CN114686460A - 调控禾谷类植物粒宽的基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种调控禾谷类植物粒宽的基因及其应用。经过大规模的研究筛选，克隆获得一种新型的与调控植物籽粒粒型相关的基因GS2，其功能缺失会导致籽粒粒宽变窄，表明其本身为一种具有增加籽粒粒宽功能的基因。本发明为植物的籽粒性状改良提供了新途径。

Description

调控禾谷类植物粒宽的基因及其应用
技术领域
本发明属于植物育种领域，更具体地，本发明涉及调控禾谷类植物粒宽的基因及其应用。
背景技术
进入21世纪，随着人口的膨胀和可耕地面积的日趋减少，如何在有限的耕地上种出更多的粮食，一直是农业工作者的研究重心。目前，传统育种的方法已不能满足这一需求，综合利用多种分子生物学及分子标记辅助育种等手段可以帮助人们最大程度提升作物产量。因此研究调节农作物株型、优化农作物种植的手段，是非常重要的工作。
禾本科植物，特别是水稻，是世界主要粮食作物，稻米也是中国居民的主要食粮和重要的出口农产品。水稻作为世界上最重要的粮食作物之一，近年来成为科技工作者的重要研究材料。
中国是一个水稻生产和消费大国，水稻对保障我国粮食安全具有重要作用。栽培稻被分为两大亚种：粳稻和籼稻。经过长期的人工选择，亚洲栽培稻从普通野生稻驯化而来。研究表明，粳稻最早是由一小部分野生稻在中国南方驯化而来，而籼稻则是由驯化的粳稻与一些当地的野生稻进一步杂交，从而从中国扩散到东亚和南亚等地区。根据粳稻的种植地区以及其它的农艺性状，又被分为热带粳稻和温带粳稻两种亚型。在这些过程中，许多农艺性状，如落粒性的降低，从匍匐生长到直立生长，种子壳色等都发生了变化。同时，在这么多年的进化过程中，许多栽培品种为了适应当地的气候环境或者增加产量，它们的遗传基础又进一步得到改良。典型的籼稻是长粒，温带粳稻的籽粒为短圆形；与温带粳稻相比，热带粳稻(又名爪哇稻)是大粒、大穗、每穗粒数增加、以及剑叶较宽。
随着人们生活水平提高，对米质的要求不仅要口味适合，而且要外形美观，尤其是在国际市场上特别突出。水稻谷粒的长、宽、长/宽和千粒重直接决定着稻米的长、宽、长/宽和粒重，而这些性状恰好是组成稻米品质及饮食喜好的重要部分。
在水稻中，目前克隆的GW5是控制粒宽的主效基因，其具有一个核定位信号和一个精氨酸富集结构域，与任何已知功能的蛋白都不具有同源性，进一步研究发现GW5通过参与泛素蛋白酶体途径来调控水稻种子粒型。同时组织切片观察发现，粒宽的增加主要在于外稃上表皮细胞数量增加，从而导致外稃增大。在水稻的5号染色体上，除了GW5之外，还有一个GS5，GS5对籽粒的灌浆速率、粒宽和千粒重均有影响。GS5编码一个丝氨酸羧基肽酶(serine carboxypeptidase)，作为一个粒型的正调控因子影响水稻的千粒重。GS3是一个在籼稻中控制粒长的主效基因，GS3基因编码232个氨基酸，具有4个已知功能的区域和结构域，其中最重要的结构域是第97～117位氨基酸构成的跨膜区，以及C端类似于VWFC模体的半胱氨酸富集区。GW2是一个控制粒宽的主效基因，研究发现GW2基因编码一个含有425个氨基酸残基的多肽，含有与锌指蛋白相似的蛋白序列，具有E3泛素连接酶活性,参与降解促进细胞分裂的蛋白途径，GW2缺失导致粒宽的增加。GW8是一个可以同时影响水稻品质和产量的重要基因，是控制水稻种子大小的正调控因子，它能促进细胞分裂和增加稻米粒重。千粒重基因TGW6编码一个IAA-葡萄糖水解酶基因(indole-3-acetic acid-glucose hydrolaseactivity)，TGW6不仅直接控制胚乳的长度，而且还间接参与源到库的碳水化合物的运输，通过调节细胞数目，最终影响到籽粒长度和千粒重。控制大粒的GLW7是通过增加粒长和粒厚来增加千粒重的。
育种领域中，已经将一些基因与籽粒粒型或产量性状密切相关，但是随着人们需求水平的提高，开发表型进一步改良的植物新品种仍然是本领域亟待进行的。
发明内容
本发明的目的在于提供调节禾谷类植物的籽粒粒型的基因及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种GS2蛋白或其调节剂的用途，用于调节禾谷类植物的籽粒粒型。
在一个优选例中，所述的GS2蛋白包括其同源物。
在另一优选例中，所述调节剂为上调剂，所述GS2蛋白或其上调剂用于增加籽粒的粒宽。
在另一优选例中，所述的上调剂包括：过表达所述GS2蛋白的表达盒或表达构建物(包括表达载体)；或，提高所述GS2蛋白翻译效率的表达盒或表达构建物；或，与所述GS2蛋白相互作用、从而提高其表达或活性的上调剂。
在另一优选例中，所述的调节剂为下调剂，其用于增加籽粒的粒长、降低籽粒的粒宽。
在另一优选例中，所述下调剂包括：敲除或沉默GS2蛋白的编码基因的试剂，抑制GS2蛋白活性的试剂；较佳地，所述下调剂包括：针对所述GS2蛋白的编码基因的基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将GS2蛋白进行功能丧失性突变；或，特异性干扰GS2蛋白的编码基因表达的干扰分子(如siRNA，shRNA等)。
在本发明的另一方面，提供一种调控禾谷类植物的籽粒粒型的方法，包括：在植物中调控GS2蛋白的表达或活性。
在一个优选例中，所述调控为增加籽粒的粒宽；所述方法包括：在植物中上调GS2蛋白的表达或活性；较佳地，所述在植物中上调GS2蛋白的表达或活性包括：在植物中过表达GS2蛋白；或，以与GS2蛋白相互作用的上调剂进行调控，从而提高GS2蛋白的表达或活性。
在另一优选例中，所述调控为增加籽粒的粒长、降低籽粒的粒宽；所述方法包括：在植物中下调GS2蛋白的表达或活性；较佳地，所述在植物中下调GS2蛋白的表达或活性包括：在植物中敲除或沉默GS2蛋白的编码基因，或抑制GS2蛋白的活性；较佳地包括：以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除GS2蛋白的编码基因；以同源重组的方法敲除GS2蛋白的编码基因；以特异性干扰GS2蛋白编码基因表达的干扰分子来沉默；或将GS2蛋白进行功能丧失性突变。
