CN103397048B - 培育抗全蚀病和纹枯病转基因小麦的方法及其相关生物材料 - Google Patents

Abstract

本发明公开了培育抗全蚀病和纹枯病转基因小麦的方法及其相关生物材料。本发明的培育抗病转基因小麦的方法，包括向受体小麦中导入编码序列是序列表中序列1的第7至405位核苷酸的抗全蚀病相关基因得到抗病性高于所述受体小麦的抗病转基因小麦的步骤；所述抗病转基因小麦为a1或a2的小麦：a1、抗全蚀病和抗纹枯病的转基因小麦；所述抗病性为对全蚀病和纹枯病的抗性；a2、抗全蚀病的转基因小麦；所述抗病性为对全蚀病的抗性。实验证明转入上述抗全蚀病相关基因的转基因小麦与对照扬麦18相比，小麦全蚀病抗病效果提高60%-80%之间，小麦纹枯病抗病效果提高20%-33%之间。

Description

培育抗全蚀病和纹枯病转基因小麦的方法及其相关生物材料

技术领域

本发明涉及培育抗全蚀病和纹枯病转基因小麦的方法及其相关生物材料。 

背景技术

近年来，我国小麦生产区的土传真菌病害呈加重发生态势。小麦全蚀病(take-all）又称“黑脚病”和“立枯病”，是由真菌禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis var.tritici，Ggt)引起的一种世界性小麦土传病害（Gutteridge R J,Bateman G L,Todd A D.Variation in the effects of take‐all disease on grain yield and quality of winter cereals in field experiments.Pest management science,2003,59(2):215-224）。Ggt以菌丝体形式侵染小麦根部和茎基部，致使病株的大部分根部和茎基部变黑，传导组织被堵塞，分蘖数减少，成穗率较低，千粒重明显下降、植株枯死，抽穗后田间出现早枯白穗，导致严重减产，给小麦生产造成极大威胁。小麦纹枯病又称小麦尖眼点病(wheat sharp eyespot)，是世界小麦生产的重要土传真菌病害，主要危害小麦的茎秆基部，造成植株倒伏、枯死和白穗，导致小麦产量严重损失，一般地块小麦减产10%～30%,严重地块减产超50%（路妍,张增艳*,任丽娟,刘宝业,廖勇,徐惠君,杜丽璞,马鸿翔,任正隆,井金学,辛志勇.转Rs-AFP2基因小麦的分子分析及其纹枯病抗性，作物学报,2009,35:640-646）。我国小麦纹枯病主要是由禾谷丝核菌（Rhizo ctonia cerealis）引起的。自20世纪80年代以来，小麦纹枯病已成为我国长江流域麦区、黄淮麦区的主要病害。化学药剂防治上述土传病害的效果较差。因此，选育和推广抗病小麦品种是控制上述病害最经济、有效和安全的措施。然而,目前，生产上大面积推广品种、高代品系对全蚀病和纹枯病的抗性普遍较差；这两种土传病害的常规抗病育种进展缓慢。因此，发掘、利用抗病有效基因,开展抗全蚀病和/或纹枯病的小麦基因工程育种非常重要。 

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种小麦全蚀病抗病相关基因及其相关生物材料。 

本发明所提供的小麦全蚀病抗病相关基因，名称为AcAMP-sn，其编码序列是序列表中序列1的第7至405位核苷酸。 

其中，序列表中序列1由411个核苷酸组成，其编码序列是序列表中序列1的第7至405位核苷酸，编码序列表中的序列2（由132个氨基酸残基组成）。 

本发明所提供的小麦全蚀病抗病相关基因的相关生物材料的相关生物材料，具体可为下述B1）至B4）中的任一种： 

B1）含有AcAMP-sn的表达盒； 

B2）含有AcAMP-sn的重组载体、或含有B1）所述表达盒的重组载体； 

B3）含有AcAMP-sn的重组微生物、或含有B1）所述表达盒的重组微生物、或含有B2）所述重组载体的重组微生物； 

B4）含有AcAMP-sn的转基因植物细胞系、或含有B1）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B2）所述重组载体的转基因植物细胞系。 

