CN108624599B - 水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用 - Google Patents

水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，公开了水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用。本发明发明人发现OsWRKY21基因在病虫害的防御反应中起正调控作用，即OsWRKY21基因能够提高水稻抗稻飞虱虫害的能力。OsWRKY21基因是转录因子基因，其在植物体内过量表达时，可以转录激活一系列下游抗病虫害功能基因的表达，赋予转基因植物良好的抗病效果，从而克服转入个别功能基因的不足之处。本发明不仅可以为后续WRKY转录因子抗虫机理研究提供基础，更是为丰富抗褐飞虱基因资源、培育高产高抗水稻品种提供理论依据。

Description

水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，特别涉及水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用。
背景技术
病虫害是造成水稻减产的主要因素之一，在水稻生产中比较严重的病虫害主要有稻飞虱(含褐飞虱、白背飞虱等)、稻纵卷叶螟、水稻二化螟、稻瘟病和纹枯病五种。其中，稻飞虱、卷叶螟和稻瘟病因具有年度波动大、发病急、容易大爆发等特点，对水稻生产的威胁最大。
稻飞虱属同翅目飞虱科，俗称火蠓虫、响虫，是一种单食性水稻害虫。我国危害水稻的稻飞虱主要有三种：褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱，其中以褐飞虱发生和危害最重，每年因褐飞虱危害导致全球水稻产量损失在10％以上。稻飞虱主要聚集在水稻基部为害，通过口器吸食稻株韧皮部的汁液，刺伤稻株茎叶组织，形成大量伤口，破坏水稻疏导组织，受害重时稻株基部发黑、腐烂，最终引起水稻瘫痪倒伏、干枯致死。除了直接取食，稻飞虱还是某些植物病毒的媒介，如褐飞虱能传播水稻草状从矮病和齿叶萎缩病、白背飞虱能传播水稻黑条矮缩病等。稻飞虱取食后排泄的蜜露，富含各种糖类、氨基酸，极易导致其他危害水稻的病菌滋生。稻飞虱具有迁飞性、突发性和猖獗性等特点，我国每年初次发生的虫源主要由亚洲大陆南部和热带终年发生地由南向北迁飞而来。每年春、夏随暖湿气流由南向北推进而逐代逐区向北迁移，常年可出现3～5次自南向北迁飞，并随季节气候变化可出现2～3次由北向南的回迁；褐飞虱繁殖能力极强，正常条件下每只雌性成虫可产卵200～700粒，并且20天足有即可繁殖一代。我国大面积推广的主栽培水稻品种中，对稻飞虱具有抗性的品种较少，主要依靠化学杀虫剂防治为主，但稻飞虱的迁飞性、突发性和猖獗性等特点，使得防治的难度大，成本高，因此而带来的害虫抗药性上升、有害物残留、环境污染等问题也使得防治效果越来越不理想。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用；
所述的水稻OsWRKY21转录因子基因的编码核苷酸序列如下所示：
ATGGCGATGCTGGGGAGCTCGTCGGCGGTGGTGCTGGAGCTGATGACGATGGGGTACCAGTCGGCGGCGTACCTCGGCGAGCTGCTCCGGGCGGCGTCCCCGGCGCAGGCAGGGGATGAGCAGCAGGAGCTCGCCGCGGAGATCCTCCGCTGCTGCGACCGCGTCATCGCCGAGCTGAACCGGGGAGGAGCCACTGGTGCTACTACCGGCAAGAAGCGGAAGGCGGCGGAGTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTGACCTCCCCTTCTCTCCCCGTCACGCCGACCAAAAGAAGGGCGCGTGGCGCGGAGGCGGTGAGGGAGGTGAGGAGCGGCACGACGACGGACGGGTTCATCTGGAGGAAGTACGGGCAGAAGGAGATCAATGGCTGCAAGCACCCGAGGCTCTACTACCGCTGCGCGTTCAGGGGCCAGGGCTGCCTCGCCACGCGGCGGGTGCAGCAGTCGCAGTCGCAGGACGACCCGGCCGCGGCGTTCGTGATCGCCTACTACGGCGAGCACACCTGCGGAGGCGACGCCGCCGCCGCCGCCGCGTGCCGGGACGGGGAACTAATGCCACCTGCCGTCATCAACTCCGGCGCGTCGAGCTTCGCCGCCGCTTGGAACATGGCCTCGCGTGAGCCGGCGTCGTCGCTCGCCGTCGAGCGGAGGAGCTGCGACGGCGACGCTCCCAGCGAGACGTCGCAGGGGTGGTCTCCCTCCTTCTCGTCGGAGGTGGAGCTGGACGTGGTGGGATTCGACCTCGCCGGAGCCGACTCGTCGGCGTCGCCGGTGTGGGAGTTCTTGAATGGCAGCTTCGACTGGGAATTCGTCATCAACTCCCTCTGA。