在另一优选例中，所述禾谷类作物为表达GS2蛋白或其同源物的植物；较佳地，所述的禾谷类作物包括禾本科植物；较佳地，所述禾谷类作物包括选自(但不限于)：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、二穗短柄草。
在另一优选例中，所述的禾谷类植物是GS2蛋白相对低表达(如显著低于该种植物的该基因的表达水平)或不表达的植物，其通过提高GS2蛋白的表达或活性，提高增加籽粒的粒宽。
在另一优选例中，所述的GS2的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(i)多肽功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％，≥95％、≥98％或≥99％)，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或(v)在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。
在本发明的另一方面，提供GS2蛋白或其编码基因的用途，用作鉴定禾谷类植物籽粒粒型的分子标记物。
在本发明的另一方面，提供一种定向选择或鉴定禾谷类植物籽粒粒型的方法，包括：鉴定测试植物体内GS2蛋白的表达或活性，若该测试植物中GS2蛋白的表达或活性高于或等于该类植物(对照植物)中GS2蛋白的表达或活性的平均值，则其为籽粒粒宽增加的禾谷类植物；若该测试植物中GS2蛋白的表达或活性低于该类植物(对照植物)中GS2蛋白的表达或活性的平均值，则其为籽粒的粒长增加、籽粒的粒宽降低的禾谷类植物。
在一个优选例中，所述高表达或高活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。
在另一优选例中，所述低表达或低活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。
在另一优选例中，所述粒长或粒宽“增加”是指与同类或同种植物的量相比，有统计学意义的增加，如增加2％、5％、10％、20％、40％、60％、80％、90％或更多。
在另一优选例中，所述粒宽“降低”是指与同类或同种植物的量相比，有统计学意义的降低，如降低2％、5％、10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。
在本发明的另一方面，提供一种筛选促进禾谷类植物性状改良的物质(潜在物质)的方法，所述性状改良包括：籽粒粒型的改良；所述方法包括：(1)将候选物质加入到表达GS2蛋白的体系中；(2)检测所述体系，观测其中GS2蛋白的表达或活性，若其表达或活性提高(显著提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高)，则表明该候选物质为增加禾谷类植物籽粒的粒宽的物质；若表达或活性降低(显著降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低)，则表明该候选物质为增加禾谷类植物的粒长、降低籽粒的粒宽的物质。
在一个优选例中，所述方法还包括：设置不添加所述候选物质的对照组，从而明确分辨测试组中所述GS2蛋白表达或活性与对照组的差异。
在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对所述GS2蛋白或其编码基因或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如上调剂、小分子化合物基因编辑构建物等。
在本发明的另一方面，提供一种植物细胞、组织或器官，其中含有外源的GS2蛋白的上调剂，所述上调剂包括选自：过表达所述GS2蛋白的表达盒或表达构建物(包括表达载体)；或提高所述GS2蛋白翻译效率的表达盒或表达构建物；或与所述GS2蛋白相互作用、从而提高其表达或活性的上调剂。
在一个优选例中，所述的植物细胞、组织或器官不具有繁殖能力。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、CRISPR/Cas9编辑系统的骨架质粒(A)，构建质粒(B)的示意图，以及基因编辑后碱基变异的测序结果(C)。
图2、GWAS分析的GS2的位点。GS2位点的候选基因为LOC_Os02g09910。
图3、GS2编辑后的水稻种子变长，变窄。DJ WT，为东京的野生型(Dongjing)；CR1，CR2，CR3分别为三个独立的经过CRISPR/Cas9编辑后造成移码突变的后代。
具体实施方式
本发明人经过大规模的研究筛选，克隆获得了一种新型的与调控植物籽粒粒型相关的基因GS2，其功能缺失会导致籽粒粒宽变窄，表明其本身为一种具有增加籽粒粒宽功能的基因。本发明为植物的籽粒性状改良提供了新途径。
术语
如本文所用，所述的“植物”包括表达GS2或包含GS2及其所参与的信号通路的植物。根据本领域的知识，表达GS2的植物，其内在存在如本发明所主张的作用机制，可以实现如本发明所主张的技术效果。在一些优选方式中，所述的植物为作物，较佳地为禾谷类作物，所述禾谷类作物为具有籽粒(穗粒)的作物。所述的“禾谷类作物”可以是禾本科植物。较佳地，所述的禾本科植物包括：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、二穗短柄草等。
如本文所用，术语“提高”、“改良”或“增强”是相互可以交换的并且在应用含义上应当意指与本文中定义的对照植物相比较，至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选的至少15％或20％、更优选25％、30％更高的调节。
