CN109136260A - Wrky20蛋白质及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了WRKY20蛋白质及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用。本发明公开的WRKY20蛋白质为如下A1)、A2)、A3)或A4)：A1)氨基酸序列是序列4的蛋白质；A2)氨基酸序列是序列13的蛋白质；A3)氨基酸序列是序列14的蛋白质；A4)氨基酸序列是序列21的蛋白质。实验证明降低WRKY20蛋白质含量具有提高植物抗棉铃虫、二斑叶螨和蚜虫的作用，而提高WRKY20蛋白质的含量具有提高植物抗烟粉虱、抗真菌病害和抗双生病毒病害的作用，为培育抗虫和/或抗病植物新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值。

Description

WRKY20蛋白质及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域中，WRKY20蛋白质及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用。

背景技术

近年来,受气候变化、经济一体化和农业新品种的出现等诸多因素的影响,农作物病虫害问题日益严重，农业病虫害的种类多、数量大、为害重、并时常暴发成灾的特点，常常对作物造成严重危害，造成作物的产量损失和生产成本上升，也会引起农产品质量安全问题。我国经济作物常见的有以下种类的病虫害：烟粉虱、稻飞虱、白粉病、棉铃虫、棉蚜、稻纹枯病、稻瘟病、二斑叶螨、双生病毒病以及油菜菌核病等，已成为严重影响我国农业生产的重大病虫害。以往的农业害虫都是采用农药进行防治,而现在的绿色防控策略，需要降低农药的使用量，因此提高植物的抗病性、抗虫性是非常有效的一种防治病虫害的方式。

植物的许多次级代谢物已被证明在植物-病原或植物-植食性的重组和防御中发挥重要作用，如生长抑制剂，毒素，或为病原和不同的取食模式昆虫提供的取食抑制剂。芥子油苷是一类含氮和硫的植物次级代谢物，它们主要存在于十字花科、花椒科和番石榴科中，能够抑制病原和昆虫对植物的侵染。已知有120多种不同的芥子油苷，根据其氨基酸来源的不同，可以分为吲哚类、脂肪类和芳香类芥子油苷，而在模式植物拟南芥中以吲哚类和脂肪类为主。在拟南芥植株叶片中，芥子油苷被储存在沿维管束系统的韧皮部区域内，并通过韧皮部进行长距离运输。由于芥子油苷的空间分布不同，广食性的鳞翅目幼虫(棉铃虫)更倾向于取食叶片内层的部分，而避免叶片的中脉，尽管螨虫和鳞翅目昆虫的取食方式不同，但植物对螨虫取食的转录反应与鳞翅目植食性昆虫的反应相似。烟粉虱是一种韧皮部取食的广食性的半翅目昆虫，对寄主植物的适应性与植物体内吲哚类和脂肪类芥子油苷的水平密切相关。然而，在韧皮部周围组织中积累较高水平的芥子油苷，对于减少另一种韧皮部取食的广食性半翅目昆虫-蚜虫的寄主适应性具有关键作用。因此，植物-昆虫群落的相互作用，可能会将植物代谢转化为具有组织特异性模式的防御反应。

植物激素在植物生长发育和抗病抗虫中发挥重要的作用，能够通过参与各种复杂的信号网络来响应外界环境的不同胁迫，外源应用植物激素能够调控植物的基础免疫，提高植物的抗病性和抗虫性。刺吸式昆虫烟粉虱取食后会激活植物体内的茉莉酸(Jasmonicacid，JA)、乙烯(Ethylene，ET)和水杨酸(Salicylic acid，SA)等激素抗性途径，相应的防御基因会发生变化，导致昆虫难以进一步取食。植物激素信号途径在植物抗病中也起着重要的作用，在防御网络中还会涉及到各种激素信号途径之间的交叉互作。植物WRKY转录因子在番茄、水稻、玉米、油菜等作物中已经陆续发现了WRKY转录因子，例如番茄中81个、水稻中100多个、玉米中119个、油菜中46个。WRKY转录因子结合下游靶基因的顺势元件W-box(TTGAC和TTGACC/T)或者W-box like(TGACC/T)，它的结构域中都至少含有一个由大约60个高度保守的氨基酸残疾多肽组成的WRKY结构域，其N-末端含有7个保守的氨基酸残基WRKYGQK，同时在C-端普遍包含一个特殊的锌指结构，分为C2H2型或C2HC型。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗病性和抗虫性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述M1-M3中的任一种在调控植物抗逆性中的应用：

M1、WRKY20蛋白质；

M2、调控WRKY20蛋白质含量和/或活性的物质；

M3、与WRKY20蛋白质相关的生物材料；所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码WRKY20蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)抑制WRKY20蛋白质编码基因表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

上述应用中，WRKY20蛋白质可来源于E1)、E2)、E3)或E4)：

E1)植物；

E2)双子叶植物或单子叶植物；

E3)十字花科植物或锦葵科植物或茄科植物；

E4)拟南芥或棉花或番茄。

所述调控植物WRKY20蛋白质含量的物质可为调控WRKY20蛋白质编码基因表达的物质。

上述应用中，WRKY20蛋白质可为如下A1)、A2)、A3)、A4)、A5)或A6)：

A1)氨基酸序列是序列4的蛋白质；

A2)氨基酸序列是序列13的蛋白质；

A3)氨基酸序列是序列14的蛋白质；

A4)氨基酸序列是序列21的蛋白质；

A5)将序列表中序列1或序列13或序列14或序列21所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A6)在A1)或A2)或A3)或A4)或A5)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