所述的植物指的是对虫害敏感的禾本科植物，优选为水稻，更优选为水稻品种籼稻9311。
所述的虫优选为稻飞虱，更优选为褐飞虱。
所述的水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用，包含如下步骤：应用农业生物技术方法，将水稻OsWRKY21转录因子基因转化入植物细胞，得到表达OsWRKY21蛋白的植物品种。
其中，使用PCR技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsWRKY21基因部分以及全长DNA或与其同源的一段DNA。将上述分离到包含OsWRKY21基因的序列与合适的植物表达载体连接，转化植物，获得表达OsWRKY21基因的抗病转基因植物。
所述的转化入植物细胞的方式包括基因枪转化法和农杆菌转化法。
所述的农杆菌转化法中所用的农杆菌优选为EHA105菌株。
所述的农杆菌转化法的步骤优选如下：将表达OsWRKY21的重组载体转入EHA105菌株中，得到转化菌株；以籼稻9311的幼胚为受体，转化菌株配制成OD660nm为0.4～0.6的侵染液作用受体，筛选，得到表达OsWRKY21蛋白的水稻。
所述的幼胚为开始灌浆第9天的种子分离得到的幼胚。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明的发明人通过基因功能研究，发现OsWRKY21基因在病虫害的防御反应中起正调控作用，即OsWRKY21基因能够提高水稻抗稻飞虱虫害的能力。OsWRKY21基因是转录因子基因，其在植物体内过量表达时，可以转录激活一系列下游抗病虫害功能基因的表达，赋予转基因植物良好的抗病效果，从而克服转入个别功能基因的不足之处。
(2)本发明发明人在使用农杆菌转化时，通过对比不同的农杆菌菌株，如LBA4404和EHA105；对比不同的受体，如成熟胚、开始灌浆第6、9、12天的幼胚；对比不同OD660nm的侵染液的转化效率，发现使用EHA105、开始灌浆第9天的幼胚，OD660nm＝0.6时，平均转化率从2％提升至14％以上。
附图说明
图1是T0代转OsWRKY21基因植株的PCR检测结果图；其中，泳道1～22为可能的转OsWRKY21基因植株，泳道M为分子量标准，泳道P为质粒阳性对照，泳道N为野生型植株阴性对照；+表示阳性；－表示阴性。
图2是T1代转OsWRKY21基因植株的RT-PCR检测结果图；其中，泳道1～10为不同株系的转OsWRKY21基因植株；N：野生型植株。
图3是T2代转OsWRKY21基因植株的RT-PCR检测结果图；其中，泳道1～8为同一株系的不同转基因植株；泳道N为野生型植株。
图4是T3代转OsWRKY21基因植株的qPCR检测结果图；其中，#1为1号株系，#2为2号株系，#4为4号株系，6#为6号株系。
图5是T2代转OsWRKY21基因植株和野生型植株接虫12天后的照片图；其中，#1为1号株系，#2为2号株系。
图6是T3代转OsWRKY21基因植株和野生型植株接虫9天后的照片图；其中，#1为1号株系，#2为2号株系。
图7是T2代转OsWRKY21基因植株和野生型植株的BPH存活率分析结果图；其中，#1为1号株系，#2为2号株系。
图8是T3代转OsWRKY21基因植株和野生型植株的BPH存活率分析结果图；其中，#1为1号株系，#2为2号株系。
图9是转OsWRKY21基因植株与野生型植株上的褐飞虱生历育期分析结果图；其中，图A是每株植株分别接种一对新近羽化的成虫，图B是每株植株同一批新孵化的幼虫3只；***表示P值＜0.005。
图10是转OsWRKY21基因植株与野生型植株中的褐飞虱取食量测定结果图；其中，图A为显示的滤纸照片图，图B是分析结果图；***表示P值＜0.005。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
首先，对于实施例的内容进行简要概述：在实验室前期工作中，对OsWRKY21基因功能进行了研究，发现OsWRKY21基因能应答多种化学诱导物、生物胁迫和非生物胁迫。结果表明OsWRKY21基因正调控水稻对酸雨和白叶枯病的抗性。接着，本发明发明人进一步研究OsWRKY21基因对褐飞虱的抗性。本发明发明人通过农杆菌转化法将OsWRKY21基因转入籼稻9311中，得到OsWRKY21转基因植株，发现OsWRKY21转基因植株无论从褐飞虱存活率、苗存活率还是褐飞虱取食量均表现出对褐飞虱更强的抗性。因此，我们认为OsWRKY21基因在水稻应答褐飞虱侵袭的防卫反应中是起着正调控的作用。这个发现不仅可以为后续WRKY转录因子抗虫机理研究提供基础，更是为丰富抗褐飞虱基因资源、培育高产高抗水稻品种提供理论依据。