关于“对照植物”，选择合适的对照植物是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应转基因植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同或属于同一类的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
如本发明所用，所述的“籽粒”是指植物的果实或种子，在水稻、玉米、小麦、大麦等作物中也称为穗粒。
GS2基因及其所编码的蛋白
在本发明中，除非特别说明，所述GS2蛋白包括了其同源物(同源蛋白)。所述GS2为具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽(蛋白)。本发明还包括具有与GS2蛋白相同功能的序列变异形式。
所述的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的GS2蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO:2所示的多肽序列的同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有所述GS2蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。
本发明中，所述的“GS2蛋白”也包括它们的同源物。应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种的GS2蛋白，但是获自其它物种、特别是禾本科植物的与所述GS2蛋白高度同源(如具有70％以上，更特别80％，85％、90％、95％、甚至98％以上序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内。
来源于水稻以外其它物种的与SEQ ID NO:2所示序列的多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。
本发明还提供了分离的蛋白，其是GS2蛋白的片段或在两端添加其它蛋白或标签等形成的。
本发明还涉及编码本发明的GS2蛋白或其序列变异形式的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2序列的多肽，但与SEQ ID NO:3所示的基因组序列或SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体(变体)，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。
本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或多肽编码核酸经基因工程产生的宿主细胞。
本发明中，编码本发明的多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。较佳地，所述表达载体还可选择性地加入抗性元件、筛选(选择)元件或报告基因元件，如Bar、GUS。
所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。
植物改造
本发明通过大量的系统性研究、大规模的研究筛选，鉴定到了GS2基因，此基因调控粒宽。通过CRISPR/cas9技术对此基因进行编辑，得到了粒宽改变的材料。
具体的实施例中，本发明人通过靶向编辑GS2基因使之缺失，之后观测性状变化。结果显示，GS2基因缺失植株与野生型植株的籽粒相比，粒宽变窄，因此，GS2基因本身为一种促进籽粒变宽的基因。
基于本发明人的新发现，提供了一种GS2蛋白或其调节分子的用途，用于：调节禾谷类植物的籽粒粒型。
同时，本发明也提供了一种调控禾谷类植物的籽粒粒型的方法，包括：在植物中调控GS2蛋白的表达或活性；其中，所述的GS2蛋白包括其同源物。
应理解，在得知了所述GS2蛋白在禾谷类植物的籽粒粒型调控中的作用后，可以根据实际所需，采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的GS2蛋白的表达或活性，这些方法均被包含在本发明中。
可以利用GS2蛋白的表达或活性的上调剂来上调GS2蛋白的活性。所述的GS2蛋白的表达或活性的上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“促进”。任何可提高GS2蛋白的活性、提高GS2蛋白基因或蛋白的稳定性、上调GS2蛋白基因的表达、增加GS2蛋白的有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调GS2蛋白或其编码的蛋白有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。
作为一种优选的实施方式，提供一种上调植物中GS2蛋白的表达的方法，所述的方法包括：将GS2蛋白或其编码的蛋白的表达构建物或载体转入植物中。
优选地，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：
(1)将外源的本发明的多肽的编码核酸转入植物器官或组织，获得转化入所述多肽的编码核酸的植物组织或器官；和
(2)将步骤(1)获得的转入了外源的本发明的多肽的编码核酸的植物组织或器官再生成植物植株。
作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：
(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有本发明的GS2蛋白的编码核酸；
(s2)将植物组织或器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使所述多肽的编码核酸转入并且整合到植物细胞的染色体上；
(s3)选择出转入所述GS2蛋白的编码核酸的植物组织或器官；以及
(s4)将步骤(s3)中的植物组织或器官再生成植物。
