物进行酶切和检测，能够检测待测小麦中是否含有小麦抗叶锈病基因Lr47。
在一种优选的实施例中，检测方法包括：a)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物进行PCR扩增；b)使用限制性内切酶MspI对PCR扩增产物进行酶切；c)对酶切产物进行检测，判断酶切产物的碱基序列长度，若碱基序列长度为672bp，则待测小麦不含小麦抗叶锈病基因；若碱基序列长度包括300bp和372bp，则待测小麦含有小麦抗叶锈病基因。
利用基因组提取试剂盒等现有技术，能够提取待测小麦的基因组，作为模板进行PCR扩增。或直接从小麦幼苗上进行取样、处理后，也能够作为PCR模板进行PCR扩增。PCR扩增产物后，利用限制性内切酶MspI对PCR扩增产物进行酶切，在对携带小麦抗叶锈病基因的待测小麦的扩增片段上，有MspI的酶切位点，能够酶切切开；在不携带小麦抗叶锈病基因的待测小麦的扩增片段上，没有MspI的酶切位点，不能酶切切开。对酶切后的PCR产物进行检测，若酶切产物中的碱基序列长度包括300bp和372bp，则待测小麦含有小麦抗叶锈病基因；若酶切产物中的碱基序列长度不包括300bp和372bp，而是为672bp，则待测小麦不含有小麦抗叶锈病基因。
有无抗性基因的小麦，在酶切之前的PCR产物都为672bp。由于含有抗性基因Lr47的小麦材料PCR扩增产物内部有拟斯卑尔脱山羊草特异性的SNPs，导致酶切位点差异：含有Lr47基因的小麦材料PCR产物内部含有限制性内切酶MspI识别位点，因此能被切开，形成300+372bp条带；而不含Lr47基因的小麦材料PCR产物内部没有限制性内切酶MspI识别位点，因此不能被切开，形成672bp条带。
在一种优选的实施例中，c)中，若碱基序列长度包括300bp、372bp和672bp，则待测小麦为含有小麦抗叶锈病基因的杂合子；若碱基序列长度包括300bp、372bp且不包括672bp，则待测小麦为含有小麦抗叶锈病基因的纯合子；优选地，c)中的检测包括琼脂糖凝胶电泳；优选地，a)中的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
若待测小麦为含有Lr47基因的纯合子小麦，则酶切产物中的碱基序列长度只包括300bp和372bp，而没有672bp；若待测小麦为含有Lr47基因的杂合子小麦，则酶切产物中的碱基序列长度包括300bp、372bp和672bp三种片段长度。上述酶切产物的检测方法包括但不限于琼脂糖凝胶电泳。上述PCR扩增程序可以根据PCR所用模板量、DNA聚合酶种类等因素进行灵活调整。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种易位系小麦育种方法，该易位系小麦育种方法包括：(1)将中国春ph1b突变体材料与携带小麦抗叶锈病基因Lr47的抗病亲本(携带长片段7S染色体)进行杂交，获得F1植株；中国春ph1b突变体能够诱导7A和7S部分同源染色体发生重组(即纯合ph1b基因能够促使外源7S染色体与普通小麦7A染色体之间发生重组配对)，创制短片段的易位系，打破连锁累赘，促进抗叶锈病基因Lr47的育种利用。(2)F1植株自交获得F2植株，在F2植株群体(即分离群体)中，选择携带纯合ph1b突变基因，同时携带7A/7S染色体的杂合单株，进行自交，获得F3植株；杂合单株即同时含有7S染色体片段和7A染色体的单株，其中，7A来自于中国春ph1b突变体，7S来自于抗病亲本Kern Lr47；(3)利用上述分子标记、或试剂盒、或检测方法，对F3植株及其自交后代中的小麦抗叶锈病基因的基因型进行确定，并进行叶锈病表型鉴定，得到含有小麦抗叶锈病基因的、外源7S片段缩小的、纯合的重组体小麦。(4)将携带小麦抗叶锈病基因Lr47及外源7S短片段的纯合的重组体小麦回交转育到无抗性小麦中，得到携带小麦抗叶锈病基因Lr47及外源7S短片段的纯合的易位系小麦；其中，外源7S短片段指短于携带小麦抗叶锈病基因Lr47的抗病亲本中的外源7S片段的长度的片段。
上述易位系小麦即为短片段易位系小麦。本申请中的短片段易位系，指的是相较于现有技术中的150Mb的外源片段，该易位系小麦的外源片段较短，约为40Mb。在该约40Mb的外源片段中，包括Lr47基因，因此仍具有叶锈病抗性。在易位系小麦育种方法中，将重组体小麦与无抗性小麦进行杂交，并将杂交子代与无抗性小麦(即轮回亲本)进行多次回交，从而获得性状与初始的无抗性小麦母本相似的子代植株，在子代植株中保留轮回亲本的优良性质。在每代回交中，均利用上述分子标记、或试剂盒、或检测方法进行检测。在转育过程中短片段7S和无抗性轮回亲本7A染色体并不能发生重组，利用上述引物、分子标记、试剂盒或检测方法，就可以确定回交后代及其自交后代中的基因型，筛选出携带Lr47抗性基因的子代植株。本申请中利用上述分子标记对Lr47基因进行鉴定，方便快捷，并能够实现高通量鉴定，能够减少现有技术中的叶锈病表型鉴定或复杂的分子标记鉴定所需时间和成本。将多次回交后的子代进行自交，利用上述分子标记、或试剂盒、或检测方法进行检测，筛选出携带小麦抗叶锈病基因的、纯合的易位系小麦。
