CN115074381B - 调节禾本科植物株高或生物量性状的方法及应用 - Google Patents

调节禾本科植物株高或生物量性状的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种调节禾本科植物株高或生物量性状的方法及应用。所述方法包括：调节植物中OHP12或OHP5的表达或活性，所述性状包括株高、节间长度、生物量、穗长、光耐受性或发芽时间。本发明的技术方案具有操作简单，效果显著的优点，为植物株高等性状的分子设计育种提供了重要的基因资源和技术支撑。

Description

调节禾本科植物株高或生物量性状的方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术和植物学领域，更具体地，本发明涉及调节禾本科植物株高或生物量性状的方法及应用。
背景技术
株高是禾本科作物的重要经济性状之一，是作物决定生物学产量的重要农艺性状。株高影响作物种植方式、收获指数与抗倒伏能力，对作物光合作用的光能利用效率、光合产物分配起到至关重要的作用。第一次"绿色革命"利用矮化基因培育了大量抗倒伏能力、产量提高的矮化优良品种，使收获指数大大提高。
茎是植物的主要结构，支撑着叶片和花等器官，茎的伸长使植物能够适应环境并生存下来，例如细长的茎使得叶片充分地暴露在阳光下，从而最大限度地提高光能利用效率。禾本科植物的茎由节和节间组成，影响植株的高度和生产力。节间长度的调节是作物育种中一个重要的目标性状，在水稻和小麦中，由于遗传基因合成或信号转导减少而导致节间较短的半矮秆品种已经生产出来并在世界范围内广泛种植。
与抗风与破坏的矮化水稻相对比的是被称为深水水稻的抗洪水稻，节间会根据水深伸长，这种水稻在南亚和西周期性的洪水中幸存下来。近年来中国科学院亚热带农业生态研究所夏新界研究员培育出一种株形高大、茎秆粗壮的“巨人稻”，具有高产、抗倒伏、抗病虫害、耐淹涝等特点，其单穗最高结实粒数达到800粒之多”，亩产可以达到900-1100公斤，达到了现在的杂交水稻的产量水平，由于其具有超大生物量，具有能创造更高的水稻产量潜力。
激素是影响植物株高的主要内在因素，这些激素包括赤霉素(GA)、脱落酸(ABA)、生长素(IAA)、乙烯等。因此，可以通过靶向突变GA的生物合成位点，增加GA的周转，能够使水稻变矮杆型，但不影响产量。此外，类胡萝卜素可以为植物激素ABA和独角金素(Strigolactone)提供合成前体，从而影响植物的株高和株型。
因此，了解株高发育机理，发掘利用控制作物株高的基因，选育理想株型的新材料，对于提高农作物产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调节禾本科植物株高或生物量性状的方法及应用。
在本发明的第一方面，提供一种调节禾本科植物性状的方法，包括：调节植物中OHP12或OHP5的表达或活性；其中，所述性状包括株高、节间长度、生物量、穗长、光耐受性或发芽时间；所述OHP12或OHP5包括其同源物。
在一个优选例中，所述调节禾本科植物株高、节间长度、穗长、光耐受性或发芽时间包括：下调OHP12的表达或活性，从而增加株高、增加节间长度、增加生物量、增加穗长、促进发芽；或，下调OHP5的表达或活性，从而降低株高、降低节间长度、提高光耐受性、延长发芽时间。
在另一优选例中，下调OHP12或OHP5的表达或活性包括(但不限于)：在植物中敲除或沉默OHP12或OHP5的编码基因，或抑制OHP12或OHP5的活性；较佳地，包括：以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除OHP12或OHP5的编码基因、以同源重组的方法敲除OHP12或OHP5编码基因、在含有OHP12或OHP5的植物中将OHP12或OHP5进行功能丧失性突变，或以特异性干扰OHP12或OHP5的编码基因表达的干扰分子来沉默OHP12或OHP5。
在本发明的另一方面，提供OHP12或OHP5或它们的调节剂的用途，用于调节禾本科植物株高、节间长度、生物量、穗长、光耐受性或发芽时间；或用于制备调节禾本科植物株高、节间长度、生物量、穗长、光耐受性或发芽时间的试剂；其中，所述OHP12或OHP5包括其同源物。
在一个优选例中，所述的调节剂包括下调剂；较佳地，所述OHP12的下调剂用于增加禾本科植物的株高、增加节间长度、增加生物量、增加穗长、促进发芽；或，所述OHP5的下调剂用于降低禾本科植物的株高、降低节间长度、提高光耐受性、延长发芽时间。
在另一个优选例中，所述的OHP12或OHP5下调剂包括(但不限于)：敲除或沉默OHP12或OHP5的试剂，抑制OHP12或OHP5活性的试剂；较佳地，包括：针对OHP12或OHP5的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂、所述试剂将OHP12或OHP5进行功能丧失性突变，特异性干扰OHP12或OHP5的编码基因表达的干扰分子。
在另一个优选例中，所述下调OHP12包括(但不限于)：进行突变，使其第75位氨基酸的天冬酰胺突变成组氨酸；较佳地，在OHP12的CDS序列的第223位进行由A至C的碱基突变。
在另一个优选例中，所述下调OHP5包括(但不限于)：在OHP5的CDS序列的第188～189位碱基之间插入碱基T，导致其编码的蛋白提前终止；将OHP5的CDS序列的第187～189位碱基缺失，导致其编码的蛋白缺失苯丙氨酸；或，将OHP5的CDS序列的第187～188位碱基缺失，导致其编码的蛋白提前终止。
在另一个优选例中，所述的禾本科植物包括(但不限于)下组或所述OHP12或OHP5来自包括(但不限于)下组：水稻(Oryza sativa)，玉米(Zea mays)，小米(Setariaitalica)，大麦(Hordeum vulgare)，小麦(Triticum aestivum)，黍(Panicum miliaceum)，高粱(Sorghum bicolor)，黑麦(Secale cereale)，燕麦(Avena sativaL)，二穗短柄草(Brachypodium distachyum)。
在另一个优选例中，所述的OHP12或OHP5包括cDNA序列、基因组序列(gDNA)，或在它们基础上人工优化或改造的序列。
在另一个优选例中，所述的水稻包括：籼稻、粳稻。
在另一个优选例中，所述OHP12的氨基酸序列选自下组：
(i)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽；
(ii)将如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；
(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥85％，≥90％，≥95％或≥98％)，具有所述调控性状功能的多肽；
(iv)SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或，
(v)在SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。
在另一个优选例中，所述OHP5的氨基酸序列选自下组：
(i)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；
(ii)将如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；
(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥85％，≥90％，≥95％或≥98％)，具有所述调控性状功能的多肽；