本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了所述多肽的编码核酸的转基因植物。
作为一种可选择的方式，敲除所述GS2基因的5’UTR上的上游开放阅读框(upstream open reading frame；uORF)，提高所述GS2基因翻译效率的表达盒或表达构建物。uORF广泛存在于真核生物mRNA中，其为一种翻译调控元件。通常，uORF的翻译优先于mORF(主要开放阅读框)，导致mORF翻译受阻。本发明中，靶向敲除所述GS2基因的5’UTR上的uORF，从而可有效提高所述GS2蛋白翻译效率，提高其表达。
本发明中，所述的GS2蛋白或其编码基因的下调剂是指任何可降低GS2蛋白的活性、降低GS2蛋白或其编码基因的稳定性、下调GS2蛋白的表达、减少GS2蛋白有效作用时间、抑制GS2基因的转录和翻译的物质、或降低蛋白的磷酸化/激活水平，这些物质均可用于本发明，作为对于下调GS2蛋白有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的下调剂是：特异性干扰GS2蛋白或其它信号通路基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性编辑GS2基因的基因编辑试剂，等等。
作为本发明的一种优选方式，提供一种下调植物中GS2蛋白的方法，包括对GS2蛋白进行靶向性地突变、基因编辑或基因重组，从而实现下调。作为一种更为具体的实施例方式，藉由上述任一的方法，使GS2蛋白转变为其突变体，从而使其不再发挥作用。作为一种更为具体的实施例方式，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，可以设计并找到合适的靶位点。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。本发明的实施例中提供了优选的基因编辑试剂。
作为其它可选的方式，所述下调植物中GS2蛋白的表达的方法可包括：(1)将干扰GS2基因表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。较佳地，所述方法还包括：(3)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。
可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。
植物定向筛选及分子标记
基于本发明人的新发现，本发明提供了适用于鉴定籽粒粒型的植物的分子标记，即GS2基因。本发明还涉及针对所述GS2基因设计的特异性分子标记，以及鉴定策略。
因此，本发明提供了一种定向选择或鉴定农艺性状被调节的植物的方法，包括：鉴定测试植物体内GS2蛋白的表达或活性，若该测试植物中GS2蛋白的表达或活性高于该类植物(对照植物)中GS2蛋白的表达或活性的平均值，则其为籽粒粒宽增加的植物；或，若该测试植物中GS2蛋白的表达或活性低于该类植物(对照植物)中GS2蛋白的表达或活性的平均值，则其为籽粒粒宽变窄/籽粒增长的植物。
根据本发明的新发现，本领域技术人员可以采用任何本领域公知的或正在发展的多种技术来进行核酸序列的分析，这些技术均可被包含在本发明中。所述的方法例如包括但不限于：测序法，PCR扩增法，探针法，杂交法，限制性酶切分析法，等位基因多态性分析法(如溶解曲线法)进行核酸序列的鉴定，等等。
本发明的鉴定方法，只需进行PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的长度，就可以准确、快速地判断待测样品的表型，成本低廉，适合于大规模鉴定，而且所需的样品量很少。如果需要，本领域技术人员能够设计出鉴定所述分子标记的引物。
获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。
本发明在分子设计育种及利用基因工程技术进行农作物品种改良等方面具有良好的应用前景。
在得知了GS2基因的功能以后，可以以其为分子标记物，来进行植物的定向筛选。也可基于该新发现来筛选通过调节这一机制，从而定向调控籽粒粒型的物质或潜在物质。
本发明提供了一种筛选促进禾谷类植物性状改良的物质(潜在物质)的方法，所述性状改良包括：籽粒粒宽增加；该方法包括：(1)将候选物质加入到表达GS2蛋白的体系中；(2)检测所述体系，观测其中GS2蛋白的表达或活性，若其表达或活性提高，则表明该候选物质为促进禾谷类植物籽粒粒宽增加的物质。
本发明提供了一种筛选促进禾谷类植物性状改良的物质(潜在物质)的方法，所述性状改良包括：籽粒粒宽变窄或籽粒粒长增加；该方法包括：(1)将候选物质加入到表达GS2蛋白的体系中；(2)检测所述体系，观测其中GS2蛋白的表达或活性，若其表达或活性降低，则表明该候选物质为促进禾谷类植物籽粒粒宽变窄或籽粒粒长增加的物质。
以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。
检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术(GST-Pull Down)、双分子荧光互补实验、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术等。
经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于GS2蛋白或其编码基因，对禾谷类植物的籽粒性状改良有调控作用的物质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
1、材料
本发明人收集了382份水稻粳稻材料，大约每份种36株。收获种子后测量水稻粒长，进行GWAS分析。种子的饱满度会影响粒长、粒宽，在种子完全成熟后，单株收种用于粒型考察。
每个单株随机取100粒左右的种子，去芒后使用扫描仪进行粒型扫描。得到的扫描图像使用“种子大米外观品质检测软件”计算每个种子的长度和宽度，计算平均值。