B1)所述核酸分子为如下b1)-b15)中的任一种：

b1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2)序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b3)序列表中序列1的第304-3696位所示的cDNA分子或DNA分子；

b4)序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b5)编码序列是序列表中序列11的cDNA分子或DNA分子；

b6)序列表中序列11的cDNA分子或DNA分子；

b7)序列表中序列9的cDNA分子或DNA分子；

b8)编码序列是序列表中序列12的cDNA分子或DNA分子；

b9)序列表中序列12的cDNA分子或DNA分子；

b10)序列表中序列10的cDNA分子或DNA分子；

b11)编码序列是序列表中序列20的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列20的cDNA分子或DNA分子；

b13)序列表中序列19的cDNA分子或DNA分子；

b14)与b1)-b13)中任一种限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码WRKY20蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

b15)在严格条件下与b1)-b14)中任一种限定的核苷酸序列杂交，且编码WRKY20蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

B8)所述核酸分子的序列为序列表中序列11的第945-1394位或序列12的第938-1387位或序列20的第1333-1765位。

为了使A1)或A2)或A3)或A4)或A5)中的蛋白质便于纯化，可在其氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A5)中的WRKY20蛋白质，为与序列4或序列13或序列14或序列21所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A5)中的WRKY20蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A5)中的WRKY20蛋白质的编码基因可通过将序列2或11或12或20所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。序列2、11、12和20所示的DNA分子分别编码序列4、13、14和21所示的蛋白质。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码WRKY20蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的WRKY20蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码WRKY20蛋白质且具有WRKY20蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列4或序列13或序列14或序列21所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码WRKY20蛋白质的核酸分子的表达盒(WRKY20基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达WRKY20蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动WRKY20基因转录的启动子，还可包括终止WRKY20基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic AcidRes.,15:9627)。

B2)所述表达盒中启动子可为序列表中序列3所示的DNA片段。

可用现有的表达载体构建含有所述WRKY20基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为表达载体pBA-YFP,pBI121载体或表达载体pBA002a,pCAMBIA2300载体。

B3)所述重组载体具体可为35S:YFP-AtWRKY20或AtWRKY20promoter:flag-AtWRKY20。所述35S:YFP-AtWRKY20为将序列1的第304-3696位所示的DNA片段插入至表达载体pBA-YFP中35S启动子下游得到的能表达序列表中序列4所示的蛋白质的重组载体。

所述AtWRKY20 promoter:flag-AtWRKY20为将序列1的第304-3696位所示的DNA片段与序列3所示的DNA片段插入至表达载体pBA002a中得到的能表达序列表中序列4所示的蛋白质的重组载体，其中序列1的第304-3696位所示的DNA片段的表达由序列3所示的DNA片段驱动。

B9)所述重组载体可为psTRV2-GhWRKY20-1载体或psTRV2-GhWRKY20-2载体或psTRV2-SlWRKY20-1。所述psTRV2-GhWRKY20-1载体可为将psTRV2载体的XbaI和BamHI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列11的第945-1394位所示的DNA片段得到的重组载体。所述psTRV2-GhWRKY20-2载体可为将psTRV2载体的XbaI和BamHI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列12的第938-1387位所示的DNA片段得到的重组载体。所述psTRV2-SlWRKY20-1可为将psTRV2载体的XbaI和BamHI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列20的第1333-1765位所示的DNA片段得到的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌(如农杆菌EHA105)或大肠杆菌。

所述重组微生物可为将所述重组载体导入所述微生物中得到的微生物。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

上述应用中，所述植物抗逆性可为如下F1)、F2)或F3)的抗逆性：

F1)双子叶植物或单子叶植物；

F2)十字花科植物或锦葵科植物或茄科植物；

F3)拟南芥或棉花或番茄。

上述应用中，所述抗逆性可为抗病性和/或抗虫性。

所述抗虫可为抗烟粉虱、棉铃虫、蚜虫或二斑叶螨；

所述抗病可为抗真菌病害或双生病毒病害。

所述真菌病害可为菌核病，如油菜菌核病。所述双生病毒病害可为曲叶病毒病害，如甘蓝曲叶病毒病害。

本发明还提供了下述M1或M2或M3的方法：

M1、培育抗虫转基因植物的方法，所述抗虫为抗棉铃虫、蚜虫或二斑叶螨，所述方法包括降低目的植物中WRKY20蛋白质的活性、降低目的植物中WRKY20蛋白质的含量、抑制目的植物中WRKY20蛋白质的编码基因的表达或敲除目的植物中WRKY20蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物抗棉铃虫、蚜虫或二斑叶螨性高于所述目的植物；

M2、培育抗虫转基因植物的方法，所述抗虫为抗烟粉虱，所述方法包括增加目的植物中WRKY20蛋白质的活性、增加目的植物中WRKY20蛋白质的含量、促进目的植物中WRKY20蛋白质的编码基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物抗烟粉虱性高于所述目的植物；

M3、培育抗病转基因植物的方法，包括增加目的植物中WRKY20蛋白质的活性、增加目的植物中WRKY20蛋白质的含量、促进目的植物中WRKY20蛋白质的编码基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物抗病性高于所述目的植物；

WRKY20蛋白质可为上文所述WRKY20蛋白质；

M1所述方法可通过抑制所述目的植物中所述WRKY20蛋白质的编码基因的表达实现。

M2和M3所述方法可通过向所述目的植物中导入WRKY20的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。

所述WRKY20蛋白质的编码基因可为B1)所述编码WRKY20蛋白质的核酸分子。

上述方法中，所述降低目的植物中WRKY20蛋白质的含量可通过将与所述抑制WRKY20蛋白质编码基因表达的核酸分子导入所述目的植物中实现。

所述抗病可为抗真菌病害或双生病毒病害。所述真菌病害可为菌核病，如油菜菌核病。所述双生病毒病害可为曲叶病毒病害，如甘蓝曲叶病毒病害。

上述方法中，其中所述WRKY20的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述WRKY20的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述WRKY20的编码基因可利用含有所述WRKY20的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物。所述重组表达载体具体可为所述35S:YFP-AtWRKY20或所述AtWRKY20promoter:AtWRKY20。

