CN110628786B - 基因bec1019在提高小麦的全蚀病抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及基因BEC1019在提高小麦全蚀病抗性中的应用。本发明的提高小麦对小麦全蚀菌抗性的方法包括在小麦中沉默基因BEC1019的步骤。BEC1019基因是小麦全蚀菌的重要效应子基因，可以利用该基因增强小麦对多种病原菌的抗病，培育具有持久、广谱抗性的小麦新品种。

Description

基因BEC1019在提高小麦的全蚀病抗性中的应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及基因BEC1019在提高小麦的全蚀病抗性中的应用。

背景技术

小麦是二十一世纪世界上产量最高、最重要的作物之一。小麦的生产对于全球粮食安全至关重要，但其粮食产量和质量受到了各种病虫害的巨大影响。作为遏制植物真菌病害发病率上升的措施，种植抗病品种和施用各种杀菌剂已成为农民采取的主要途径，而后者极易污染环境。此外，由于毒性菌种和抗杀菌剂菌株的迅速出现，传统育种已不能有效地防治农作物的大量病害，培育抗病品种已成为目前提高植物抗病性的主要途径。

根据生活周期的不同，植物病原菌可分为通过杀死宿主植物从而吸取营养的腐生真菌和仅以活体寄生的方式侵染寄主的活体真菌。植物对病原菌的识别主要包括两个层面，第一层免疫反应是由病原菌相关分子模式(Pathogen associated molecularpattern,PAMP)引起，植物细胞表面的模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)识别病原菌的PAMPs激发了PTI(PAMP-triggered immunity)抗性反应，包括一系列细胞反应：活性氧产生、MAPK激酶的激活、抗性基因的诱导表达和抗菌肽的产生等；第二层免疫反应是由病原菌特异的效应子(effector)基因激活的的ETI反应(Effector triggeredimmunity，ETI)，通常ETI反应比PTI反应更为强烈，因植物是由一系列具有NB-LRR结构域的抗病蛋白对效应子识别引起过敏反应的抗性反应，且ETI和PTI反应存在着复杂的信号转导途径，两者并不是完全独立的，它们的信号转导途径多有交叉。

小麦全蚀病是由腐生真菌禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminisvar.tritici,Ggt)引起的典型的土传真菌世界性病害，Ggt侵染小麦根系细胞后沿着茎基部向地上部蔓延，大量繁殖后堵塞根部导管，使得植物体内水分和营养运输受阻，最终导致植株变矮，叶片失绿变黄，地中茎和种子根变黑，造成麦田严重减产40-60％，严重可使小麦绝收。

宿主诱导的基因沉默(host induced gene silencing，HIGS)技术的发展加快了植物与病原菌互作的分子机制研究，尤其是在大麦白粉菌(Blumeria graminisf.sp.hordei，Bgh)Bgh中。

发明内容

本发明的目的在于提供基因BEC1019在提高小麦全蚀病抗性中的应用。

本发明的再一目的在于提供提高小麦对小麦全蚀病抗性的方法。

本发明对BEC1019基因在小麦全蚀菌(禾顶囊壳小麦变种)的同源基因进行克隆，结果发现BEC1019基因在小麦全蚀菌中的序列与大麦白粉菌完全同源。

BEC1019基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

ATGCAGTCTGTATTGCTTTTGACCGTTCTTACACAATCGTTTATAGCTACAGCTTCTCCTCTAGTAGAAAGATCTACACCACTCTCTTTTGCAGAGAAAAGGCCACAAAAAGTCTCCTACGACTGGACAACACCTTATGTCAAGGATTTCACAATTCACGGGTCATGTAATGCTACACAGACAAATGTACTCCGCCGTGGCTTAGAAGATGCTGTAACCCTTGCTCAGCATGCCAAAGAGCACATTCTGGTTCACGGAAAGGAATCACCAATCTACCAAAAGTATTATGGGGCGCTGCCTACAGGGGCAGTGATCGGATGGTTCGATACGATAGCGACAGCCAATCGGGCCGGTGTTACCTTCCGTTGTGATGACCCGGACAAAAAATGTGCAACCGAGAACCGATGGGCTGGTCACTGGCGCGGGAAAGATGCTCCTTCAGAGACGGTCATCTGTGATGTTTCCTTCTTTGAACGGCTTCCTTTGGAGGATTTGTGCTCACGAGGCTACAAAATTGCAACCGGTAAAGTATACTCATACTGGGGGGCTGATCTAATCCATCGCATGTTTCATGTGGACATCGTCGGTCAGAACGCCATAACTCATGCCTCACATGGTTACCAAGATGCCCTCAACCTTGCCGCGGGCCAAAATTACACCCAGACTGCCACAAATACCGACTCTCTCATTTACTTTGCGGTTGAGGCGTATGCGTTTGACATCAGCGTGCCCGGGGAGGGCTGTGCTGGCCAAGCCTCATCTATTCCCGATACGAAAGTCACTCCGACTGATCCAAACGCGCTGCCAGACTCAATCGTCATTCCCTCCCCTAAAGAACCCGAGAAGAAAGACGAGCCTGAGAAAAAAGCCGAGCCTGAAAAGAAGGCCGAGCCTGAAGCACTAGGAAAGAATTGCCATACCCACGACGATGGCGAGGTTCATTGTGTCTAG