上述生物材料中，B1）所述的含有AcAMP-sn的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达AcAMP-sn的DNA，该DNA不但可包括启动AcAMP-sn转录的启动子，还可包括终止AcAMP-sn转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人（1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128（CN101063139B(中国专利200710099169.7)），种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子（Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Odell等人（I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人（1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141;Proudfoot(1991)Cell,64:671;Sanfacon等人Genes Dev.,5:141;Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人（1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。 

在本发明的实施例中，所述AcAMP-sn表达盒中启动所述AcAMP-sn转录的启动子为玉米Ubiquitin启动子，终止所述AcAMP-sn转录的终止子为胭脂碱合成酶基因终止子TNos。 

可用现有的植物表达载体构建含有所述AcAMP-sn表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、 pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。在本发明的一个实施方式中，所述含有AcAMP-sn的重组载体为pAHC25::AcAMP-sn，所述pAHC25::AcAMP-sn是用序列表中序列1的第7至405位核苷酸所示的DNA分子替换pAHC25的SmaI和SacI酶切位点间的片段得到的重组表达载体。 

上述生物材料中，B3）所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。B4）所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。 

实验证明AcAMP-sn、或上述AcAMP-sn相关的生物材料、序列表中序列1的第7至405位核苷酸编码的蛋白可用于调控植物对全蚀病和纹枯病的抗性。 

所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，如小麦。既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦（如小麦品种扬麦18）。 

在本发明的一个实施方式中，所述全蚀病由禾顶囊壳小麦变种（Gaeumannomyces graminis var.tritici）引起，所述纹枯病由禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）R0301引起。 

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种培育抗病转基因小麦的方法。 

本发明所提供的培育抗病转基因小麦的方法，包括向受体小麦中导入编码序列是序列表中序列1的第7至405位核苷酸的抗全蚀病相关基因（AcAMP-sn）得到抗病性高于所述受体小麦的抗病转基因小麦的步骤；所述抗病转基因小麦为a1或a2的小麦： 

a1、抗全蚀病和抗纹枯病的转基因小麦；所述抗病性为对全蚀病和纹枯病的抗性； 

a2、抗全蚀病的转基因小麦；所述抗病性为对全蚀病的抗性。 

上述方法中，编码序列是序列表中序列1的第7至405位核苷酸的抗全蚀病相关基因（AcAMP-sn）可通过AcAMP-sn表达盒导入受体小麦中，所述AcAMP-sn表达盒中启动所述AcAMP-sn转录的启动子为玉米Ubiquitin启动子，终止所述AcAMP-sn转录的终止子为胭脂碱合成酶基因终止子TNos。 

在本发明的一个实施方式中，所述抗全蚀病相关基因通过pAHC25::AcAMP-sn导入所述受体小麦中，所述pAHC25::AcAMP-sn是用序列表中序列1的第7至405位核苷酸所示的DNA分子替换pAHC25的SmaI和SacI酶切位点间的片段得到的重组表达载体。 

在本发明的一个实施方式中，所述全蚀病由禾顶囊壳小麦变种（Gaeumannomyces graminis var.tritici）引起，所述纹枯病由禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）R0301引起。所述受体小麦具体为扬麦18。 

上述方法中，其中所述AcAMP-sn基因可先进行如下修饰，再导入受体小麦中，以达到更好的表达效果： 

1）修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰； 

2）与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达； 

3）与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接； 

4）引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel）和病毒前导序列（例如来源于TMV,MCMV和AMV）。 

所AcAMP-sn可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach,1998，Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463;Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。 

上述方法中，所述转基因小麦理解为不仅包含将所述AcAMP-sn转化受体小麦得到的第一代转基因小麦，也包括其子代。对于转基因小麦，可以在该物种中繁殖 该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因小麦包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。 