所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant MolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition).)。

所述目的植物理解为不仅包含WRKY20蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述目的植物可为如下F1)、F2)或F3)：

F1)双子叶植物或单子叶植物；

F2)十字花科植物或锦葵科植物或茄科植物；

F3)拟南芥或棉花或番茄。

本发明还提供了下述P1)或P2)或P3)的产品：

P1)WRKY20蛋白质；

P2)所述生物材料；

P3)植物抗虫或抗病产品，包括WRKY20蛋白质或所述生物材料。

所述植物抗虫或抗病产品可以WRKY20蛋白质或所述生物材料作为其活性成分，还可将WRKY20蛋白质或所述生物材料与具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

上述产品中，所述植物可为如下F1)、F2)或F3)：

F1)双子叶植物或单子叶植物；

F2)十字花科植物或锦葵科植物或茄科植物；

F3)拟南芥或棉花或番茄。

本发明的实验证明，本发明将通过T-DNA插入获得敲除AtWRKY20基因的突变体，突变体植株表现为抗棉铃虫、二斑叶螨和蚜虫的表型，并且易感油菜菌核病和甘蓝曲叶病毒病；但是将AtWRKY20基因转入野生型植物中得到的AtWRKY20基因的转基因植物表现为抗烟粉虱和抗油菜菌核病的表型。另外，将沉默植物中的WRKY20基因后植物具有易感烟粉虱但是抗棉铃虫的作用,其中抗棉铃虫的作用和含有Bt基因的陆地棉相似。证明降低WRKY20基因的表达或其表达的蛋白具有提高植物抗棉铃虫、二斑叶螨和蚜虫的作用，而提高该基因或其表达的蛋白具有提高植物抗烟粉虱、抗真菌病害和抗双生病毒病害的作用，为培育抗虫和/或抗病植物新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值。

附图说明

图1为鉴定拟南芥wrky20突变体。A为拟南芥突变体wrky20-1(SALK_055904)和wrky20-2(SALK_116115)的T-DNA插入位点显示为倒置三角形的示意图；B为茉莉酸甲酯处理野生型拟南芥Col-0和wrky20突变体植物，检测AtWRKY20基因的表达水平；C为利用AtWRKY20^1-300单抗抗体的免疫印迹实验检测拟南芥植物体内AtWRKY20蛋白的含量，rbcL代表蛋白上样量，为考马斯亮蓝染色膜上的核糖体大亚基条带。星号代表不同植物之间AtWRKY20基因的表达水平存在显著差异(^*，P<0.05；^**，P<0.01；Student’s t-test)。

图2为降低AtWRKY20基因的表达提高植物对棉铃虫、蚜虫和二斑叶螨的抗性。A为取食野生型拟南芥Col-0和wrky20突变体植物5天内棉铃虫的体重变化情况；B为每只蚜虫幼虫在野生型拟南芥Col-0和wrky20突变体拟南芥植物上，生长9天后繁殖的蚜虫幼虫数量；C为野生型拟南芥Col-0和wrky20突变体拟南芥植物中每株植物上，二斑叶螨的数量。小写字母表示不同拟南芥植物上二斑叶螨数量或者蚜虫繁殖力的差异达到了显著水平(新复极差检验，P＜0.05)。

图3为AtWRKY20基因提高植物对烟粉虱的抗性。A为在野生型拟南芥Col-0和35S启动子或者AtWRKY20启动子驱动的AtWRKY20基因过表达的拟南芥植物上，每头雌性烟粉虱每天的产卵量；B为在野生型拟南芥Col-0和wrky20突变体的拟南芥植物上，每头雌性烟粉虱每天的产卵量；C为在野生型拟南芥Col-0和wrky20突变体的拟南芥植物上，烟粉虱的伪蛹数。小写字母表示不同拟南芥植物上烟粉虱产卵量的差异达到了显著水平(新复极差检验，P＜0.05)。

图4为AtWRKY20调控植物对油菜菌核病的抗性。A为野生型拟南芥Col-0、pdf1.2a、wrky20-1以及35S：YFP-WRKY20#19转基因植物叶片对油菜菌核病的抗性表型；B为在野生型拟南芥Col-0、pdf1.2a、wrky20-1以及35S：YFP-WRKY20#19转基因植物叶片上，油菜菌核病斑的大小。小写字母表示不同拟南芥植物上油菜菌核病斑大小的差异达到了显著水平(新复极差检验，P＜0.05)。

图5为AtWRKY20调控植物对甘蓝曲叶病毒(CaLCuV)病害的抗性。A为野生型拟南芥Col-0和wrky20-1突变体植物感染甘蓝曲叶病毒病害的病症表型；B为甘蓝曲叶病毒病害在Col-0和wrky20-1突变体植物上的病症指数，数值越高代表病害越严重；C为检测甘蓝曲叶病毒病害在Col-0和wrky20-1突变体植物中的病毒积累量。小写字母表示不同拟南芥植物上相对病毒滴度的差异达到了显著水平(新复极差检验，P＜0.05)。

图6为AtWRKY20在植物体内的表达模式。图A-G为将AtWRKY20 promoter:GUS转基因植物进行GUS染色，发现AtWRKY20主要在植物的子叶(A)、莲座叶(B)、根(C和D)、花序(E)和果荚(F和G)的维管束组织中表达，图中比例尺代表的长度代表1毫米；H为显微镜下At-WRKY20 promoter:GUS转基因植物GUS染色根的树脂切片，图中比例尺代表的长度代表20微米；I为6周左右大小转基因植物叶片GUS染色情况；J为经茉莉酸甲酯处理后6小时后诱导转基因植物叶片的GUS表达，I和J图中比例尺代表的长度代表2毫米。