根据本发明具体实施方式的提高小麦对小麦全蚀菌抗性的方法，包括在小麦中沉默基因BEC1019的步骤。

根据本发明具体实施方式的提高小麦对小麦全蚀菌抗性的方法，所述方法包括构建包含基因BEC1019的序列片段的沉默载体的步骤，基因BEC1019的序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

GTGATGACCCGGACAAAAAATGTGCAACCGAGAACCGATGGGCTGGTCACTGGCGCGGGAAAGATGCTCCTTCAGAGACGGTCATCTGTGATGTTTCCTTCTTTGAACGGCTTCCTTTGGAGGATTTGTGCTCACGAGGCTACAAAATTGCAACCGGTAAAGTATACTCATACTGGGGGGCTGATCTAATCCATCGCATGTTTCATGTGGACATCGTCGGTCAGAACGCCATAACTCATGCCTCACATGGTTACCAAGATGCCCT

根据本发明具体实施方式的提高小麦对小麦全蚀菌抗性的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将基因BEC1019中如SEQ ID NO.2所述的序列片段构建至载体pDONR207中，得到重组表达载体pDONR207-BEC1019-RNAi；

(2)将组表达载体pDONR207-BEC1019-RNAi与沉默载体pCAMBIA2301进行反应，得到重组质粒pCAMBIA2301-BEC1019-RNAi；

(3)利用农杆菌介导的转化法将重组质粒pCAMBIA2301-BEC1019-RNAi转入小麦成熟胚中；

(4)培养T1代，得到小麦全蚀菌抗性提高的株系。

本发明对禾顶囊壳小麦变种侵染的小麦根系的不同时间点进行了表达分析，qRT-PCR结果表明在禾顶囊壳小麦变种侵染4d时达到高峰。

将BEC1019基因全长构建到以35S启动子启动的植物载体CTAPi-GW-3HA中，以及BEC1019基因的部分片段构建至以35S启动子启动的pCAMBIA2301载体中，分别获得过表达重组载体CTAPi-GW-3HA-BEC1019和沉默重组载体pCAMBIA2301-BEC1019-RNAi，分别将以上重组载体转化农杆菌以备转化；以小麦成熟胚为受体，利用农杆菌介导的转化法将构建好的重组载体转入小麦成熟胚中，获得BEC1019基因过表达和沉默的T1代株系，对其接种禾顶囊壳小麦变种进行抗性分析。结果分析显示，过表达BEC1019基因后，显著地增强了小麦禾顶囊壳小麦变种的感病性，而利用HIGS技术在小麦中沉默BEC1019基因后，则明显地提高了小麦对小麦禾顶囊壳小麦变种的抗性；

BEC1019基因过表达植株中抗病标志基因显著下调表达，在沉默植株中抗病标志基因上调表达，与表型结果一致，说明本发明获得的BEC1019转基因植株可以稳定遗传。

本发明确认BEC1019基因是禾顶囊壳小麦变种的重要效应子基因，利用该基因可以增强小麦对多种病原菌的抗病，培育具有持久、广谱抗性的小麦新品种。

附图说明

图1显示BEC1019基因在野生型小麦根系接种Ggt不同时间点的表达量分析情况；

图2显示过表达BEC1019基因增强了小麦对Ggt的感病性，沉默BEC1019基因增加了对Ggt的抗病性；A为BEC1019过表达和沉默植株根系上接种Ggt 21d后发病部位的显微分析；B为BEC1019过表达和沉默植株接种Bgt 7d后真菌生物量检测；C为BEC1019过表达和沉默植株根系上接种Ggt 21d后表型分析；D为BEC1019在接种Ggt后的转基因植株中的表达量分析；

