CN114573669A

CN114573669A - 蛋白质Ghd7在调控植物抗低氮性中的应用

Info

Publication number: CN114573669A
Application number: CN202011374156.8A
Authority: CN
Inventors: 王青; 粘金沯; 苏青梅; 陈凡; 林少扬; 谢先芝; 左建儒
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: CN114573669B

Abstract

本发明公开了蛋白质Ghd7在调控植物抗低氮性中的应用。蛋白质Ghd7为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.1所示的蛋白质；a2)在序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同生物学功能的蛋白质；a4)与序列表中SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于水稻且具有相同生物学功能的蛋白质。蛋白质Ghd7正调控植物对低氮胁迫的抗性，过量表达Ghd7基因增强植物对低氮胁迫的耐受性。

Description

蛋白质Ghd7在调控植物抗低氮性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及蛋白质Ghd7在调控植物抗低氮性中的应用。

背景技术

在过去的五十多年，由于种质资源的创新、栽培管理的优化和商品化肥的使用，作物产量得到了持续提高。但是，随着人口的持续增长和消费需求的不断提高，使得高产作物品种的产量表现及其稳定性，尤其是过度依赖使用化肥而带来的增产，在未来将面临更加严峻的挑战。工业革命之后，随着氮肥的大面积使用，全世界范围内农作物产量迅速增加，但同时造成农业生产成本增加、土壤养分失衡和生态环境污染等问题。因此，由包括国际水稻所在内的15个研究中心组成的国际农业研究磋商组织提出了通过以改良养分利用效率而提高作物产量为目标的第二次绿色革命。提高农作物氮素利用效率(nitrogen-useefficiency，NUE)成为实现农业可持续发展的有效途径之一。

氮元素是所有生命活动所必需的营养元素之一，植物为自然界氮循环提供了最初氮来源。植物从土壤中获取氮素涉及多个偶连的生物学过程，包括氮素的吸收和转运，氮素的同化以及氮素的再利用等。植物主要通过铵根转运蛋白(ammonium transporters，AMTs)和硝酸根转运蛋白(nitrate transporters，NRTs)分别从土壤中吸收无机态的铵根离子和硝酸根离子，而后经过谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶(glutamine synthetase/glutamatesynthase，GS/GOGAT)循环同化为有机氮。GS/GOGAT循环同化而来的谷氨酸在不同转氨酶的作用下，进一步合成植物生长发育所必需的氨基酸。

氮元素作为植物生长发育所必需的大量营养元素之一，对农作物产量的影响至关重要。长期以来，作物氮素利用效率的改良是作物育种过程中的一个重要目标。在水稻中，氮元素参与调控多个重要的农艺性状，包括株高、分蘖数、开花时间和穗粒数等，并最终决定了水稻产量形成。水稻氮素利用效率同时受遗传因子和环境因素及其互作调控，对其深入研究具有重要的理论意义和应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的耐低氮性与产量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述任一种作用：

A1)蛋白质Ghd7在调控植物的产量中的应用；A2)蛋白质Ghd7在调控植物的单株产量中的应用；A3)蛋白质Ghd7在调控植物的株高中的应用；A4)蛋白质Ghd7在调控植物的穗粒数中的应用；A5)蛋白质Ghd7在调控植物的叶绿素含量中的应用；A6)蛋白质Ghd7在调控植物抗低氮性中的应用；A7)蛋白质Ghd7在调控植物对缺氮胁迫的敏感性中的应用；A8)蛋白质Ghd7在调控植物中氮素吸收标志基因的表达量中的应用；A9)蛋白质Ghd7在调控植物中氮素同化标志基因的表达量中的应用；A10)蛋白质Ghd7在调控植物中ARE1基因的表达量中的应用。

所述蛋白质Ghd7来源于禾本科稻属(Oryza sativa L.)，全称为Grain number，plant height，and heading date7。所述蛋白质Ghd7可为a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.1所示的蛋白质；a2)在序列表中SEQ IDNO.1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列表中SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同生物学功能的蛋白质；a4)与序列表中SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于水稻且具有相同生物学功能的蛋白质。

其中，序列表中SEQ ID NO.1由257个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQ ID NO.1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质，均可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO.2自5′末端第211-984位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′末端和/或3′末端连上表1所示的标签的编码序列得到。

与所述蛋白质Ghd7相关的生物材料的应用也属于本发明的保护范围；与所述蛋白质Ghd7相关的生物材料的应用可为如下B1)至B10)中的至少一种：

B1)与所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物的产量中的应用；B2)与所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物的单株产量中的应用；B3)与所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物的株高中的应用；B4)与所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物的穗粒数中的应用；B5)与所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物的叶绿素含量中的应用；B6)与所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物抗低氮性中的应用；B7)与所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物对缺氮胁迫的敏感性中的应用；B8)与所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物中氮素吸收标志基因的表达量中的应用；B9)与所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物中氮素同化标志基因的表达量中的应用；B10)与所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物中BRE1基因的表达量中的应用。

上述应用中，所述生物材料为下述c1)至c7)中的任一种：

c1)编码所述蛋白质Ghd7的核酸分子；c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。所述核酸分子可为编码所述蛋白质Ghd7的基因及其调控序列形成的核酸分子。

例如，所述编码所述蛋白质Ghd7的核酸分子可为如下d1)或d2)或d3)或d4)或d5)所示的DNA分子：

d1)核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子；d2)核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子；d3)编码区如序列表中SEQ ID NO.2第211-984位所示的DNA分子；d4)与d1)或d2)或d3)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于水稻且编码所述蛋白质Ghd7的DNA分子；d5)在严格条件下与d1)或d2)或d3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质Ghd7的DNA分子。

序列表中SEQ ID NO.2由1009个核苷酸组成，序列表中序列2自5′末端第211-984位所示的核苷酸序列编码序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

序列表中SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列是cDNA(序列表中SEQ ID NO.2所示)的基因组DNA。序列表中SEQ ID NO.3由3809个碱基组成，自5′末端起第1至1155位为启动子区，第1156至1365位为5′UTR区，第3785至3809位为3′UTR区，第1366至1809位为第一个外显子，第1810至3454位为第一个内含子，第3455至3784位为第二个外显子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码蛋白质Ghd7的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的蛋白质Ghd7的核苷酸序列90％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质Ghd7且来源于水稻，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码蛋白质Ghd7的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。

所述编码所述蛋白质Ghd7的核酸分子既可为Ghd7基因的cDNA序列，也可为Ghd7基因的基因组DNA序列；与Ghd7基因具有90％以上同一性且编码蛋白质Ghd7的DNA序列，是将Ghd7基因的cDNA用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效的发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变异的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

本发明还提供了培育转基因植物的方法，具体可包括向出发植物中导入提高所述蛋白质Ghd7的含量和/或活性的物质，得到转基因植物的步骤。

所述转基因植物与所述出发植物相比，所述转基因植物具有下述至少一种特性：

1)植物产量增加；2)植物株高受低氮胁迫抑制程度降低；3)植物穗粒数受低氮胁迫抑制程度降低；4)植物叶绿素含量受低氮胁迫抑制程度降低5)植物抗低氮性增加；6)植物对缺氮胁迫的敏感性降低；7)植物中氮素吸收标志基因的表达量增加；8)植物中氮素同化标志基因的表达量增加；9)植物中ARE1基因的表达量降低。

上述方法中，所述“提高所述蛋白质Ghd7的含量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到表达或过量表达所述蛋白质、或提高所述蛋白质的活性的效果。

上述方法中，所述“提高所述蛋白质Ghd7的含量和/或活性的物质”具体可为上文记载的所述蛋白质Ghd7相关的生物材料。例如，向出发植物中导入编码所述蛋白质Ghd7的核酸分子。

上述方法中，所述“向出发植物中导入编码所述蛋白质Ghd7的核酸分子”为通过重组表达载体导入所述出发植物；所述重组表达载体具体可为实施例提及的Ghd7基因过量表达载体。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可包括将通过上述方法获得的转基因植物与待改良植物杂交，得到后代转基因植物的步骤。所述后代转基因植物与所述转基因植物(即作为亲本的转基因植物)表型基本一致。

本发明还保护植物育种方法，该植物育种方法具体可包括增加植物中所述蛋白质Ghd7的含量和/或活性，从而植物具有下述至少一种特性：

1)植物产量增加；2)植物株高受低氮胁迫抑制程度降低；3)植物穗粒数受低氮胁迫抑制程度降低；4)植物叶绿素含量受低氮胁迫抑制程度降低；5)植物抗低氮性增加；6)植物对缺氮胁迫的敏感性降低；7)植物中氮素吸收标志基因的表达量增加；8)植物中氮素同化标志基因的表达量增加；9)植物中ARE1基因的表达量降低。

本发明还保护了包含所述蛋白质Ghd7或所述生物材料的下述任意一种产品：

D1)提高植物产量的产品；D2)提高植物株高的产品；D3)提高植物穗粒数的产品；D4)提高植物叶绿素含量的产品；D5)提高植物抗低氮性的产品；D6)降低植物对缺氮胁迫的敏感性的产品；D7)提高植物中氮素吸收标志基因的表达量的产品；D8)提高植物中氮素同化标志基因的表达量的产品；D9)降低植物中ARE1基因的表达量的产品。

上文中的氮素吸收标志基因可选自AMT1；1基因、AMT1；2基因的和调控植物中AMT1；3基因中的一种或多种。

上文中的氮素同化标志基因可为GS1；2基因的表达量和/或NADH-GOGAT1基因。

上述任一所述植物可为如下f1)至f15)中的任一种：f1)双子叶植物；f2)单子叶植物；f3)禾本科植物；f4)水稻；f5)水稻品种合江19；f6)水稻品种空育131；f7)水稻品种明恢63号；f8)水稻品种日本晴；f9)水稻品种浙辐802；f10)水稻品种中花11号；f11)水稻品种南京6号；f12)水稻品种特青2号；f13)水稻品种窄叶青8号；f14)水稻品种雷蒙特；f15)水稻品种黄华占。

上述任一所述低氮具体可为氮含量低于180kg/ha(如120kg/ha、60kg/ha或0kg/ha)。

上述任一所述低氮生长条件为氮含量低于180kg/ha(如120kg/ha、60kg/ha或0kg/ha)的生长条件。

以蛋白质Ghd7或其编码基因作为靶点而培育抗低氮胁迫转基因植物的应用也属于本发明保护的范围。

携带有本发明Ghd7基因或其它同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca²⁺、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任一一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。转基因植株对低氮胁迫抗性的改变包括植物体内氮代谢通路标志基因(包括氮素吸收标志基因AMT和氮素同化标志基因GS/GOGAT等)表达量的增加和氮素利用效率调控基因ARE1表达量的降低，不同器官(包括株高、叶片叶绿素含量和穗粒数等)受低氮抑制程度的降低，以及植物对缺氮胁迫敏感性的降低。