图7为AtWRKY20对植物体内芥子油苷的组织特异性调控。A为茉莉酸甲酯处理6小时后，脂肪类和吲哚类芥子油苷在拟南芥植物叶片主脉和非主脉组织内的含量；B为植物叶片主脉组织内3种吲哚类芥子油苷和4种脂肪类芥子油苷的含量；C为植物叶片非主脉组织内3种吲哚类芥子油苷和4种脂肪类芥子油苷的含量。小写字母表示不同拟南芥植物体内芥子油苷含量的差异达到了显著水平(新复极差检验，P＜0.05)。I3M，吲哚-3-甲基芥子油苷；4MI3G，4-甲氧基吲哚基-3-甲基芥子油苷；1MI3G，1-甲氧基吲哚基-3-甲基芥子油苷；4MSB，4-甲基磺酰丁基芥子油苷；4MTB，4-甲基硫代丁基芥子油苷；3MSP，3-甲基磺酰丙基芥子油苷；8MSO，8-甲基亚砜基芥子油苷。

图8为AtWRKY20与茉莉酸途径抗虫基因AtMYC2在植物体内存在负反馈调控的关系。A为茉莉酸甲酯处理后野生型拟南芥植物中AtMYC2和AtWRKY20基因的表达水平；B为野生型拟南芥Col-0和myc2-1突变体经茉莉酸甲酯处理后植物体内AtWRKY20基因的表达水平；C为野生型拟南芥植物Col-0和wrky20-1突变体经茉莉酸甲酯处理后植物体内AtMYC2、AtMYC3和AtMYC4基因的表达水平。星号表示不同拟南芥植物体内基因的表达存在显著差异(**，P<0.01；Student’s t-test)。

图9为AtWRKY20对茉莉酸途径两个不同分支的调控作用。茉莉酸甲酯处理后野生型拟南芥Col-0和wrky20突变体植物体内AtPDF1.2(A)和AtVSP1(B)基因的相对表达水平。星号表示不同拟南芥突变体内基因表达水平存在显著差异(**，P<0.01；Student’s t-test)。

图10为植物体内AtWRKY20对水杨酸途径相关基因的调控作用。在野生型拟南芥Col-0和wrky20突变体植物体内水杨酸途径相关基因AtSID2(A)、AtPAL1(B)、AtEDS5(C)、AtPAD4(D)或者AtPR1(E)的表达水平。小写字母表示不同拟南芥植物上基因表达的差异达到了显著水平(新复极差检验，P＜0.05)。

图11为WRKY20蛋白在植物体内的高度保守性。植物WRKY20蛋白的系统发育树，详细蛋白accession number如下：水稻OsWRKY30，NP_001062148.1；水稻OsWRKY78，NP_001060116.1；本式烟NbWRKY20，BAS69353.1；番茄SlWRKY20-1，XP_004251909.1；番茄SlWRKY20-2，XP_004244048.1；拟南芥AtWRKY20，NP_849450.1；油菜BnWRKY20，ACI14387.1；棉花GhWRKY20-1，AIE43819.1；棉花GhWRKY20-2，AIE43818.1。

图12为棉花中GhWRKY20对烟粉虱和棉铃虫的不同抗性作用。A为在载体对照棉花(即空载体对照棉花植株)和GhWRKY20-1 VIGS棉花(即GhWRKY20-1 VIGS基因沉默的棉花植株)或者GhWRKY20-2VIGS棉花(即GhWRKY20-1 VIGS基因沉默的棉花植株)上，每头雌性烟粉虱每天的产卵量；B为在载体对照棉花和GhWRKY20-1 VIGS棉花或者GhWRKY20-2 VIGS棉花上，取食5天内棉铃虫的体重变化情况；C为对照棉花和含Bt转基因棉花(即含有Bt(Bacillus thuringiensis)基因的BD18陆地棉植株)上，取食5天内棉铃虫的体重变化情况；D-F为在载体对照棉花和GhWRKY20-1 VIGS棉花或者GhWRKY20-2 VIGS棉花中，GhWRKY20基因的相对表达水平(D),以及具有抗虫作用的棉酚合成相关基因GhCAD3(E)和GhCAD4(F)的表达水平。星号代表不同处理植物之间GhWRKY20基因的表达或者棉铃虫的体重存在显著差异(*，P<0.05,**，P<0.01；Student’s t-test)；小写字母表示不同处理棉花植物上烟粉虱产卵量或者基因表达的差异达到了显著水平(新复极差检验，P＜0.05)。

图13为番茄中SlWRKY20-1对烟粉虱的抗性作用。A为在载体对照番茄(即空载体对照番茄植株)和SlWRKY20-1 VIGS基因沉默的番茄植株(即SlWRKY20-1 VIGS番茄)上，每头雌性烟粉虱每天的产卵量；B为在载体对照番茄和SlWRKY20-1 VIGS基因沉默的番茄植株中SlWRKY20-1基因的相对表达水平。星号代表不同处理植物之间烟粉虱产卵量存在显著差异(*，P<0.05,**，P<0.01；Student’s t-test)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

以下实施例中pENTR-3C克隆载体为invitrogen公司产品，植物表达载体pBA-YFP为invitrogen公司产品，植物表达载体pBA002a为invitrogen公司产品，GUS基因表达载体pKGWFS7为invitrogen公司产品，病毒诱导的基因沉默VIGS载体psTRV1和psTRV2记载在专利申请201080035446.8(公布号为CN 102803496 A)中。