(iv)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或，
(v)在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。
在本发明的另一方面，提供一种定向选择或鉴定禾本科植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中的OHP12或OHP5的表达或序列特征；若是该测试植物的OHP12低表达或不表达，或其为株型高、节间长度长、生物量大、穗的长度长、发芽早的植物；或，若是该测试植物的OHP5低表达或不表达，或其为从而株型矮、节间长度短、光耐受性高、发芽时间延长的植物。
在另一个优选例中，所述低表达或低活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的降低，如降低2％、5％、10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。
在另一优选例中，所述株型高、节间长度长、生物量大、穗的长度长、发芽早，是指与同类或同种植物的株型、节间长度、生物量、穗的长度、发芽时间相比，具有统计学意义地株型增高、节间长度增长、生物量增大、穗的长度增长、发芽时间提早。
在另一优选例中，所述株型矮、节间长度短、光耐受性高、发芽时间延长，是指与同类或同种植物的株型、节间长度、光耐受性、发芽时间相比，具有统计学意义地株型降低、节间长度降低、光耐受性提高、发芽时间延长(变晚)。
在本发明的另一方面，提供一种筛选调节禾本科植物性状的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达OHP12的体系中；(2)检测所述体系，观测其中OHP12的表达或活性，若其表达或活性降低，则表明该候选物质为可用于增加禾本科植物的株高、增加节间长度、增加生物量、增加穗长、促进发芽的物质。
在本发明的另一方面，提供一种筛选调节禾本科植物性状的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达OHP5的体系中；(2)检测所述体系，观测其中OHP5的表达或活性，若其表达或活性降低，则表明该候选物质为可用于降低禾本科植物的株高、降低节间长度、提高光耐受性、延长发芽时间的物质。
在另一优选例中，所述筛选方法中，还包括设置对照组，从而明确分辨测试组中OHP12或OHP5表达或活性与对照组的差异。
在另一优选例中，还包括设置对照组，从而明确分辨测试组中OHP12或OHP5的表达或活性与对照组的差异。
在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对OHP12或OHP5蛋白或其编码基因或它们的上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如上调剂、小分子化合物基因编辑构建物等。
在本发明的另一方面，提供一种植物细胞、组织或器官，其中含有外源的OHP12或OHP5的下调剂；较佳地，所述下调剂包括(但不限于)：敲除或沉默OHP12或OHP5的试剂，抑制OHP12或OHP5活性的试剂；更佳地，所述下调剂包括(但不限于)：针对OHP12或OHP5的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂、所述试剂将OHP12或OHP5进行功能丧失性突变，特异性干扰OHP12或OHP5的编码基因表达的干扰分子。
在一个优选例中，所述的植物细胞、组织或器官不具有繁殖能力。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、CRISPR/Cas9介导的OsOHP5和OsOHP12基因编辑；
(A)OsOHP5基因编辑靶位点模式图；
(B)OsOHP12基因编辑靶位点模式图。灰色方框表示内含子及UTR区，黑色方框表示外显子，竖线位置是基因编辑位置。
图2、野生型与突变体水稻种子的发芽表型。
图3、Osohp5和Osohp12突变体的生长表型。
图4A～B、Osohp12突变体的遗传互补(CL)转基因水稻(CLOsohp12)的表型，以野生型及突变体为对照。
图5、OsOHP5和OsOHP12蛋白的亚细胞定位。
图6、野生型和突变体的叶绿素荧光参数的光响应曲线分析。其中，Fv/Fm表示光系统II最大光化学速率，rETR(II)表示经过光系统II的线性电子传递相对速率，QA(1-qL)表示质醌的相对还原程度，Y(II)表示PSII的光量子产额，Y(NPQ)表示可调节能量耗散，NPQ表示非光化学猝灭。每个数值代表平均值±标准差(n＝5-6)。
图7、野生型和突变体跨类囊体膜质子梯度建立的比较。(A)毫秒延迟发光动力曲线图，斜线位置表示慢相状态；(B)慢相阶段曲线倾斜率，每个数值代表平均值±标准差，n＝6。星号表示差异显著(T检验，“**”代表P＜0.01)。
图8、Osohp5突变体的农艺性状分析。A、株高；B、分蘖数。
图9、野生型和突变体Osohp12的叶绿素荧光参数的光响应曲线分析。其中，Fv/Fm表示最大光合速率，rETR(II)表示线性电子传递相对速率，Y(II)表示PSII的光量子产额，NPQ表示非光化学猝灭。每个数值代表平均值±标准差(n＝5-6)。
图10A-C、OsOHP12基因对农艺性状的影响。其中，每个数值代表平均值±标准差，n＝15。星号表示差异显著(T检验，“*”代表P＜0.05，“**”代表P＜0.01，“***”代表P＜0.001)。
具体实施方式
本发明人的前期工作中，通过比较类胡萝卜素异构酶突变体和野生型在暗中表达的基因，发现两个在突变体中上调的基因；之后，本发明人获得了两种节间突变体：一种短节间突变体ohp5和一种长节间突变体ohp12，并且通过遗传互补实验，证明了所述基因参与了植株节间长度的控制。本发明人还发现，ohp12能够增加禾本科植物的生物量，ohp12能够提高植物光耐受性。此外，该两个基因还参与了发芽的调控。本发明的技术方案为禾本科植物株高等性状的分子设计育种提供了重要的基因资源和技术支撑。
术语
如本文所用，所述的“植物”包括表达OHP12或OHP5(包括其同源物)或包含OHP12或OHP5及其所参与的信号通路的植物。根据本领域的知识，表达OHP12或OHP5的植物，其内在存在如本发明所主张的作用机制，可以实现如本发明所主张的技术效果。在一些方式中，所述的植物为作物，较佳地为禾谷类作物，所述禾谷类作物为具有籽粒(穗粒)的作物。所述的“禾谷类作物”可以是禾本科植物。在一些优选方式中，所述的禾本科植物包括：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、二穗短柄草等。
如本文所用，术语“提高”、“改良”或“增强”是相互可以交换的并且在应用含义上应当意指与本文中定义的对照植物相比较，至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选的至少15％或20％、更优选25％、30％更高的调节。
关于“对照植物”，选择合适的对照植物是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应转基因植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同或属于同一类的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
如本发明所用，所述的“籽粒”是指植物的果实或种子，在水稻、玉米、小麦、大麦等作物中也称为穗粒。
如本发明所用，所述的上调、促进、提高或增强表示显著性的上调、促进、提高或增强，如上调、促进、提高或增强20％、40％、60％、80％、90％或更高。