上述任一所述双子叶植物还可为拟南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕榈树、橄榄树、蓖麻、马铃薯或烟草。上述任一所述单子叶植物还可为玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高梁或草坪草。

水稻作为单子叶植物基础理论研究的模式植物，亦是人类社会重要的粮食作物，其为全世界近一半人口提供主食。水稻氮素利用效率是一类复杂的农艺性状，明确Ghd7基因是否参与调控水稻氮素利用效率并对其调控机制进行深入研究，具有重要的理论意义与应用价值，可为改良作物抗低氮胁迫能力及培育耐低氮胁迫作物新品种提供有效的分子靶点和育种策略。

下述实施例实验证明，蛋白质Ghd7正调控植物对低氮胁迫的抗性，过量表达Ghd7基因增强植物对低氮胁迫的耐受性。Ghd7位点是改良水稻抗低氮性的有效位点。利用植物基因工程技术对Ghd7基因进行定点改造，为培育抗低氮作物新品种提供了有效分子策略。

附图说明

图1为Ghd7基因位于ARE1基因的遗传学上游调控水稻的耐低氮性的实验结果；

A为携带不同Ghd7等位变异的水稻受体品种及其相应的are1-1近等基因系植物(NIL-are1-1)中Ghd7基因表达量的定量分析；

B为携带不同Ghd7等位变异的水稻受体品种及其相应的NIL-are1-1植物中ARE1基因表达量的定量分析；

C为携带不同Ghd7等位变异的水稻受体品种及其相应的NIL-are1-1植物在高氮(HN，300kg/ha尿素)和低氮(LN，180kg/ha尿素)生长条件下，其株高的定量分析，植物株高在低氮生长条件下降低的比值(HN-LN/HN)列于柱状图的上方；

D为携带不同Ghd7等位变异的水稻受体品种及其相应的NIL-are1-1植物在高氮和低氮生长条件下，其主穗粒数的定量分析，主穗粒数在低氮生长条件下降低的比值(HN-LN/HN)列于柱状图的上方；

E为携带不同Ghd7等位变异的水稻受体品种及其相应的NIL-are1-1植物，在低氮生长条件下株高降低的比例，数值由高氮与低氮生长条件下株高的差值与高氮生长条件下株高的比值计算而来；

F为携带不同Ghd7等位变异的水稻受体品种及其相应的NIL-are1-1植物，在低氮生长条件下主穗粒数降低的比例，数值由高氮与低氮生长条件下主穗粒数的差值与高氮生长条件下主穗粒数的比值计算而来；

其中，A-D中are1-1近等基因系植物(NIL-are1-1)以受体品种名及其右上角“a”指示，A-F中所有受体品种的全称见表3和表4；

A和B中的数值表示平均值±标准偏差，结果由4次技术重复统计而来，每个样品包含6株植物；C和D中的数值表示平均值±标准偏差，每个数值的样本容量为45株植物。

图2为ghd7 are1双突变体的表型分析；

A为高氮(300kg/ha尿素)和低氮(180kg/ha尿素)生长条件下的野生型WT、are1单突变体、ghd7单突变体和ghd7 are1双突变体在成熟期植株的表型照片(标尺为15厘米)；

B为高氮和低氮生长条件下的野生型WT、are1单突变体、ghd7单突变体和ghd7are1双突变体株高的定量分析，野生型WT或ghd7单突变体背景下，are1突变后株高增加的比例列于柱状图的上方，该数值由are1单突变体与野生型WT株高的差值与野生型WT株高的比值，或ghd7 are1双突变体与ghd7单突变体株高的差值与ghd7单突变体株高的比值计算而来；

C为高氮和低氮生长条件下的野生型WT、are1单突变体、ghd7单突变体和ghd7are1双突变体主穗粒数的定量分析，野生型WT或ghd7单突变体背景下，are1突变后主穗粒数增加的比例列于柱状图的上方，该数值由are1单突变体与野生型WT主穗粒数的差值与野生型WT主穗粒数的比值，或ghd7 are1双突变体与ghd7单突变体主穗粒数的差值与ghd7单突变体主穗粒数的比值计算而来；

B和C中数值表示平均值±标准偏差，样本容量为20株植物；

野生型WT、are1单突变体、ghd7单突变体和ghd7 are1双突变体中Ghd7基因与ARE1基因的基因型分别为：Ghd7-2 ARE1^NPB、Ghd7-2 are1-1、Ghd7-0a ARE1^NPB和Ghd7-0a are1-1。

图3为蛋白质Ghd7对ARE1基因启动子区结合能力的分析；

A为ARE1基因结构的模式图，模式图下方的两个三角型分别指示启动子和第一个内含子中的两个evening element-like(EEL)顺式调控元件EE1和EE2，模式图上方的四条虚线分别指示用于染色质免疫共沉淀和荧光定量PCR实验(ChIP-qPCR)的四段DNA序列A1-A4，其中，A1和A4作为负对照，分别位于启动子和第六个外显子中，A2和A3分别包含EE1和EE2元件，转录起始位点被视为+1位置；

B中左上为酵母单杂交实验中报告质粒pARE1-AUR1-C的模式图，左下为野生型(pARE1-AUR1-C)及多个截短版本(D1至D10)的ARE1基因启动子融合至AUR1-C报告基因上游，构建的多个报告质粒的模式图，三角形分别指示EE1和EE2的位置，右为共转化报告质粒和对照质粒pGADT7或效应质粒pGADT7-Ghd7的酵母分别稀释10、100和1000倍后，在含有500ng/mL金担子素A(Aureobasidin A，AbA)的SD/-Leu培养基生长2至3天的表型照片，其中GAD为共转化对照质粒pGADT7，GAD-Ghd7为共转化效应质粒pGADT7-Ghd7；

C为用于凝胶电泳迁移实验(EMSA)的野生型(WT)及不同突变型(m1-m14)探针的序列，其中EE1和EE2分别指示ARE1基因启动子和第一个内含子的探针序列，加粗字体指示EEL核心序列，小写字母指示突变碱基；

D为MBP标签蛋白或MBP-Ghd7重组蛋白与C中所示野生型探针的EMSA实验结果图，箭头指示蛋白质与DNA复合体，FP指示游离探针，“+”表示添加，“-”表示未添加，竞争实验组为自左而右第4至7泳道，添加生物素未标记的冷探针(competitor)的浓度分别为标记探针的1、20、200和500倍；

E为MBP-Ghd7重组蛋白与C中所示探针的EMSA实验结果图，箭头指示蛋白质与DNA复合体，FP指示游离探针。

图4为蛋白质Ghd7对ARE1基因表达的调控；

A为染色质免疫共沉淀实验结合荧光定量PCR实验(ChIP-qPCR)分析植物体内Ghd7-GFP融合蛋白对ARE1基因的结合能力，其中，“-anti-GFP”为ChIP实验中不加GFP抗体，“+anti-GFP”为ChIP实验中添加GFP抗体，ChIP实验材料由空育131(KY131，携带Ghd7-0a无效变异)背景下的35S：：Ghd7-GFP转基因植物的叶片制备而来；

B为KY131叶片制备的原生质体中Ghd7转录抑制活性的分析，WT表示野生型ARE1^NPB启动子驱动的LUC报告基因，Δ1、Δ2和Δ3分别表示EE1缺失、EE2缺失和EE1/EE2同时缺失的ARE1^NPB启动子驱动的LUC报告基因；

C为KY131和NIL-Ghd7-2植物中ARE1基因的节律表达模式，线状图下的开框和黑框分别指示光照和黑暗；

D为处于抽穗期的野生型中花11(ZH11，携带Ghd7-2等位变异)植物的旗叶不同部位中Ghd7基因表达量的定量分析，柱状图下的叶片指示检测部位；

E为处于抽穗期的野生型中花11(ZH11，携带Ghd7-2等位变异)植物的旗叶不同部位中ARE1基因表达量的定量分析，柱状图下的叶片指示检测部位；

F为合江19(HJ19，携带Ghd7-0a等位变异)背景下Ghd7过表达植物(OX-14和OX-25)中ARE1基因表达量的定量分析；

G为ZH11背景下Ghd7过表达植物(OX-Ghd7)中ARE1基因表达量的定量分析；

A中数值表示平均值±标准偏差，由4次技术重复统计而来，B中数值表示平均值±标准偏差，由10次技术重复统计而来；C-G中数值表示平均值±标准偏差，由3次技术重复统计而来，每个样品至少包含6株植物；

**和ns分别表示在t测验中二者差异达到显著水平(P<0.05)和无显著性差异。

图5为Ghd7基因过表达植物对缺氮胁迫的敏感性分析；

A为Ghd7基因和ARE1基因表达量对缺氮胁迫的响应；

B-F为合江19(HJ19)和合江19背景下Ghd7基因过表达植物(OX-14和OX-25)对缺氮胁迫的敏感性分析，通过RT-qPCR实验技术分析氮素吸收和同化标志基因表达量的变化，包括铵根转运蛋白基因OsAMT1；1(B)，OsAMT1；2(C)和OsAMT1；3(D)，以及氮同化基因OsGS1；2(E)和OsNADH-GOGAT1(F)表达量的变化，指示植物对缺氮胁迫的敏感性；

G-K为中花11(ZH11)和ZH11背景下的Ghd7基因过表达植物(OX-Ghd7)对缺氮胁迫的敏感性分析，通过RT-qPCR实验技术分析氮素吸收和同化标志基因表达量的变化，包括铵根转运蛋白基因OsAMT1；1(G)，OsAMT1；2(H)和OsAMT1；3(I)，以及氮同化基因OsGS1；2(J)和OsNADH-GOGAT1(K)表达量的变化，指示植物对缺氮胁迫的敏感性；

A中野生型NPB植物在正常(1.46mM硝酸铵)生长条件下生长2周后，一半植物移至缺氮(0mM硝酸铵)生长条件下，一半保留在正常生长条件下，继续培养图中所示时间后，按所示时间同时收集正常和缺氮生长条件下的叶片，通过RT-qPCR技术检测Ghd7与ARE1基因的表达量，基因相对表达量由缺氮生长条件与正常生长条件下基因表达量的比值(缺氮/加氮)计算而来；B-K中植物在正常(1.46mM硝酸铵)生长条件下生长2周后，转移至缺氮生长条件下继续培养图中所示时间后，按所示时间同时收取根组织，通过RT-qPCR技术检测所示基因的表达量；水稻Ubiquitin 1基因作为内参基因；

