CN116253784A - 小麦叶锈病抗性蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种小麦叶锈病抗性蛋白及其编码基因和应用。其中，上述小麦叶锈病抗性蛋白，包括如下(a)‑(c)任一所示：(a)具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有抗小麦叶锈病活性的蛋白质；或(c)与(a)和(b)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。该蛋白质具有小麦叶锈病抗性，解决了现有技术中小麦易染叶锈病、染病后产量损失严重的问题，适用于小麦育种领域。
Description
技术领域
本发明涉及小麦育种领域，具体而言，涉及一种小麦叶锈病抗性蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
小麦是世界性的粮食作物，为全球大约三分之一的人口提供主食。然而，小麦的安全生产受到多种真菌病害的威胁，其中包括小麦叶锈病。由叶锈菌(Puccinia triticina)侵染所引起的小麦叶锈病，是一种气传性真菌病害，具有分布范围广、传播速度快和危害损失大等特点。该病害在全世界小麦主产区都有发生，包括欧洲、北美、亚洲、澳洲和非洲的多个国家和地区。其主要危害小麦叶片，破坏光合作用，进而造成小麦减产，通常可造成5％～15％的减产，发病严重时会造成40％以上的减产。因此，防治小麦叶锈病成为小麦生产上的一个重要任务。
克隆和利用抗叶锈病基因，培育抗叶锈病小麦品种是防治该病害最经济、安全和有效的方法。小麦抗叶锈病基因Lr47来自小麦近缘物种拟斯卑尔脱山羊草(Aegilopsspeltoides，基因组为SS)。研究表明，Lr47对全球许多国家的叶锈菌都表现出近免疫、广谱的抗性。因此，一旦该基因被克隆和转育，在小麦抗叶锈病育种中将具有重大的应用前景。
到目前为止，国际上已经正式命名的小麦抗叶锈病基因约有82个(Lr1-Lr82)。但是，由于小麦的基因组十分庞大，且超过80％的序列是重复序列，因此小麦功能基因的分离克隆研究远远落后于水稻和玉米等其它作物。目前，只有少数几个抗叶锈病基因被成功地分离克隆。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种小麦叶锈病抗性蛋白及其编码基因和应用，以解决现有技术中小麦易染叶锈病、染病后产量损失严重的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种小麦叶锈病抗性蛋白，为如下(a)-(c)任一所示：(a)具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有抗小麦叶锈病活性的蛋白质；或(c)与(a)和(b)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
进一步地，与(a)和(b)中任一所限定的氨基酸序列具有85％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选99％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种小麦叶锈病抗性基因，为如下(a)-(d)任一所示：(a)编码上述小麦叶锈病抗性蛋白质的核苷酸序列；或(b)在严格条件下与(a)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1的小麦叶锈病抗性蛋白质的核苷酸序列；或(c)具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或(d)与(a)-(c)中限定的任一种核苷酸序列具有70％以上同源性且编码具有相同功能蛋白质的基因。
进一步地，与(a)至(c)中限定的任一种核苷酸序列具有75％以上，优选85％以上，更优选95％以上，进一步优选99％以上同源性且编码具有相同功能蛋白质的基因。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种表达盒，该表达盒包括调控序列和上述小麦叶锈病抗性基因。
进一步地，调控序列包括启动子；优选地，启动子包括如下启动子中的一种或几种：组成型、增强型、组织特异型及诱导型。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种重组载体，包含上述小麦叶锈病抗性基因或上述表达盒。
进一步地，重组载体包括翻译控制信号；优选地，翻译控制信号包括增强子；优选地，增强子包括翻译增强子和/或转录增强子；优选地，翻译控制信号来源于天然序列或人工合成序列；优选地，重组载体包括植物表达载体；优选地，植物表达载体包括农杆菌转化的双元载体和基因枪轰击的载体；优选地，植物表达载体包括pCAMBIA1300；优选地，重组载体包括报告基因；优选地，报告基因包括抗性基因或表达产生颜色变化的酶或发光化合物的基因；优选地，抗性基因包括抗生素抗性基因或化学试剂抗性基因。
为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞转化有上述重组载体；优选地，宿主细胞为非植物的宿主细胞；优选地，宿主细胞包括大肠杆菌或根瘤农杆菌；优选地，大肠杆菌包括DH5α；优选地，根瘤农杆菌包括EHA105。
上述小麦叶锈病抗性蛋白质，或者小麦叶锈病抗性基因，或者表达盒，或者重组载体，或者宿主细胞在调控植物对叶锈病的抗性、增强或降低植物对叶锈病的抗性、或培育对叶锈病的抗性增强或降低的转基因植物、或小麦抗叶锈病育种中的应用。
为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了一种制备转基因植物的方法，包括将上述小麦叶锈病抗性基因、或表达盒、或重组载体、或宿主细胞导入目的植物中，得到对叶锈病具有抗性的转基因植物。
进一步地，重组载体通过植物病毒载体、基因枪或农杆菌侵染的方法导入到目的植物中；优选地，目的植物为双子叶植物或单子叶植物；优选地，目的植物为小麦；优选地，小麦为Fielder小麦；优选地，小麦叶锈病抗性基因由组成型启动子驱动。
为了实现上述目的，根据本发明的第七个方面，提供了一种增加或降低植物对叶锈病抗性的育种方法，该方法包括：增加或降低目的植物中上述小麦叶锈病抗性蛋白质的活性或含量，使得植物对叶锈病的抗性增强或降低。
进一步地，目的植物为双子叶植物或单子叶植物；优选地，目的植物为小麦；优选地，小麦为Fielder小麦；优选地，叶锈病为叶锈菌生理小种引起的叶锈病；优选地，叶锈菌生理小种为中国流行叶锈菌毒性小种，中国流行叶锈菌毒性小种包括FHJL、PHQS、FHJR、THDB、PHRT、PHTT、THTT、HCJR或FHHM。