在一种优选的实施例中，结合多个位于7S染色体但与Lr47基因不紧密连锁的分子标记，对F3植株及其自交后代家系的基因型进行确定，并进行叶锈病表型鉴定，得到携带小麦抗叶锈病基因及外源7S短片段的纯合的重组体小麦；优选地，利用无抗性小麦对重组体小麦进行多次回交后的子代进行自交，利用上述分子标记、或上述试剂盒、或上述检测方法进行检测，从而得到携带小麦抗叶锈病基因及外源7S短片段的纯合的易位系小麦；优选地，携带Lr47基因的抗病亲本包括抗病亲本Kern Lr47。
利用上述易位系小麦育种方法，能够以无抗性的扬麦21小麦为母本，获得性状与扬麦21相近，并带有抗叶锈病能力的易位系小麦。
上述分子标记，或试剂盒，或检测方法，或重组体小麦，或易位系小麦育种方法，在小麦育种中的应用。
上述分子标记，或试剂盒，或检测方法，在克隆小麦抗叶锈病基因、鉴定或辅助鉴定小麦抗叶锈病表型性状、或筛选拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病品系、或在小麦-拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病种质资源及其衍生品种或品系中的应用。
衍生品种或品系，指利用上述易位系小麦跟任何其他小麦材料杂交、回交选育出来的品种或品系。
下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用到的试剂等无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1.室内苗期叶锈病抗性鉴定
在人工气候室种植抗病亲本Kern Lr47和感病亲本CSph1b，人工气候室条件设置：光照16小时，黑暗8小时，白天25℃，夜间22℃，湿度80-90％。当幼苗长至两叶一心期，采用人工扫抹法，接种强毒性的叶锈菌生理小种PHQS。接菌后黑暗、保湿处理24小时。接菌12天后对材料进行叶锈病抗性鉴定，鉴定方法按照0-4级分级标准进行(注：0级为免疫；0；为近免疫；1级为高抗；2级为中抗；3级为中感；4级为高感)。结果显示：Kern Lr47表现出近免疫的抗性，而CSph1b表现为高感(如图1所示)。
利用同样的方法，我们对Kern Lr47 x CSph1b杂交产生的分离群体进行表型鉴定。群体表型鉴定所用的叶锈菌菌种为PHQS。如图1所示，接菌12天后，含有拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病基因Lr47的杂交后代单株表型出近免疫抗性，而不含有Lr47的单株表型为高感。
实施例2.拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病短片段易位系的创制
拟斯卑尔脱山羊草缺乏高质量的参考基因组且该物种具有异花授粉的特性，因此不同材料之间序列差异较大，给特异性分子标记的开发造成了一定的困难。对三份拟斯卑尔脱山羊草PI 554292、AE159、AE915；三份携带Lr47的材料Yecora Rojo Lr47、UC1041Lr47、Kern Lr47和它们背景材料Yecora Rojo、UC1041、Kern，总共九份材料的转录组和外显子组测序数据，结合所有已经测序小麦的参考基因组序列和生物信息学分析，找到拟斯卑尔脱山羊草7S染色体特异的SNPs(单核苷酸多态性，single nucleotidepolymorphism)，得到的SNPs数据也表明Kern Lr47携带约150Mb的7S染色体片段。本申请利用中国春ph1b突变体的方法缩小外源基因所在的染色体区间，在知悉基因位置范围后，能够进一步开发紧密连锁分子标记。需要多代的杂交、自交、筛选、鉴定，确定基因所在的区间，难度很大。利用得到的拟斯卑尔脱山羊草7S染色体特异的SNPs，在外源7S染色体上开发了多个特异性分子标记，但开发的多个7S特异性分子标记除Pku1176外都位于在后续实验中被重组掉的7S染色体上(现有技术中携带Lr47基因的易位系小麦，携带的7S染色体片段约150Mb；本申请获得了携带Lr47基因的易位系小麦，其携带的7S染色体片段约40Mb，外源7S染色体的长度缩短了110Mb)。