实施例1含有OsWRKY21基因的表达载体的构建
含有OsWRKY21基因过量表达载体pDT-W21构建步骤如下：从实验室前期构建的含有OsWRKY21基因全长编码序列的T载体pGEM-OsWRKY21(已在专利号为“201210183789.X”、名称为“水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用”中公开)中，使用XbaI和KpnI双酶切获得OsWRKY21DNA片段，将其插入pCDTNGUS载体(已在文献“Chen SB etal.Green fluorescent protein as a vital elimination marker to easily screenmarker-free transgenic progeny derived from plants co-transformed with adouble T-DNA binary vector system.Plant Cell Rep.2005,23(9):625-31.”中公开)的XbaI和KpnI酶切位点之间，具体步骤参见TaKaRa公司限制性内切酶和T4连接酶说明书。随后从过量表达载体pUbiGUSPlus(已在文献“Vickers CE et al.A synthetic xylanase asa novel reporter in plants.Plant Cell Rep.2003,22(2):135-40.”中公开)中克隆Ubi启动子，并在序列两端引入HindIII和XbaI酶切位点，具体步骤参见TaKaRa公司
Figure BDA0001696205910000041
HS DNA Polymerase说明书。使用HindIII和XbaI双酶切处理后将Ubi启动子片段插入pCDTNGUS-OsWRKY21载体中，将重组质粒转化大肠杆菌菌种DH5α，酶切鉴定为阳性的克隆即含有OsWRKY21基因过量表达载体pDT-W21。
分别将含pCDTNGUS质粒的大肠杆菌DH5α和含pDT-W21质粒的大肠杆菌DH5α接种于含25μg/mL氯霉素的LB培养基，于37℃、150rpm的条件下培养过夜。按OMEGA质粒小量提取试剂盒说明书抽提质粒，备用。
实施例2OsWRKY21基因的转化
(1)农杆菌感受态的制备和转化
1)农杆菌冷冻转化法
A、取50μL农杆菌EHA105菌液加入到5mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，26℃，250r/min培养12h进行菌株活化；
B、取250uL活化好的待转化菌株菌液加入到25mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，26℃，250r/min培养12h进行扩大培养；
C、取20mL培养好的菌液分装于两个25mL冷冻离心管中，4℃，4000r/min离心10min；弃上清，每管加入10mL预冷的1×TE重悬沉淀，置冰上15min；
D、4℃，4000r/min离心10min；
E、每管加入1mL YEB液体培养基重悬沉淀，分装于4个1.5Ml EP管中，每管加100μL。
F、每管加入10μL质粒(2管转化组质粒pDT-W21，2管阴性对照组质粒pCDTNGUS)，轻轻吹打混匀；
G、依次置于冰上、液氮、37℃水浴各5min；
F、每管分别加入YEB液体培养基500μL，28℃震荡培养3h；
H、常温下，4500r/min离心5min，用200μL YEB液体培养基重悬，涂布于加了氯霉素(25μg/mL)的YEB固体培养基上培养2-3d；
I、若转化组的平板上有菌落出现而阴性对照组无菌落出现，则获得转化成功的菌株，可挑取单菌落进行培养保菌种并进行进一步的鉴定；
J、挑取数个单菌落在乳糖培养基上划平板，每个平板分区划4个不同的单菌落；
K、待平板上长出菌落，加入本尼迪特试剂(Benedict’s Reagent)，30min后，如果菌落周围的乳糖培养基由乳白色变为黄色，说明该菌落是根癌农杆菌。最终得到含OsWRKY21基因的农杆菌EHA-OsWRKY21。
(2)根癌农杆菌介导的籼稻幼胚转化法
1)提前三天将农杆菌EHA-OsWRKY21划平板于AB固体培养上培养3d；
2)取籼稻9311种子(约8-9穗)，选取的标准是稻穗已经灌浆但是未完全成熟，用指甲轻掐穗粒有轻微凹陷但是不破裂，更具体的是开始灌浆第9天的种子；
3)去除种子的外壳，在超净台中，置于已灭菌的100mL三角瓶中；
4)加入50mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液，震荡10秒；
5)弃去废液，加入50mL浓度为质量百分比1.5％的次氯酸钠溶液(含2滴Tween-20)，震荡5min；
6)弃去消毒液，用无菌水漂洗5-6次；
7)弃去废液，将种子置于已灭菌的滤纸皿上；
8)在滤纸皿上从未成熟的种子中剥离出幼胚，置于琼脂培养基上暂存；