大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105菌株均为博迈德(Biomed)生物公司产品。

使用的拟南芥品种为哥伦比亚生态型Col-0，wrky20-1(SALK_055904)，wrky20-2(SALK_116115)和pdf1.2a(SALK_063966)突变体材料均来源于TAIR网站上的SALK突变体库；棉花为栽培品种(Gossypium barbadense cv.Xinhai21)记载在“李尔文，邰红忠，周永莲，卢金宝，晏萍，练文明.“早熟、高产、优质长绒棉新品种新海21号”《中国棉花》2004,31”一文中；番茄为栽培品种中杂9号(Solanum lycopersicum)。

所用烟粉虱为B型烟粉虱MEAM1(mtCOI，GenBank编号为MF579701)Bemisia tabaci从北京郊区捕获，烟粉虱饲养在养虫笼中，以棉花为寄主植物生长繁殖；棉铃虫(Helicoverpa armigera)由中国科学院动物研究所邹振研究员课题组提供，从植物上获得；二斑叶螨(Tetranychus urticae)、桃蚜(Myzus persicae)从植物上获得。室内温度25℃，相对湿度65％，光照周期为12h光照/12h黑暗。

油菜菌核从发病的油菜种植田地获得。甘蓝曲叶病毒的CaLCuV DNA-A和DNA-B的侵染性克隆由本实验室构建，记载在“Ye J,Yang J,Sun Y,Zhao P,Gao S,Jung C,Qu J,Fang R,Chua NH.2015 Geminivirus activates ASYMMETRIC LEAVES 2 to acceleratecytoplasmic DCP2-mediated mRNA turnover and weakens RNA silencing inArabidopsis.PLoS Pathog.11,e1005196.(doi:10.1371/journal.ppat.1005196)”一文中。

以下实施例中的主要试剂为：

分子克隆所用试剂：EX Taq DNA聚合酶和LA Taq DNA聚合酶为Takara公司产品，限制性内切酶和T4DNA连接酶为NEB公司产品，所用抗生素为Inolco公司产品，1Kb DNAmarker和2000bp DNA marker为博迈德生物公司产品，SYBR qPCR Mix为TOYOBO公司产品。

蛋白相关实验所用试剂：Cocktail蛋白酶抑制剂为Roche公司产品，IPTG为Inolco公司产品，40％Acrylamide为Sigma公司产品，二抗为北京全式金生物技术公司产品，预染蛋白分子量marker为柏奥易杰生物公司产品。

试剂盒：质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和DNA纯化回收试剂盒为AxyGen公司产品，植物DNA小量提取试剂盒和植物RNA小量提取试剂盒为Qiagen公司产品，ECL发光液为GE healthcare公司产品。

主要常规试剂购自Sigma-Aldrich公司，其它试剂为国产分析纯。

实施例中所使用的引物由英潍捷基公司合成，并进行相关测序工作。

实施例1、AtWRKY20基因的克隆及AtWRKY20基因表达载体的构建

本实施例提供了来源于拟南芥的AtWRKY20基因及其编码的蛋白质，拟南芥中AtWRKY20基因的基因组DNA的核苷酸序列为序列1，AtWRKY20基因编码区DNA的核苷酸序列为序列2，AtWRKY20基因启动子区DNA的核苷酸序列为序列3，编码AtWRKY20蛋白的氨基酸序列为序列4。

一、AtWRKY20基因的克隆

1.分别以拟南芥基因组DNA和叶片cDNA为模板，用上游引物AtWRKY20-F和下游引物AtWRKY20-R进行PCR扩增，分别得到约3393bp和1674bp的PCR扩增产物。所用引物如下：

上游引物AtWRKY20-F：5’-CAAGGGTACCATGAACCCTCAAGCTAATGACCG-3’(序列5)；

下游引物AtWRKY20-R：5’-CAAGGCGGCCGCGGACCCGATTGTACTCTC-3’(序列6)。

2.以拟南芥基因组DNA为模板，用上游引物AtWRKY20pro-F和下游引物AtWRKY20pro-R进行PCR扩增，得到1986bp的PCR扩增产物。所用引物如下：

上游引物AtWRKY20pro-F：5’-CAAGGGTACCATGATGGTGTGGTTATGTG-3’(序列7)；

下游引物AtWRKY20pro-R：5’-CAAGCTCGAGTTCAGAGATTCGCAAGGGT-3’(序列8)。

二、表达AtWRKY20基因载体的构建

1.表达AtWRKY20的载体35S:YFP-AtWRKY20为将序列2所示的AtWRKY20基因通过LR反应重组到表达载体pBA-YFP中得到的载体。

上述载体的构建方法如下:先将上述步骤一得到的约1674bp的PCR扩增产物利用KpnI和NotI双酶切后与将pENTR-3C克隆载体利用KpnI和NotI双酶切后得到的骨架载体相连，得到中间载体pENTR-3C-AtWRKY20；再将中间载体和表达载体pBA-YFP通过LR反应进行重组，得到AtWRKY20基因表达重组载体，将序列正确的重组载体记为35S:YFP-AtWRKY20。35S:YFP-AtWRKY20含有序列2所示的AtWRKY20基因，并能表达序列4所示的AtWRKY20蛋白质与YFP形成的融合蛋白，该融合蛋白编码基因的表达由35S驱动。

2.表达AtWRKY20的载体AtWRKY20 promoter:AtWRKY20为将序列1的第304-3696位所示的AtWRKY20基因的基因组DNA序列和序列3所示的AtWRKY20基因启动子区DNA序列通过LR反应重组到表达载体pBA002a中得到的载体。