实验证明5个转AcAMP-sn基因小麦株系A3、A4、A13、A8和A9与对照扬麦18相比，小麦全蚀病抗病效果提高在60%-80%之间，小麦纹枯病抗病效果提高在20%-33%之间，说明AcAMP-sn过表达显著增强了转基因小麦对全蚀病和纹枯病的抗性。 

附图说明

图1为pAHC25::AcAMP-sn表达载体的构建流程图。 

图2为转AcAMP-sn基因小麦T0代植株的PCR检测。 

图中，1-10：T0代转AcAMP-sn基因植株；WT：未转基因扬麦18；P：pAHC25::AcAMP-sn。 

图3为转AcAMP-sn基因小麦根部中AcAMP-sn基因表达的半定量RT-PCR(a)和Q-RT-PCR(b)分析。 

图中，WT:未转基因的扬麦18；A3:转AcAMP-sn株系A3；A4:转AcAMP-sn株系A4；A8:转AcAMP-sn株系A8；A9:转AcAMP-sn株系A9；A13:转AcAMP-sn株系A13。 

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。 

小麦品种扬麦18（江苏里下河地区农业科学研究所，品种权公告日为2011年5月1日，公告号为CNA003630G）。 

小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）R0301（江苏省农业科学院）（冷苏凤，张爱香，李伟，陈怀谷.江苏省小麦新品种（系）对纹枯病的抗性分析.江苏农业学报，2010，26（6）：1176-1180）。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。 

单子叶植物表达载体pAHC25（Christensen and Quail,1996;Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants.Transgenic Research，5,213–218），由作者之一赠送，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。pAHC25由pUC8改造而成，含有2个表达盒，第1个表达盒具有玉米 Ubiquitin启动子、Exon、Intron、GUS、Nos终止子，GUS两端具有SmaI和SacI酶切位点，第2个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、Bar、Nos终止子。 

实施例中所用的小麦全蚀病致病菌为Gaeumannomyces graminis var.tritici(Ggt)（Liu Xin,Yang Lihua，Zhou Xianyao,Zhou Miaoping,Lu Yan,Ma Lingjian,Ma Hongxiang,Zhang Zengyan*.Transgenic wheat expressing Thinopyrum intermedium MYB transcription factor TiMYB2R-1shows enhanced resistance to the take-all disease.Journal of experimental botany,2013,64(8):2243-2253），由西北农林科技大学分离、提供，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。 

实施例1、AcAMP-sn基因的获得和重组表达载体的构建 

人工合成了AcAMP-sn基因的编码序列，并在其5’端和3’端分别添加Sma I和Sac I限制内切酶的识别位点。AcAMP-sn基因的核苷酸序列如序列表中的序列1所示，由411个核苷酸组成，其编码序列如序列表中序列1的第7至405位核苷酸所示，其编码的蛋白序列如序列表的序列2所示，由132个氨基酸残基组成。 

AcAMP-sn基因被连接到pMD18-T vector上，构建了中间载体pMD18-AcAMP-sn，克隆到大肠杆菌细胞中。 

用限制内切酶Sma I和Sac I酶切中间载体质粒pMD18-AcAMP-sn，回收AcAMP-sn基因片段，同时用Sma I和Sac I双酶切单子叶高效组成型表达载体pAHC25，回收切除GUS基因的pAHC25载体骨架（约7700bp），并利用T₄连接酶将回收的AcAMP-sn基因片段与pAHC25载体片段以3∶1摩尔比连接，转化到E.coli菌株Top10感受态细胞中，通过菌落PCR筛选阳性克隆并测序，以确定构建成功、得到重组转基因表达载体质粒pAHC25::AcAMP-sn。根据测序结果，对重组质粒pAHC25::AcAMP-sn进行结构描述如下：将单子叶植物表达载体pAHC25的Sma I和Sac I酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列1第7至405位核苷酸所示的AcAMP-sn基因）。重组质粒pAHC25::AcAMP-sn的结构示意图见图1。该载体中目标基因AcAMP-sn的表达受玉米Ubiqutin启动子控制，Bar基因的表达由另一个Ubiqutin启动子控制，可为后续利用Bialaphos筛选转化再生植株提供抗性筛选标记。 