应用本发明的技术方案，提供了一种新的叶锈病抗性蛋白及其编码基因及应用，有助于解析抗病基因对病原菌的抗病机制的研究，提高小麦对叶锈病的抗性，为小麦分子育种提供可靠、有效的叶锈病抗源，对于小麦抗叶锈病育种具有重大的应用推广价值。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明实施例1的含有Lr47和不含有Lr47的近等基因系分别接菌叶锈病生理小种的表型结果图。
图2示出了根据本发明实施例2的叶锈病抗性基因Lr47的精细定位示意图。其中，图2中a为小麦材料Kern Lr47的7A染色体示意图；图2中b为在外源7S染色体上开发的基因组特异性的分子标记示意图，物理位置参照中国春1.0参考基因组；图2中c为利用小麦CSph1b诱导渗入的7S染色体发生部分同源染色体重组，得到发生在67.6-85.2Mb之间的关键重组体的示意图；图2中d为利用感病EMS突变体m118与野生型Kern Lr47构建的分离群体进行Lr47精细定位的连锁遗传图谱示意图；图2中e为定位的候选染色体区间在拟斯卑尔脱山羊草TS01参考基因组中的候选基因示意图。
图3示出了根据本发明实施例3的Lr47候选基因的EMS突变体验证结果图。其中，图3中a为感病突变体接菌叶锈病生理小种THDB的表型鉴定结果图；图3中b为Lr47基因结构和EMS诱导的感病突变体发生碱基/氨基酸的改变的示意图。
图4示出了根据本发明实施例4的Lr47候选基因的转基因互补验证结果图。其中图4中a为用于转基因互补验证的Lr47基因组片段示意图，包括起始密码子上游2097bp，基因全长3132bp(从ATG到TGA)和基因下游2005bp；图4中b为对照品种Fielder和部分T1代转基因植株对叶锈菌生理小种PHQS接菌培养10天后的差异表型结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
术语解释：
翻译控制信号：即蛋白质翻译控制信号，指存在于基因上游或下游，可以调控目的基因的转录从而影响蛋白质翻译的核苷酸序列，如增强子。
如背景技术所提到的，随着气候变化以及新的强毒性叶锈菌生理小种的不断出现，致使小麦品种中的抗叶锈病基因难以对新的毒性小种产生抗性而导致小麦丧失叶锈病抗性，毒性小种一旦流行，将造成重大危害，严重威胁小麦的安全生产。而利用抗叶锈病基因，培育抗病小麦新品种是控制该病害最经济有效的方法。目前，虽然已有超过80个正式命名的小麦抗叶锈病基因，但其中只有少数几个基因被成功分离克隆。因而，在本申请中发明人对来源于小麦近缘植物拟斯卑尔脱山羊草的抗叶锈病基因Lr47进行了深入研究，完成了Lr47的精细定位，分离克隆以及功能验证，发现Lr47所编码的抗性蛋白具有抗小麦叶锈病活性。在此基础上提出了本申请的一系列保护方案。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种小麦叶锈病抗性蛋白，为如下(a)-(c)任一所示：(a)具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有抗小麦叶锈病活性的蛋白质；或(c)与(a)和(b)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
上述小麦叶锈病抗性蛋白质，具有抗小麦叶锈病的活性。在(a)序列的基础上对蛋白质进行突变，取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸，若突变发生在该蛋白质的活性位点，可能会导致该蛋白质关键的氨基酸结合位点发生改变，影响该蛋白质抗小麦叶锈病的活性，导致其活性升高或降低乃至失去活性；若突变发生在该蛋白质的非活性位点，可能会影响该蛋白质的折叠方式、三维结构等性质，从而影响蛋白质的理化性质和活性。80％、85％、90％、95％、99％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，其活性位点、活性口袋、活性机制等均和(a)序列提供的蛋白质大概率相同，为通过氨基酸突变获得的同源蛋白。本申请中对于同源蛋白的“相同功能”的描述，即指抗小麦叶锈病的活性。可以通过本领域技术人员所常用的试验手段来筛选获得具有相同功能蛋白质。
本说明书中的“同源性”是指类似性(Similarity)或同一性(Identity)，特别是指同一性。“氨基酸序列的同源性”是指相对于氨基酸序列整体的同源性。氨基酸序列之间的“同一性”是指这些氨基酸序列中的种类相同的氨基酸残基的比率的总计。氨基酸之间的“类似性”是指这些氨基酸序列中的种类相同的氨基酸残基的比率与侧链的性质类似的氨基酸残基比率的总计，氨基酸序列的同源性可以利用BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)、FASTA等比对程序来确定。
如本文所用，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)，丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
取代、替换等规则，一般情况下，性质类似的氨基酸之间相互替换后的效果也类似。例如，在上述同源蛋白中，可发生保守的氨基酸替换。“保守的氨基酸替换”包括但不限于：
疏水性氨基酸(Ala、Cys、Gly、Pro、Met、Val、Ile、Leu)被其他疏水性氨基酸取代；
侧链粗大的疏水性氨基酸(Phe、Tyr、Trp)被其他侧链粗大的疏水性氨基酸取代；
侧链带正电的氨基酸(Arg、His、Lys)被其他侧链带正电的氨基酸取代；
侧链有极性不带电的氨基酸(Ser、Thr、Asn、Gln)被其他侧链有极性不带电的氨基酸取代。
本领域技术人员也可以根据现有技术中的“blosum62评分矩阵”等本领域技术人员熟知的氨基酸替换规则对氨基酸进行保守替换。
在一种优选的实施例中，与(a)和(b)中任一所限定的氨基酸序列具有85％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选99％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
上述具有同源性的蛋白质变体，与SEQ ID NO：3所示的蛋白质具有类似或相同的抗小麦叶锈病活性。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种小麦叶锈病抗性基因，为如下(a)-(d)任一所示：(a)编码上述小麦叶锈病抗性蛋白质的核苷酸序列；或(b)在严格条件下与(a)限定的DNA分子杂交且编码上述小麦叶锈病抗性蛋白质的核苷酸序列；或(c)具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；或(d)与(a)-(c)中限定的任一种核苷酸序列具有70％以上同源性且编码具有相同功能蛋白质的基因。
如本文所用的术语在“严格条件下的DNA分子杂交”，意指核苷酸序列以可检测地强于非特异性杂交的量与靶序列特异性杂交。严格性条件可以包括例如低盐和/或高温条件，例如由在约50℃至70℃的温度下约0.02M至0.1M NaCl或等同物提供的。