A中数值表示平均值±标准偏差，由3次生物学重复统计而来，每个样品至少包含6株植物，B-K中数值表示平均值±标准偏差，由3次技术重复统计而来，每个样品包含6株植物。

图6为Ghd7基因过表达植物根中氮吸收和同化标志基因表达量的定量分析；

A-E为野生型HJ19和HJ19背景下Ghd7过表达植物OX-14和OX-25在高氮(1.46mM硝酸铵)和低氮(0.78mM硝酸铵)生长条件下，根中氮素吸收标志基因OsAMT1；1(A)，OsAMT1；2(B)和OsAMT1；3(C)，以及氮素同化标志基因OsGS1；2(D)和OsNADH-GOGAT1(E)基因表达量的定量分析；

F-J为野生型ZH11和ZH11背景下Ghd7过表达植物OX-Ghd7在高氮(1.46mM硝酸铵)和低氮(0.78mM硝酸铵)生长条件下，根中氮素吸收标志基因OsAMT1；1(F)，OsAMT1；2(G)和OsAMT1；3(H)，以及氮素同化标志基因OsGS1；2(I)和OsNADH-GOGAT1(J)基因表达量的定量分析；

A-J中植物水培生长在高氮(1.46mM硝酸铵)或低氮(0.78mM硝酸铵)生长条件下，三周后收取根组织并提取总RNA，通过RT-qPCR技术检测上述标志基因相对表达量；水稻Ubquitin 1基因作为内参基因；

A-J中所有数值均表示平均值±标准偏差，由3次技术重复结果统计而来，每个样品包含6株植物。

图7为Ghd7基因过表达植物在田间对低氮胁迫的耐受性分析；

A为ZH11与ZH11背景下的Ghd7过表达植物OX-Ghd7，以及HJ19与HJ19背景下的Ghd7过表达植物OX-14和OX-25在高氮(300kg/ha尿素)和低氮(180kg/ha尿素)生长条件下成熟期的表型照片(标尺均为15厘米)；

B为A中植物株高的定量分析，柱状图上方的数值表示与高氮生长条件相比，株高在低氮生长条件下降低的比例，该数值由高氮与低氮生长条件下株高的差值与高氮生长条件下株高的比值计算而来；

C为A中植物旗叶中部相对叶绿素含量(SPAD)的定量分析，柱状图上方的数值表示与高氮生长条件相比，SPAD值在低氮生长条件下降低的比例，该数值由高氮与低氮生长条件下SPAD值的差值与高氮生长条件下SPAD值的比值计算而来；

D为A中植物主穗的穗粒数的定量分析，柱状图上方的数值表示与高氮生长条件相比，主穗粒数在低氮生长条件下降低的比例，该数值由高氮与低氮生长条件下主穗粒数的差值与高氮生长条件下的主穗粒数的比值计算而来；

E为A中植物单株产量的定量分析，柱状图上方的数值表示在高氮或低氮生长条件下，与野生型对照植物相比，Ghd7过表达植物单株产量增加的比例；

B-E中数值表示平均值±标准偏差，样本容量至少为40株植物；

**和ns分别表示在t测验中二者差异达到显著水平(P＜0.05)和无显著性差异。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中涉及的引物的信息见表2，第1列为引物名称，第2列为引物的核苷酸序列，第3列为在实施例中的用途。

表2.引物序列列表

实施例1、Ghd7基因位于ARE1基因的遗传学上游调控植物的耐低氮性

一、水稻Ghd7和ARE1基因的等位变异形式

不同水稻品种携带的Ghd7和ARE1基因的等位变异形式具体如表3和表4。

表3.Ghd7基因在不同水稻品种中的等位变异形式及其功能

表4.ARE1基因在不同水稻品种中的等位变异形式与功能

二、不同Ghd7基因遗传背景下are1-1近等基因系植物的构建

将日本晴(Nipponbare，NPB，粳稻品种)背景下筛选到的ARE1基因功能丧失型变异are1-1分别导入到携带不同Ghd7等位变异的受体品种(除HJ以外的表3中的品种)中，构建了一系列are1-1近等基因系材料(near-isogenic lines，NILs-are1-1)。具体构建方法为将are1-1单突变体分别与上述水稻受体品种杂交并获得杂种F₁代植物，而后继续利用受体品种对杂种F₁代植物进行回交6-8次，从而获得不同Ghd7遗传背景下are1-1等位变异的BC_5-7F₃代近等基因系材料。

三、携带不同Ghd7和ARE1等位变异的水稻材料对低氮胁迫的耐受性分析

水稻幼苗于含1.46mM硝酸铵的营养液中生长2周后，收集叶片并提取总RNA，反转录成cDNA。然后用Ghd7基因或ARE1基因的特异引物进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析，用2^-ΔΔCT法(Livak KJ，Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expressiondata using real-time quantitative PCR and the 2^-ΔΔCTmethod.Methods.25∶402-408)分析基因的表达情况。Ghd7基因的特异引物对详见表2中Ghd7qrt_F和Ghd7qrt_R，ARE1基因的特异引物对详见表2中ARE1qrt5_F和ARE1qrt5_R，内参基因Ubiquitin 1基因的引物对详见表2中UBQF和UBQR。

结果如图1中A和B所示，在上述水稻受体品种及其NILs材料中，由于其携带不同的Ghd7等位变异，Ghd7基因的表达量不同(图1中A)。在大多数受体品种中，ARE1基因的表达量与Ghd7基因的表达量呈现较明显的负相关性(图1中A和B)，暗示Ghd7基因可能负调控ARE1基因的表达。

由于ARE1基因参与负调控水稻氮素利用效率，为明确Ghd7基因是否参与调控植物对低氮胁迫的耐受性，本发明的发明人分析了上述水稻品种及其NILs材料在高氮(300kg/ha尿素)和低氮(180kg/ha尿素)生长条件下的田间生长表现。

具体田间氮肥实验方法为：连续三年在海南省陵水县(18°52’N，110°01’E)采用田间随机区组设计方法进行氮肥实验，选取水稻成熟期的株高和主穗粒数两个受氮素调控的农艺性状作为分析指标，通过检测株高和主穗粒数受低氮胁迫的抑制程度，以分析上述受体品种及其NILs材料对低氮胁迫的耐受性。选用尿素作为唯一氮源，分别设置高氮(300kg/ha尿素)和低氮(180kg/ha尿素)两个处理浓度，每个处理三个生物学重复。施肥策略为：分别在水稻幼苗期、分蘖期和孕穗期，每个处理分别按30％、40％和30％的尿素总量施用。选用硫酸钾和重过磷酸钙作为钾肥和磷肥来源，并按30kg/ha纯钾和120kg/ha纯磷标准于水稻秧苗移栽前等量施用。所有上述水稻材料等量(10行×10株)种植于高氮和低氮生长条件下，株距×行距为25×25厘米；每份材料的株高和主穗粒数均在材料成熟期进行测量与统计，每个生物学重复统计10-15株植物，共统计40株植物。

结果如图1中C-F所示，田间氮肥实验结果表明：在ARE1基因具有生物学功能(包括ARE1^NPB和ARE1^9311/MH63等位变异)的遗传背景下，携带Ghd7无效变异(包括Ghd7-0a)或弱等位变异(包括Ghd7-2)的水稻受体品种，其株高和穗粒数受低氮胁迫抑制的程度，要高于携带Ghd7强等位变异(包括Ghd7-1和Ghd7-3)的水稻受体品种(图1中C、D、E和F)，表明功能完整的Ghd7基因增强水稻对低氮胁迫的耐受性。因此，Ghd7基因正调控水稻的氮素利用效率。值得指出的是，当将日本晴背景下鉴定到的ARE1基因的无效等位变异are1-1导入到这些受体品种中后，获得的NIL-are1-1材料的株高和穗粒数受低氮胁迫的抑制程度较其轮回亲本有所降低(图1中C、D、E和F)。此外，在这些NIL-are1-1材料中，Ghd7基因不同等位变异介导的不同低氮胁迫耐受性的差异明显减小(图1中C、D、E和F)，表明Ghd7基因介导的低氮耐受性部分依赖于ARE1基因。上述结果表明，Ghd7基因可能位于ARE1基因的上游调控氮素利用效率。

实施例2、ghd7 are1双突变体的表型分析

一、空育131背景下ghd7与are1突变体材料的构建

上述结论是由不同遗传背景下的NILs材料中获得，本发明的发明人期望在相同遗传背景下进一步确认Ghd7与ARE1在调控水稻对低氮胁迫耐受性上的遗传关系。空育131(KY131)是我国东北地区的一个主栽粳稻品种，其携带的Ghd7和ARE1基因的等位变异分别是功能丧失的Ghd7-0a和功能完全的ARE1^NPB(表3和表4)。因此，本发明的发明人将KY131视为ghd7突变体。在此基础上，本发明的发明人在KY131背景下构建了三份近等基因系材料：NIL-Ghd7-2由粳稻品种日本晴(携带Ghd7-2等位变异，表3)与KY131杂交并回交获得，其基因型为Ghd7-2ARE1^NPB；NIL-are1-1由日本晴背景下的are1-1突变体与KY131杂交并回交获得，其基因型为Ghd7-0a are1-1；NIL-Ghd7-2 are1-1由NIL-Ghd7-2与NIL-are1-1杂交并自交获得，其基因型为Ghd7-2 are1-1。为了便于进行遗传分析，根据上述材料所携带的Ghd7与ARE1基因是否具有生物学功能，本发明的发明人将NIL-Ghd7-2，NIL-Ghd7-2 are1-1，KY131和NIL-are1-1分别视为野生型(wild type，WT)，are1单突变体，ghd7单突变体和ghd7arel双突变体(图2)。

二、ghd7 are1双突变体对低氮胁迫的耐受性分析

本发明的发明人将上述KY131背景下构建的4份材料分别种植在高氮(300kg/ha尿素)和低氮(180kg/ha尿素)生长条件下，并分析了其对低氮胁迫的耐受性。

具体田间氮肥实验方法和结果检测方法与实施例1相同。

结果如图2，统计分析发现，不论在高氮或低氮生长条件下，与野生型植物相比，ghd7单突变体均显著降低株高和穗粒数，而are1单突变体均增加株高和穗粒数(图2中B和C)。此外，在高氮生长条件下，ghd7 are1双突变体部分恢复ghd7突变体的株高和穗粒数，恢复比例分别为5.8％和10.5％；而在低氮生长条件下，ghd7 are1双突变体恢复ghd7突变体的株高和穗粒数的效果增加，分别为8.9％和12.6％(图2中B和C)，表明Ghd7基因位于ARE1基因的遗传学上游增强水稻对低氮胁迫的耐受性。值得指出的是，虽然ghd7 are1双突变体的表型介于ghd7单突变体和are1单突变体之间，但是ghd7 are1双突变体的表型并未完全恢复至野生型水平(图2中A、B和C)，表明Ghd7同时调控ARE1和其它未知的氮素利用相关调控基因的功能。上述结果表明，Ghd7与ARE1基因在同一条生物学通路上拮抗调控水稻对低氮的耐受性及氮素调控性状。