如本发明所用，所述的下调、降低、抑制、弱化或减弱表示显著性的下调、降低、抑制、弱化或减弱，如下调、降低、抑制、弱化或减弱20％、40％、60％、80％、90％或更低。
OHP12或OHP5基因及其所编码的蛋白
在本发明中，除非特别说明，所述OHP12或OHP5蛋白包括了其同源物(同源蛋白)。所述OHP5为具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽(蛋白)。所述OHP12为具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽(蛋白)。本发明还包括具有与OHP12或OHP5蛋白相同功能的序列变异形式。
所述的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的OHP12或OHP5蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO:2所示或SEQID NO:4所示的多肽序列的同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有所述OHP12或OHP5蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。
本发明中，所述的“OHP12或OHP5蛋白”也包括它们的同源物。应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种的OHP12或OHP5蛋白，但是获自其它物种、特别是禾本科植物的与所述OHP12或OHP5蛋白高度同源(如具有70％以上，更特别80％，85％、90％、95％、甚至98％以上序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内。
来源于水稻以外其它物种的与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示序列的多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。
本发明还提供了分离的蛋白，其是OHP12或OHP5蛋白的片段或在两端添加其它蛋白或标签等形成的。
本发明还涉及编码本发明的OHP12或OHP5蛋白或其序列变异形式的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4序列的多肽，但与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的编码区序列有差别的核酸序列。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体(变体)，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。
本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或多肽编码核酸经基因工程产生的宿主细胞。
本发明中，编码本发明的多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。较佳地，所述表达载体还可选择性地加入抗性元件、筛选(选择)元件或报告基因元件，如Bar、GUS。
所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。
植物改造
本发明通过大量的系统性研究、大规模的研究筛选，鉴定到了OHP12或OHP5基因，所述基因调控株高、节间长度、生物量、穗长、光耐受性或发芽时间等性状。该两个基因的改变，并没有降低光合作用效率，没有引起植物生物量的下降，其中一个基因突变反而增加了植物的生物量。同时，本发明具有操作简单，效果显著的优点。
本发明人的前期工作中，利用基因编辑技术改变影响GA前体合成的途径，来达到控制禾本科植物的株高的目的；通过比较类胡萝卜素异构酶突变体和野生型在暗中表达的基因，发现了本发明所述的两个在突变体中上调的基因。根据本发明的具体实施例，利用基因编辑技术，敲除该两个基因，获得了两种节间突变体：一种发芽推迟、短节间突变体OsOHP5和一种发芽提早、长节间突变体OsOHP12，并且通过遗传互补实验，对这两个基因OsOHP5和OsOHP12进行了验证，证明了改变这两个基因就能明显地改变植物株高。另外，这两个基因的改变并没有影响光合作用效率，所以，没有引起植物生物量的下降，其中一个基因突变反而增加了水稻的生物量。
基于本发明人的新发现，提供了一种OHP12蛋白或OHP5蛋白或其调节剂的用途，用于：调节禾本科植物的株高、节间长度、生物量、穗长、光耐受性或发芽时间。
同时，本发明也提供了一种调控禾本科植物的株高、节间长度、生物量、穗长、光耐受性或发芽时间的方法，包括：在植物中调控OHP12或OHP5蛋白的表达或活性；其中，所述的OHP12或OHP5蛋白包括其同源物。
应理解，在得知了所述OHP12或OHP5蛋白在禾本科植物中的调控作用后，可以根据实际所需，采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的OHP12或OHP5蛋白的表达或活性，这些方法均被包含在本发明中。
可以利用OHP12或OHP5蛋白的表达或活性的上调剂来上调OHP12或OHP5蛋白的活性。所述的OHP12或OHP5蛋白的表达或活性的上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“促进”。任何可提高OHP12或OHP5蛋白的活性、提高OHP12或OHP5蛋白基因或蛋白的稳定性、上调OHP12或OHP5蛋白基因的表达、增加OHP12或OHP5蛋白的有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调OHP12或OHP5蛋白或其编码的蛋白有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。
作为一种优选的实施方式，提供一种上调植物中OHP12或OHP5蛋白的表达的方法，所述的方法包括：将OHP12或OHP5蛋白或其编码的蛋白的表达构建物或载体转入植物中。
优选地，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：
(1)将外源的本发明的多肽的编码核酸转入植物器官或组织，获得转化入所述多肽的编码核酸的植物组织或器官；和
(2)将步骤(1)获得的转入了外源的本发明的多肽的编码核酸的植物组织或器官再生成植物植株。
作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：
(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有本发明的OHP12或OHP5蛋白的编码核酸；
(s2)将植物组织或器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使所述多肽的编码核酸转入并且整合到植物细胞的染色体上；
(s3)选择出转入所述OHP12或OHP5蛋白的编码核酸的植物组织或器官；以及
(s4)将步骤(s3)中的植物组织或器官再生成植物。
本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了所述多肽的编码核酸的转基因植物。
本发明中，所述的OHP12或OHP5蛋白或其编码基因的下调剂是指任何可降低OHP12或OHP5蛋白的活性、降低OHP12或OHP5蛋白或其编码基因的稳定性、下调OHP12或OHP5蛋白的表达、减少OHP12或OHP5蛋白有效作用时间、抑制OHP12或OHP5基因的转录和翻译的物质、或降低蛋白的磷酸化/激活水平，这些物质均可用于本发明，作为对于下调OHP12或OHP5蛋白有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的下调剂是：特异性干扰OHP12或OHP5蛋白或其它信号通路基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性编辑OHP12或OHP5基因的基因编辑试剂，等等。
作为本发明的一种优选方式，提供一种下调植物中OHP12或OHP5蛋白的方法，包括对OHP12或OHP5蛋白进行靶向性地突变、基因编辑或基因重组，从而实现下调。作为一种更为具体的实施例方式，藉由上述任一的方法，使OHP12或OHP5蛋白转变为其突变体，从而使其不再发挥作用。作为一种更为具体的实施例方式，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，可以设计并找到合适的靶位点。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。本发明的实施例中提供了优选的基因编辑试剂。
作为其它可选的方式，所述下调植物中OHP12或OHP5蛋白的表达的方法可包括：(1)将干扰OHP12或OHP5基因表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。较佳地，所述方法还包括：(3)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。
可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。
与通过物理或化学诱变来筛选株高突变体的传统方法相比，本发明的技术方案具有操作简单，效果显著的优点，为植物株高的分子设计育种提供了重要的基因资源和技术支撑。
植物定向筛选及分子标记
基于本发明人的新发现，本发明提供了适用于鉴定植物性状的分子标记，即OHP12或OHP5基因；所述植物性状包括：株高、节间长度、生物量、穗长、光耐受性或发芽时间。本发明还涉及针对所述OHP12或OHP5基因设计的特异性分子标记，以及鉴定策略。
作为一种优选方式，本发明的定向选择或鉴定农艺性状被调节的植物的方法包括：鉴定测试植物体内OHP12或OHP5蛋白的表达或活性，若是该测试植物的OHP12低表达或不表达，或其为株型高、节间长度长、生物量大、穗的长度长、发芽早的植物；或，若是该测试植物的OHP5低表达或不表达，或其为从而株型矮、节间长度短、光耐受性高、发芽时间延长的植物。
根据本发明的新发现，本领域技术人员可以采用任何本领域公知的或正在发展的多种技术来进行核酸序列的分析，这些技术均可被包含在本发明中。所述的方法例如包括但不限于：测序法，PCR扩增法，探针法，杂交法，限制性酶切分析法，等位基因多态性分析法(如溶解曲线法)进行核酸序列的鉴定，等等。
本发明的鉴定方法，只需进行PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的长度，就可以准确、快速地判断待测样品的表型，成本低廉，适合于大规模鉴定，而且所需的样品量很少。如果需要，本领域技术人员能够设计出鉴定所述分子标记的引物。
获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。
本发明在分子设计育种及利用基因工程技术进行农作物品种改良等方面具有良好的应用前景。
在得知了OHP12或OHP5基因的功能以后，可以以其为分子标记物，来进行植物的定向筛选。也可基于该新发现来筛选通过调节这一机制，从而定向调控禾本科植物株高、节间长度、生物量、穗长、光耐受性或发芽时间的物质或潜在物质。
本发明提供了一种筛选调节禾本科植物性状的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达OHP12的体系中；(2)检测所述体系，观测其中OHP12的表达或活性，若其表达或活性降低，则表明该候选物质为可用于增加禾本科植物的株高、增加节间长度、增加生物量、增加穗长、促进发芽的物质。
以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。
检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术(GST-Pull Down)、双分子荧光互补实验、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术等。
经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于OHP12或OHP5蛋白或其编码基因，对禾本科植物的性状改良有调控作用的物质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
质粒构建：酶切连接法构建质粒
根据实验要求设计所需基因片段引物，设计时在F与R引物中加入合适的酶切位点(基因片段中没有的酶切位点)，用Phanta高保真酶扩增片段，电泳鉴定并切胶回收目的条带。目的条带与要连接的载体分别用相应的限制性内切酶酶切反应处理(37℃水浴锅)，酶切时间根据限制性内切酶性质来确定。酶切反应(酶切反应体系：PCR产物/质粒载体加入xμL，限制性内切酶1与限制性内切酶2各加1μL，10×FastDigest buffer加入2μL，用H2O补齐至20μL)结束后，电泳分离并割胶回收目的片段和载体(用DNA纯化回收试剂盒)，电泳确认浓度，将回收片段与载体按照一定的比例加入到含有Solution I的连接反应体系中，4℃连接过夜。次日，连接产物中加入100μL的大肠杆菌感受态中转化，在超净工作台中加入600μL的无抗液体LB培养基(10g/L Tryphtone，5g/L Yeast Extract，5g/L NaCl)，37℃摇床孵育30min，均匀涂在含有相应抗生素的LB培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，5g/L NaCl，1.5％琼脂上，37℃培养箱生长12h以上。PCR鉴定阳性克隆，阳性克隆液体培养8h提取质粒，最后测序验证克隆的正确性。
其中，酶切反应体系中PCR产物不超过0.5μg，质粒DNA不超过1μg。连接反应体系中目的片段与载体的比例在1:1-1:5之间。
质粒构建：Gateway体系构建质粒
用Gateway体系构建质粒要先将目的基因连到中间载体pDONR207载体上，引物设计时如果需要、后面的标签可去掉终止密码子。PCR产物与载体pDONR207做BP反应(BP反应体系：1μL pDONR207，3μL PCR产物，1μL BP酶)，25℃重组过夜，然后将重组产物转化至大肠杆菌感受态中，在超净工作台中加入600μL的无抗液体LB培养基，37℃摇床孵育30min，均匀涂在含有50μL/mL gent抗生素的LB培养基。37℃培养箱生长12h以上。PCR鉴定阳性克隆，相应的克隆液体培养8h提取质粒，测序验证克隆的正确性。最后将正确的克隆质粒与终载体进行LR反应(LR反应体系：100ng阳性克隆质粒，100ng终载体，1μL LR酶)，25℃重组过夜，然后转化DH5a，涂含有相应抗生素的LB培养基上。在37℃培养箱中生长12h后挑2～3个单克隆鉴定。其中，BP酶和LR酶来自Invitrogen。
质粒构建：ClonExpress II One Step Cloning Kit构建质粒
按照试剂盒的方法获得线性化载体，选取合适的两个酶切位点，对载体进行双酶切(37℃水浴锅处理)后，用胶回收试剂盒进行回收。