实施例2、转AcAMP-sn基因小麦植株的获得及其抗病性分析 

一、转AcAMP-sn基因小麦植株的获得 

1、将1600块扬麦18的幼胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体，用基因枪将实施例1的重组质粒pAHC25::AcAMP-sn轰击到愈伤组织，具体方法如下： 

1）将扬麦18的幼胚愈伤组织在高渗透培养基(SD2培养基附加0.2mol/L甘露醇，0.2mol/L山梨醇)上进行渗透处理4-6h（25℃，暗培养）：将愈伤组织放置在培养皿中央直径约2.5cm范围内，每盘培养皿50块愈伤组织。其中，SD2培养基的配方是MS培养基+1mg/L VB₁+150mg/L天冬门酰胺+2mg/L2,4-D。

2）用pAHC25::AcAMP-sn质粒包裹直径1μm金粉，采用PDS-1000/He基因枪(Bio-Red公司生产)，选择1100Psi的可裂膜，载样距靶材料6cm进行轰击。 

2、轰击后的愈伤组织继续在原培养基上培养16-18h（25℃，暗培养）。 

3、将愈伤组织转移到SD2培养基（MS培养基+1mg/L VB₁+150mg/L天冬门酰胺+2mg/L2,4-D)上，恢复培养2周（25℃，暗培养）。 

4、将愈伤组织转移到分化筛选培养基（1/2MS培养基+1mg/L玉米素+2mg/L Bialaphos）中，24-26℃光照培养14-21d。 

5、将愈伤组织分化小苗后转移到生长筛选培养基中（1/2MS培养基+4mg/LBialaphos），24-26℃光照培养14-28天，获得了100株生根的再生植株。 

6、将再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/L多效唑+6.3mg/L吲哚乙酸)上，24-26℃光照培养约21天。 

7、将苗高7-8cm且根系发达的植株移栽到花盆,在移栽到温室3周以后，有95株植株成活。 

8、分子鉴定 

在4叶期，每株成活的再生植株取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，根据转基因载体pAHC25::AcAMP-sn的序列，设计转基因检测的特异引物UBI-TU（5’-GCTCTGCCTTCATACGCTA-3’，位于Ubiquitin启动子序列上）和AcAMP-TL（5’-CAGAATGGACGAACAAAGG-3’，位于AcAMP-sn基因读码框上）进行转基因的PCR鉴定（目标条带为438bp）。扩增条件为94℃预变性5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物经含EB的2.0%琼脂糖凝胶电泳分析，紫外拍照。部分结果见图2。图2中，泳道1-10为PCR鉴定阳性植株，Y18为扬麦18（受体，阴性对照），P为重组质粒pAHC25::AcAMP-sn（阳性对照）。从95株成活的再生植株中筛选得到10株PCR鉴定阳性的植株，即为T0代转pAHC25::AcAMP-sn基因植株（T0代转AcAMP-sn基因植株），转化率为0.62%。 

9、植株的传代与转基因分子检测 

将步骤8得到的10株T0 转AcAMP-sn基因PCR呈阳性植株进行自交，获得的种子及其长成的植株为T1代植株，并单株播种T1代转基因植株，并进行转基因的分子检测和抗病性鉴定;依此类推，得到T4代植株。 

对转AcAMP-sn基因小麦株系的T1-T4代植株进行PCR检测，结果表明，A3、A4、A8、A9和A13每代材料均可以检测到转入的AcAMP-sn基因，说明转入的AcAMP-sn基因在这些 转基因小麦株系中能稳定遗传;在所测试的这5个转基因株系T4代各100个植株中均能检测到外源AcAMP-sn基因，表明在这5个转基因小麦株系中转入的AcAMP-sn基因已趋于纯合。 