利用北京大学现代农业研究院室内植物生长室，将Kern Lr47与感病亲本CSph1b进行杂交，得到F1。将得到的F1单株自交获得F2，通过分子标记鉴定，在F2群体中选择ph1b基因纯合，同时携带7S/7A染色体的杂合单株，进行自交，获得F3。随后，借助于分子标记，对F3群体进行基因型鉴定，找出拟斯卑尔脱山羊草7S染色体发生重组的单株。对得到的重组体及其自交后代接种叶锈菌PHQS，进行室内表型鉴定，结合分子标记检测，得到了一个关键的小片段重组体，株系编号为F284。重组体F284是筛选到的携带抗叶锈病基因Lr47并且外源7S染色体片段最小的重组体。分子标记鉴定表明F284含有的外源7S染色体大小约为40Mb，该易位片段约占整条7A染色体的5.4％(如图2所示)。重组体F284是一个杂合子，其自交产生分离的后代，利用分子标记Pku1176在后代中筛选纯合重组单株。
用于扩增所述的分子标记Pku1176的扩增引物序列如下：
F：5’-ctttgttatgaaggtaccgct-3’，编号为SEQ ID NO：1；
R：5’-ccctggaagatattagatgc-3’，编号为SEQ ID NO：2。
实施例3.拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病短片段转移到普通小麦主栽品种
为了将缩小的7S染色体片段转移到普通小麦品种，利用从重组体F284后代中鉴定得到的含有纯合7S短片段染色体的单株(如图3中泳道4、6、11对应的单株)与普通小麦品种扬麦21进行杂交，得到F1。
利用分子标记Pku1176对上述重组体F284 x扬麦21的后代群体单株基因组DNA进行PCR扩增，具体反应体系如下：
DNA模板(100ng/μL)0.5μL
2×Taq Plus PCR MasterMix 6.25μL(睿博兴科公司)
10μM引物各0.5μL
加ddH2O补齐至12.5μL
PCR扩增反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
对上述扩增产物通过限制性内切酶MspI进行酶切。具体反应体系如下：
10×NEB buffer 1.0μL
限制性内切酶 0.2μL
PCR产物 5μL
加ddH2O补齐至10μL
酶切反应程序：酶切温度为37℃，酶切时间为2小时。
酶切产物通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析，电泳缓冲液为1×TAE，电泳仪的恒定电压为100V。凝胶采用EB染色，使用BIO-RAD成像仪进行拍照。部分结果如图3所示，泳道4、6、11扩增出与Kern Lr47(泳道14)一样的条带，说明含有纯合的7S短片段染色体；泳道5、8的条带与CSph1b(泳道15)一样，说明不含有7S染色体；而泳道2、3、7、9、10、12、13为杂合带型，说明为杂合单株。利用叶锈菌小种PHQS对上述重组体F284自交的后代单株进行抗病性鉴定，结果显示，得到的表型与基因型完全一致。
F1与扬麦21进行回交，每一代都需要利用分子标记Pku1176进行辅助选择。得到的BC2F1进行自交，在BC2F2群体中利用分子标记Pku1176进行辅助选择，得到含有纯合7S短片段染色体的单株。利用叶锈菌小种PHQS对上述挑选得到的单株进行抗病性鉴定，结果显示，这些单株都表现出和Kern Lr47类似的抗性表型。挑选的单株自交收获BC2F3种子，该种质资源保存在北京大学现代农业研究院小麦抗病遗传育种实验室，保存编号PKU-2102，并对公众开放该种质资源材料。
实施例4.拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病基因Lr47紧密连锁分子标记Pku1176的验证
利用分子标记Pku1176对国内外62份六倍体小麦(包含四份携带Lr47的材料Yecora Rojo Lr47、UC1041 Lr47、Kern Lr47、RSI5 Lr47)和87四倍体小麦材料进行基因型鉴定。
具体地，利用分子标记Pku1176对上述六倍体和四倍体小麦基因组DNA进行PCR扩增，具体反应体系如下：
DNA模板(100ng/μL)0.5μL
2×Taq Plus PCR MasterMix 6.25μL(睿博兴科公司)
10μM引物各0.5μL
加ddH2O补齐至12.5μL
PCR扩增反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
对上述扩增产物通过限制性内切酶MspI进行酶切。具体反应体系如下：
10×NEB buffer 1.0μL
限制性内切酶 0.2μL
PCR产物 5μL
加ddH2O补齐至10μL
酶切反应程序：酶切温度为37℃，酶切时间为2小时。