在一种优选的实施例中，与(a)至(c)中限定的任一种核苷酸序列具有75％以上，优选85％以上，更优选95％以上，进一步优选99％以上同源性且编码具有相同功能蛋白质的基因。
上述小麦叶锈病抗性基因，可以编码具有抗小麦叶锈病活性的蛋白质。在(a)序列的基础上对核苷酸进行突变，在严格条件下与(a)限定的DNA分子杂交，且不发生移码突变，若突变发生在编码蛋白质活性位点的核苷酸上，可能会导致编码出的蛋白质关键的氨基酸结合位点发生改变，影响该基因编码的蛋白质的抗小麦叶锈病活性，导致其活性升高或降低乃至失去活性；若突变发生在编码蛋白质非活性位点的核苷酸上，可能会影响编码蛋白质的折叠方式、三维结构等性质，从而影响蛋白质的理化性质和活性。70％、75％、85％、95％或99％以上同源性且编码具有相同功能蛋白质的小麦叶锈病抗性基因，其编码的蛋白质的活性位点、活性口袋、活性机制等均和(a)序列提供的基因大概率相同，为通过核苷酸突变获得的同源基因。
本发明的抗性亲本为Kern Lr47(PI 638739)，其携带一段来自小麦近缘物种拟斯卑尔脱山羊草的外源染色体片段，该染色体片段大小约为150Mb，易位到普通小麦Kern的7A染色体上。研究表明该外源片段内含有一个广谱的叶锈病抗性基因Lr47，对全球的叶锈菌小种都表现出高水平的抗性，但由于小麦基因组的复杂性，以及缺乏遗传学研究与基因组序列等相关信息，因此在现有技术中Lr47基因尚未被分离克隆。本申请利用大的分离群体开展精细定位，结合MutRNASeq的方法克隆到了Lr47基因，并利用独立的EMS突变体和转基因互补实验进行了功能验证。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种表达盒，该表达盒包括调控序列和上述小麦叶锈病抗性基因。
在上述表达盒中，调控序列包括但不限于启动子；优选地，启动子包括但不限于如下启动子中的一种或几种：组成型、增强型、组织特异型及诱导型。
上述表达盒，即基因表达盒，由调控序列、上述小麦叶锈病抗性基因组成，也可包含其他核酸片段。通过调控序列对上述小麦叶锈病抗性基因的转录、翻译等表达产生影响。调控序列可以是启动子、增强子、沉默子、调节蛋白附着位点等核酸片段，其中启动子可以由组成型启动子、增强型启动子、组织特异型启动子、诱导型启动子或其他类型的启动子中的一种或几种联合发挥作用，达到调控基因表达的目的。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种重组载体，该重组载体包含上述小麦叶锈病抗性基因或表达盒。
在一种优选的实施例中，优选地，重组载体包括翻译控制信号；优选地，翻译控制信号包括增强子；优选地，增强子包括翻译增强子和/或转录增强子；优选地，翻译控制信号来源于天然序列或人工合成序列；优选地，重组载体包括植物表达载体；优选地，植物表达载体包括农杆菌转化的双元载体和基因枪轰击的载体；优选地，植物表达载体包括pCAMBIA1300；优选地，重组载体包括报告基因；优选地，报告基因包括抗性基因或表达产生颜色变化的酶或发光化合物的基因；优选地，抗性基因包括抗生素抗性基因或化学试剂抗性基因。
上述重组载体，包含小麦叶锈病抗性基因或上述表达盒，也可包含其他核酸片段如复制起始位点、多克隆位点、翻译控制信号等。来源于天然序列或人工合成序列的翻译控制信号，包括增强子、分子伴侣及其他可以对蛋白质翻译产生影响的核苷酸序列。上述增强子包括翻译增强子和/或转录增强子，可以单独使用或联合发挥作用，调控蛋白质转录、翻译。上述重组载体可以为植物表达载体，可以转化入植物中，在植物中表达目的基因，产生目的蛋白质从而发挥作用；植物表达载体包括但不限于农杆菌转化的双元载体和基因枪轰击的载体，可以通过不同转化方法导入植物细胞中以提高转化效率，上述植物表达载体载体包括但不限于实施例中使用的pCAMBIA1300。
在上述重组载体中还可以包括报告基因；优选地，报告基因包括但不限于抗性基因或表达产生颜色变化的酶或发光化合物的基因，从而通过抗性筛选、颜色筛选、荧光筛选等多种方式判断重组载体是否成功转化并表达；其中抗性基因包括但不限于抗生素抗性基因或化学试剂抗性基因，可以通过抗生素、化学试剂等药品对转化的母体进行高效的筛选，判断重组载体是否成功转化并表达。从转基因安全性考虑，也可不加任何报告基因，直接以表型筛选转化是否成功。
在本申请第五种典型的实施方式中，提供了一种非植物的宿主细胞，该宿主细胞转化有上述重组载体；优选地，宿主细胞包括但不限于大肠杆菌或根瘤农杆菌；优选地，大肠杆菌包括但不限于DH5α；优选地，根瘤农杆菌包括但不限于EHA105。
上述宿主细胞中转化有重组载体，可以携带重组载体进行如重组载体拷贝、基因表达、基因整合到染色体等多种作用。宿主细胞可以为大肠杆菌、根瘤农杆菌等多种菌株，其中大肠杆菌可以为常用的DH5α，根瘤农杆菌可以为常用的EHA105。
在本申请第六种典型的实施方式中，提供了一种上述小麦叶锈病抗性蛋白质，或者小麦叶锈病抗性基因，或者表达盒，或者重组载体，或者宿主细胞在调控植物对叶锈病的抗性、增强或降低植物对叶锈病的抗性、或培育对叶锈病的抗性增强或降低的转基因植物、或小麦抗叶锈病育种中的应用。
上述应用利用小麦叶锈病抗性蛋白质、基因、表达盒、重组载体或宿主细胞，通过抗性蛋白质、抗性基因编码的蛋白质等调控植物对叶锈病的抗性；通过调控序列、翻译控制信号等增强或降低植物对叶锈病的抗性；将携带有重组载体的宿主细胞利用多种转化手段转化入母本植物中，从而培育对叶锈病的抗性增强或降低的转基因植物。
在本申请第七种典型的实施方式中，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：将上述小麦叶锈病抗性基因、或表达盒、或重组载体、或宿主细胞导入目的植物中，得到对叶锈病具有抗性的转基因植物。
在一种优选的实施例中，重组载体通过植物病毒载体、基因枪或农杆菌侵染的方法导入到目的植物中；优选地，目的植物为双子叶植物或单子叶植物；优选地，目的植物为小麦；优选地，小麦为Fielder小麦；优选地，小麦叶锈病抗性基因由组成型启动子驱动。
在上述方法中，上述重组载体通过植物病毒载体、基因枪或农杆菌侵染的方法导入到目的植物中。上述制备转基因植物的方法，利用植物病毒载体、基因枪或农杆菌侵染等多种方法，将小麦叶锈病抗性基因、表达盒、重组载体或宿主细胞导入目的植物中，得到对叶锈病的抗性增强的转基因植物。目的植物为双子叶植物或单子叶植物；优选地，单子叶植物可以为小麦，小麦的品种包括但不限于使用Fielder小麦。上述方法可以通过如建立突变体库，获得突变体家系，在抗性基因的核苷酸位点上发生突变等方式，影响小麦叶锈病抗性基因的表达、蛋白质的活性或翻译，从而得到对叶锈病的抗性降低或增强的转基因植物。
在本申请第八种典型的实施方式中，提供了一种增加或降低植物对叶锈病抗性的育种方法，该方法包括：增加或降低目的植物中小麦叶锈病抗性蛋白质的活性或含量，使得植物对叶锈病的抗性增强或降低。