2、GS2基因及其编码的蛋白序列
GS2基因的CDS序列(SEQ ID NO:1)：
ATGGATCGCCCGCCGCATCTCGTCATCGACCTCAACGAGGAGCCCGAGCCGGCGCCGTGCGAGACGCCCCCTCCCGCCCCCGCCCCCGCCCCAGCGCCCGCGCCGCCGCCCGTTCCAGCGGCGGCGGTGGCGGCTCCTCTTCCTCTTTTCCCGGCGCAGCCGACGGCCCCGGCCGCCGTGGGCGGCGCCGTGGTGAGCCAGGTGGGGATGCTTCCTTACGAGGCGCGTGAGGTGGCGATGGGGATCCATCGGGACGCGGTGGCGCAGGCGCAGGCGCTGAGGGTGGCGGCGGCGAGCGCGATCGAGTCGGTGACGGCGAGGGCGCCGCCGTTCGGGCCGCCGGCGGCGCGGCACCCGGGGGAGGCAGGGCGTGGGAACCCGCCGCCCCCGTGCGCGGCGTGCGGCCTCCCCGAGAACCCCGGGGGGACCATCGTCTGCGACTCCTGCGAGCGCGGGTTCCACCTCGCCTGCGTCCGCGTCTGGCCGCCGCTCATGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGGCCCCCCCCGGCGCGCGTCGGCCCCGCGCCACCGCCAACGAGGACTGGATATGCCCCGAGTGCGAGATGCGTGGCGCCCGCACCAACAGGTGGAAGCTCGGCCCCGTGCCGCTCGACATCAACGTGCCCCCGCCGAGCACCCCGGACGCGGAGGACCCCGTCGCCGTCGCCACCAGAGACGTCACCAGGCAGTTATCTCAGCTCTCATTTCCTCAACTCCTTTTGCTTACGGCTGACTTGATCCGTTGGTCTAAAAAGTGCTGA
GS2蛋白序列(SEQ ID NO:2)：
MDRPPHLVIDLNEEPEPAPCETPPPAPAPAPAPAPPPVPAAAVAAPLPLFPAQPTAPAAVGGAVVSQVGMLPYEAREVAMGIHRDAVAQAQALRVAAASAIESVTARAPPFGPPAARHPGEAGRGNPPPPCAACGLPENPGGTIVCDSCERGFHLACVRVWPPLMPPPPPPPAPPGARRPRATANEDWICPECEMRGARTNRWKLGPVPLDINVPPPSTPDAEDPVAVATRDVTRQLSQLSFPQLLLLTADLIRWSKKC
GS2的基因组序列(SEQ ID NO:3)：
>LOC_Os02g09910GCTTTGCTCGTGCTTTGCTTTGCTTGTTGCTCTCCTCGCGTGAGCTCTCTCCTCCTCTTCTCCCCCACCCGCCTCCTCCTCCTCCTCCTGCTGCTGCTGGGGCGAGGCGATGCCCTAGATCGTAGCCCTAGAACGAGCTTGCGCGGCGAAGCCCCGATCCCCCACACCATTCCCGGAAATGGATCGCCCGCCGCATCTCGTCATCGA CCTCAACGAGGAGCCCGAGCCGGCGCCGTGCGAGACGCCCCCTCCCGCCCCCGCCCCCGCCCCAGCGCCCGCGCCGC CGCCCGTTCCAGCGGCGGCGGTGGCGGCTCCTCTTCCTCTTTTCCCGGCGCAGCCGACGGCCCCGGCCGCCGTGGGC GGCGCCGTGGTGAGCCAGGTGGGGATGCTTCCTTACGAGGCGCGTGAGGTGGCGATGGGGATCCATCGGGACGCGGT GGCGCAGGCGCAGGCGCTGAGGGTGGCGGCGGCGAGCGCGATCGAGTCGGTGACGGCGAGGGCGCCGCCGTTCGGGC CGCCGGCGGCGCGGCACCCGGGGGAGGCAGGGCGTGGGAACCCGCCGCCCCCGTGCGCGGCGTGCGGCCTCCCCGAG AACCCCGGGGGGACCATCGTCTGCGACTCCTGCGAGCGCGGGTTCCACCTCGCCTGCGTCCGCGTCTGGCCGCCGCT CATGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGGCCCCCCCCGGCGCGCGTCGGCCCCGCGCCACCGCCAACGAGGACTGGATAT GCCCCGAGTGCGAGATGCGTGGCGCCCGCACCAACAGGTGGAAGCTCGGCCCCGTGCCGCTCGACATCAACGTGCCC CCGCCGAGCACCCCGGACGCGGAGGACCCCGTCGCCGTCGCCACCAGAGACGTCACCAGGCAGTTATCTCAGCTCTC ATTTCCTCAACTCCTTTTGCTTACGGCTGACTTGATCCGTTGGTCTAAAAAGTGCTGAAAATTCATGCCGCCTTGCGATGAAATGCTGGTGCTCTGCAGATGGTATTCTTGGTGGGACTAAGCCACACCCGTTAGCGTGGGATGACGCTATGAACCCTTTTTTGTTATGGTTGATGTTTTAATTCATTGTTTGCCATGGTTACAGACTTAATATGTGTGTTACGTTTATCTGCTCTGTTTGACTGTTGATGCATTTGGATCTTAGTCCTGTTGCATGATTGATGCCGAAATGACTGGGTTTCAATTCTATAGTTAGCACTATGTGGCAGTGGCCTTAGTCTTTTTATAGC
实施例1、GS2基因的鉴定