9)将剥离出的幼胚置于装有1mL无菌水的已灭菌1.5mL EP管中，用手指轻弹管壁使幼胚都沉于EP管底部；
10)将EP管置于43℃水浴中加热30min；
11)水浴期间，挑取适量培养好的根癌农杆菌EHA-OsWRKY21溶于AA-inf培养基中制成侵染液(侵染液的在660nm的OD值约为0.6)；
12)水浴完毕后，将EP管置于冰上冷却1min；
13)常温下，1100g离心10min；
14)将预处理好的幼胚连同无菌水倒入滤纸皿上，用移液器吸去多余水分；
15)将幼胚盾片朝上置于NBAS培养基上(每皿约100块)；
16)在每块幼胚上滴加5μL制备好的根癌农杆菌侵染液；
17)常温下共培养15-20min至侵染液完全渗入培养基中；
18)将共培养完的幼胚盾片朝上移到新的NBAS培养基上(每皿约50块)，28℃，黑暗共培养7d；
19)共培养7d后的幼胚可以观察到已经诱导长出愈伤组织和胚根，愈伤周围有明显的白色菌圈，将胚根切除，愈伤组织转移至CCMC培养基上，32℃、5000lx持续光照培养5d；
20)将每一块愈伤切成3-4小块，移至新的CCMC培养基上，32℃、5000lx持续光照培养10d；
21)将培养良好的愈伤每一块再切成4-6小块，移至CCMCH60筛选培养基上，32℃、5000lx持续光照培养15d；
22)将生长良好，表现出抗潮霉素B筛选的愈伤移至NBPRH40预再生培养基上，32℃、5000lx持续光照培养14d；
23)将生长良好，已经冒出绿芽的愈伤移至RNMH30再生培养基上，32℃、5000lx持续光照培养14d；
24)将再生出的幼苗移至MSI生根培养基上，32℃、5000lx持续光照培养14d；
25)将根生长旺盛的幼苗移至营养土中培养；
26)苗在营养土中种植7d后，取叶片进行转基因检测，阳性苗种植3周后移栽到泥土中继续生长。
(3)转OsWRKY21基因植株的分子鉴定
为检测OsWRKY21基因在转基因植株中的整合、遗传和表达情况，利用PCR、RT-PCR(逆转录PCR)、qPCR技术对转基因当代植株(T0代)及其后代植株(T1、T2、T3代)进行分子鉴定和遗传分析。其中，T1代为T0代自交得到的后代，T2代为T1代自交得到的后代，以此类推。
植株基因组DNA的提取可通过植物基因组DNA提取试剂盒提取，或CTAB法提取。植物总RNA的提取可通过植物RNA分离试剂盒或TRIzol法提取，运用DNaseI(RNase free，购自Promega)消化基因组DNA污染(方法参见DNaseI说明书)，运用逆转录酶M-MLV(购自Promega)将总RNA逆转录合成cDNA第一链(方法参见逆转录酶说明书)，反应条件为：25℃5min；42℃60min；70℃10min。
以植物基因组DNA为模板，以21E-S和21E-A为引物进行PCR，PCR的反应条件为：94℃预变性2min；96℃30sec，60℃30sec，72℃2min，30个循环；72℃延伸2min。在大量筛选鉴定时，也可通过21in-S和21in-A进行，72℃延伸时间可缩短为1分钟。以21E-S和21E-A为引物扩增得到的片段长度为843bp；以21in-S和21in-A为引物扩增得到的片段长度为400bp。
以cDNA为模板，以UBC基因(登录号：AK059694)为内参基因(UBC基因扩增引物为UBC-S和UBC-A，利用OsWRKY21基因特异性引物21E-S(qPCR)和21E-A(qPCR)，使用ABIStepOnePlus荧光定量PCR仪进行实时定量PCR，反应条件为：95℃预变性30sec；95℃5sec、60℃30sec，40个循环；95℃15sec、60℃60sec、95℃15sec，1个循环。
用于转基因植株的PCR、RT-PCR和qPCR检测的引物表如下所示：
表1OsWRKY21基因检测引物表
Figure BDA0001696205910000061
(4)结果：
1)T0代的检测结果
T0代转OsWRKY21基因植株的PCR检测结果如图1所示，阳性植株DNA样扩增出的特异条带与质粒扩增出的特异条带一致，阴性植株和野生型植株DNA样扩增则无条带，表明OsWRKY21基因已成功转入转基因植株中。
2)T1代的检测结果
A、选取DNA检测为阳性的T0代转OsWRKY21基因植株进行繁种。挑取饱满、无虫眼的种子25粒催芽后种植于营养土后即得T1代转基因植株，取2周龄左右T1代转基因植株叶片提取DNA进行PCR检测，根据T1代植株的DNA检测情况。将T1代植株可能的分离比和实际检测过程中观察到的分离比利用SPSS18.0软件进行适合性检验(卡方检验)，结果表明大部分转基因株系T1代转基因植株的分离比符合3:1。
B、为研究OsWRKY21基因在转基因植株中的表达情况，选取T1代每个株系DNA检测为阳性的转基因植株1株，取适量叶片用TRIzol法提取水稻总RNA，并用特异性引物反转录获得cDNA，对cDNA进行扩增并凝胶电泳检测。结果如图2所示，从图中可以观察到株系1、2、3、6的转基因植株OsWRKY21表达量相对较高，其他株系转基因植株OsWRKY21的表达量相对更低。