插入片段的扩增：在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物在5’和3’最末端分别带有与线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15～20bp)。高保真聚合酶Phanta进行扩增，电泳检测条带单一性，条带不单一时进行目的条带的割胶回收，或者重新PCR反应。
重组反应：冰上配置反应体系，在37℃反应30min，结束后，立即冰上冷却5min，反应产物可直接进行转化(克隆载体使用量为0.03pmol，最适插入片段使用量0.06pmol)，克隆的生长与鉴定同上。
大肠杆菌转化及质粒抽提
将质粒或者反应产物与大肠杆菌感受态混匀，冰上放置30min，42℃热激45s，冰上放置2min，在超净工作台中加入无菌无抗生素LB培养基500μL，在37℃摇床中复苏30-60min，转速180-200rpm。复苏后，5000rpm离心1min，倒掉部分上清后留下适量体积的液体，将液体与沉淀混匀后将菌液均匀涂到含有相应抗生素的固体LB培养基上，37℃培养箱培养12h以上。
大肠杆菌菌液质粒的提取按照Plasmid Mini Kit I(OMEGA)提供的操作步骤进行操作，提取完成后存于-20℃保存。
原核表达及纯化和抗体制备
将测序检验正确的阳性克隆转化至用于原核表达的BL21或者Rosetta大肠杆菌感受态中，挑取2-3个克隆分别接种在含有相应抗生素的液体培养基中培养过夜，第二天按照1：100的比例转接在新的培养基中，在OD600达到0.5-0.6时加入0.1mM的IPTG诱导培养，可以在16℃/28℃/37℃条件下诱导3h/9h/12h，诱导结束后取出1mL的菌液离心后沉淀用1/20菌液体积的Bugbuster溶液重悬并在37℃摇床摇30min，随后在4℃下12,000rcf离心30min分离上清与沉淀，将上清与沉淀在加入相应量的5×SDS上样缓冲液(250mM pH6.8 Tris-HCl，50％Glycerol，10％SDS，0.25％溴酚蓝，1％2-ME)，煮沸5min，12,000rpm离心10min，取上清用SDS PAGE电泳分离。电泳结束后考马斯亮蓝染液染色(考马斯亮蓝染色液：10％乙酸，45％甲醇，45％水，0.25％R-250)并脱色(考马斯亮蓝脱色液：7％乙酸，40％甲醇，53％水)，根据表达蛋白的大小判定位置，依据该条带的量判断并调整诱导表达的条件，最终选择最佳表达条件来大量诱导表达。
高压破碎菌体。每升菌液离心后收集的菌体用约15mL的裂解缓冲液(非变性蛋白裂解缓冲液：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH8.0；变性蛋白裂解缓冲液：8M尿素，50mMNaH2PO4，300mM NaCl，pH8.0)重悬混匀，4℃下进行高压破碎。破碎所得液体于4℃下12,000rcf离心20min后，经0.45μm滤器过滤后于冰上静置。同时装柱(1L菌液大约用1mL的Ni-NTA His Bind树脂)，用前先用裂解缓冲液平衡柱子，随后加入样品，使样品靠自身重力流过层析柱，并收集流出液再重复该步骤约2次。该过程需要在4℃条件下进行。
层析柱的洗脱。样品与Ni-NTA His Bind树脂结合后用4倍体积的裂解缓冲液清洗2次，随后用含有不同浓度咪唑的裂解缓冲液洗脱层析柱，咪唑浓度从低到高：10mM、20mM、50mM、80mM、1000mM、120mM、150mM，洗脱体积4-8mL，洗脱后收集液分管装。
用SDS-PAGE检测洗脱收集液中目的蛋白的蛋白量以及杂蛋白情况，选取量足够且纯度足够的样品送于攸归(上海)生物科技有限公司制备抗体。
抗体检测。提取野生型及相应材料的总蛋白，通过Western blot检测在不同效价下的显影情况，最终确定最佳稀释倍数用于后续实验。
农杆菌转化
-80℃取出农杆菌感受态室温下融化，35-50μL感受态加入5-10μL待转化质粒，混匀后冰上放置25-30min，液氮速冻1-2min，37℃水浴保温5min后，在超净工作台中加入1mLLB无抗液体培养基，于28℃摇床复苏3-4h，转速180rpm，复苏后的农杆菌经4500rpm离心10min，留100μL培养基悬浮菌体，将悬浮菌液均匀涂在含有相应抗性的固体LB培养基上，28℃培养箱培养2-3d。
植物组织DNA的提取
取待提样品少量叶片放于1.5mL的离心管中，放入钢珠，加入50-100μL的Lysis提取液(250mM pH7.5 Tris-HCl，250mM NaCl，25mM pH8.0 EDTA，0.5％SDS)，用全自动样品快速研磨仪(上海净信科技)磨碎材料，加入Lysis提取液两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，-20℃中放置30min后12,000rpm离心30min，弃上清，待干燥后用水溶解DNA，震荡混匀后12,000rpm离心30min，吸取上清转移至新的离心管中。
色素含量的鉴定
将待测定的样品叶片去除叶脉后切碎，称取约0.1g鲜重浸泡在2mL的80％的丙酮中于暗中过夜，第二天经离心后取上清用分光光度计(UV-2450，Shimadzu Europe)在663.6、646.6、440.5nm的波长处测量，根据公式(Chl a＝12.25*A663.6-2.55*A646.6，Chl b＝20.31*A646.6-4.91*A663.6，Chl a+b＝17.76*A646.6+7.34*A663.6，Car＝4.69*A440.5-0.267*Chla+b)计算即可(Arnon and D.，1949；Zhao等，2016)色素浓度单位μg/ml。
叶绿素荧光参数的测定
将生长状态良好的植物材料用PAM 2000(Walz，Effeltrich，Germany)荧光仪测定不同光强下的光合参数(非光化学猝灭NPQ，PSII最大光合速率Fv/Fm)。具体操作参照PAM2000使用操作说明。
毫秒延迟发光动力学测定
叶绿素毫秒延迟发光由光合实验室研制的转盘磷光仪进行测定，测定时将样品放入避光样品室，测定样品生长状态良好。
基因序列
Osohp5野生型CDS序列(日本晴)(SEQ ID NO:1)
atggcggcgacagctacacttgctgccccctccttcttggcacatcagtcgatcttgagccacaagcctctgaggaagcttggtctatccctggaactgccaagaaccagatctgtcaaaattagagctgcaaagctgcctgcaggggttgaggtgccgaggaagcagccaaagctgagtgagcccttcctgggtttcaccaggactgcagagatatggaactccagggcctgcatgattggcctcattggcaccttcatcgtggagctggtgctgaacaagggcattcttcagatgattggtgtggaagtcggcaagggacttgatctccctctttaa
Osohp5氨基酸序列(日本晴)(SEQ ID NO:2)
MAATATLAAPSFLAHQSILSHKPLRKLGLSLELPRTRSVKIRAAKLPAGVEVPRKQPKLSEPFLGFTRTAEIWNSRACMIGLIGTFIVELVLNKGILQMIGVEVGKGLDLPL*
Osohp12野生型CDS序列(日本晴)(SEQ ID NO:3)