实施例3、Ghd7蛋白质结合到ARE1基因启动子的两个EEL元件上

上述研究结果表明，ARE1基因位于Ghd7基因的遗传学下游发挥生物学功能。本发明的发明人发现，与Ghd7基因功能完整的Ghd7-1遗传背景相比，在Ghd7基因功能丧失的Ghd7-0a遗传背景下，ARE1基因的表达量较高(图1中B)，暗示Ghd7可能直接或间接抑制ARE1基因的转录。为验证上述推测，本发明的发明人期望通过酵母单杂交实验分析蛋白质Ghd7对ARE1基因启动子区潜在的结合能力。

一、日本晴基因组DNA的提取

1)取约400mg水稻品种日本晴叶片，装入含有钢珠的离心管(规格为2mL)中，加入400μL DNA提取液(含500mM NaCl、50mM EDTA和1％SDS(1mg/100mL)的pH 7.5、100mM Tris-HCl缓冲液)。

2)完成步骤1)后，将所述离心管装载至混合磨样仪(RETSCH公司的产品，型号为MM400)，以最大频率振荡3min，置于65℃的水浴锅静置30min，冷却至室温。

3)完成步骤2)后，取所述离心管，加入等体积氯仿，振荡混匀，13000r/min离心10min。

4)完成步骤3)后，取所述离心管，转移上清至另一新的离心管(规格为1.5mL)，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置1h。

5)完成步骤4)后，取所述离心管，13000r/min离心10min，弃上清，用70％(v/v)乙醇水溶液洗涤沉淀2次，晾干。

6)完成步骤5)后，取所述离心管，加入400μL去离子水，混匀，得到水稻基因组DNA。-20℃保存备用。

二、水稻明恢63号的cDNA的获得

1)水稻籼稻品种明恢63号(Minghui63，MH63)携带功能完整的Ghd7-1强等位变异(表3)。本发明的发明人采用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN公司的产品，产品目录号为DP432)提取水稻籼稻品种明恢63号3周幼苗的叶片中总RNA，得到MH63植物总RNA。

2)取1-2μg MH63总RNA，采用TransScr扣t First-Strand cDNA SynthesisSuperMix试剂盒(TransGen Biotech公司的产品，产品目录号为AT301)合成第一链cDNA，得到MH63植物的cDNA。

三、报告质粒和效应质粒的构建

为构建融合ARE1基因启动子的报告质粒，本发明的发明人采用一对分别包埋SacI和KpnI酶切位点的引物对P0_F和P0_R(表2)对日本晴基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物为一段跨ARE1基因转录起始位点上游2000bp的基因组DNA片段(包含ARE1基因的启动子，5′UTR和第一个内含子的核苷酸序列)。报告质粒由该PCR产物连接至载体p53-AbAi(Takara公司产品，产品目录号为：630491)中的金担子素A(AureobasidinA，AbA)抗性基因(AUR1-C)的上游(图3中A和B)构建而来。不同截短版本的其它报告质粒(D1-D10，图3中B)采用类似的方法构建而来。

为构建融合表达Ghd7基因的效应质粒，本发明的发明人采用一对分别包埋EcoRI和BamHI酶切位点的引物对AD-Ghd7_F和AD-Ghd7_R(表2)对MH63的cDNA进行PCR扩增。效应质粒由上述PCR产物连接至pGADT7载体(Takara公司产品，产品目录号为：630491)中酵母转录因子GAL4的转录激活域(GAD)构建而来，以下简称pGADT7-Ghd7或GAD-Ghd7。对照质粒为pGADT7空载体，以下简称pGADT7或GAD。在报告质粒中，AUR1-C报告基因的表达使得酵母细胞对AbA产生抗性(图3中B)。

四、酵母单杂交实验分析蛋白质Ghd7与ARE1基因的相互作用

本发明的发明人选用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid System试剂盒(Clontech公司产品，产品目录号为：630491)进行酵母单杂交实验。不同报告质粒通过PEG介导的化学转化方法转化至酵母感受态细胞中，并在尿嘧啶缺陷型(SD/-Ura)培养基上生长48h，通过克隆PCR方法筛选阳性转化细胞而获得报告菌株。效应质粒经PEG介导的转化方法转化至上述报告菌株，并在亮氨酸缺陷型(SD/-Leu)培养基上生长48-72h。随机挑选阳性菌株，并分别稀释10、100和1000倍后，涂于含有500ng/mLAbA的SD/-Leu培养基上继续培养48-72h，观察酵母生长状况并拍照。

结果发现，与报告质粒共转化pGADT7空载体相比，共转化pGADT7-Ghd7融合表达载体赋予酵母细胞对AbA产生抗性(图3中B)，表明蛋白质Ghd7能够结合到ARE1基因的启动子区。

为鉴定蛋白质Ghd7在ARE1基因启动子区的结合位点，本发明的发明人对ARE1基因启动子区进行了逐段截短突变处理。结果表明，ARE1基因启动子进行D1至D9不同长度的截短，均不影响报告基因的表达，酵母细胞均能正常生长(图3中B)。当进一步截短至5′末端第一个内含子(D10)后显著降低酵母细胞对AbA的抗性(图3中B)，表明蛋白质Ghd7的结合位点可能位于D9至D10间差异的16bp序列中。分析发现，该区间序列包含一个类eveningelement元件(evening element-like，EEL)的回文结构序列，5′-AAGATATCT-3′(图3中A和C)。此外，在ARE1基因的启动子区同样存在一个相同的序列(图3中A和C)，因此将这两个EEL元件其分别命名为EE1和EE2。

五、MBP-Ghd7融合蛋白的表达与纯化

为明确上述两个EEL元件是否是蛋白质Ghd7的结合位点，本发明的发明人进行了凝胶电泳迁移实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)。本发明的发明人采用一对分别包埋BamHI和EcoRI酶切位点的引物对MBP-Ghd7_F和MBP-Ghd7_R(表2)对MH63的cDNA进行PCR扩增，PCR产物克隆至pMAL-c2X载体(New England Biolabs公司产品，目录号为：#E8000S)中获得MBP-Ghd7融合表达载体。融合表达载体和空载体分别转化大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)菌株，获得表达菌株。MBP标签蛋白和MBP-Ghd7重组蛋白的表达和纯化采用直链淀粉树脂珠子(Amylose Resin beads，New England Biolabs公司产品，产品目录号为E8021S)进行。

MBP标签蛋白及MBP-Ghd7重组蛋白的具体纯化方法如下：

1)挑取阳性单克隆菌落于50mL含抗生素的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养过夜。

2)吸取过夜培养的菌液20mL，接种于700mL含抗生素的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养3小时，加IPTG至终浓度为1mM，37℃，200r/min继续培养6小时。

3)4℃，9,000r/min离心菌液10分钟，弃上清，收集菌体约1.5g。

4)加入20mL column buffer(含50mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.0，200mM NaCl，5％甘油，1mM EDTA和1mM蛋白酶抑制剂PMSF)重悬菌体，冰浴混匀，超声破碎(振幅设置为60，工作/暂停时间为10秒/15秒，超声6-9分钟)至澄清。

5)加入浓度为20％的TritonX-100至终浓度为1％，冰浴30分钟，期间摇动几次。

6)4℃，13,000r/min离心20分钟，弃沉淀。

7)移上清至含400μL直链淀粉树脂珠子(Amylose Resin beads，New EnglandBiolabs公司产品，目录号为E8021S)的结合柱中，4℃混匀孵育5小时，弃上清。

8)用10mL column buffer洗涤4-6次，用500μL洗脱液(含20mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.4，200mM NaCl，1mM EDTA和5mM麦芽糖)洗涤3次，收集洗脱液。

六、凝胶电泳迁移实验分析蛋白质Ghd7与ARE1基因的互作

本发明的发明人使用LightShift Chemiluminescent EMSAKit(ThermoScientific公司产品，产品目录号为20148)试剂盒进行了凝胶电泳迁移实验(Electrophoretic Mobility ShiftAssay，EMSA)。

5’末端用生物素标记的野生型(WT)和突变(m1-m7)探针EE1，野生型(WT)和突变(m8-m14)探针EE2序列如图3中C所示。

具体程序为：取约500ng重组蛋白和200pM人工合成的5’端生物素标记的探针，在20μL反应体系中(含10mM Tris-HCl，pH7.5，50mM KCl，1mM DTT，2.5％甘油，5ng/μL poly(dI-dC))室温孵育20min。每个实验组参见图3中D和E，一条泳道代表一个实验组，其中，在竞争实验组中，生物素未标记的冷探针分别以生物素标记探针的1、20、200和500倍浓度加入到反应体系中，以竞争结合Ghd7蛋白质。反应产物上样至6％聚丙烯酰胺凝胶，于0.5XTBE缓冲液(含45mM Tris，45mM boric acid，1mM EDTA，pH 8.3)中进行凝胶电泳。

结果如图3中D和E所示，结果表明，MBP-Ghd7重组蛋白能够有效的结合到同时含有EEL核心元件和侧翼序列的EE1和EE2序列上，且其结合能力可以被冷探针(competetor)有效的抑制(图3中D)。此外，EEL核心元件不同形式的突变可不同程度地抑制MBP-Ghd7融合蛋白与EE1或EE2的结合，而侧翼序列突变对二者的互作无明显影响(图3中E)。上述结果表明，蛋白质Ghd7能够结合到ARE1基因启动子区和第一个内含子的EEL元件上。

实施例4、Ghd7基因抑制ARE1基因的表达

为分析在植物体内蛋白质Ghd7是否可以结合到ARE1基因启动子和第一个内含子中的两个EEL元件上，本发明的发明人进行了染色质免疫共沉淀和荧光定量PCR试验(ChIP-qPCR)。

本发明的发明人在空育131(携带Ghd7-0a无效变异)背景下构建了Ghd7-GFP融合基因的过表达植物。35S：：Ghd7-GFP转基因植物的具体构建方法如下：

1)水稻NPB叶片cDNA的制备

水稻粳稻品种日本晴(Nipponbare，NPB)携带功能部分丧失的Ghd7-2弱等位变异(表3)。本发明的发明人采用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN公司的产品，产品目录号为DP432)提取水稻NPB三周幼苗的叶片中总RNA，采用TransScript First-StrandcDNA Synthesis SuperMix试剂盒(TransGen Biotech公司的产品，产品目录号为AT301)合成第一链cDNA，获得NPB幼苗叶片的cDNA。