2)T2代的检测结果
A、将T1代转OsWRKY21基因植株所结的种子每个株系随机挑取50粒饱满的种子催芽后种植于营养土中得到T2代转基因植株，对T2代植株进行PCR检测。对T2代的检测情况进行统计并利用SPSS18.0软件对数据进行适合性检验，结果表明部分T1代转基因植株为阳性纯合植株。
B、对T2代转OsWRKY21基因植株进行RT-PCR检测，部分株系的转基因植株检测结果如图3所示，从图中可以看出株系1、2、3、6的表达量较高，株系4、5的表达相对较弱，检测结果与T1代植株的RT-PCR检测结果一致，且同株系内的转基因植株表达情况相对一致，表明OsWRKY21过量表达基因在后代植株中能稳定地表达。
3)T3代的检测结果
A、将株系T2代转OsWRKY21基因植株所结的种子，随机挑取饱满的种子50粒催芽后种植于营养土中得到T3代转基因植株，对T3代植株进行PCR检测，部分株系的T3代植株DNA检测结果全为阳性。
B、为检测OsWRKY21基因在转基因植株中的表达量，选取3周龄T3代阳性纯合株系(株系1、株系2、株系4、株系6)转基因植株提取RNA进行实时荧光定量PCR检测，结果如图4所示，从图中可以看出转OsWRKY21基因植株1号株系、2号株系、4号株系和6号株系的OsWRKY21基因表达量分别为野生型植株的33.8倍、41.2倍、27.1倍和62.9倍。
实施例3水稻培养及抗稻飞虱鉴定方法
一、水稻培养及抗稻飞虱鉴定方法
(1)水稻育苗及繁种
1)将野生型材料(籼稻9311)与转基因材料种子用自来水漂洗数遍后，置于装有200mL纯净水的培养瓶中，33℃、全黑暗条件下浸泡36h进行催芽；
2)将催芽完毕的种子置于装有10mL纯净水的培养皿中，每皿约50粒，轻轻晃动皿使种子分布均匀，28℃、12h光照、12h黑暗条件下培养4-5天；
3)将幼苗移栽到育苗盆中，每孔一株苗，每盆按至少1/7的比例配相应数量的野生型植株，盆移至植物培养室，培养室白天温度28～30℃、晚上温度24～26℃，全天14h光照、10h黑暗，湿度保持在60-80％rH；
4)苗移栽至育苗盆7天后，每株取叶片样提取DNA进行转基因检测；
5)苗移栽至育苗盆2周后，将检测出的阳性苗移栽至泥土中，在自然条件下生长，直至开花结实。
(2)苗期人工接虫鉴定
1)将催芽完毕的供试材料种子和野生型种子播在育苗盆(10cm×10cm正方形格，共8格)中，每个编号一格，每格15粒种子，野生型植株与转基因植株种植比例不小于1/3；
2)待种子萌发、出苗后匀苗，每格保留8-10株水稻苗；
3)当苗长到2-3片叶时，用周身带有通气孔的塑料罩将每个编号的苗分别罩住，每个编号接入20头1～2龄褐飞虱(已在文献“梁梓强等.褐飞虱可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析.中山大学学报(自然科学版),2015(6):27-30”公开)若虫(观察转基因植株与野生型植株生长情况对比时接7～8头虫/株苗)；
4)每天观察并记录苗的状态和各组褐飞虱存活的数量(观察转基因植株与野生型植株生长情况对比时拍照记录植株生长情况)。
(3)分蘖盛期稻飞虱生育历期测定
1)取播种40d后，单株种植、生长旺盛的分蘖期稻苗，减去次生分蘖，仅保留主茎并清洗干净，用周身带有通气孔的塑料罩(直径10cm，高45cm)罩住；
2)每株苗接入一对新近羽化的成虫(雌、雄各一只)或刚孵化的幼虫三只；
3)待雌虫产卵并孵化后，每天观察两次，记录新孵化幼虫每次蜕皮的时间，直到幼虫羽化为成虫为止。统计新孵化幼虫的生历育期，运用SPSS18.0软件进行差异显著性分析。
(4)分蘖盛期稻飞虱取食量测定
1)取播种40d后，单株种植、生长旺盛的分蘖期稻苗，减去次生分蘖，仅保留主茎并清洗干净；
2)将一个底部有小孔的塑料杯(直径7cm)杯口朝上穿过稻株置于底部，杯子上放上直径7cm，中间有贴合稻株小孔的滤纸，滤纸上再倒扣一个底部有通气孔的塑料杯，制成取食室；
3)每个取食室中接入新近羽化、经饥饿处理24h(饥饿处理期间用湿透的棉花饲水)的褐飞虱雌虫1只，雌虫取食后分泌的蜜露滴落在滤纸上；
4)24h后，收集取食室内的滤纸，用0.1％茚三酮-丙酮溶液处理，滤纸上即呈现出大小不一的紫红色蜜露斑；
5)扫描并通过image J软件分析计算蜜露斑面积大小，从而反映出褐飞虱取食量的多少。以蜜露斑面积为统计指标，使用Image J软件分析计算蜜露斑面积，用SPSS18.0软件进行差异显著性分析。
二、实验结果
(1)转OsWRKY21基因植株对褐飞虱的反应：分别取T2、T3代2周龄左右的转OsWRKY21基因植株和野生型植株按7～8头虫/株苗接入褐飞虱，用带有透气孔的塑料筒罩住，当野生型植株死亡率达到95％以上时，观察并拍照记录转OsWRKY21基因植株的生长情况。结果如图5和图6所示，可见，大部分野生型植株已干枯死亡，而转基因植株中大部分植株除叶片发黄外还存活，这意味着转OsWRKY21基因植株比野生型植株对褐飞虱的抗性更高，而且，转OsWRKY21基因植株的抗虫性能稳定地遗传给后代。