用RNAiso Plus试剂盒(TaKaRa)提取转AcAMP-sn基因小麦T4代植株根部总RNA，按RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(TaKaRa)说明书合成第一链cDNA。利用ABI PRISMR7300实时荧光定量RT-PCR仪(ABI，美国)，以第一链cDNA为模板，小麦18S rRNA基因特异引物（F:5’-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3’;R:5’-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3′）为内参照，调整试材cDNA，使其浓度一致，然后用AcAMP-sn基因的特异引物（F:5’-CTACGGACTCGGAAGGGC-3’;R:5’-CCACCAGAATGGACGAACAA-3’）进行半定量RT-PCR分析。扩增条件为94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共32个循环；最后72℃延伸5min，3次独立重复。实时荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析按照SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)反应系统，反应体系为25μl，反应条件为94℃预变性2min；然后94℃变性15s，60℃退火31s，41个循环。对每个反应进行3次独立重复实验。以受体扬麦18为对照,用2^-ΔΔCT方法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the2^-△△CT method.Methods.25:402-408)^]计算转基因小麦根部AcAMP-sn基因的相对表达量。 

半定量RT-PCR分析结果表明，A3、A4、A8、A9和A13这5个稳定的转AcAMP-sn基因小麦株系根部中AcAMP-sn基因的转录水平明显高于受体扬麦18（图3中a）。进一步利用Q-RT-PCR分析上述5个转基因抗病株系中AcAMP-sn基因的相对表达量，结果表明转AcAMP-sn基因小麦株系根部中AcAMP-sn基因的相对表达量明显高于未转基因小麦中的表达量（图3中b），与半定量RT-PCR分析结果基本一致。 

二、转空载体植物的获得 

用单子叶植物表达载体pAHC25代替重组质粒pAHC25::AcAMP-sn转化扬麦18，其它同步骤一，得到T₄代转pAHC25植株，记作转空载体植株，作为转AcAMP-sn基因植株的对照。 

三、转基因植物的全蚀病和纹枯病的抗性鉴定 

1、全蚀病抗性鉴定 

采用菌饼法对步骤一和步骤二的转基因株系及受体小麦——扬麦18接种小麦全蚀病致病菌，将接种小麦全蚀病致病菌的小麦幼苗置于河沙与营养土质量比为1∶2的基质中，接种21天，调查单株的总根长和黑(病)根长，计算黑根面积占总根面积百分率，并将全蚀病严重度划分为0-4级〔0（0级）、0-10%（不包括0%）（1级）、10%-30%（不包括10%）（2级）、30%-60%（不包括30%）（3级）和60%-100%（不包括60%） （4级）〕。按照Bithell等（Bithell S,Butler R,Harrow S,Mckay A,Cromey M.Susceptibility to take-all of cereal and grass species,and their effects on pathogen inoculum.Annals of Applied Biology,2011,159(2):252-266）报道的方法计算全蚀病病情指数TAI(Take-all index)=(10×N₁+30×N₂+60×N₃+100×N₄)/(N₁+N₂+N₃+N₄)，N为各病级的病株数，采用SPSS19软件进行方差分析。实验重复三次，每个株系每次重复处理15个植株。并统计全蚀病抗病效果（％）＝〔（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数〕×100%。 

结果表明，接种小麦全蚀病致病菌21天，未转基因扬麦18出现典型的全蚀病病症，病根百分比为59.63%，全蚀病病情指数为72.73；而5个转AcAMP-sn基因小麦株系A3、A4、A13、A8和A9的病根百分比分别为10.46-19.61%，全蚀病病情指数为18.75、14.29、28.75、27.78及28.00，均与未转基因受体扬麦18的达极显著差异(P<0.01)（表1），5个转AcAMP-sn基因小麦株系A3、A4、A13、A8和A9与对照扬麦18相比，小麦全蚀病抗病效果提高了60%-80%之间，说明AcAMP-sn过表达显著增强了转基因小麦对全蚀病的抗性。 