2)p35S：：Ghd7-GFP载体的构建

以NPB cDNA为模板，以分别包埋SpeI和PmlI酶切位点的引物对Ghd7-GFP_F和Ghd7-GFP_R(表2)对其进行PCR扩增，获得长度为813bp的PCR产物，后通过同源重组方法插入pCAMBIA1305-GFP载体的SpeI和PmlI位点中，获得p35S：：Ghd7-GFP载体。

3)电激转化法

a)取40μL冰浴融化的感受态细胞，加入1μL脱盐质粒，轻轻混匀。

b)1800V电激转化，迅速加入500μμL无抗LB液体培养基。

c)37℃，200r/min培养1小时，使细菌复苏。

d)吸取适量菌液，加入50μL利福平，均匀涂在抗性LB固体培养基上。28℃，倒置培养过夜。

e)菌落PCR获得阳性单克隆。

4)根癌农杆菌介导的水稻遗传转化

将去壳的水稻空育131种子浸泡于30％次氯酸钠溶液中，灭菌30分钟后，用无菌水冲洗4至5次，接种至水稻转化MS培养基上，培养7至10天；去除芽和胚，保留愈伤，继代培养20天；将愈伤切成小块，二次继代培养7至10天，备用。

将构建好的表达载体p35S：：Ghd7-GFP用上述步骤3)的电激转化方法转入农杆菌EHA105菌株中。挑取农杆菌阳性单克隆菌落，接种至2mL LB液体培养基(含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)，28℃，150r/min培养15小时。以2％接种量接菌至20mL含有利福平和潮霉素的LB液体培养基，培养约15小时至OD₆₀₀值约为1.0，离心收集菌体，用等体积AAM侵染液(Tμoki S et al.，2006.Early infection of scutellum tissue with Agrobacteriumallows high-speed transformation ofrice.PlantJ.47：969-976)重悬菌体，离心去上清，加入5ml左右AAM侵染液，直至OD₆₀₀值约为0.4。

将备好的愈伤组织置于上述AAM侵染液中浸泡30分钟，期间轻摇2至3次；侵染后倒掉菌液，移愈伤组织至无菌滤纸晾干，转移到N6共培养基(含1g/L葡萄糖，10-20g/LAS，2.5g/L植物凝胶，pH 5.2-5.6)，避光培养2天；第一次筛选培养时间为20至25天，挑取抗性愈伤组织进行第二次筛选，培养20至25天；转移抗性愈伤组织至预分化培养基继续培养7至15天，移至分化培养基继续培养25至30天，直至愈伤组织再生出苗；移再生苗至生根培养基培养25天左右，转移至大田栽培。

5)ChIP-qPCR实验分析Ghd7-GFP融合蛋白对ARE1基因启动子的体内结合能力

ChIP实验所需的染色质样品由上述构建的35S：：Ghd7-GFP转基因纯合T₂代植物叶片制备，经GFP抗体共沉淀后，DNA富集的倍数由特异识别A1至A4序列的引物对(表2中A1_F和A1_R、A2_F和A2_R、A3_F和A3_R、A4_F和A4_R)进行qPCR扩增分析，不经GFP抗体沉淀的A1片段的富集倍数视为1.0。ChIP实验的具体步骤如下：

a)剪取约5g新鲜叶片，切成约1mm的小段，立即移至含45mL交联缓冲液(含400mM蔗糖，10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM PMSF，1mM EDTA和1％甲醛)的三角瓶中；将样品移至真空泵中，以0.67kg/cm²压力，抽真空约10min至样品完全浸没；加入3.3mL 2M的甘氨酸溶液至三角瓶中，室温孵育5min。

b)去离子水冲洗样品3次，吸干样品表面水份，液氮研磨至粉末；移至含25mL新鲜制备的细胞核提取液(含250mM sucrose，15mM PIPES，pH 6.8，5mM MgCl₂，60mM KCl，15mMNaCl，1mM CaCl₂，1％Triton-X 100，1mM PMSF和1mg/mL罗氏蛋白酶抑制剂cocktail)的三角瓶中，4℃，震荡混匀30min。

c)样品经4层奇迹滤布过滤后，4℃，11,000×g离心20min，弃上清；加入3mL新鲜制备的冷的核裂解液(含50mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，1％SDS，0.1％sodiumdeoxycholate，2％Triton-X 100，0.1mM PMSF和1mg/mL罗氏蛋白酶抑制剂cocktail)，等分4份，置于超声破碎仪(比利时Diagenode公司产品，型号为：Bioruptor^TMNext Gen system)，功率设置为Low 4，开/关时间为10s/60s，超声15次；4℃，13,800×g离心10min，收集上清并混匀。

d)加入5倍体积的稀释缓冲液(含50mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，0.1％sodium deoxycholate，0.1％Triton x-100，0.1mM PMSF和1mg/mL罗氏蛋白酶抑制剂cocktail)；4℃，16,000×g离心10min，吸取上清，重复离心一次，加入4％体积的蛋白A琼脂糖珠，4℃混合孵育90min；4℃，3,800×g离心2min，弃沉淀，收集上清，取1％体积样品，作为input对照。

e)上清等分为2份，其中一份加入来源小鼠的GFP单克隆抗体(Abmart公司产品，货号为M20000L；抗体稀释倍数为1∶100)，另一份加入等量的稀释缓冲液，4℃孵育4h，加入8％体积的蛋白A琼脂糖珠，继续孵育2h。

f)琼脂糖珠先后用低盐漂洗液(含150mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0，0.2％SDS，0.5％Triton-X 100和2mM EDTA)、高盐漂洗液(含500mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH8.0，0.2％SDS，0.5％Triton-X 100和2mM EDTA)、LiCl漂洗液(含250mM LiCl，10mM Tris-HCl，pH 8.0，1％NP-40，0.1％sodium deoxycholate和1mM EDTA)和TE漂洗液(含10mMTris-HCl，pH 8.0和1mM EDTA)，分别漂洗2次，先后2次加入250μL洗脱液(含1％SDS和0.1MNaHCO₃)，混匀孵育15min，3,800×g离心2min，收集上清，即为IP样品。

g)向IP样品和input对照中分别加入20μL5M NaCl至终浓度为200mM，65℃孵育4h至过夜；向每个样品中先后加入10μL 0.5M EDTA(pH 8.0)，混匀；加入20μL 1M Tris-Cl(pH6.5)，再混匀；加入1.5μL 20mg/mL Proteinase K；混匀；45℃，孵育1-2h。

h)加入400μL酚氯仿(Tris饱和酚：氯仿＝1∶1)，充分混匀抽提一次；13,000r/min离心5min；吸取上清约400μL，依次加入1μL20mg/mL糖原，混匀；加入40μL 3MNaOAc(pH5.2)，再混匀；最后加入960μL无水乙醇，充分混匀；室温沉淀2h。

i)4℃，13,200r/min离心15min；用75％乙醇清洗沉淀两次；晾干沉淀，用50μL去离子水溶解DNA，混匀，短暂离心后，先在室温溶解DNA 30min，然后冻存到-20℃冰箱，备用。

利用上述转基因植物及ChIP-qPCR实验技术，本发明的发明人分析了蛋白质Ghd7对ARE1基因的A1至A4(图3中A)四段序列的富集情况，其中A2和A3分别包含顺式调控元件EE1和EE2，A1和A4分别作为启动子区和编码区的负对照。结果表明，GFP抗体特异识别的信号在A2和A3区域高度富集(图4中A)，表明在植物体内Ghd7-GFP融合蛋白可以结合到ARE1基因的EE1和EE2元件上。

为分析两个EEL元件对ARE1基因表达的调控作用，本发明的发明人利用携带Ghd7-0a无效变异的空育131植物的叶片制备了叶肉细胞原生质体，并通过双荧光素酶报告系统进行了ARE1基因的瞬时表达分析。

萤火虫荧光素酶报告基因(LUC)分别由野生型(WT，即野生型ARE1^NPB基因启动子)和三个突变版本(Δ1、A2和Δ3，分别指示野生型ARE1^NPB基因的启动子中的EE1元件单独缺失、EE2元件单独缺失和EE1与EE2元件同时缺失的突变型ARE1^NPB基因启动子)的ARE1基因启动子驱动，报告质粒分别与对照质粒35S：：YFP或效应质粒35S：：Ghd7-YFP共转化水稻原生质体，转化效率由报告质粒携带的海肾荧光素酶报告基因REN校正，共转化野生型报告质粒和对照质粒35S：：YFP测得的LUC活性被视为1.0。

1)报告质粒与效应质粒的构建

a)为构建野生型报告质粒pARE1-LUC，以分别包埋KpnI和NcoI酶切位点的引物对Rep-WT_F和Rep-WT_R(表1)，对NPB基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物克隆至pGreenII0800-LUC载体(Hellens et al.，2005)的KpnI和NcoI位点中。

b)EE1和EE2元件单独缺失或同时缺失的报告质粒，分别利用引物对1_F和1_R、2_F和2_R，采用上述类似的方法构建而来。

c)为构建效应质粒35S：：Ghd7-YFP，以分别包埋HindIII和SalI酶切位点的引物对Eff-Ghd7_F和Eff-Ghd7_R，对MH63 cDNA进行PCR扩增，PCR产物克隆至pSAT6-EYFP-N1载体(Tzfira et al.，2005)的HindIII和SalI位点中。未插入Ghd7基因编码序列的空载体pSAT6-EYFP-N1视为对照质粒，即35S：：YFP。

2)KY131叶肉细胞原生质体的制备与转化

a)选取水培10天的KY131幼苗茎干和叶鞘部分，用锋利的刀片切成大约0.5mm宽的条块；立刻转移到0.6M甘露醇溶液中，避光放置10分钟。

b)过滤掉甘露醇溶液，样品移至新鲜配置的酶解液(含1.5％Cellulase R-10，0.75％Macerozyme R-10，0.6M甘露醇，10mM MES，pH 5.7，10mM CaCl₂和0.1％BSA)中，真空泵避光抽真空30分钟，压力约为0.6kg/cm²；避光酶解5-6小时，同时缓慢摇动(脱色摇床，速度10)。

c)酶解结束后，加入等体积的W5溶液(含154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl和2mMMES，pH 5.7)，稍有力地用手水平摇动10秒钟，释放原生质体；使用40μm尼龙膜过滤原生质体到50ml的圆底离心管中，再加W5溶液冲洗条块；

d)250×g水平离心3分钟沉淀原生质体，用5ml移液器吸出上清；加入10ml W5溶液重悬原生质体，250×g离心3分钟，弃上清；加适量MMG溶液(含0.4M甘露醇，15mM MgCl₂和4mM MES，pH 5.7)重悬，使原生质体浓度约为2*10⁶/ml。

e)依次向2mL离心管中加入约10μg报告质粒和效应质粒(或对照质粒)，200μL原生质体(大约4*10⁵细胞)，220μL新配的PEG溶液，混匀，室温避光放置10～20分钟诱导转化；

f)缓慢加入880μL W5溶液，轻轻颠倒混匀，250×g水平离心3分钟，弃上清；

g)加入1mL WI溶液(含0.5M甘露醇，20mM KCl和4mM MES，pH 5.7)重悬，转移到六孔板中(已预先加入1ml WI溶液)，室温暗处培养18-20小时。