图3显示抗病标志基因的表达变化情况。

具体实施方式

材料与方法

1.1植物材料和病原菌

供试的小麦品种为普通面包小麦(Triticum aestivum L.)周麦26，分别由河南科技学院和周口市农业科学院提供，保存在河南作物分子育种与生物反应器重点实验室。禾顶囊壳小麦变种采用LY3-21生理小种，在马铃薯葡萄糖培养基上22℃培养5-7d。

本发明所用中间载体为pDONR207，植物过表达载体为CTAPi-GW-3HA，沉默载体为的pCAMBIA2301，克隆载体为pEASY-Blunt，采用大肠杆菌DH5α进行基因克隆，农杆菌EHA105进行小麦转化。

实施例1克隆BEC1019基因同源序列

取禾顶囊壳小麦变种侵染7d的小麦根系和茎基部，用液氮充分研磨后，在预冷的研钵中提取病原菌的DNA，设计引物，扩增禾顶囊壳小麦变种的BEC1019同源基因，PCR反应体系(50μL)：2×Easy pfu Mix 25μL，真菌DNA模板2μL，引物各1μL，ddH2O 21μL，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃再延伸5min，4℃保存备用。

引物序列如下：

BEC1019-F：5’-ATGCAGTCTGTATTGCTTTT-3’，

BEC1019-R：5’-CTAGACACAATGAACCTCGC-3’。

片段经电泳检测后纯化，分别取4μL的PCR产物，加入1μL的pEASY-Blunt克隆载体，室温反应30min以上，将离心管置于冰上，转化E.coli DH5α感受态细胞，均匀的涂布在含有100mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃培养箱过夜倒置培养后，选取阳性克隆质粒，进行测序比对。结果发现BEC1019基因在禾顶囊壳小麦变种中的序列与大麦白粉菌完全同源。

实施例2获得BEC1019过表达及沉默转基因植株

采用Gateway技术，首先分别将BEC1019基因的全长和264bp的片段(368-632bp)构建至中间载体pDONR207中，引物序列如下：

F：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGTGATGACCCGGACAAAA-3’

R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGGGCATCTTGGTAACCA-3’。

PCR反应体系为(5μL)：PCR回收产物3.5μL，pDONR207质粒1μL，BPClonase^TMⅡEnzyme Mix(Invitrogen)0.5μL。混合均匀后于低温恒温槽中25℃反应1～3h；然后将其转入感受态细胞E.coli DH5α中，转化后涂于含庆大霉素的LB培养基上，37℃过夜生长，挑取单克隆于含庆大霉素的液体LB培养基中培养，提取质粒后将阳性克隆进行测序，获得重组质粒pDONR207-BEC1019和pDONR207-BEC1019-RNAi。

将重组质粒pDONR207-BEC1019与过表达载体CTAPi-GW-3HA反应，pDONR207-BEC1019-RNAi与沉默载体pCAMBIA2301反应，反应体系及条件如下：重组质粒3μL，终载体CTAPi-GW-3HA和pCAMBIA2301各1μL，LR Clonase^TMEnzyme Mix 1μL。25℃，反应5h。将连接产物转化DH5α感受态细胞中，阳性菌落送测成功后获得重组质粒CTAPi-GW-3HA-BEC1019和pCAMBIA2301-BEC1019-RNAi。

BEC1019基因过表达质粒和沉默质粒通过冻融法转化至农杆菌EHA105中。分别挑取过表达质粒和沉默质粒的阳性农杆菌克隆，在含有卡那霉素的20ml LB液体培养基中过夜培养，温度为28℃，农杆菌的OD₆₀₀值达到2.0时，5000r/min离心6min收集农杆菌，重悬于溶液中(MS+乙酰丁香酮200umol/L+1％Triton 100)，28℃下黑暗振荡培养1～3h，在3h内使用。