(2)转OsWRKY21基因植株对褐飞虱存活率的影响：分别取2周龄左右的T2、T3代转OsWRKY21基因植株和野生型植株接入褐飞虱，接虫后每天统计虫存活数。以虫存活率为统计指标，利用Graphpad prism6软件对获得的统计数据进行分析，统计14天。结果如图7和图8所示，可见，转OsWRKY21基因植株相较于野生型植株对褐飞虱的抗性更高，且抗虫性能稳定地遗传到后代植株中。
(3)转OsWRKY21基因植株对褐飞虱生历育期的影响：取4～5周龄的T2代转OsWRKY21基因植株和野生型植株，通过接种雌、雄成虫一对和刚孵化幼虫两种接虫方式来处理植株，记录褐飞虱若虫分别在转OsWRKY21基因植株和野生型植株上的生历育期。以生历育期为统计指标，利用SPSS18.0软件对获得的统计数据进行分析。结果如图9所示：图9A中，WT、#1和#2植株的平均生历育期分别为9.13d、12.27d、12.20d；图9B中，WT、#1和#2植株的平均生历育期分别为8.86d、12.26d、12.73d。褐飞虱在OsWRKY21过表达植株上的生历育期比在野生型植株上的生历育期长，表明转OsWRKY21基因植株能延通过缓褐飞虱若虫的生长发育来增强对褐飞虱的抗性。
(4)转OsWRKY21基因植株对褐飞虱取食量的影响：结果如图10所示，WT、#1和#2植株上接收的蜜露平均面积分别为630.9mm2、333.4mm2、310.7mm2，褐飞虱在转OsWRKY21基因植株上的取食量明显少于在野生型植株上的取食量，表明转OsWRKY21基因植株对褐飞虱的抗性更强。
所用到的培养基如下：
1)YEB培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、MgSO4·7H2O 0.24g、蔗糖5g、琼脂15g(液体YEB培养基不添加琼脂)、调pH至7.0-7.2，116℃高压灭菌25min。
2)乳糖培养基(500mL)：酵母提取物0.5g、乳糖5g、琼脂10g，116℃高压灭菌25min。
3)AB培养基(1L)：AB盐50mL、AB缓冲液50mL、葡萄糖5g、琼脂15g，116℃高压灭菌25min。
AB盐(200mL)：NH4Cl 4g、MgSO4·7H2O 1.2g、KCl 0.6g、CaCl2·2H2O 53mg、FeSO4·7H2O 10mg。
AB缓冲液(200mL，pH7.0)：NaH2PO4 4g、K2HPO4 12g。
4)NBAS培养基(1L)：钙贮存液8.3mL、铁贮存液10mL、肌醇贮存液10mL、N6大量元素贮存液20mL、B5微量元素贮存液10mL、B5维生素贮存液10mL、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D，0.2mg/mL，下同)10mL、萘乙酸(NAA，0.1mg/mL，下同)10mL、6-苄基嘌呤(6-BA，0.2mg/mL，下同)5mL、蔗糖20g、葡萄糖10g、脯氨酸0.5g、酸水解酪蛋白0.5g，琼脂糖8g，调pH至5.2，116℃高压灭菌25min，冷却后加AS溶液(200mmol/mL，溶剂为DMSO)500μl。
钙贮存液(500mL)：CaCl2 7.55g或CaCl2·2H2O 10g。
铁贮存液(500mL)：Na2·EDTA·2H2O 1.865g、FeSO4·7H2O 1.39g。
肌醇贮存液(500mL)：肌醇5g。
N6大量元素贮存液(500mL)：KNO3 70.75g、MgSO4·7H2O 4.635g、KH2PO4 10g、(NH4)2SO411.575g。
B5微量元素贮存液(500mL)：MnS04·H2O 500mg、H3BO3150mg、KI 37.5mg、ZnSO4·7H2O100mg、Na2MoO4·2H2O 12.5mg。
B5维生素贮存液(500mL)：烟酸50mg、维生素B6 50mg、维生素B1 500mg。
5)CCMC培养基(1L)：钙贮存液29.4mL、铁贮存液10mL、肌醇贮存液9mL、CC大量元素贮存液20mL、CC微量元素贮存液10mL、CC维生素贮存液10mL、2,4-D 10mL、NAA10mL、6-BA1mL、麦芽糖20g、甘露醇36g、脯氨酸0.5g、酸水解酪蛋白0.5g，植物凝胶(Gelrite)5g，调pH至5.8，116℃高压灭菌25min，冷却后加先锋霉素(Cef)溶液(100mg/mL，下同)2.5mL、羧苄青霉素(Car)溶液(250mg/mL，下同)400μl。
CC大量元素贮存液(500mL)：KNO3 30.3g、MgSO4·7H2O 6.175g、KH2PO4 3.4g、NH4NO316g。
CC微量元素贮存液(500mL)：MnS04·4H2O 577.5mg、H3BO3155mg、KI 41.5mg、ZnSO4·7H2O 288mg、Na2MoO4·2H2O 12mg、Cu/Co贮存液1mL。