3)转录激活实验分析蛋白质Ghd7对ARE1基因的转录抑制作用

报告质粒和效应质粒(或对照质粒)通过PEG介导的方法共转化入KY131叶肉细胞原生质体后，室温孵育18-20h，离心收集原生质体。选用Dual-Lucy Assay Kit试剂盒(Vigorous公司产品，目录号为T002)分析原生质体中LUC活性，生物发光强度通过GloMax20/20化学发光检测仪(Promega公司产品)测定。

结果发现，与共转化35S：：YFP对照质粒(YFP)相比，共转化35S：：Ghd7-YFP效应质粒(Ghd7-YFP)降低报告基因ARE1：：Luc的表达水平至对照水平的40％左右(图4中B)，表明Ghd7-YFP抑制ARE1：：Luc表达。此外，ARE1启动子区EE1或EE2元件的缺失突变对Ghd7-YFP介导的ARE1：：Luc转录抑制效应无明显影响，但EE1和EE2同时缺失可部分解除Ghd7-YFP对ARE1：：Luc的转录抑制作用(图4中B)，表明两个EEL元件均是Ghd7-YFP介导的ARE1转录抑制作用所必需的。上述结果表明。蛋白质Ghd7可直接结合到ARE1基因启动子和第一个内含子的EEL元件上，并抑制ARE1基因的转录。

有研究表明，EEL元件通常作为一类顺式调控元件介导节律基因的表达(Harmeret al.，2000)，且Ghd7基因呈现白天表达量高而夜晚表达量低的节律表达模式(Xue etal.，2008)。

为明确ARE1基因是否具有节律表达模式，及其表达模式与Ghd7基因的关系，本发明的发明人在携带Ghd7-0a无效变异的空育131(KY131)材料背景下，构建了Ghd7-2的近等基因系植物NIL-Ghd7-2。NIL-Ghd7-2植物由携带Ghd7-2弱等位变异的野生型NPB植物与KY131杂交一次，后经KY131回交7次获得的BC₆F₃代植物。同时将KY131和NIL-Ghd7-2植物在16h光照/8h黑暗的光周期条件下培养2周后，每隔2小时同时收集KY131和NIL-Ghd7-2植物叶片，并制备总RNA，通过RT-qPCR实验检测ARE1基因在上述两份材料中的表达差异，所用RT-qPCR引物为表2中引物对ARE1qrt5_F和ARE1qrt5_R。

ARE1基因的节律表达模式结果如图4中C所示，作为受Ghd7基因调控的下游组分，ARE1基因则呈现出与Ghd7基因相反的节律表达模式，其在白天表达量降低而在夜晚表达量升高。此外，与携带Ghd7-0a无效变异的空育131相比，携带Ghd7弱等位变异的NIL-Ghd7-2植物中ARE1基因的表达量显著降低。

此外，处于抽穗期的野生型ZH11植物的同一旗叶不同部位中Ghd7基因和ARE1基因表达量的定量分析结果如图4中D和E所示，Ghd7基因的表达量在同一叶片的叶尖至叶基部逐渐降低，而ARE1基因的表达量呈现出完全相反的表达模式。

HJ19和ZH11背景下Ghd7过表达植物OX-14、OX-25和OX-Ghd7构建方法具体如下。

1)为获得HJ19背景下的Ghd7过表达植物OX-14和OX-25，利用分别包埋KpnI和BamHI酶切位点的引物对OX-F和OX-R对明恢63号植物叶片的cDNA进行PCR扩增，后连接至pCAMBIA1301U载体(由pCAMBIA1301载体多克隆位点处插入水稻Ubiquitin启动子序列后改造而来，具体见文献Xiaoyu Weng et al，Plant Physiology_，February 2014，Vol.164，pp.735-747)KpnI和BamHI之间上，得到Ghd7过表达载体pUbi：：Ghd7。pUbi：：Ghd7是将pCAMBIA1301U的KpnI和BamHI识别位点间的片段(小片段)替换为SEQ ID NO.2所示的Ghd7基因，保持pCAMBIA1301U的其它核苷酸不变得到的重组载体。采用电激转化法将pUbi：：Ghd7导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。重组农杆菌侵染转化水稻HJ19愈伤组织的培养条件以及筛选方法与实施例4“4)根癌农杆菌介导的水稻遗传转化”相同，得到转基因植株。转基因植株和HJ19于含1.46mM硝酸铵的营养液中生长2周后，收集叶片并提取总RNA，反转录成cDNA。然后用Ghd7基因的特异引物进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析，用2^-ΔΔCT法(Livak KJ，Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2^-ΔΔCTmethod.Methods.25：402-408)分析基因的表达情况。Ghd7基因的特异引物对详见表2Ghd7qrt_F和Ghd7qrt_R。内参基因Ubiquitin 1的引物对详见表2中UBQF和UBQR。实验重复三次，结果取平均值。通过RT-qPCR筛选出Ghd7过表达的转基因阳性植株，其中两个T2代转基因阳性纯合株系OX-14和OX-25用于后续实验分析。

2)为获得ZH11背景下的Ghd7过表达植物OX-Ghd7，首先利用分别包埋KpnI和BamHI酶切位点的引物对PRO-F和PRO-R对Ghd7基因的启动子(SEQ ID NO，3第1至1155位)进行PCR扩增，并克隆至pCAMBIA1301载体(pCAMBIA1301载体，订购自Abcam公司，产品目录号为：ab275753)的KpnI和BamHI之间，得到携带启动子区的pCAMBIA1301-pGhd7载体，然后利用分别包埋BamHI和HindIII酶切位点的引物对ORF-F和ORF-R对Ghd7基因的cDNA(SEQ ID NO.2)进行PCR扩增，融合连接至携带启动子区的pCAMBIA1301-pGhd7载体(该载体从澳大利亚独立的、非营利性机构Cambia获得(Roberts et al.，1997)的BamHI和HindIII之间，得到Ghd7过表达载体pGhd7：：Ghd7。pGhd7：：Ghd7是将pCAMBIA1301载体多克隆位点中的KpnI和HindIII酶切位点之间的序列替换为Ghd7基因的启动子和cDNA序列，其它核苷酸保持不变得到的重组载体。采用电激转化法将pGhd7：：Ghd7导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。将重组农杆菌侵染转化水稻ZH11愈伤组织，具体培养条件以及筛选方法与实施例4“4)根癌农杆菌介导的水稻遗传转化”，得到转基因植株。转基因植株和ZH11生长于含1.46mM硝酸铵的营养液中2周后，收集叶片并提取总RNA，反转录成cDNA。利用Ghd7基因的特异引物进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析，用2^-ΔΔCT法(Livak KJ，Schmittgen TD.2001.Analysisof relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^-ΔΔCTmethod.Methods.25：402-408)分析基因的表达情况。Ghd7基因的特异引物对详见表2Ghd7qrt_F和Ghd7qrt_R。内参基因Ubiquitin 1的引物对详见表2中UBQF和UBQR。实验重复三次，结果取平均值。通过RT-qPCR筛选出Ghd7过表达的转基因阳性植株，其中一个T₂代转基因阳性纯合株系OX-Ghd7用于后续试验分析。

HJ19、OX-14、OX-25、ZH11、OX-Ghd7在16h光照/8h黑暗的光周期条件下生长2周后，收集叶片并制备总RNA，用于RT-qPCR实验以检测ARE1基因表达，RT-qPCR引物为表2中ARE1qrt5_F和ARE1qrt5_R。

结果如图4中F和G所示，ARE1基因的表达量在Ghd7过表达植物中显著降低。上述结果表明，Ghd7负调控ARE1基因的表达。

实施例5、Ghd7基因过表达植物对缺氮胁迫的敏感性分析

鉴于蛋白质Ghd7作为一个转录因子负调控ARE1基因的表达，而ARE1基因负调控氮素利用效率，为明确Ghd7基因在调控氮素利用效率中的潜在功能，本发明的发明人进行了Ghd7基因过表达植物对缺氮胁迫的敏感性分析。

本发明的发明人首先检测了Ghd7基因对缺氮处理的响应。

实验方法具体为：将正常生长条件下(含1.46mM硝酸铵)生长2周的NPB幼苗，取一半幼苗移至缺氮生长条件下(含0mM硝酸铵)，另一半留在正常生长条件下(含1.46mM硝酸铵)，分别继续培养0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6和7小时后，同时收取两组植物的叶片并提取总RNA，通过RT-qPCR技术检测Ghd7基因和ARE1基因的表达量。RT-qPCR引物分别为表2中的Ghd7qrt_F和Ghd7qrt_R、ARE1qrt5_F和ARE1qrt5_R，基因表达量分别由缺氮条件与正常条件下的基因表达量的比值计算而来。内参基因Ubiquitin 1的引物对详见表2中UBQF和UBQR。实验重复三次，结果取平均值。

结果如图5中A所示，该结果显示缺氮处理诱导Ghd7基因上调表达，而抑制ARE1基因表达。

然后，发明人对野生型合江19(HJ19)和合江19背景下Ghd7基因过表达植物(实施例4所制备的OX-14和OX-25)、以及野生型中花11(ZH11)和ZH11背景下的Ghd7基因过表达植物(实施例4所制备的OX-Ghd7)对缺氮胁迫的敏感性进行分析。

实验方法具体为：将在正常生长条件下(含1.46mM硝酸铵)生长2周的上述植物，移至缺氮生长条件下(含0mM硝酸铵)继续培养0、0.5、1、2、3、6、12和24小时后，分别收集上述植物的根组织，通过RT-qPCR技术检测根中氮素吸收相关标志基因OsAMT1；1、OsAMT1；2和OsAMT1；3，以及氮素同化相关标志基因OsGS1；2和OsNADH-GOGAT1的表达量变化趋势，来分析植物对缺氮处理的敏感性。RT-qPCR引物分别为表2中的OsAMT1；1F和OsAMT1；1R、OsAMT1；2F和OsAMT1；2R、OsAMT1；3F和OsAMT1；3R、GS1；2F和GS1；2R、GOGAT1F和GOGAT1R。内参基因Ubiquitin 1的引物对详见表2中UBQF和UBQR。实验重复三次，结果取平均值。