本发明人从世界各地收集到了382份粳稻材料(其中包括342份温带粳稻和40份热带粳稻)，结合用全基因组关联分析(Genome-Wide Association Study，简称GWAS)，分析粳稻群体的粒长、粒宽和千粒重等性状。
经过大量的研究、比较和实验，本发明人分析鉴定出二号染色体一个新的位点，此位点鉴定获得与籽粒性状密切相关，尤其与籽粒的粒宽有关(图2)。
实施例2、靶向编辑GS2基因使之缺失后的性状变化
1、CRISPR/Cas9编辑
基因编辑系统用的是华南农业大学刘耀光课题组的编辑系统，双元载体骨架(LB—RB非T-DNA序列)为pCAMBIA-1300(ACCESSION:AF234296)(Ma X et al.A RobustCRISPR/Cas9 System for Convenient，High-Efficiency Multiplex Genome Editing inMonocot and Dicot Plants.Mol Plant.20158(8):1274-84)。骨架质粒的示意图如图1A。
基因编缉技术，用的以下CRISPR/Cas9编辑系统，双靶点敲除，启动子分别使用OsU3和OsU6a(Ma X et al.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient，High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants.MolPlant.20158(8):1274-84)。构建质粒的示意图如图1B。
所用CRISPR/Cas9编辑的靶序列为：
靶点1序列：TCTCGTCATCGACCTCAACG(SEQ ID NO:4)；
所用引物：
2ZF-U3-F：ggcaTCTCGTCATCGACCTCAACG(SEQ ID NO:5)；
2Zf-U3-R：aaacCGTTGAGGTCGATGACGAGA(SEQ ID NO:6)。
靶点2序列：TGGCGCCCGCACCAACAGG(SEQ ID NO:7)；
所用引物：
2ZF-U6a-F：gccgTGGCGCCCGCACCAACAGG(SEQ ID NO:8)；
2ZF-U6a-R：aaacCCTGTTGGTGCGGGCGCCA(SEQ ID NO:9)。
上述引物经退火后形成双链，连入前述CRISPR载体中，通过农杆菌介导的遗传转化法，转入野生型水稻品种Dongjing中，通过分子生物学检测获得纯合突变植株。
检测结果显示，基因编辑后靶点2相应区段缺失了四个碱基：TGGCGCCCGCAC(CAAC缺失)AGG(图1C)。
CRISPR/Cas9编辑GS2基因后，造成了移码突变，具体发生在GS2，造成其C端氨基酸的缺失。
2、GS2基因缺失植株与野生型的比较
种植转基因植物以及野生型植物，直至成熟，收获籽粒，观察CR1、CR2和CR3的粒型，并与野生型植株的籽粒粒型进行比较。
结果如图3所示，GS2基因缺失植株与野生型植株的籽粒相比，与对照相比种子显著变长，粒宽显著变窄。
因此，GS2基因本身为一种促进籽粒变宽的基因。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心
<120> 调控禾谷类植物粒宽的基因及其应用
<130> 20A639
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 780
<212> DNA
<213> 稻(Oryza sativa L)
<400> 1
atggatcgcc cgccgcatct cgtcatcgac ctcaacgagg agcccgagcc ggcgccgtgc 60
gagacgcccc ctcccgcccc cgcccccgcc ccagcgcccg cgccgccgcc cgttccagcg 120
gcggcggtgg cggctcctct tcctcttttc ccggcgcagc cgacggcccc ggccgccgtg 180
ggcggcgccg tggtgagcca ggtggggatg cttccttacg aggcgcgtga ggtggcgatg 240
gggatccatc gggacgcggt ggcgcaggcg caggcgctga gggtggcggc ggcgagcgcg 300
atcgagtcgg tgacggcgag ggcgccgccg ttcgggccgc cggcggcgcg gcacccgggg 360
gaggcagggc gtgggaaccc gccgcccccg tgcgcggcgt gcggcctccc cgagaacccc 420
ggggggacca tcgtctgcga ctcctgcgag cgcgggttcc acctcgcctg cgtccgcgtc 480
tggccgccgc tcatgccgcc gccgccgccg ccgccggccc cccccggcgc gcgtcggccc 540
cgcgccaccg ccaacgagga ctggatatgc cccgagtgcg agatgcgtgg cgcccgcacc 600
aacaggtgga agctcggccc cgtgccgctc gacatcaacg tgcccccgcc gagcaccccg 660
gacgcggagg accccgtcgc cgtcgccacc agagacgtca ccaggcagtt atctcagctc 720
tcatttcctc aactcctttt gcttacggct gacttgatcc gttggtctaa aaagtgctga 780
<210> 2
<211> 259
<212> PRT
<213> 稻(Oryza sativa L)
<400> 2
Met Asp Arg Pro Pro His Leu Val Ile Asp Leu Asn Glu Glu Pro Glu
1 5 10 15