Cu/Co贮存液(100mL)：CuSO4·5H2O 100mg、CoCl2·6H2O 100mg。
CC维生素贮存液(500mL)：烟酸300mg、维生素B6 50mg、维生素B1 425mg、甘氨酸100mg。
6)CCMCH60筛选培养基(1L)：钙贮存液29.4mL、铁贮存液10mL、肌醇贮存液9mL、CC大量元素贮存液20mL、CC微量元素贮存液10mL、CC维生素贮存液10mL、2,4-D 10mL、NAA10mL、6-BA 1mL、麦芽糖20g、甘露醇36g、脯氨酸0.5g、酸水解酪蛋白0.5g，Gelrite 5g，调pH至5.8，116℃高压灭菌25min，冷却后加Cef溶液2.5mL、Car溶液400μl、潮霉素B溶液(50mg/mL)1.2mL。
7)NBPRH40预再生培养基(1L)：钙贮存液8.3mL、铁贮存液10mL、肌醇贮存液10mL、N6大量元素贮存液20mL、B5微量元素贮存液10mL、B5维生素贮存液10mL、2,4-D 10mL、NAA10mL、6-BA 5mL、麦芽糖30g、脯氨酸0.5g、酸水解酪蛋白0.5g，谷氨酰胺0.3g，Gelrite5g，调pH至5.8，116℃高压灭菌25min。
8)RNMH30再生培养基(1L)：钙贮存液8.3mL、铁贮存液10mL、肌醇贮存液10mL、N6大量元素贮存液20mL、B5微量元素贮存液10mL、B5维生素贮存液10mL、2,4-D 10mL、NAA 10mL、6-BA 15mL、麦芽糖30g、脯氨酸0.3g、酸水解酪蛋白0.3g，谷氨酰胺0.3g，琼脂糖4g，调pH至5.8，116℃高压灭菌25min。
9)MSI生根培养基(1L)：钙贮存液11mL、铁贮存液10mL、肌醇贮存液10mL、MS大量元素贮存液10mL、MS微量元素贮存液10mL、MS modified维生素贮存液10mL、吲哚乙酸(IAA、1.0mg/mL)2mL、蔗糖15g、酸水解酪蛋白1g，Gelrite 3g，调pH至5.8，116℃高压灭菌25min。
MS大量元素贮存液(500mL)：KH2PO4 4.25g、KNO3 47.5g、NH4NO3 41.25g、MgSO4·7H2O9.25g。
MS微量元素贮存液(500mL)：MnS04·H2O 845mg、H3BO3310mg、KI 41.5mg、ZnSO4·7H2O430mg、Na2MoO4·2H2O 12.5mg、Cu/Co贮存液1mL。
MS modified维生素贮存液(500mL)：烟酸25mg、维生素B6 25mg、维生素B1 50mg、甘氨酸100mg。
10)AA-inf培养基(1L)：钙贮存液7.5mL、铁贮存液10mL、肌醇贮存液10mL、AA大量元素贮存液20mL、B5微量元素贮存液10mL、B5维生素贮存液10mL、AA氨基酸贮存液100mL、蔗糖20g、葡萄糖10g、酸水解酪蛋白0.5g，调pH至5.2，加入AS溶液500μl，0.22μm滤器过滤除菌。
AA氨基酸贮存液(500mL，pH5.8)：Gln 5.38g、Asp 1.33g、Arg 0.87g、Gly 37.5mg。
AA大量元素贮存液(500mL)：KCl 74.75g、MgSO4·7H2O 12.5g、NaH2PO4 3.75g。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中山大学
<120> 水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用
<130> 2
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 843
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<220>
<223> 水稻OsWRKY21转录因子基因
<400> 1
atggcgatgc tggggagctc gtcggcggtg gtgctggagc tgatgacgat ggggtaccag 60
tcggcggcgt acctcggcga gctgctccgg gcggcgtccc cggcgcaggc aggggatgag 120
cagcaggagc tcgccgcgga gatcctccgc tgctgcgacc gcgtcatcgc cgagctgaac 180
cggggaggag ccactggtgc tactaccggc aagaagcgga aggcggcgga gtccgccgcc 240
gccgccgccg tgacctcccc ttctctcccc gtcacgccga ccaaaagaag ggcgcgtggc 300
gcggaggcgg tgagggaggt gaggagcggc acgacgacgg acgggttcat ctggaggaag 360