结果如图5中的B-K所示。结果表明，在携带Ghd7-0a无效变异的合江19(HJ19)背景下，缺氮处理诱导HJ19根中的氮素吸收标志基因OsAMT1；1、OsAMT1；2和OsAMT1；3，以及氮素同化标志基因OsGS1；2和OsNADH-GOGAT1不同程度的上调表达(图5中B、C、D、E和F)，而缺氮处理同样诱导Ghd7过表达植物(OX-14和OX-25)中上述标志基因的上调表达，但这些标志基因在Ghd7过表达植物中受缺氮处理诱导上调表达的程度显著低于野生型HJ19(图5中B、C、D、E和F)，表明过量表达Ghd7基因降低植物对缺氮胁迫的敏感性。相似地，在携带Ghd7-2弱等位变异的中花11(ZH11)背景下，过量表达Ghd7同样降低上述氮素吸收和同化相关标志基因受缺氮诱导上调表达的程度(图5中G、H、I、J和K)，表明Ghd7基因过表达植物对缺氮胁迫不敏感。

实施例6、Ghd7基因过表达植物对低氮胁迫的耐受性分析

将野生型ZH11与ZH11背景下的Ghd7过表达植物OX-Ghd7(实施例4制备)，以及野生型HJ19与HJ19背景下的Ghd7过表达植物OX-14和OX-25(实施例4制备)分别在高氮(1.46mM硝酸铵)和低氮(0.78mM硝酸铵)生长条件下水培生长三周后，收取植物的根并提取总RNA，通过RT-qPCR技术检测上述植物中铵根转运蛋白基因OsAMT1；1，OsAMT1；2和OsAMT1；3，以及氮同化基因OsGS1；2和OsNADH-GOGAT1的表达量，RT-qPCR引物分别为表2中的OsAMT1；1F和OsAMT1；1R、OsAMT1；2F和OsAMT1；2R、OsAMT1；3F和OsAMT1；3R、GS1；2F和GS1；2R、GOGAT1F和GOGAT1R。内参基因Ubiquitin 1的引物对详见表2中UBQF和UBQR。实验重复三次，结果取平均值。

结果如图6中A-J所示，在高氮生长条件下，与野生型HJ19相比，Ghd7过表达植物OX-14和OX-25根中铵根转运蛋白基因OsAMT1；1，OsAMT1；2和OsAMT1；3，以及氮同化基因OsGS1；2和OsNADH-GOGAT1的表达量没有发生显著的变化(图6中A、B、C、D和E)；在低氮生长条件下，与野生型HJ19相比，OX-14和OX-25植物根中OsAMT1；1，OsAMT1；2，OsAMT1；3和OsNADH-GOGAT1基因的表达量显著增加(图6中A、B、C、D和E)，表明过量表达Ghd7基因增加氮素的吸收和同化。与野生型中花11相比，Ghd7过表达植物OX-Ghd7表现出类似的结果(图6中F、G、H、I和J)。

本发明的发明人进一步通过田间氮肥试验分析了Ghd7基因是否参与调控植物对低氮胁迫的耐受性。

野生型ZH11与ZH11背景下的Ghd7过表达植物OX-Ghd7(实施例4制备)，以及野生型HJ19与HJ19背景下的Ghd7过表达植物OX-14和OX-25(实施例4制备)分别在高氮(HN，300kg/ha尿素)和低氮(LN，180kg/ha尿素)生长条件下生长。

在水稻成熟期，株高由测量植物根基部至主穗顶部的长度获得，SPAD值作为植物叶片相对叶绿素含量的一个指标，由便携式叶绿素仪SPAD-502Plus(日本KONICAMINOLTA公司产品)在主茎旗叶的中部测得，穗粒数由主穗上的饱满种子数目统计而来，产量由单株植物脱粒后称重获得。所有上述性状至少统计40株植物，结果取其平均值。

田间氮肥试验结果表明，与水稻HJ19和ZH11相比，Ghd7过表达植物的株高、旗叶叶绿素含量和穗粒数均显著增加(图7中A、B、C和D)。在低氮生长条件下，野生型和Ghd7基因过表达植物的株高、旗叶叶绿素含量以及穗粒数均有所降低，但Ghd7基因过表达植物中上述性状受低氮胁迫降低的程度显著低于野生型(图7中B、C和D)，表明过量表达Ghd7基因增加植物对低氮胁迫的耐受性。与此相吻合，过量表达Ghd7基因同时增加高氮和低氮生长条件下的水稻产量，且过量表达Ghd7的增产效应在低氮生长条件下更加明显(图7中E)。值得指出的是，Ghd7过表达植物在低氮生长条件下的产量与野生型在高氮生长条件下的产量几乎保持一致(图7中E)。上述结果表明，Ghd7基因正调控植物对低氮胁迫的耐受性和水稻产量。

上述实验结果表明，Ghd7基因是调控植物抗低氮胁迫的重要基因。Ghd7基因过表达植物增加水稻抗低氮胁迫能力，提高水稻在低氮生长条件下的氮素利用效率和产量；Ghd7基因是改良水稻耐低氮性的有效遗传位点；过量表达Ghd7基因增强水稻抗低氮胁迫的能力，是培育植物耐低氮胁迫新品种的有效方法。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 蛋白质Ghd7在调控植物抗低氮性中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 257

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

Met Ser Met Gly Pro Ala Ala Gly Glu Gly Cys Gly Leu Cys Gly Ala

1 5 10 15

Asp Gly Gly Gly Cys Cys Ser Arg His Arg His Asp Asp Asp Gly Phe

20 25 30

Pro Phe Val Phe Pro Pro Ser Ala Cys Gln Gly Ile Gly Ala Pro Ala

35 40 45

Pro Pro Val His Glu Phe Gln Phe Phe Gly Asn Asp Gly Gly Gly Asp

50 55 60

Asp Gly Glu Ser Val Ala Trp Leu Phe Asp Asp Tyr Pro Pro Pro Ser

65 70 75 80

Pro Val Ala Ala Ala Ala Gly Met His His Arg Gln Pro Pro Tyr Asp

85 90 95

Gly Val Val Ala Pro Pro Ser Leu Phe Arg Arg Asn Thr Gly Ala Gly

100 105 110

Gly Leu Thr Phe Asp Val Ser Leu Gly Glu Arg Pro Asp Leu Asp Ala

115 120 125

Gly Leu Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Arg His Ala Glu Ala Ala Ala