2、纹枯病抗性鉴定 

采用牙签接种法(蔡士宾,任丽娟,颜伟,吴纪中,陈怀谷,吴小有,张仙义.Germplasm development and mapping of resistance to sharp eyespot(Rhizoctonia cerealis)in wheat.中国农业科学,2006,39(5):928-934)，对转基因小麦及受体小麦接种纹枯病菌R0301，并喷水保湿7天。于小麦乳熟期调查单株的纹枯病发病情况，根据小麦植株无病斑（0级）、叶鞘有病斑但不侵茎（1级）、病斑环茎小于1/2（2级）、病斑环茎1/2-3/4（3级）、病斑环茎3/4-1（不包括3/4，4级）、枯孕穗或枯白穗（5级），将纹枯病的严重程度划分为0～5级，并计算纹枯病病情指数，病情指数=[(Σ各级病株数×各级代表值)/(总株数×最高级代表值)]×100。采用SPSS19软件进行方差分析。实验重复三次，每个株系每次重复处理15个植株。并统计纹枯病抗病效果（％）＝〔（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数〕×100%。 

对5个稳定遗传的小麦转AcAMP-sn基因株系及其受体亲本扬18采用牙签接菌法进行纹枯病鉴定，结果见表1。扬18的纹枯病平均病级和平均病情指数分别为2.67和53.14，转基因株系A3、A4、A8、A9和A13的纹枯病病情指数分别为41.38、38.10、35.56、35.56、42.50。转基因株系A4、A8、A13均与未转基因受体扬麦18的平均病情指数达到显著差异（P<0.05），而A8和A9株系与扬18的病情指数达到极显著差异（P<0.01）,5个转AcAMP-sn基因小麦株系A3、A4、A13、A8和A9与对照扬麦18相比，小麦纹枯病抗病效果提高20%-33%之间，说明AcAMP-sn过表达显著增强了转基因小麦对纹枯病的抗性。 

表1转AcAMP-sn基因小麦及受体扬18的全蚀病及纹枯病鉴定结果 

注:**分别表示转基因株系与未转化扬麦18（受体）有极显著差异（P<0.01水平）。 

Claims (7)

1.一种培育抗病转基因小麦的方法，包括向受体小麦中导入编码序列是序列表中序列1的第7至405位核苷酸的抗全蚀病相关基因得到抗病性高于所述受体小麦的抗病转基因小麦的步骤；所述抗病转基因小麦为a1或a2的小麦：

a1、抗全蚀病和抗纹枯病的转基因小麦；所述抗病性为对全蚀病和纹枯病的抗性；

a2、抗全蚀病的转基因小麦；所述抗病性为对全蚀病的抗性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抗全蚀病相关基因通过pAHC25::AcAMP-sn导入所述受体小麦中，所述pAHC25::AcAMP-sn是用序列表中序列1的第7至405位核苷酸所示的DNA分子替换pAHC25的SmaI和SacI识别位点间的小片段得到的重组表达载体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述全蚀病由禾顶囊壳小麦变种引起，所述纹枯病由禾谷丝核菌引起。

4.编码序列是序列表中序列1的第7至405位核苷酸的DNA分子或所述DNA分子的相关生物材料在调控小麦对小麦全蚀病的抗性中的应用；所述相关生物材料，为下述B1)至B4)中的任一种：

B1)含有所述DNA分子的表达盒；

B2)含有所述DNA分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B3)含有所述DNA分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B4)含有所述DNA分子的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B2)所述重组载体的转基因植物细胞系。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述全蚀病由禾顶囊壳小麦变种引起。

6.序列表中序列1的第7至405位核苷酸编码的蛋白在调控小麦对小麦全蚀病的抗性中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述全蚀病由禾顶囊壳小麦变种引起。