tacgggcaga aggagatcaa tggctgcaag cacccgaggc tctactaccg ctgcgcgttc 420
aggggccagg gctgcctcgc cacgcggcgg gtgcagcagt cgcagtcgca ggacgacccg 480
gccgcggcgt tcgtgatcgc ctactacggc gagcacacct gcggaggcga cgccgccgcc 540
gccgccgcgt gccgggacgg ggaactaatg ccacctgccg tcatcaactc cggcgcgtcg 600
agcttcgccg ccgcttggaa catggcctcg cgtgagccgg cgtcgtcgct cgccgtcgag 660
cggaggagct gcgacggcga cgctcccagc gagacgtcgc aggggtggtc tccctccttc 720
tcgtcggagg tggagctgga cgtggtggga ttcgacctcg ccggagccga ctcgtcggcg 780
tcgccggtgt gggagttctt gaatggcagc ttcgactggg aattcgtcat caactccctc 840
tga 843
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<220>
<223> 引物UBC-S
<400> 3
gcaggcatct agagctaggc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物UBC-A
<400> 3
gtcaagaagc gaacttgcgg 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物21E-S
<400> 4
atggcgatgc tggggagctc gtcgg 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物21E-A
<400> 5
tcagagggag ttgatgacga attcc 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物21in-S
<400> 6
aggagccact ggtgctacta 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物21in-A
<400> 7
gatgacggca ggtggcatta 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物21E-S(qPCR)
<400> 8
ggtgctacta ccggcaagaa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物21E-A(qPCR)
<400> 9
tagtagagcc tcgggtgctt 20

Claims (6)

1.水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用，其特征在于：所述的水稻OsWRKY21转录因子基因的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的植物为水稻；
所述的虫为褐飞虱。
2.根据权利要求1所述的水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用，其特征在于：步骤如下：应用农业生物技术方法，将水稻OsWRKY21转录因子基因转化入植物细胞，得到表达OsWRKY21蛋白的植物品种。
3.根据权利要求2所述的水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用，其特征在于：所述的转化入植物细胞的方式包括基因枪转化法和农杆菌转化法。
4.根据权利要求3所述的水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用，其特征在于：所述的农杆菌转化法中所用的农杆菌为EHA105菌株。
5.根据权利要求4所述的水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用，其特征在于步骤如下：将表达OsWRKY21的重组载体转入EHA105菌株中，得到转化菌株；以籼稻9311的幼胚为受体，转化菌株配制成OD660nm为0.4～0.6的侵染液作用受体，筛选，得到表达OsWRKY21蛋白的水稻。
6.根据权利要求5所述的水稻OsWRKY21转录因子基因在改良植物抗虫性中的应用，其特征在于：所述的幼胚为开始灌浆第9天的种子分离得到的幼胚。
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