atgacgttattaatctccatagttcaaccaccatccctcctggcaatccaattccaacccctccagaacaacagattcaagaggaataatcctgccatctcagcaagagcaagaactgtcagagctagggcagcagagctcccagcaggagttgtggtgccaagggagcagcccaagctgagtgagccattcctagggttcaccaagactgcagaggtttggaactctagggcctgcatgattggtctcattggggttttcattgtggagctggtgctgagcaagggtgttcttcagacaattggactggaagtggggaaaggactcgatcttccactgtag
Osohp12氨基酸序列(日本晴)(SEQ ID NO:4)
MTLLISIVQPPSLLAIQFQPLQNNRFKRNNPAISARARTVRARAAELPAGVVVPREQPKLSEPFLGFTKTAEVWNSRACMIGLIGVFIVELVLSKGVLQTIGLEVGKGLDLPL*
实施例1、通过CRISPR/Cas9基因编辑构建日本晴Osohp5和Osohp12突变体
本发明人在前期研究中发现，水稻类胡萝卜素异构酶突变体中OsOHP5与OsOHP12两个基因在暗中显著上调，它们功能还有待于阐明。本发明人采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除日本晴(Nipponbare)OsOHP5与OsOHP12基因，构建基因编辑载体的引物序列见表1。
表1、CRISPR/Cas9技术敲除引物
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结果，本发明人获得Osohp5和Osohp12突变体，测序表明在敲除OsOHP5基因时本发明人获得三个不同株系的突变体(图1A)：
Osohp5.1突变体：在第二个外显子位置即CDS序列从ATG起始的第188位碱基和第189位碱基之间插入碱基T，导致编码蛋白质紊乱提前终止；
Osohp5.2突变体：在第二个外显子位置即CDS序列ATG起始的第187-189位置的碱基(TTC)缺失导致突变体编码的蛋白缺失苯丙氨酸；
Osohp5.3突变体：在第二个外显子位置即CDS序列从ATG起始的第187和188位置的碱基(TT)缺失，致编码的蛋白质紊乱提前终止。
Osohp12突变体测序表明，在敲除OsOHP12基因时本发明人获得一个突变体，在第二个外显子位置即CDS序列的第223个碱基位置发生由A碱基变成C碱基的碱基突变，最终导致突变体编码的第75个氨基酸位置的天冬酰胺突变成组氨酸(图1B)。
实施例2、Osohp5和Osohp12突变体的表型
本实施例中，本发明人对突变体植物的种子进行发芽分析，取等数的种子于相同环境下发芽，观察发芽状况。
如图2所示，本发明人发现Osohp5突变体的发芽所需时间要慢于野生型，虽然露白时间与野生型相同，但是在5天后野生型胚芽已经较长时，Osohp5突变体的发芽情况与野生型第4天时的发芽情况类似。而Osohp12突变体明显要快于野生型，在第四天时胚芽已经显著长于野生型。
总之，相较于野生型而言，Osohp5突变体与Osohp12突变体发芽时间长短有相反的趋势，前者要慢于野生型，后者却快于野生型。
在水稻正常培养条件下(6-10月种植于试验田)，Osohp5突变体的3个株系表型一致，因此接下来实验所用的材料都是Osohp5.3突变体，后续简称Osohp5。在大田中Osohp12突变体有肉眼可观察到的表型，株高明显高于野生型；同时，其生物量有显著增加(图3)。
禾本科植物的茎由节和节间组成，影响植株的高度和生产力，节间长度的调节是作物育种中一个重要的目标性状。本发明人比较了野生型和突变体的节间长度。
经分析，本发明人发现，在Osohp5突变体中节间长度比野生型短，其中第一节间比野生型的短了大约20％、第二节间比野生型的短了大约10％；而Osohp12突变体的节间长度长于野生型，其中第一节间比野生型的长了大约20％、第二节间比野生型的长了大约60％，长同时比野生型的节数多了两节，野生型和突变体茎秆节间长度比较结果如表2。
表2
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注：从结穗的下一节开始被认为是第一节，随后一节是第二节。
为了验证确认OsOHP12基因的突变体，本发明人构建含有OsOHP12基因自身启动子的载体，用来互补(CL)Osohp12突变体。互补后代表型出现分离，种植大田后，本发明人获得几个表型回复的株系，即株型明显矮于Osohp12突变体(图4A-B)。
由此可以判断，Osohp12突变体的性状变化是由OsOHP12基因突变后所引起的。
实施例3、OsOHP5和OsOHP12蛋白定位于叶绿体
为进一步了解这两个基因的功能，本发明人对其进行亚细胞定位分析。克隆两个基因的全长连接到p2GWY7(C-YFP)载体上，转化原生质体，激光共聚焦显微镜观察OsOHP5和OsOHP12蛋白的亚细胞定位。
结果如图5显示，OsOHP5和OsOHP12蛋白均定位于叶绿体中。
实施例4、Osohp5突变体光合活性分析
OsOHP5蛋白经证实定位于叶绿体，为了进一步了解OsOHP5基因的功能，本发明人在获得Osohp5突变体之后先对其进行光合活性的分析。利用PAM2000测量生长在大田三个月的苗子，分析叶绿素荧光参数。
如图6所示，在Osohp5突变体中的PSII的最大光合速率(Fv/Fm)几乎没有受到影响，但是突变体的经过光系统II的线性电子传递速率(rETR)在不同光照条件下都明显高于野生型，同时非光化学猝灭(NPQ)在不同光照条件下显著高于野生型。NPQ可以进一步分为可调节(Y(NPQ))和非调节(Y(NO))能量耗散两部分，其中可调节(Y(NPQ))能量耗散在光照强度低于500μmol photons m-2sec-1时，突变体与野生型相差不大，但是在光强增大的时候突变体开始明显高于野生型。该结果提示，Osohp5突变体对于高光胁迫的耐受要高于野生型。
以上结果说明，突变体中的热耗散能力高于野生型的，由于热耗散能力与跨类囊体膜质子梯度密切相关，本发明人用实验室搭建的毫秒级延迟发光仪检测突变体的跨类囊体膜质子梯度的变化。
图7A是毫秒延迟发光的动力曲线图，斜线的倾斜率可以用来表示ΔpH的高低；图7B是相应的统计结果，发现突变体的ΔpH诱导速度明显高于野生型。
实施例5、Osohp5突变体的农艺性状分析
前面研究表明，Osohp5突变体的最大光合速率受到的影响不大，另外，从表型看来，Osohp5突变体的生物量和野生型没有太大的区别。接着下来，本发明人观察统计分析田间生长的突变体的农艺性状是否发生了变化。
从图8A-B可以看出，Osohp5突变体有矮化的表型，与野生型相比株高降低8％，分蘖数没有发生变化。
由此可见，OsOHP5基因的突变对农艺性状有显著影响，这表明OsOHP5基因对于植株的株高性状、产量性状有显著的调控作用。
实施例6、Osohp12突变体光合活性分析
OsOHP12蛋白经证实定位于叶绿体，经蛋白序列比对与OsOHP5蛋白同源性很高，但是在株型上两个突变体差异很大。为了进一步了解OsOHP12基因的功能，本发明人在获得Osohp12突变体之后先对其进行光合活性的分析。利用PAM2000测量培养箱用营养液培养三周的苗子，分析叶绿素荧光参数。
如图9所示，在Osohp12突变体中的PSII的最大光化学效率几乎没有受到影响，非光化学猝灭(NPQ)在不同光照条件下都显著低于野生型，并且突变体的NPQ在光照强度小于500μmol photons m-2sec-1时已达到最大值，在光强大于500μmol photons m-2sec-1时突变体的NPQ不能再增大。同时，Osohp12突变体PSII的光量子产额也要低于野生型，并且突变体的经过光系统II的电子传递速率在不同光照条件下都显著低于野生型。
实施例7、突变体Osohp12的农艺性状分析