选用大小饱满的种子，先用双蒸水冲洗干净，用75％的无水乙醇表面消毒1min，灭菌双蒸水冲洗3-5次，用0.1％升汞处理10min，再用灭菌水冲洗3-5次。用灭菌的手术刀沿着胚的中心纵切1刀，横切2刀，放置于诱导愈伤的培养基上(MS+2,4-D2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L)7d左右，在继代培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L)上继代培养14d左右，将继代14d左右的愈伤放置于上述农杆重悬液中浸染20-30min，之后将愈伤组织放在灭菌滤纸上沥干；再将愈伤组织转接至分化培养基(MS+6-BA 1mg/L+NAA0.3mg/L+KT 4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L)上，25℃光培养1个月左右，转移至新的分化培养基上，继续培养生成再生分化苗，当再生苗生长约2-3cm时，将再生苗转移至生根培养基上(1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂6g/L)，25℃光培养3-5d后，在4℃培养箱中春化一段时间后，春化结束后移栽入温室培养。

首先通过抗性基因对转基因植株进行初筛，在提取基因组DNA进行PCR扩增检测，之后通过qRT-PCR技术检测BEC1019基因在野生型和转基因植株中的表达情况，进一步对初筛的阳性植株进行再次筛选。将筛选获得的阳性转基因植株移入大田中，成熟后收获T1种子。

实施例3分析BEC1019基因在禾顶囊壳小麦变种中的表达模式

选取禾顶囊壳小麦变种侵染周麦26根系和茎基部后0、2、3、4、5、6和7d等7个时间点，提取以上不同时间点植物组织的RNA，合成第一链cDNA。采用禾顶囊壳小麦变种的18SrRNA作为内参基因，对BEC1019基因表达量进行分析。定量PCR，每次定量实验中每个模板进行三次同步扩增与检测，且进行三次生物学重复，引物序列如下：

Ggt-18S rRNA-F：5’-CGAACTCGGTCGTTTAGAGG-3’；

Ggt-18S rRNA-R：5’-GGTATGTTCACAGGGGTTGG-3’；

BEC1019-F：5’-TCATGTGGACATCGTCGGTC-3’，

BEC1019-R：5’-CACGCTGATGTCAAACGCAT-3’。

对禾顶囊壳小麦变种侵染的小麦根系的不同时间点进行表达分析，结果如图1所示，qRT-PCR结果表明在禾顶囊壳小麦变种侵染4d时达到高峰。

实施例4 BEC1019过表达及沉默转基因植株的感/抗病分析

全蚀病的接种方法采用菌块接种法，取新鲜的菌块(4×4cm2)接种在转基因和对照周麦26植株的根系，放置于温度白天20℃/夜晚12℃、光照周期16h/8h、相对湿度50％的光照培养箱中培养21d后，首先对其发病部位在台盼蓝中染色6h进行显微分析，再用CanonEOS 600D相机对发病部位进行表型观察和拍照。

在转基因和对照植株根系接种禾顶囊壳小麦变种21d后，取其发病部位显微观察发现，BEC1019过表达植株菌丝显著多于对照植株，BEC1019沉默植株发病部位菌丝则显著少于对照植株，如图2中A所示。

如图2中B、C所示，发病部位表型分析结果与显微观察结果一致，过表达BEC1019的植株茎基部黑褐色症状比对照植株更明显，沉默BEC1019的植株茎基部则无明显发黑变褐的现象。

如图2中D所示，荧光定量PCR结果显示，BEC1019的表达量在接种Ggt后，过表达植株中显著高于对照植株，而在沉默植株中显著低于对照植株，以上结果表明，在小麦中过表达BEC1019增强了对Ggt的感病性，而沉默BEC1019则增强小麦对Ggt的抗病性。

实施例5 BEC1019过表达及沉默转基因植株的抗病标志基因的表达变化

为进一步分析转基因植株中抗病标志基因的表达变化，提取BEC1019转基因和对照植株的RNA，利用荧光定量PCR试验分析TaPR2和TaPR10的表达量变化，参照基因选用小麦的TaActin基因。定量PCR，每次定量实验中每个模板进行三次同步扩增与检测，且进行三次生物学重复，引物序列如下：

TaPR2-F：5’-CCGGCCATACTACCCGGC-3’，

TaPR2-R：5’-ACACCTTGATGGCGCTGAGA-3’；

TaPR10-F：5’-ACGGAGCGGATGTGGAAG-3’