130 135 140

Ser Ala Thr Ile Met Ser Tyr Cys Gly Ser Thr Phe Thr Asp Ala Ala

145 150 155 160

Ser Ser Met Pro Lys Glu Met Val Ala Ala Met Ala Asp Asp Gly Glu

165 170 175

Ser Leu Asn Pro Asn Thr Val Val Gly Ala Met Val Glu Arg Glu Ala

180 185 190

Lys Leu Met Arg Tyr Lys Glu Lys Arg Lys Lys Arg Cys Tyr Glu Lys

195 200 205

Gln Ile Arg Tyr Ala Ser Arg Lys Ala Tyr Ala Glu Met Arg Pro Arg

210 215 220

Val Arg Gly Arg Phe Ala Lys Glu Pro Asp Gln Glu Ala Val Ala Pro

225 230 235 240

Pro Ser Thr Tyr Val Asp Pro Ser Arg Leu Glu Leu Gly Gln Trp Phe

245 250 255

Arg

<210> 2

<211> 1009

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

caacttgccc tgtcttcttc ttcttcttct tcttgtacct atattattac aagtcatcga 60

tctcgctgat cgatcagtga tcacaagcat ttcacaaccc tagctagctg agctgatcga 120

gctcaagtga cctcacctgc tatagctaac ttactagcta gctctagcta gttgttgttt 180

gtagctcgat cgagtttgat ttatccgttc atgtcgatgg gaccagcagc cggagaagga 240

tgtggcctgt gcggcgccga cggtggcggc tgttgctccc gccatcgcca cgatgatgat 300

ggattcccct tcgtcttccc gccgagtgcg tgccagggga tcggcgcccc ggcgccaccg 360

gtgcacgagt tccagttctt cggcaacgac ggcggcggcg acgacggcga gagcgtggcc 420

tggctgttcg atgactaccc gccgccgtcg cccgttgctg ccgccgccgg gatgcatcat 480

cggcagccgc cgtacgacgg cgtcgtggcg ccgccgtcgc tgttcaggag gaacaccggc 540

gccggcgggc tcacgttcga cgtctccctc ggcgaacggc ccgacctgga cgccgggctc 600

ggcctcggcg gcggcggcgg ccggcacgcc gaggccgcgg ccagcgccac catcatgtca 660

tattgtggga gcacgttcac tgacgcagcg agctcgatgc ccaaggagat ggtggccgcc 720

atggccgatg atggggagag cttgaaccca aacacggtgg ttggcgcaat ggtggagagg 780

gaggccaagc tgatgaggta caaggagaag aggaagaaga ggtgctacga gaagcaaatc 840

cggtacgcgt ccagaaaagc ctatgccgag atgaggcccc gagtgagagg tcgcttcgcc 900

aaagaacctg atcaggaagc tgtcgcaccg ccatccacct atgtcgatcc tagtaggctt 960

gagcttggac aatggttcag atagataatt acagtgcgta tataccact 1041

<210> 3

<211> 3809

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

aaatccacgg ctgacgcacc gatgctccac cacagctcaa cctctgccga tgtgtgggac 60

cactgcaccc cgtccccgcc ggctagcctt cgtgcgccga agaccgcgcc acaccctcaa 120

tctattatca gtcatatgta tgagagcaac cacggtatat cgaaaggtaa ccttatggca 180

atgattacat ttataaagtg gaacacatac attgtgagaa atagctttag cttagagtgc 240

atcttatact taaggtctac cacaagcata aagaaaatat tctctctctc atttatgtca 300

tgaacaagag ctgaaaagca ggtttttcta tctcataagg gccccatatt attgttaaat 360

ttcagcaagg gattagctaa aaaactgttg caggtttttt gagtaaaaaa ctttcaaatc 420

taactatagt acataatttt actagaacta cactataata attatataac ttgtatagat 480

gtattaaaat aatatatgca actttatatc taatttgata gagataataa tgtagttact 540

gtaactaggg tataactgga gtataagtaa catgtaactt gctaattttt taaaaaactt 600

gcaagctggt gggatcgagg tcctgggttc gaaccccatg cagcgcacaa attatgtttc 660

tcacacggga tttttttcca tgaacgcgcc agcacgaatc ttgagatgaa tctgacggtc 720

aaaaattcga aagaatttac ccccgttttc tgtcgataga aaactagcaa atccgtttca 780

gcaatagcat tatgggaatt gctttaacaa caatcaaact attcatgggc cacttctaag 840

atcacactag acccatatac attgagattg ccctgatata tccatctaat tcatggacat 900

tttcctagtc ttggggggat ataatataat aggagctaga ggggggcatg ggtagtgaag 960

tccagccagc gcagaagatc cttgggggga tctggttgca atggggatgg ccaatgagga 1020

gtcgccaaat tatcaggtga aaaaaggcgg ccggattcct ccacgtaagg accaaatcca 1080

tccacagatc gccccgctct cctcgatcga tcataatatg atctcgcaat ggccccccta 1140

cctttccctc atccccaact tgccctgtct tcttcttctt cttcttcttg tacctatatt 1200

attacaagtc atcgatctcg ctgatcgatc agtgatcaca agcatttcac aaccctagct 1260

agctgagctg atcgagctca agtgacctca cctgctatag ctaacttact agctagctct 1320

agctagttgt tgtttgtagc tcgatcgagt ttgatttatc cgttcatgtc gatgggacca 1380

gcagccggag aaggatgtgg cctgtgcggc gccgacggtg gcggctgttg ctcccgccat 1440

cgccacgatg atgatggatt ccccttcgtc ttcccgccga gtgcgtgcca ggggatcggc 1500

gccccggcgc caccggtgca cgagttccag ttcttcggca acgacggcgg cggcgacgac 1560

ggcgagagcg tggcctggct gttcgatgac tacccgccgc cgtcgcccgt tgctgccgcc 1620

gccgggatgc atcatcggca gccgccgtac gacggcgtcg tggcgccgcc gtcgctgttc 1680

aggaggaaca ccggcgccgg cgggctcacg ttcgacgtct ccctcggcga acggcccgac 1740

ctggacgccg ggctcggcct cggcggcggc ggcggccggc acgccgaggc cgcggccagc 1800

gccaccatcg tgagtatcaa tccaataatc ctgatccggc cggcatgatc ggctcgattg 1860

agccgtgtcg attattaatt tccatcttat atattattaa ttgatgaatt cttgattgat 1920

tcatcgatcc tcctcgtctt ttcttggctt ctttgttttt gttatttagt caaaaacaac 1980

tcttcatttc tgctgcctat atgccgtaca acttcaaact atcaaaggtc aaataatcga 2040

tcaatatata ccaagtttga attaatttgg agcttaatta attaattact ggcttgcagc 2100

agctggttta tagtattgtt tctagctata tatgtgaggg ccgtgtgtgg gatgtgattt 2160

gcatctttcg atggcgactt aattaattcg atgatatatt tcattgcata tgcatacgga 2220

tccagcctct gtctatactg tacgattcca catacgtata tgtacggtta agtcagtata 2280

tatactttta gatagtcgcg tgtgcttttc gagttcggta gctatatttt agattgtaaa 2340

aacaagtcag aggctaattt tataatctag aaatacttat ttccccatat ataagcgtat 2400

gttaaatatt gatggtgtaa tctacttata tgtcaggaaa catcattgct tgctttctgg 2460

cgctttcttc tacatatcag tagaggaaaa tggaaaaaaa aagatgaatt ttgatgttgt 2520

agtttgctat attcagcata tataccatca gttatacata tgcagatctt gctaaaacca 2580

aaataaaaat agaactgtaa ggagatattg tgcttctcgg tctatttact tacagtttgt 2640

tgagaagtaa tacgagcaag caaatgtata tatatatttc tttagaactg caaggagatg 2700

catatacatg tgtgattcaa acacacgtac tgcacattca aactataaaa acaacttgat 2760

tgccgtagaa gttaaaaggg agacatatcc atgggtttcg gattctaaat caatctatgt 2820

gtaaatgaaa ctttagtata gtaggaaata ggttttcaaa aaaaaaagta tagtaggaaa 2880

tagtatgtgt atatgccttt ttaaccctta attacaagtt gttataattc agtgttaaca 2940

aagtcacgga ctcacagagt gtgcccttac acaatttcag actaatttgt aaatgcatcg 3000

atcgtcacat tttatgtggt tcaattatct gacacagtta attaatggtg gccgatcgat 3060

gtatgctctt ctagctttcc agctatatgc gtatgtaata aatgaataaa acgtgtagga 3120

tgaaatgtga atacgcatca ttgtaattaa tttgattaat gctagtaaaa aatctgcaaa 3180

tttgtctttt tgaaattaaa atatgcctta taaaattaat ggacccaggc ccctagggca 3240

aaatatattg gggcacaaaa tcatgtccat atatacattc ttatttgaaa gtagactctg 3300

aaacaaaata tgcccatata aatcaaggga ggttacaact aactgcattt gcttatgcgt 3360

acatctggat tgtaacttct atgttttgta catacgatga ttaattgtat tcgagcttct 3420

taattgtaca tctattaact aactagtttt gcagatgtca tattgtggga gcacgttcac 3480

tgacgcagcg agctcgatgc ccaaggagat ggtggccgcc atggccgatg atggggagag 3540

cttgaaccca aacacggtgg ttggcgcaat ggtggagagg gaggccaagc tgatgaggta 3600

caaggagaag aggaagaaga ggtgctacga gaagcaaatc cggtacgcgt ccagaaaagc 3660

ctatgccgag atgaggcccc gagtgagagg tcgcttcgcc aaagaacctg atcaggaagc 3720

tgtcgcaccg ccatccacct atgtcgatcc tagtaggctt gagcttggac aatggttcag 3780

atagataatt acagtgcgta tataccact 3809

Claims

1.应用，其特征在于：所述应用为如下A1)至A10)中的至少一种：

A1)蛋白质Ghd7在调控植物的产量中的应用；

A2)蛋白质Ghd7在调控植物的单株产量中的应用；

A3)蛋白质Ghd7在调控植物的株高中的应用；

A4)蛋白质Ghd7在调控植物的穗粒数中的应用；

A5)蛋白质Ghd7在调控植物的叶绿素含量中的应用；

A6)蛋白质Ghd7在调控植物抗低氮性中的应用；

A7)蛋白质Ghd7在调控植物对缺氮胁迫的敏感性中的应用；

A8)蛋白质Ghd7在调控植物中氮素吸收标志基因的表达量中的应用；

A9)蛋白质Ghd7在调控植物中氮素同化标志基因的表达量中的应用；

A10)蛋白质Ghd7在调控植物中AREl基因的表达量中的应用；

所述蛋白质Ghd7为a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

a2)在序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同生物学功能的蛋白质；

a4)与序列表中SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于水稻且具有相同生物学功能的蛋白质。

2.应用，其特征在于：所述应用为如下B1)至B10)中的至少一种：

B1)与权利要求1中所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物的产量中的应用；

B2)与权利要求1中所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物的单株产量中的应用；

B3)与权利要求1中所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物的株高中的应用；

B4)与权利要求1中所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物的穗粒数中的应用；

B5)与权利要求1中所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物的叶绿素含量中的应用；

B6)与权利要求1中所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物抗低氮性中的应用；

B7)与权利要求1中所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物对缺氮胁迫的敏感性中的应用；

B8)与权利要求1中所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物中氮素吸收标志基因的表达量中的应用；

B9)与权利要求1中所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物中氮素同化标志基因的表达量中的应用；

B10)与权利要求1中所述蛋白质Ghd7相关的生物材料在调控植物中BRE1基因的表达量中的应用；

所述生物材料为下述c1)至c7)中的任一种：

c1)编码权利要求1中所述蛋白质Ghd7的核酸分子；

c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；

c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；

c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；

c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞糸；

c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；

c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

c1所述核酸分子为如下d1)或d2)或d3)或d4)或d5)所示的DNA分子：

d1)核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

d2)核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

d3)编码区如序列表中SEQ ID NO.2第211-984位所示的DNA分子；

d4)与d1)或d2)或d3)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于水稻且编码权利要求1中所述蛋白质Ghd7的DNA分子；

d5)在严格条件下与d1)或d2)或d3)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质Ghd7的DNA分子。

4.培育转基因植物的方法，其特征在于：

包括向出发植物中导入提高权利要求1中所述蛋白质Ghd7的含量和/或活性的物质，得到转基因植物的步骤；

1)植物产量增加；

2)植物株高受低氮胁迫抑制程度降低；

3)植物穗粒数受低氮胁迫抑制程度降低；

4)植物叶绿素含量受低氮胁迫抑制程度降低

5)植物抗低氮性增加；

6)植物对缺氮胁迫的敏感性降低；

7)植物中氮素吸收标志基因的表达量增加；

8)植物中氮素同化标志基因的表达量增加；

9)植物中ARE1基因的表达量降低。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述提高权利要求1中所述蛋白质Ghd7的含量和/或活性的物质为权利要求2或3中的所述蛋白质Ghd7相关的生物材料。

6.植物育种方法，其特征在于：

包括增加植物中权利要求1中所述蛋白质Ghd7的含量和/或活性，从而植物具有下述至少一种特性：

1)植物产量增加；

2)植物株高受低氮胁迫抑制程度降低；

3)植物穗粒数受低氮胁迫抑制程度降低；

4)植物叶绿素含量受低氮胁迫抑制程度降低

5)植物抗低氮性增加；

6)植物对缺氮胁迫的敏感性降低；

7)植物中氮素吸收标志基因的表达量增加；

8)植物中氮素同化标志基因的表达量增加；

9)植物中AREl基因的表达量降低。

7.包含权利要求1中所述蛋白质Ghd7或权利要求2中所述生物材料的下述任意一种产品：

D1)提高植物产量的产品；

D2)提高植物株高的产品；

D3)提高植物穗粒数的产品；

D4)提高植物叶绿素含量的产品；

D5)提高植物抗低氮性的产品；

D6)降低植物对缺氮胁迫的敏感性的产品；

D7)提高植物中氮素吸收标志基因的表达量的产品；

D8)提高植物中氮素同化标志基因的表达量的产品；

D9)降低植物中ARE1基因的表达量的产品。

8.根据权利要求1-3任一所述的应用，根据权利要求4或5所述的方法或根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述氮素吸收标志基因选自AMT1；1基因、AMTl；2基因的和调控植物中AMT1；3基因中的一种或多种；

所述氮素同化标志基因为GS1；2基因的表达量和/或NADH-GOGAT1基因。

9.根据权利要求1-3任一所述的应用，根据权利要求4或5所述的方法或根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述植物为如下f1)至f4)中的任一种：

f1)双子叶植物；f2)单子叶植物；f3)禾本科植物；f4)水稻。