Pro Ala Pro Cys Glu Thr Pro Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Ala Pro Pro Pro Val Pro Ala Ala Ala Val Ala Ala Pro Leu Pro
35 40 45
Leu Phe Pro Ala Gln Pro Thr Ala Pro Ala Ala Val Gly Gly Ala Val
50 55 60
Val Ser Gln Val Gly Met Leu Pro Tyr Glu Ala Arg Glu Val Ala Met
65 70 75 80
Gly Ile His Arg Asp Ala Val Ala Gln Ala Gln Ala Leu Arg Val Ala
85 90 95
Ala Ala Ser Ala Ile Glu Ser Val Thr Ala Arg Ala Pro Pro Phe Gly
100 105 110
Pro Pro Ala Ala Arg His Pro Gly Glu Ala Gly Arg Gly Asn Pro Pro
115 120 125
Pro Pro Cys Ala Ala Cys Gly Leu Pro Glu Asn Pro Gly Gly Thr Ile
130 135 140
Val Cys Asp Ser Cys Glu Arg Gly Phe His Leu Ala Cys Val Arg Val
145 150 155 160
Trp Pro Pro Leu Met Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro Gly
165 170 175
Ala Arg Arg Pro Arg Ala Thr Ala Asn Glu Asp Trp Ile Cys Pro Glu
180 185 190
Cys Glu Met Arg Gly Ala Arg Thr Asn Arg Trp Lys Leu Gly Pro Val
195 200 205
Pro Leu Asp Ile Asn Val Pro Pro Pro Ser Thr Pro Asp Ala Glu Asp
210 215 220
Pro Val Ala Val Ala Thr Arg Asp Val Thr Arg Gln Leu Ser Gln Leu
225 230 235 240
Ser Phe Pro Gln Leu Leu Leu Leu Thr Ala Asp Leu Ile Arg Trp Ser
245 250 255
Lys Lys Cys
<210> 3
<211> 1250
<212> DNA
<213> 稻(Oryza sativa L)
<400> 3
gctttgctcg tgctttgctt tgcttgttgc tctcctcgcg tgagctctct cctcctcttc 60
tcccccaccc gcctcctcct cctcctcctg ctgctgctgg ggcgaggcga tgccctagat 120
cgtagcccta gaacgagctt gcgcggcgaa gccccgatcc cccacaccat tcccggaaat 180
ggatcgcccg ccgcatctcg tcatcgacct caacgaggag cccgagccgg cgccgtgcga 240
gacgccccct cccgcccccg cccccgcccc agcgcccgcg ccgccgcccg ttccagcggc 300
ggcggtggcg gctcctcttc ctcttttccc ggcgcagccg acggccccgg ccgccgtggg 360
cggcgccgtg gtgagccagg tggggatgct tccttacgag gcgcgtgagg tggcgatggg 420
gatccatcgg gacgcggtgg cgcaggcgca ggcgctgagg gtggcggcgg cgagcgcgat 480
cgagtcggtg acggcgaggg cgccgccgtt cgggccgccg gcggcgcggc acccggggga 540
ggcagggcgt gggaacccgc cgcccccgtg cgcggcgtgc ggcctccccg agaaccccgg 600
ggggaccatc gtctgcgact cctgcgagcg cgggttccac ctcgcctgcg tccgcgtctg 660
gccgccgctc atgccgccgc cgccgccgcc gccggccccc cccggcgcgc gtcggccccg 720
cgccaccgcc aacgaggact ggatatgccc cgagtgcgag atgcgtggcg cccgcaccaa 780
caggtggaag ctcggccccg tgccgctcga catcaacgtg cccccgccga gcaccccgga 840
cgcggaggac cccgtcgccg tcgccaccag agacgtcacc aggcagttat ctcagctctc 900
atttcctcaa ctccttttgc ttacggctga cttgatccgt tggtctaaaa agtgctgaaa 960
attcatgccg ccttgcgatg aaatgctggt gctctgcaga tggtattctt ggtgggacta 1020
agccacaccc gttagcgtgg gatgacgcta tgaacccttt tttgttatgg ttgatgtttt 1080
aattcattgt ttgccatggt tacagactta atatgtgtgt tacgtttatc tgctctgttt 1140
gactgttgat gcatttggat cttagtcctg ttgcatgatt gatgccgaaa tgactgggtt 1200
tcaattctat agttagcact atgtggcagt ggccttagtc tttttatagc 1250
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 4
tctcgtcatc gacctcaacg 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 5
ggcatctcgt catcgacctc aacg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 6
aaaccgttga ggtcgatgac gaga 24
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 7
tggcgcccgc accaacagg 19
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 8
gccgtggcgc ccgcaccaac agg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 9
aaaccctgtt ggtgcgggcg cca 23

Claims (14)

1.一种GS2蛋白或其调节剂的用途，用于调节禾谷类植物的籽粒粒型。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调节剂为上调剂，所述GS2蛋白或其上调剂用于增加籽粒的粒宽。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的上调剂包括：过表达所述GS2蛋白的表达盒或表达构建物；或，提高所述GS2蛋白翻译效率的表达盒或表达构建物；或，与所述GS2蛋白相互作用、从而提高其表达或活性的上调剂。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的调节剂为下调剂，其用于增加籽粒的粒长、降低籽粒的粒宽。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述下调剂包括：敲除或沉默GS2蛋白的编码基因的试剂，抑制GS2蛋白活性的试剂；较佳地，所述下调剂包括：针对所述GS2蛋白的编码基因的基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将GS2蛋白进行功能丧失性突变；或，特异性干扰GS2蛋白的编码基因表达的干扰分子。
6.一种调控禾谷类植物的籽粒粒型的方法，包括：在植物中调控GS2蛋白的表达或活性。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述调控为增加籽粒的粒宽；所述方法包括：在植物中上调GS2蛋白的表达或活性；较佳地，所述在植物中上调GS2蛋白的表达或活性包括：在植物中过表达GS2蛋白；或，以与GS2蛋白相互作用的上调剂进行调控，从而提高GS2蛋白的表达或活性。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述调控为增加籽粒的粒长、降低籽粒的粒宽；所述方法包括：在植物中下调GS2蛋白的表达或活性；较佳地，所述在植物中下调GS2蛋白的表达或活性包括：在植物中敲除或沉默GS2蛋白的编码基因，或抑制GS2蛋白的活性；较佳地包括：以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除GS2蛋白的编码基因；以同源重组的方法敲除GS2蛋白的编码基因；以特异性干扰GS2蛋白编码基因表达的干扰分子来沉默；或将GS2蛋白进行功能丧失性突变。
9.如权利要求1或6所述，其特征在于，所述禾谷类作物为表达GS2蛋白或其同源物的植物；较佳地，所述的禾谷类作物包括禾本科植物；较佳地，所述禾谷类作物包括选自：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、二穗短柄草。
10.如权利要求1或6所述，其特征在于，所述的GS2的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(i)多肽功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的同源性≥85％，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或(v)在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。
11.GS2蛋白或其编码基因的用途，用作鉴定禾谷类植物籽粒粒型的分子标记物。
12.一种定向选择或鉴定禾谷类植物籽粒粒型的方法，包括：鉴定测试植物体内GS2蛋白的表达或活性，若该测试植物中GS2蛋白的表达或活性高于或等于该类植物中GS2蛋白的表达或活性的平均值，则其为籽粒粒宽增加的禾谷类植物；若该测试植物中GS2蛋白的表达或活性低于该类植物中GS2蛋白的表达或活性的平均值，则其为籽粒的粒长增加、籽粒的粒宽降低的禾谷类植物。
13.一种筛选促进禾谷类植物性状改良的物质的方法，所述性状改良包括：籽粒粒型的改良；所述方法包括：(1)将候选物质加入到表达GS2蛋白的体系中；(2)检测所述体系，观测其中GS2蛋白的表达或活性，若其表达或活性提高，则表明该候选物质为增加禾谷类植物籽粒的粒宽的物质；若表达或活性降低，则表明该候选物质为增加禾谷类植物的粒长、降低籽粒的粒宽的物质。
14.一种植物细胞、组织或器官，其中含有外源的GS2蛋白的上调剂，所述上调剂包括选自：过表达所述GS2蛋白的表达盒或表达构建物；或提高所述GS2蛋白翻译效率的表达盒或表达构建物；或与所述GS2蛋白相互作用、从而提高其表达或活性的上调剂。
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