酶切产物通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析，电泳缓冲液为1×TAE，电泳仪的恒定电压为100V。凝胶采用EB染色，使用BIO-RAD成像仪进行拍照。部分结果如图4和图5所示。图5中未标注具体小麦品种的泳道均为不同种的上述小麦的基因型鉴定结果。在这149份小麦材料中，只有4份材料Yecora Rojo Lr47、UC1041 Lr47、Kern Lr47、RSI5 Lr47能够酶切出300-bp和372-bp两个条带，这4份小麦材料携带拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病基因Lr47是我们已知的，这与我们的检测结果一致。其它剩下的145份小麦材料都只检测到672-bp的电泳条带，说明这些材料都不含有来自拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病基因Lr47。这些结果说明本发明所提供的分子标记Pku1176可以高效、精确的用于鉴定小麦材料中是否含有拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈基因Lr47，统计结果如表1所示。
表1：分子标记Pku1176鉴定不同的四倍体和六倍体小麦材料
此外，我们分析了所有已经公布的小麦参考基因组和几百份外显子组测序的小麦材料。我们设计的上游引物Pku1176-F和下游引物Pku1176-R以及引物所在的基因，在这些材料中具有很高的保守性，能够扩出672bp的PCR产物。因此，推测不含有拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈基因Lr47的待测小麦，理论上都能够扩出672bp的PCR产物。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明提供了一种检测小麦抗叶锈病基因的分子标记Pku1176，利用上游引物Pku1176-F和下游引物Pku1176-R，能够以待检测小麦样本的基因组为模板，扩增该分子标记，从而检测小麦样本是否含有拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病基因，检测难度低。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京大学现代农业研究院
<120> 检测小麦抗叶锈病基因Lr47的分子标记、检测方法及其应用
<130> PN173284XDNY
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 分子标记Pku1176的F端扩增引物
<400> 1
ctttgttatg aaggtaccgc t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 分子标记Pku1176的R端扩增引物
<400> 2
ccctggaaga tattagatgc 20
Claims (10)
1.一种检测小麦抗叶锈病基因Lr47的分子标记，其特征在于，所述分子标记为Pku1176；
用于扩增所述分子标记的引物包括具有SEQ ID NO：1所示的上游引物Pku1176-F和具有SEQ ID NO：2所示的下游引物Pku1176-R。
2.一种检测小麦抗叶锈病基因Lr47的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物，所述引物包括所述上游引物Pku1176-F和所述下游引物Pku1176-R。
3.一种小麦抗叶锈病基因Lr47的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
对权利要求1所述的分子标记，或利用权利要求2所述的试剂盒进行扩增，并对扩增的产物进行酶切和检测。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
a)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述引物进行PCR扩增；
b)使用限制性内切酶MspI对PCR扩增产物进行酶切；
c)对酶切产物进行检测，判断所述酶切产物的碱基序列长度，若所述碱基序列长度为672bp，则所述待测小麦不含所述小麦抗叶锈病基因；
若所述碱基序列长度包括300bp和372bp，则所述待测小麦含有所述小麦抗叶锈病基因。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述c)中，若所述碱基序列长度包括300bp、372bp和672bp，则所述待测小麦为含有所述小麦抗叶锈病基因的杂合子；
若所述碱基序列长度包括300bp、372bp且不包括672bp，则所述待测小麦为含有所述小麦抗叶锈病基因的纯合子；
优选地，所述c)中的检测包括采用琼脂糖凝胶电泳对所述酶切产物进行检测；
优选地，所述a)中的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
6.一种易位系小麦育种方法，其特征在于，所述育种方法包括：
(1)将中国春ph1b突变体材料与携带小麦抗叶锈病基因Lr47的抗病亲本进行杂交，获得F1植株；