上述载体的构建方法如下:先将上述步骤一得到的约3393bp的AtWRKY20基因的PCR扩增产物和约1986bp的AtWRKY20基因启动子区的PCR扩增产物通过特定引物AtWRKY20pro-F(序列7)和AtWRKY20-R(序列6)再次PCR连接到一起，得到PCR产物；然后将该PCR产物利用KpnI和NotI双酶切后与将pENTR-3C克隆载体利用KpnI和NotI双酶切后得到的骨架载体相连，得到中间载体pENTR-3C-AtWRKY20 promoter:flag-AtWRKY20；再将该中间载体和表达载体pBA002a通过LR反应进行重组，得到AtWRKY20基因表达的重组载体，将序列正确的重组载体记为AtWRKY20 promoter:flag-AtWRKY20。AtWRKY20 promoter:flag-AtWRKY20含有序列1的第304-3696位所示的AtWRKY20基因和序列3所示的DNA片段，该重组载体能表达序列4所示的AtWRKY20蛋白质与Flag标签形成的融合蛋白质，该融合蛋白质编码基因的表达由作为启动子的序列3所示的DNA片段驱动。

三、GUS融合载体AtWRKY20 promoter:GUS的构建

含有AtWRKY20启动子区的GUS融合载体AtWRKY20 promoter:GUS为将序列3所示的AtWRKY20基因启动子区序列通过LR反应重组到表达载体pKGWFS7中得到的载体。

上述载体的构建方法如下:先将上述步骤一得到的1986bp的AtWRKY20基因启动子区的PCR扩增产物利用KpnI和XhoI双酶切后与将pENTR-3C克隆载体利用KpnI和XhoI双酶切后得到的骨架载体相连，得到中间载体pENTR-3C-AtWRKY20promoter；再将该中间载体和表达载体pKGWFS7通过LR反应进行重组，将得到的含有序列3所示的AtWRKY20基因启动子区的序列正确的重组载体记为AtWRKY20 promoter:GUS。该重组载体含有序列3所示的DNA片段且该DNA片段位于GUS基因上游，序列3所示的DNA片段可以驱动GUS基因的表达。

实施例2、敲除拟南芥WRKY20基因在植物抗虫性中的应用

一、敲除AtWRKY20基因的植物的检测

1.PCR检测AtWRKY20基因在拟南芥wrky20突变体中表达水平

经100μM茉莉酸甲酯处理后，提取野生型拟南芥Col-0、拟南芥突变体wrky20-1(SALK_055904)和wrky20-2(SALK_116115)(两个突变体T-DNA的插入位点如图1中A所示)植株的RNA，反转录合成cDNA，然后利用AtWRKY20基因的特异引物进行定量PCR分析，如图1中B所示，与野生型拟南芥相比，在拟南芥wrky20突变体中AtWRKY20基因的表达水平显著降低。所用引物为：AtWRKY20_qF：GAACCCAAATCCCAGGAGCTAC；AtWRKY20_qR：GGATTTCGTGATTGCTGC。内参为拟南芥ACTIN2基因，内参的引物为：AtACTIN2_qF：AGTGGTCGTACAACCGGTATTGT；AtACTIN2_qR：GATGGCATGAGGAAGAGAGAAAC。

2.AtWRKY20单克隆抗体的获得

PCR扩增AtWRKY20基因编码区序列1-300bp(即序列2的第1-300位)的片段，通过NdeI和XhoI双酶切的方式连入pET-28a(+)载体，通过Ni-NTA磁珠蛋白纯化获得His-AtWRKY20^1-300的融合蛋白，然后将该融合蛋白注入小鼠体内，制备得到可以识别AtWRKY20蛋白的AtWRKY20单克隆抗体，记为Anti-AtWRKY20^1-300。

3.蛋白质免疫印迹方法检测

提取野生型拟南芥Col-0与两个拟南芥wrky20突变体总蛋白，然后取等量的植物蛋白，用10％的SDS-PAGE胶进行电泳分离蛋白，然后用一抗为Anti-AtWRKY20^1-300的抗体和二抗为鼠抗的抗体来检测wrky20突变体的AtWRKY20蛋白含量。结果如图1中C所示，与野生型相比，两种wrky20突变体中AtWRKY20蛋白含量明显偏少，表明敲除AtWRKY20基因的植物其蛋白含量也会降低。

二、拟南芥wrky20突变体植物的抗虫性检测

1.拟南芥wrky20突变体植物对棉铃虫的抗性

棉铃虫三龄幼虫的短期饲喂实验被用来评估不同处理的植物或者不同的突变体对棉铃虫生长速度的影响：

取40只棉铃虫二龄幼虫，每4只作为一个独立的样本，共10个生物学重复。幼虫被放置在每株被单独罩起来的活体野生型拟南芥Col-0或拟南芥wrky20突变体植株上进行取食生长，在温度为25℃，14小时光照10小时黑暗的植物生长箱中进行，幼虫每天或者两天称重一次，该实验至重复三次获得同样的结果。

结果如图2中A所示，与在野生型植株Col-0上取食相比，棉铃虫在wrky20突变体植株上取食时其体重更轻，在wrky20-2突变体取食到第5天的时候，棉铃虫体重大约是野生型植株上棉铃虫体重的60％，这说明在植物体内敲除AtWRKY20基因会提高植物对棉铃虫的抗性作用，表明，降低植物体内WRKY20表达能够提高十字花科植物对棉铃虫的抗性。

2.拟南芥wrky20突变体植物对蚜虫的抗性

在拟南芥野生型Col-0和wrky20突变体的每株植物上放置一只无翅成虫，24小时后只保留三只若虫在植物叶片上，将无翅成虫和其他若虫移除。三只若虫在拟南芥野生型Col-0和wrky20突变体植物叶片上继续生长和繁殖，9天后统计新繁殖的若虫数量。每次实验每种突变体植株使用8株作为生物学重复，该实验重复三次获得同样的结果。