上述方法，可以通过核苷酸序列突变、改变调控序列和/或翻译控制信号等方法，增加或降低目的植物中小麦叶锈病抗性蛋白质的活性或含量，从而增强或降低植物对叶锈病的抗性。
在一种优选的实施例中，目的植物为双子叶植物或单子叶植物；优选地，目的植物为小麦；优选地，小麦为Fielder小麦；优选地，叶锈病为叶锈菌生理小种引起的叶锈病；优选地，叶锈菌生理小种为中国流行叶锈菌毒性小种，中国流行叶锈菌毒性小种包括FHJL、PHQS、FHJR、THDB、PHRT、PHTT、THTT、HCJR或FHHM。
下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。
实施例1：叶锈病抗性基因Lr47的抗谱分析
在植物培养箱种植美国普通小麦材料UC1041、Express、RSI5以及携带Lr47基因的近等基因系UC1041 Lr47、Express Lr47、RSI5 Lr47。植物培养箱设置如下条件：白天22℃，夜间20℃，光照16小时，黑暗8小时，湿度80-90％。当小麦苗长至两叶一心期，采用人工扫抹法，分别接种9个不同的叶锈菌生理小种FHJL、PHQS、FHJR、THDB、PHRT、PHTT、THTT、HCJR和FHHM。接菌后黑暗保湿处理24小时，黑暗处理后保持光照2小时以上，随后植物培养箱设置正常的光周期。接菌约10天后对小麦材料进行叶锈病抗性鉴定和统计，具体按照0-4级的分级标准进行叶锈病表型的分级(即0级为免疫；0；级为近免疫；1级为高抗；2级为中抗；3级为中感；4级为高感)。如图1所示，含有抗叶锈病基因Lr47的近等基因系表现出近免疫抗性(R)，而不含有Lr47的背景材料为感病(S)。
实施例2：叶锈病抗性基因Lr47的精细定位
携带Lr47的外源7S染色体(如图2中a所示)与普通小麦的7A染色体无法发生重组交换。为了对Lr47进行精细定位，我们利用抗病亲本Kern Lr47与CSph1b突变体构建了分离群体，利用ph1b突变体诱导7S/7A部分同源染色体发生重组交换。具体操作如下：利用室内植物生长室，将Kern Lr47与感病亲本CSph1b进行杂交，获得F1，得到的F1单株自交获得F2，通过分子标记鉴定，在F2群体中选择ph1b基因纯合，同时携带7S/7A染色体的杂合单株，进行自交，获得F3。如图2中b所示，我们沿着7S外源染色体片段，开发了15个基因组特异性的分子标记。利用这些分子标记，我们筛选了2654个F3单株，得到在150Mb外源7S染色体内发生重组交换的单株，即重组体。如图2中c所示，从获得的重组体中，我们选择缩小的外源染色体基因型为7S/7A杂合型且另一侧为纯合7A的单株，接菌叶锈菌生理小种THDB，进行叶锈病表型鉴定。通过基因型结合表型，Lr47被精细定位在分子标记pku1104和pku1152之间，在普通小麦中国春的参考基因组1.0中对应的物理区间是3.5Mb(图2中c)。
随后，利用抗性亲本Kern Lr47和它的感病EMS突变体家系m118进行杂交，得到F1，获得的F1自交得到F2分离群体。同时，对Kern Lr47和m118进行重测序，生物信息学分析鉴定双亲之间的单核苷酸多态性(SNP)位点，结合拟斯卑尔脱山羊草TS01参考基因组，开发CAPS或者测序标记。利用得到的分子标记，我们筛选了1141个F2单株，结合获得的重组体的表型鉴定，将Lr47基因定位于分子标记pkus675和pkus175之间，并与分子标记pkus633和CS1100共分离(图2中d)。定位的候选区间在拟斯卑尔脱山羊草TS01参考基因组中对应的物理区间是2.5Mb，其中含有一串典型的NBS-LRR基因(图2中e)。
实施例3：感病EMS突变体以及Lr47候选基因验证
对抗病亲本Kern Lr47进行甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)化学诱变处理，处理EMS浓度为0.75％，得到4568个独立的M2突变家系。利用全天候植物生长室，对其中562个M2突变体家系进行表型鉴定，每个家系种25株苗，接种叶锈菌生理小种THDB，从中找到10个家系分离出感病单株。利用分子标记进行基因型鉴定，确定感病单株存在7S外源染色体，防止种子污染。随后，移栽感病单株，收获M3种子，进行M3单株(包括图3中a中的m1541、m178、m41、m1576、m125、m1649、m118、m1606、m152、m1599)的表型鉴定，确认这些家系都为感病表型(图3中a)。
根据中国春和拟斯卑尔脱山羊草TS01参考基因组，我们发现精细定位的候选染色体区间内都存在一串典型的NBS-LRR基因，该类型基因是最常见的抗病基因，推测Lr47可能为NBS-LRR基因。利用MutRNAseq方法，我们获得了Lr47的候选基因，具体操作如下：在接种叶锈菌的条件下，我们对Kern Lr47和它的背景材料Kern进行转录组测序，并进行denovo组装，得到转录本，并分别对转录本进行本地blastx分析注释，得到相应NBS-LRR基因的转录本。在这些转录本中，找出Kern Lr47特异的NBS-LRR转录本(与Kern中不一样)，作为参考序列。随后，对得到的10个感病突变体家系进行转录组或外显子组(exon-capture)测序，将其比对至Kern Lr47特异的NBS-LRR转录本上，分析发现有一个转录本(命名为CNL102)在10个突变体家系中均有非同义突变，其中4个是提前终止突变体(图3中b)。实验证明了该候选基因对于提供叶锈病抗性是必需的。
实施例4：Lr47候选基因的转基因互补验证
为了确定该候选基因是否能够提供叶锈病抗性，进行了候选基因的转基因互补验证。
1、互补载体p1300-Lr47的构建
为了得到候选基因CNL102的内含子、上游和下游序列，利用Kern Lr47和m118重测序数据，以及多个突变体的转录组数据，拼接得到一段包含候选基因的基因组序列，PCR扩增并测序验证了得到的序列的准确性。基于该基因组序列以及转录本序列，结合NCBI数据库BLASTN/BLASTX分析，确定了基因的结构，获得SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列和SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列，即为小麦叶锈病抗性基因(CDS)和小麦叶锈病抗性蛋白。
根据上述信息，为了进行转基因互补验证，我们构建转基因载体扩增的含有Lr47的基因组片段如SEQ ID NO：1所示，包括基因起始密码子上游2097bp，基因全长(从ATG到TGA，3132bp)和基因下游2005bp，总计7234bp的基因组序列(图4中a)。分别利用引物p1300-Lr47F1(SEQ ID NO：4)和p1300-Lr47R1(SEQ ID NO：5)，以及p1300-Lr47F2(SEQ ID NO：6)和p1300-Lr47R2(SEQ ID NO：7)进行PCR扩增，然后按照宝日生物技术(北京)有限公司的In-Fusion HD Cloning Kit试剂盒的方法将候选基因重组到线性化的pCAMBIA1300上，获得p1300-Lr47质粒。