(2)所述F1植株自交获得F2植株，在所述F2植株群体中，选择携带纯合ph1b突变基因，同时携带7S/7A染色体的杂合单株，进行自交，获得F3植株；
(3)利用权利要求1所述的分子标记、或权利要求2所述的试剂盒、或权利要求3至5中任一项所述的检测方法，对所述F3植株及其自交后代家系的基因型进行确定，并进行叶锈病表型鉴定，得到携带所述小麦抗叶锈病基因Lr47及外源7S短片段的纯合的重组体小麦；
(4)将携带所述小麦抗叶锈病基因Lr47及所述外源7S短片段的纯合的所述重组体小麦回交转育到无抗性小麦中，得到携带所述小麦抗叶锈病基因Lr47及所述外源7S短片段的纯合的易位系小麦；其中，所述外源7S短片段指短于所述携带小麦抗叶锈病基因Lr47的抗病亲本中的外源7S片段的长度的片段。
7.根据权利要求6所述的易位系小麦育种方法，其特征在于，利用所述无抗性小麦对所述重组体小麦进行多次回交后的子代进行自交，利用权利要求1所述的分子标记、或权利要求2所述的试剂盒、或权利要求3至5中任一项所述的检测方法进行检测，从而得到携带所述小麦抗叶锈病基因及所述外源7S短片段的纯合的所述易位系小麦；
优选地，所述携带Lr47基因的抗病亲本包括抗病亲本Kern Lr47。
8.根据权利要求7所述的易位系小麦育种方法，其特征在于，所述无抗性小麦包括扬麦21。
9.权利要求1所述的分子标记，或权利要求2所述的试剂盒，或权利要求3至5中任一项所述的检测方法，或权利要求6至8中任一项所述的易位系小麦育种方法，在小麦育种中的应用。
10.权利要求1所述的分子标记，或权利要求2所述的试剂盒，或权利要求3至5中任一项所述的检测方法，在克隆所述小麦抗叶锈病基因、鉴定或辅助鉴定小麦抗叶锈病表型性状、或筛选拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病品系、或在小麦-拟斯卑尔脱山羊草抗叶锈病种质资源及其衍生品种或品系中的应用。
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| CN202210114498.9A Active CN114480709B (zh) | 2022-01-30 | 2022-01-30 | 检测小麦抗叶锈病基因Lr47的分子标记、检测方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114480709B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116253784A (zh) * | 2022-10-12 | 2023-06-13 | 北京大学现代农业研究院 | 小麦叶锈病抗性蛋白及其编码基因和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101955988A (zh) * | 2010-01-28 | 2011-01-26 | 天津师范大学 | 一种抗白粉病近等基因系Brock/京4117的遗传检测方法 |
| CN108342505A (zh) * | 2018-04-25 | 2018-07-31 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 抗叶锈病相关的染色体区段及其应用 |
| CN111041122A (zh) * | 2020-01-08 | 2020-04-21 | 中国农业大学 | 小麦抗叶锈病基因Lr13的indel分子标记及其应用 |
| CN112813192A (zh) * | 2021-04-08 | 2021-05-18 | 河北农业大学 | 小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22及其检测引物和应用 |
-
2022
- 2022-01-30 CN CN202210114498.9A patent/CN114480709B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101955988A (zh) * | 2010-01-28 | 2011-01-26 | 天津师范大学 | 一种抗白粉病近等基因系Brock/京4117的遗传检测方法 |
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| WO2024078038A1 (zh) * | 2022-10-12 | 2024-04-18 | 北京大学现代农业研究院 | 小麦叶锈病抗性蛋白及其编码基因和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114480709B (zh) | 2022-11-29 |
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