为了进一步评估Osohp12突变体，本发明人观察统计分析了田间生长的Osohp12突变体的农艺性状是否发生变化。从图10可以看出，Osohp12突变体有明显变高的表型(图10A)，与野生型相比Osohp12突变体的株高增加41.33％，分蘖数没有发生显著变化(图10B)，主穗长度明显高于野生型(图10C)，其中主穗长较之野生型增长约42.7％。
由此可见，OsOHP12基因的突变对农艺性状有显著影响，基因突变后植株株高以及穗长都高于野生型。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心
<120> 调节禾本科植物株高或生物量性状的方法及应用
<130> 210264
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 339
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 1
atggcggcga cagctacact tgctgccccc tccttcttgg cacatcagtc gatcttgagc 60
cacaagcctc tgaggaagct tggtctatcc ctggaactgc caagaaccag atctgtcaaa 120
attagagctg caaagctgcc tgcaggggtt gaggtgccga ggaagcagcc aaagctgagt 180
gagcccttcc tgggtttcac caggactgca gagatatgga actccagggc ctgcatgatt 240
ggcctcattg gcaccttcat cgtggagctg gtgctgaaca agggcattct tcagatgatt 300
ggtgtggaag tcggcaaggg acttgatctc cctctttaa 339
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 2
Met Ala Ala Thr Ala Thr Leu Ala Ala Pro Ser Phe Leu Ala His Gln
1 5 10 15
Ser Ile Leu Ser His Lys Pro Leu Arg Lys Leu Gly Leu Ser Leu Glu
20 25 30
Leu Pro Arg Thr Arg Ser Val Lys Ile Arg Ala Ala Lys Leu Pro Ala
35 40 45
Gly Val Glu Val Pro Arg Lys Gln Pro Lys Leu Ser Glu Pro Phe Leu
50 55 60
Gly Phe Thr Arg Thr Ala Glu Ile Trp Asn Ser Arg Ala Cys Met Ile
65 70 75 80
Gly Leu Ile Gly Thr Phe Ile Val Glu Leu Val Leu Asn Lys Gly Ile
85 90 95
Leu Gln Met Ile Gly Val Glu Val Gly Lys Gly Leu Asp Leu Pro Leu
100 105 110
<210> 3
<211> 342
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 3
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ctccagaaca acagattcaa gaggaataat cctgccatct cagcaagagc aagaactgtc 120
agagctaggg cagcagagct cccagcagga gttgtggtgc caagggagca gcccaagctg 180
agtgagccat tcctagggtt caccaagact gcagaggttt ggaactctag ggcctgcatg 240
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attggactgg aagtggggaa aggactcgat cttccactgt ag 342
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<211> 113
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 4
Met Thr Leu Leu Ile Ser Ile Val Gln Pro Pro Ser Leu Leu Ala Ile
1 5 10 15
Gln Phe Gln Pro Leu Gln Asn Asn Arg Phe Lys Arg Asn Asn Pro Ala
20 25 30
Ile Ser Ala Arg Ala Arg Thr Val Arg Ala Arg Ala Ala Glu Leu Pro
35 40 45
Ala Gly Val Val Val Pro Arg Glu Gln Pro Lys Leu Ser Glu Pro Phe
50 55 60
Leu Gly Phe Thr Lys Thr Ala Glu Val Trp Asn Ser Arg Ala Cys Met
65 70 75 80
Ile Gly Leu Ile Gly Val Phe Ile Val Glu Leu Val Leu Ser Lys Gly
85 90 95
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Leu
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<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 5
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 引物(Primer)
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<213> 引物(Primer)
<400> 8
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<212> DNA
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<400> 9
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<212> DNA
<213> 引物(Primer)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 引物(Primer)
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<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 17
aaacaggaag ggctcactca gcttc 25

Claims (14)

1.一种调节禾本科植物性状的方法，包括：调节植物中OHP12或OHP5的表达或活性；其中，所述性状包括株高、节间长度、生物量、穗长、光耐受性或发芽时间；所述OHP12的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示；所述OHP5的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述禾本科植物为水稻；