结果如图2中B所示，相比在野生型植株上取食，蚜虫在wrky20突变体植物上的繁殖力更低，这说明在植物体内敲除AtWRKY20基因会提高植物对蚜虫的抗性作用，表明，降低植物体内WRKY20表达能够提高十字花科植物对蚜虫的抗性。

3.拟南芥wrky20突变体植物对二斑叶螨的抗性

用圆柱形透明玻璃罩住拟南芥野生型Col-0和wrky20突变体的每株植物，放入3只二斑叶螨，取食10天后，在显微镜下观察叶片上活的二斑叶螨成虫数量，并进行统计分析。

结果如图2中C所示，相比在野生型植株上，二斑叶螨在wrky20突变体植株上的数量更少，这说明在植物体内敲除AtWRKY20基因会提高植物对二斑叶螨的抗性作用，表明，降低植物体内WRKY20表达能够提高十字花科植物对二斑叶螨的抗性。

实施例3、提高拟南芥WRKY20表达在调控植物抗虫性和/或抗病性中的应用

一、AtWRKY20转基因拟南芥的获得

将实施例1的步骤二制备的重组载体35S:YFP-AtWRKY20、AtWRKY20 promoter:AtWRKY20，以及实施例1的步骤三制备的GUS融合载体AtWRKY20 promoter:GUS导入农杆菌EHA105菌株中，再利用得到的重组菌通过花序浸润方法转入到野生型拟南芥Col-0植株中，得到转基因拟南芥幼苗。

上述转化方法具体为：将重组菌在28℃条件下220rpm培养过夜，在4℃条件下4000rpm离心20min后收集菌体，用浸润缓冲液(5％蔗糖，10mM MgCl₂和0.02％Silwet L-77)重悬菌液放入400ml灭菌玻璃烧杯中。选取开花良好的拟南芥野生型Col-0植物，将植物倒扣浸入菌悬液中，浸润3-5min后用保鲜膜包裹植物，移到黑暗处放置过夜，第二天将植物放入植物培养箱中在合适条件下进行生长。收到种子后，在含有卡那霉素或者Basta抗生素的MS培养基上进行转基因筛选，筛选三代后获得转基因纯系植株。

将利用重组载体35S:YFP-AtWRKY20得到的转基因植株记为35S:YFP-AtWRKY20转基因植株，并利用表达载体pBA-YFP按照相同的方法转化野生型拟南芥Col-0植株，得到35S:YFP-AtWRKY20对照植株。

将利用重组载体AtWRKY20 promoter:AtWRKY20得到的转基因植株记为AtWRKY20promoter:AtWRKY20转基因植株，并利用表达载体pBA002a按照相同的方法转化野生型拟南芥Col-0植株，得到AtWRKY20 promoter:AtWRKY20对照植株。

将利用重组载体AtWRKY20 promoter:GUS得到的转基因植株记为AtWRKY20promoter:GUS转基因植株，并利用表达载体pKGWFS7按照相同的方法转化野生型拟南芥Col-0植株，得到AtWRKY20 promoter:GUS对照植株。

二、转基因拟南芥对烟粉虱的抗性

所用植物为：拟南芥野生型植物Col-0，35S:YFP-AtWRKY20转基因植株(编号为#19)，35S:YFP-AtWRKY20对照植株，AtWRKY20 promoter:AtWRKY20转基因植株(编号为#2和#7)，AtWRKY20 promoter:AtWRKY20对照植株，两个wrky20突变体(wrky20-1(SALK_055904)和wrky20-2(SALK_116115))。

选择相似大小的植株叶片，每个叶片放置在一个叶笼(直径45毫米，高度30毫米)中进行烟粉虱的产卵实验和烟粉虱的发育实验。烟粉虱的产卵实验，捕捉三只雄性和三只雌性烟粉虱，然后释放到一个叶笼中，10天之后，在显微镜下观察叶片上烟粉虱的产卵量，并进行统计分析。烟粉虱的发育实验，捕捉16只雌性烟粉虱并释放到一个叶笼中，2天之后移除所有烟粉虱，让虫卵继续在叶笼中的叶片上进行发育，在20天之后，统计烟粉虱四龄伪蛹的数量并记录下来。每次实验每种植株使用8株，作为生物学重复。所有实验均需重复三次获得同样的结果。

结果如图3中A所示，与野生型拟南芥Col-0相比，35S:YFP-AtWRKY20的#19、AtWRKY20 promoter:AtWRKY20的#2和#7上烟粉虱的产卵量显著减少。与野生型拟南芥Col-0相比，wrky20突变体植物上烟粉虱的产卵量(图3中B)和伪蛹数(图3中C)都显著增加。35S:YFP-AtWRKY20对照植株、AtWRKY20 promoter:AtWRKY20对照植株的产卵量和伪蛹数与野生型拟南芥Col-0均无显著差异。这些结果说明在拟南芥中提高AtWRKY20基因的表达能够提高植物对烟粉虱的抗性，表明，提高植物体内WRKY20表达能够提高十字花科植物对烟粉虱的抗性。

三、拟南芥WRKY20基因在植物抗病中的应用

1.拟南芥WRKY20基因在植物抗油菜菌核病中的作用

将油菜菌核接种于马铃薯琼脂培养基(PDA)中，25℃暗培养4-5天，当平板长满白色菌丝时，用打孔器取直径2mm的带菌琼脂块，采用菌柄接种法，将大小、活力相同菌丝块贴于叶片上，接种后的植株置于25℃，空气湿度大于90％的植物生长箱培养，接种48h后测定叶片病斑大小，每处理样品测定8株植物。所用植物为：野生型拟南芥Col-0，35S:YFP-AtWRKY20的#19，35S:YFP-AtWRKY20对照植株，wrky20-1，pdf1.2a(T-DNA插入缺失突变体SALK_063966)。