，TaPR10-R：GCCACCTGCGACTTGAGC-3’；

TaActin-F：5’-CCAGGTATCGCTGACCGTAT-3’，

TaActin-R：5’-GCTGAGTGAGGCTAGGATGG-3’。

如图3所示，荧光定量PCR结果发现，抗病标志基因TaPR2和TaPR10的表达量在BEC1019基因过表达植株中的表达量显著低于对照植株，而TaPR2和TaPR10的表达量在BEC1019基因沉默植株中表达量显著高于对照植株，与表型和显微观察结果一致，抗性增强的植株中病程相关蛋白基因表达量升高，而在感病性增强的植株中病程相关蛋白基因表达量下降。

序列表

<110> 周口师范学院

<120> 基因BEC1019在提高小麦的全蚀病抗性中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 951

<212> DNA

<213> 禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis var. tritici)

<400> 1

atgcagtctg tattgctttt gaccgttctt acacaatcgt ttatagctac agcttctcct 60

ctagtagaaa gatctacacc actctctttt gcagagaaaa ggccacaaaa agtctcctac 120

gactggacaa caccttatgt caaggatttc acaattcacg ggtcatgtaa tgctacacag 180

acaaatgtac tccgccgtgg cttagaagat gctgtaaccc ttgctcagca tgccaaagag 240

cacattctgg ttcacggaaa ggaatcacca atctaccaaa agtattatgg ggcgctgcct 300

acaggggcag tgatcggatg gttcgatacg atagcgacag ccaatcgggc cggtgttacc 360

ttccgttgtg atgacccgga caaaaaatgt gcaaccgaga accgatgggc tggtcactgg 420

cgcgggaaag atgctccttc agagacggtc atctgtgatg tttccttctt tgaacggctt 480

cctttggagg atttgtgctc acgaggctac aaaattgcaa ccggtaaagt atactcatac 540

tggggggctg atctaatcca tcgcatgttt catgtggaca tcgtcggtca gaacgccata 600

actcatgcct cacatggtta ccaagatgcc ctcaaccttg ccgcgggcca aaattacacc 660

cagactgcca caaataccga ctctctcatt tactttgcgg ttgaggcgta tgcgtttgac 720

atcagcgtgc ccggggaggg ctgtgctggc caagcctcat ctattcccga tacgaaagtc 780

actccgactg atccaaacgc gctgccagac tcaatcgtca ttccctcccc taaagaaccc 840

gagaagaaag acgagcctga gaaaaaagcc gagcctgaaa agaaggccga gcctgaagca 900

ctaggaaaga attgccatac ccacgacgat ggcgaggttc attgtgtcta g 951

<210> 2

<211> 265

<212> DNA

<213> 禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis var. tritici)

<400> 2

gtgatgaccc ggacaaaaaa tgtgcaaccg agaaccgatg ggctggtcac tggcgcggga 60

aagatgctcc ttcagagacg gtcatctgtg atgtttcctt ctttgaacgg cttcctttgg 120

aggatttgtg ctcacgaggc tacaaaattg caaccggtaa agtatactca tactgggggg 180

ctgatctaat ccatcgcatg tttcatgtgg acatcgtcgg tcagaacgcc ataactcatg 240

cctcacatgg ttaccaagat gccct 265

Claims (3)

1.提高小麦对小麦全蚀病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括在小麦中沉默基因BEC1019的步骤，其中，

所述基因BEC1019的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，

所述小麦全蚀病是由腐生真菌禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomycesgraminisvar.tri tici)引起。

2.根据权利要求1所述的提高小麦对小麦全蚀病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括构建包含基因BEC1019的序列片段的沉默载体的步骤，基因BEC1019的序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的提高小麦对小麦全蚀病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将基因BEC1019中如SEQ ID NO.2所示的序列片段构建至载体pDONR207中，得到重组表达载体pDONR207-BEC1019-RNAi；

(2)将重组表达载体pDONR207-BEC1019-RNAi与沉默载体pCAMBIA2301进行反应，得到重组质粒pCAMBIA2301-BEC1019-RNAi；

(3)将所述重组质粒pCAMBIA2301-BEC1019-RNAi转入小麦成熟胚中；

(4)培养T1代，得到小麦全蚀病抗性提高的株系。

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