所述调节禾本科植物株高、节间长度、穗长、光耐受性或发芽时间包括：
下调OHP12的表达或活性，从而增加株高、增加节间长度、增加生物量、增加穗长、促进发芽；或
下调OHP5的表达或活性，从而降低株高、降低节间长度、提高光耐受性、延长发芽时间。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，下调OHP12或OHP5的表达或活性包括：在植物中敲除或沉默OHP12或OHP5的编码基因，或抑制OHP12或OHP5的活性。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，下调OHP12或OHP5的表达或活性包括：以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除OHP12或OHP5的编码基因、以同源重组的方法敲除OHP12或OHP5编码基因、在含有OHP12或OHP5的植物中将OHP12或OHP5进行功能丧失性突变，或以特异性干扰OHP12或OHP5的编码基因表达的干扰分子来沉默OHP12或OHP5。
4.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述下调OHP12包括：进行突变，使其第75位氨基酸的天冬酰胺突变成组氨酸。
5.如权利要4所述的方法，其特征在于，在OHP12的CDS序列的第223位进行由A至C的碱基突变。
6.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述下调OHP5包括：在OHP5的CDS序列的第188～189位碱基之间插入碱基T，导致其编码的蛋白提前终止；将OHP5的CDS序列的第187～189位碱基缺失，导致其编码的蛋白缺失苯丙氨酸；或，将OHP5的CDS序列的第187～188位碱基缺失，导致其编码的蛋白提前终止。
7. OHP12或OHP5或它们的调节剂的用途，用于调节禾本科植物株高、节间长度、生物量、穗长、光耐受性或发芽时间；或用于制备调节禾本科植物株高、节间长度、生物量、穗长、光耐受性或发芽时间的试剂；其中，所述OHP12的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示；所述OHP5的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述禾本科植物为水稻；所述的调节剂为下调剂，其用于增加禾本科植物的株高、增加节间长度、增加生物量、增加穗长、促进发芽，或用于降低禾本科植物的株高、降低节间长度、提高光耐受性、延长发芽时间；所述的OHP12或OHP5下调剂为敲除或沉默OHP12或OHP5的试剂或抑制OHP12或OHP5活性的试剂，包括：针对OHP12或OHP5的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂、所述试剂将OHP12或OHP5进行功能丧失性突变，特异性干扰OHP12或OHP5的编码基因表达的干扰分子。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述下调OHP12包括：进行突变，使其第75位氨基酸的天冬酰胺突变成组氨酸。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，在OHP12的CDS序列的第223位进行由A至C的碱基突变。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述下调OHP5包括：在OHP5的CDS序列的第188～189位碱基之间插入碱基T，导致其编码的蛋白提前终止；将OHP5的CDS序列的第187～189位碱基缺失，导致其编码的蛋白缺失苯丙氨酸；或，将OHP5的CDS序列的第187～188位碱基缺失，导致其编码的蛋白提前终止。
11. 一种定向选择或鉴定禾本科植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中的OHP12或OHP5的表达或序列特征；若是该测试植物的OHP12低表达或不表达，则其为株型高、节间长度长、生物量大、穗的长度长、发芽早的植物；或，若是该测试植物的OHP5低表达或不表达，则其为从而株型矮、节间长度短、光耐受性高、发芽时间延长的植物；所述OHP12的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示；所述OHP5的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述禾本科植物为水稻。
12. 一种筛选调节禾本科植物性状的物质的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达OHP12的体系中；(2)检测所述体系，观测其中OHP12的表达或活性，若其表达或活性降低，则表明该候选物质为可用于增加禾本科植物的株高、增加节间长度、增加生物量、增加穗长、促进发芽的物质；所述OHP12的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示；所述OHP5的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述禾本科植物为水稻。
13. 一种筛选调节禾本科植物性状的物质的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达OHP5的体系中；(2)检测所述体系，观测其中OHP5的表达或活性，若其表达或活性降低，则表明该候选物质为可用于降低禾本科植物的株高、降低节间长度、提高光耐受性、延长发芽时间的物质；所述OHP12的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示；所述OHP5的氨基酸序列如SEQ IDNO: 2所示；所述禾本科植物为水稻。
14. 一种植物细胞、组织或器官，其中含有外源的OHP12或OHP5的下调剂；所述下调剂包括：针对OHP12或OHP5的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂、所述试剂将OHP12或OHP5进行功能丧失性突变，特异性干扰OHP12或OHP5的编码基因表达的干扰分子；所述OHP12的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示；所述OHP5的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述禾本科植物为水稻；所述的植物细胞、组织或器官不具有繁殖能力。
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light-harvesting complex-like protein OHP1, chloroplastic [Oryza sativa Japonica Group]，NCBI Reference Sequence: XP_015620142.1;unknown;《NCBI》;全文 *
light-harvesting complex-like protein OHP1, chloroplastic [Oryza sativa Japonica Group]，NCBI Reference Sequence: XP_015638262.1;unknown;《NCBI》;全文 *

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