SEQ ID NO：1：
cctcggtgaagttggcgtcgaagtgtggctgatggtgcgggtcaggttcatctgtgtggcagtccctaggtgcgggtgaaggccatcacgacggatctgatccccgcatcgattggtggttgctgcagttcctggtgtgctgaaggtggtggctggaggcgtgcttcctcggcagtgatgtgtggcttcgactgcaagtggctgcggtgttggtggtgagaggcatctttcggggctggccggaagcttggtggcgtggaaatgtgcaatgctacggatgaaaattctgttcggccttggtcggaccggcatcgatggcacccgtgggtgtcattccccttcctggaggcgccgccgagggtagcgccattgtccacgttgccttgtatcggcaaccatctccggggcgaaagccttgatccgtaggatcggcacgacggcggcgtctttctgatgttgtttctctgttgggagcttcgtgcttggagataagaggccctatgttgcgctcctccggcgtgcaccgctacccggatcgttcttctctggcgctatgtacgatcgtcgctggttctaccaaggaagctggagttgctgttcttcgatgatctccggcgtcggtcgagacgcggcgaggatatcggttttgggtaggctcttgtatgtcgtagtgtattgtcgtgtgtggtttcctttgtttgtgtcaggtgtggagttgtgctacgctcgttgttcgcagcgagaggtagatgtggttgtatggctgtatttctctccttctataaagctaaggtatgcattttgcgtaccctcgaaaaaaacacgttagtggaggctgttgctgctaatacgttagtggaggctgctttttgttttctttttttttctttttctttttgagggggttagtggagctgctgctgctaatgcgcggagagatgcgaggagacgaccgcaagtcgttcattccatttccaggtccacaaatagtttgtttccttctgtctctggctctcttcggcgactacagtggtgtcctcccaatctgcaacggcgacggcaacggcgacagcgccaaaggtactcttctactcgtctcctccccctcctctggtccatacatttctttcgatctagttagcgcacacctctcttctttttcccattccttttggttttgaagttgcagagtttgatctgctcagcagaggtgaagagttgctgttcggtgttgcggatgctcttcttcagctcctgctctcgattgacccaagtcaggtgatgcaattttttttgtgccgtccgccacaacttcagcttttgctcatcctgaaaccgattgtgttcctattacagccatgcgtgtagatccagagcgaggggagggtcagatcttgctcgatctgtttctcccctcctgattaatctcttgtttgctatgctatttttatttctgtgacgcacaaacagaaaatctggttcctggatatttttacttttacactctagttatattattgtgaaaatgttatctatgtacatcaggaaaagaaaaagaaatataagaaaaataaagcaaagagaaaaaattggtcagtggtcagagcttagtatatctatccaagctcggaggggtgctgcatcttttttctcttttcactctgtccagcttttccaaaataaataaattagtagtaccgtgagctgtttctttcacgcacctgaaatgtccagcttttgctcatccggtggtcctctgaaaacaactacagtaggatttttggttattctaatgtgaatttatgatgtgcagaactggatcttttcttcactagttcaccttggattactgttgcaaaggactctgcccattggatttgaaggagctgttattcaaggtactcttcttctactacttctttggaggaaagcaatgcataggtgcatagtgtactgttactttcaccaaccaatcaagttcaggttttcctcattctgttttctgaaaaacacaatgttttcattgcagaatttcacgccaaggacaatgctatagccgtctgtagatccagagcaaagacaaaaaaaggtcgagatatggagatcgccgctggggtgataggccctgtcatccgtaagctcggcgagctgctcgttggagaatacaacctggagaagcgagtaaagaaaggtgtacaatcgctcctaaacgagctggagatgatgcacgccgtgcttcgcaaggttggcgaggtgccatcggagcagctcgaggagccagtccggatttgggctggcaaggtgagagacctctcttgcgacatggaagacgctgttgatgacttcctggtgcgtgtggatgagggttcaagcagcaagcctacgaacatgaggaatcgagtcaagaagttcctcaagaagaccaccaaactgtttggcaagggcaaagcacttcatcaaatcagtgatgccatcaaagaagctcaggatctcgccaaggagttggcggacctgcgtagaatgtacgagcttgacactcgtagcactagcaatggtgctaccattgaccctcgtgtgttagctctgcacaaagatgtaggggagcttgttggtgttgaccagacaagggatgagcttatcaaaacactgatttgtgaggacgggagttccaaggagcaattgaagacgatctctattgttggtgttggtgggctaggcaagacaacgatcaccaaagcagtctatgagaagatcaaagcccaatttgattgtgtggcttttgtccccgtgggtcagaacccagatatcaagaaagttttcaaggacttgctctatggccttgacaatgaaaagttcagtgacattcataatacaacaagggatgaaaatctactcatcaagcaaatcagtgatttccttgtggataagaggtatgcatgacattgtccttttgtatatattttggaaatgtgtgaagtactgagatgtatactgaatttcatatcttcaatttcttatttgttatatttctatatctgtactatgttctcctttagcaaattctacttctttctttttgcgcacgcgccttatttctgttagtcctgtatacttttaagcaatttctgttgcatttcttaatctttttgcatgcatatccttagtggttgcataagcctatggtttgctttagtaccttacagttcatccttgttacaaacttcagttgtatatagattacttgccaactaatgatgtcaaaatatttggcataggtacctgatcgtgatcgatgatatatgggaagaagaaatatggagatttataaattgtgctttgtataaaaacaaactccatagtcgggtaatcacaacaacccgcaatgtgagtgtgtctgaagcatgtctctcttccagtgatgacatgattcacaaaatggaacctctttctgatgaagactcgcagatactcttccatcgaagaatatttcaaagcgaggacaaatgtccagaagatttgcatgaagtatcaagagagatattgaagaaatgtggtggtgtaccattagccatcattacaatagctagccttctagtcagtaaccaaaggataaagcagaaagaagaatggatgcatgtgcacagttcgatgggccttggagttacacaaggtggtattgtgaaggacatgaagaggatattatcactcagctattatgatttgccatctcacctgaagccttgtttgttatatctaagcatctttcctgaagactctgagattaggagagattggctgatatggaggtggcttgctgaagggtttatcctaggtgacacagaagaaactaggctgtttgagatcggagagagctacatcaacgagcttatgaacaggagcttgatccagccagcagaaatcaatgaggaaggcacggtagtaactctccgtatacatgatatggttcttgatcttatatgctcactgtcaagtgaggagaattttatctccatattagataatgctaagtggcatgcaccttatctgaaaaggaaattccgcaggctatcacttcataatatcaaggcagaggttcagagccatcattttgacagcactagcctgtcaaatgtgaggacctttgctgttttctctcctgttacctgtgattggttgccatctctctcaagcttccaatttttacgtgtgctggatcttggaaattgcggcagccgtagcagtagctctggtatcggtctcaagtatgtagggaatttaatccacctaaggtacctagggctcaaggatgcagatgtttgcgaactcccaatggacatatgcaagttgaagcttttacagacactggatataagaggcaccagtataaaagaattaccttcaagtgttgtacagctcagaaatttgatatgcctatgtgtctattatacggtgaggctgccaaaaggaatggggagcttgttgtcccttgaagtgctgcaactagtaggcttatcctcatctcctcacattgtgaaagagctgagccatctgacagaggttaggacactccgtcttgactttgataacatggacgaggatctgattgatatattaatcaagtctctaggcaaccttcacaaattgcaaaatctgcatattgttgatggtggcagattgatagatcgcatgtgtgaaagctgggtgccccctccaaacctccgttgttttgattcatgggacccctctttttcttcgtggttcttgagacttccaaagtgggttaattcaaggtcgcttccccgcctctccaccctagaaatagatgtggaagaactgcaaggggatgacattcagatcatcgggatgttgcctgctcttcggtttctgcggctgcgtgcaagtcgcgtgatgggaacgttggttgtgagggccgatgcattcccatctgcgagatgctgcatgttcagagggtttccgacggcgccatgcctttttccact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SEQ ID NO：2：
atggagatcgccgctggggtgataggccctgtcatccgtaagctcggcgagctgctcgttggagaatacaacctggagaagcgagtaaagaaaggtgtacaatcgctcctaaacgagctggagatgatgcacgccgtgcttcgcaaggttggcgaggtgccatcggagcagctcgaggagccagtccggatttgggctggcaaggtgagagacctctcttgcgacatggaagacgctgttgatgacttcctggtgcgtgtggatgagggttcaagcagcaagcctacgaacatgaggaatcgagtcaagaagttcctcaagaagaccaccaaactgtttggcaagggcaaagcacttcatcaaatcagtgatgccatcaaagaagctcaggatctcgccaaggagttggcggacctgcgtagaatgtacgagcttgacactcgtagcactagcaatggtgctaccattgaccctcgtgtgttagctctgcacaaagatgtaggggagcttgttggtgttgaccagacaagggatgagcttatcaaaacactgatttgtgaggacgggagttccaaggagcaattgaagacgatctctattgttggtgttggtgggctaggcaagacaacgatcaccaaagcagtctatgagaagatcaaagcccaatttgattgtgtggcttttgtccccgtgggtcagaacccagatatcaagaaagttttcaaggacttgctctatggccttgacaatgaaaagttcagtgacattcataatacaacaagggatgaaaatctactcatcaagcaaatcagtgatttccttgtggataagaggtacctgatcgtgatcgatgatatatgggaagaagaaatatggagatttataaattgtgctttgtataaaaacaaactccatagtcgggtaatcacaacaacccgcaatgtgagtgtgtctgaagcatgtctctcttccagtgatgacatgattcacaaaatggaacctctttctgatgaagactcgcagatactcttccatcgaagaatatttcaaagcgaggacaaatgtccagaagatttgcatgaagtatcaagagagatattgaagaaatgtggtggtgtaccattagccatcattacaatagctagccttctagtcagtaaccaaaggataaagcagaaagaagaatggatgcatgtgcacagttcgatgggccttggagttacacaaggtggtattgtgaaggacatgaagaggatattatcactcagctattatgatttgccatctcacctgaagccttgtttgttatatctaagcatctttcctgaagactctgagattaggagagattggctgatatggaggtggcttgctgaagggtttatcctaggtgacacagaagaaactaggctgtttgagatcggagagagctacatcaacgagcttatgaacaggagcttgatccagccagcagaaatcaatgaggaaggcacggtagtaactctccgtatacatgatatggttcttgatcttatatgctcactgtcaagtgaggagaattttatctccatattagataatgctaagtggcatgcaccttatctgaaaaggaaattccgcaggctatcacttcataatatcaaggcagaggttcagagccatcattttgacagcactagcctgtcaaatgtgaggacctttgctgttttctctcctgttacctgtgattggttgccatctctctcaagcttccaatttttacgtgtgctggatcttggaaattgcggcagccgtagcagtagctctggtatcggtctcaagtatgtagggaatttaatccacctaaggtacctagggctcaaggatgcagatgtttgcgaactcccaatggacatatgcaagttgaagcttttacagacactggatataagaggcaccagtataaaagaattaccttcaagtgttgtacagctcagaaatttgatatgcctatgtgtctattatacggtgaggctgccaaaaggaatggggagcttgttgtcccttgaagtgctgcaactagtaggcttatcctcatctcctcacattgtgaaagagctgagccatctgacagaggttaggacactccgtcttgactttgataacatggacgaggatctgattgatatattaatcaagtctctaggcaaccttcacaaattgcaaaatctgcatattgttgatggtggcagattgatagatcgcatgtgtgaaagctgggtgccccctccaaacctccgttgttttgattcatgggacccctctttttcttcgtggttcttgagacttccaaagtgggttaattcaaggtcgcttccccgcctctccaccctagaaatagatgtggaagaactgcaaggggatgacattcagatcatcgggatgttgcctgctcttcggtttctgcggctgcgtgcaagtcgcgtgatgggaacgttggttgtgagggccgatgcattcccatctgcgagatgctgcatgttcagagggtttccgacggcgccatgcctttttccacttggagctatgccaagggttcagcgccttcggttctgggtctctgcgcggtcgatcgtgagtggtgaggttgactgcggcatgggccacctcccttctctcgaggatgttgaggtttgtctggagcgtgagaattccagcgatgaagagatggagacagccaaggttttgctgaggcgcgcagcagaagcccatcaaaaacgtcccaccattgaaatctatgacatatga。
SEQ ID NO：3：
MEIAAGVIGPVIRKLGELLVGEYNLEKRVKKGVQSLLNELEMMHAVLRKVGEVPSEQLEEPVRIWAGKVRDLSCDMEDAVDDFLVRVDEGSSSKPTNMRNRVKKFLKKTTKLFGKGKALHQISDAIKEAQDLAKELADLRRMYELDTRSTSNGATIDPRVLALHKDVGELVGVDQTRDELIKTLICEDGSSKEQLKTISIVGVGGLGKTTITKAVYEKIKAQFDCVAFVPVGQNPDIKKVFKDLLYGLDNEKFSDIHNTTRDENLLIKQISDFLVDKRYLIVIDDIWEEEIWRFINCALYKNKLHSRVITTTRNVSVSEACLSSSDDMIHKMEPLSDEDSQILFHRRIFQSEDKCPEDLHEVSREILKKCGGVPLAIITIASLLVSNQRIKQKEEWMHVHSSMGLGVTQGGIVKDMKRILSLSYYDLPSHLKPCLLYLSIFPEDSEIRRDWLIWRWLAEGFILGDTEETRLFEIGESYINELMNRSLIQPAEINEEGTVVTLRIHDMVLDLICSLSSEENFISILDNAKWHAPYLKRKFRRLSLHNIKAEVQSHHFDSTSLSNVRTFAVFSPVTCDWLPSLSSFQFLRVLDLGNCGSRSSSSGIGLKYVGNLIHLRYLGLKDADVCELPMDICKLKLLQTLDIRGTSIKELPSSVVQLRNLICLCVYYTVRLPKGMGSLLSLEVLQLVGLSSSPHIVKELSHLTEVRTLRLDFDNMDEDLIDILIKSLGNLHKLQNLHIVDGGRLIDRMCESWVPPPNLRCFDSWDPSFSSWFLRLPKWVNSRSLPRLSTLEIDVEELQGDDIQIIGMLPALRFLRLRASRVMGTLVVRADAFPSARCCMFRGFPTAPCLFPLGAMPRVQRLRFWVSARSIVSGEVDCGMGHLPSLEDVEVCLERENSSDEEMETAKVLLRRAAEAHQKRPTIEIYDI。
p1300-Lr47F1：(SEQ ID NO：4)：
ccatgattacgaattcgagctccctcggtgaagttggcgtcgaagt。
p1300-Lr47R1：(SEQ ID NO：5)：
tcatgtccttcacaataccaccttgtgtaact。
p1300-Lr47F2：(SEQ ID NO：6)：
ggacatgaagaggatattatcactcagctattatgatttgcc。
p1300-Lr47R2：(SEQ ID NO：7)：
acggccagtgccaagcttcatgttataggcaggggcgc。
2、T0代转基因植株的获得
利用质粒提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司)，提取并纯化互补载体p1300-Lr47的质粒，转入农杆菌菌株EHA105，通过农杆菌侵染法转入普通小麦Fielder，获得了80株Lr47互补T0代转基因植株。
3、转基因植株(家系)的抗性鉴定
首先利用标记对获得的T0代互补转基因植株进行阳性鉴定，结果表明获得的80株转基因植株都是阳性材料。温室种植T0转基因植株，自交收获T1代种子。我们对T1转基因家系接种叶锈病生理小种PHQS，接菌10天后进行表型鉴定。如图4中b所示，T1代转基因植株表现出近免疫的抗病表型(2、3、4、5、6和7)，而对照Fielder(1)表现为高感。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明获得了抗叶锈病基因Lr47，有助于解析抗病基因对病原菌的抗病机制的研究；将编码Lr47蛋白的核苷酸序列导入到小麦中，能够提高小麦对叶锈病的抗性，为小麦分子育种提供了可靠、有效的叶锈病抗源。上述Lr47蛋白具有小麦叶锈病抗性，能够解决现有技术中小麦易染叶锈病、染病后产量损失严重的问题，适用于小麦育种和生物技术领域。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.一种小麦叶锈病抗性蛋白，其特征在于，为如下(a)-(c)任一所示：
(a)具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有抗小麦叶锈病活性的蛋白质；或
(c)与(a)和(b)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，与(a)和(b)中任一所限定的所述氨基酸序列具有85％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选99％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
3.一种小麦叶锈病抗性基因，其特征在于，为如下(a)-(d)任一所示：
(a)编码权利要求1所述的小麦叶锈病抗性蛋白质的核苷酸序列；或
(b)在严格条件下与(a)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述的小麦叶锈病抗性蛋白质的核苷酸序列；或
(c)具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或
(d)与(a)-(c)中限定的任一种所述核苷酸序列具有70％以上同源性且编码具有相同功能蛋白质的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，与(a)至(c)中限定的任一种所述核苷酸序列具有75％以上，优选85％以上，更优选95％以上，进一步优选99％以上同源性且编码具有相同功能蛋白质的基因。
5.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包括调控序列和权利要求3或4所述的小麦叶锈病抗性基因。
6.根据权利要求5所述的表达盒，其特征在于，所述调控序列包括启动子；
优选地，所述启动子包括如下启动子中的一种或几种：组成型、增强型、组织特异型及诱导型。
7.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3或4所述的小麦叶锈病抗性基因或权要求5或6所述的表达盒。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括翻译控制信号；
优选地，所述翻译控制信号包括增强子；
优选地，所述增强子包括翻译增强子和/或转录增强子；
优选地，所述翻译控制信号来源于天然序列或人工合成序列；
优选地，所述重组载体包括植物表达载体；
优选地，所述植物表达载体包括农杆菌转化的双元载体和基因枪轰击的载体；
优选地，所述植物表达载体包括pCAMBIA1300；
优选地，所述重组载体包括报告基因；
优选地，所述报告基因包括抗性基因或表达产生颜色变化的酶或发光化合物的基因；
优选地，所述抗性基因包括抗生素抗性基因或化学试剂抗性基因。
9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞转化有权利要求7或8所述的重组载体；
优选地，所述宿主细胞包括非植物的宿主细胞；
优选地，所述宿主细胞包括大肠杆菌或根瘤农杆菌；
优选地，所述大肠杆菌包括DH5α；
优选地，所述根瘤农杆菌包括EHA105。
10.权利要求1或2所述的小麦叶锈病抗性蛋白质，或者权利要求3或4所述的小麦叶锈病抗性基因，或者权利要求5或6所述的表达盒，或者权利要求7或8所述的重组载体，或者权利要求9所述的宿主细胞在调控植物对叶锈病的抗性、增强或降低植物对叶锈病的抗性、或培育对叶锈病的抗性增强或降低的转基因植物、或小麦抗叶锈病育种中的应用。
11.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，将
权利要求3或4所述的小麦叶锈病抗性基因、
或权利要求5或6所述的表达盒、
或权利要求7或8所述的重组载体、
或权利要求9所述的宿主细胞导入目的植物中，得到对叶锈病具有抗性的所述转基因植物。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述重组载体通过植物病毒载体、基因枪或农杆菌侵染的方法导入到所述目的植物中；
优选地，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；
优选地，所述目的植物为小麦；
优选地，所述小麦为Fielder小麦；
优选地，所述小麦叶锈病抗性基因由组成型启动子驱动。
13.一种增加或降低植物对叶锈病抗性的育种方法，其特征在于，所述方法包括：
增加或降低目的植物中权利要求1或2所述小麦叶锈病抗性蛋白质的活性或含量，使得所述植物对叶锈病的抗性增强或降低。
14.根据权利要求13所述的育种方法，其特征在于，
所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；
优选地，所述目的植物为小麦；
优选地，所述小麦为Fielder小麦；
优选地，所述叶锈病为叶锈菌生理小种引起的叶锈病；
优选地，所述叶锈菌生理小种为中国流行叶锈菌毒性小种，所述中国流行叶锈菌毒性小种包括FHJL、PHQS、FHJR、THDB、PHRT、PHTT、THTT、HCJR或FHHM。
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