结果如图4所示，相比野生型拟南芥Col-0，35S:YFP-AtWRKY20的#19上油菜菌核病斑大小显著降低，而wrky20-1和pdf1.2a突变体植物上该病斑大小显著增加。35S:YFP-AtWRKY20对照植株与野生型拟南芥Col-0上油菜菌核病斑大小无显著差异。这说明在拟南芥中提高AtWRKY20基因的表达能够提高植物对油菜菌核病的抗性，表明，提高植物体内WRKY20表达能够提高十字花科植物对真菌病害的抗性。

2.拟南芥WRKY20基因在植物抗双生病毒病中的作用

甘蓝曲叶病毒(CaLCuV)是双组份的双生病毒，侵染时利用CaLCuV DNA-A和DNA-B的侵染性克隆。将CaLCuV DNA-A或DNA-B的侵染性克隆均电击转入农杆菌EHA105感受态细胞中，菌种保存在50％甘油中，于-80℃保存。将保存菌株涂布在含有卡那霉素和利福平的LB培养基上，28度过夜培养，将得到的菌株用MMA缓冲液(10mM MgCl2、10mM MES和150μM乙酰丁香酮)悬浮，得到悬浮液；按照1：1比率将利用CaLCuV DNA-A和DNA-B得到的两种悬浮液混合，得到混合侵染性克隆菌液，在拟南芥植物叶片中用l ml一次性无菌注射器共注射混合侵染性克隆菌液，接种植株置于可控温室内。所用拟南芥为：野生型拟南芥Col-0，wrky20-1突变体。

利用CaLCuV特异引物通过定量PCR检测发病拟南芥中病毒DNA含量。所用引物为CalCuV-F：TGAATCACCTTCAACTATGATACT；CalCuV-R：CAATTATAAGGGCTGGAGATCCAA。

结果如图5所示，相比野生型拟南芥Col-0，wrky20-1突变体植物更容易被甘蓝曲叶病毒侵染，植物的病症指数和体内含有的病毒滴度更高，这说明在拟南芥中降低AtWRKY20基因的表达会提高甘蓝曲叶病毒对植物的侵染效率，表明，提高植物体内WRKY20表达能够提高十字花科植物对双生病毒病害的抗性。

实施例4、拟南芥WRKY20基因表达模式以及调控作用

一、拟南芥WRKY20在植物体内的特异表达模式

将AtWRKY20 promoter:GUS转基因植物，浸泡在4℃条件下90％丙酮中进行脱色处理，然后用0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0漂洗3次，随后将样品放入GUS染色液[0.25g/ml X-Gluc、0.1％Triton X-100、0.5mM K₃(Fe[CN]₆)、0.5mM K₄(Fe[CN]₆)、10mM EDTA和0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0]，用抽真空的方式处理5min，然后放在37℃条件下避光染色过夜，用50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇水溶液依次进行洗脱，去掉叶片剩余的叶绿素。将GUS染色样品保存在70％乙醇水溶液中，用正置体式显微镜进行观察和记录。

如图6中A-G所示，AtWRKY20启动子可以特异地驱动GUS基因在植物叶、根、花序和果荚的维管束组织中表达，树脂切片实验进一步证明GUS基因主要是在植物韧皮部表达(图6中H)，当植物在第6周大小的时候，很难在叶片中检测到GUS基因的表达(图6中I)，但是茉莉酸甲酯处理能够强烈诱导GUS基因韧皮部特异模式的表达(图6中J)，说明AtWRKY20也具有相同的表达模式。因此，茉莉酸激活的AtWRKY20能够对植物的抗虫性和/或抗病性进行组织特异性调控。

二、拟南芥WRKY20对植物体内次级代谢物-芥子油苷的调控

1.芥子油苷的提取

将植物叶片分为主脉和非主脉两部分进行芥子油苷含量的测定。将用100μM茉莉酸甲酯处理6小时后的拟南芥突变体(wrky20-1(SALK_055904)和wrky20-2(SALK_116115))叶片，用解剖刀沿着叶片主叶脉两边各1mm切开，分为叶脉部分和非叶脉部分。取100-200mg相同重量的样品，每个突变体分别取4份叶脉部分和4份非叶脉部分最为4个生物学重复。将样品迅速放入添加有1ml沸水的离心管中，在沸水浴中煮10min，将上层水转移到新的离心管，再次加入1ml沸水到样品管中，继续煮10min后收集水溶液。将2次获得的水溶物混合，采用Agilent 1260 HPLC系统进行高效液相色谱(HPLC)分析。

2.芥子油苷的测定

将含有芥子油苷的水溶物样品先经过二乙基氨基乙基-葡聚糖A-25(DEAE-sephadexA-25)纯化柱，然后用5ml醋酸吡啶溶液淋洗，使芥子油苷能够吸附在纯化柱上，随后加入100μl 0.1％的硫酸酯酶使芥子油苷进行脱硫反应，过夜处理后用1ml水洗脱，即获得芥子油苷纯化后的样品。将样品进行HPLC定量分析，以黑芥子苷(signigrin)作为检测的内参，计算芥子油苷的含量。

结果如图7中A所示，与拟南芥野生型Col-0叶片相比，茉莉酸甲酯处理引起wrky20突变体植物叶片非主脉部分脂肪类芥子油苷含量显著增加，而主脉部分吲哚类芥子油苷含量显著减少。进一步详细的分析表明，在wrky20突变体的主脉部分几乎所有的吲哚类芥子油苷(I3M、4MI3G和1MI3G)的含量均显著降低(图7中B)，但是有四种测定的脂肪类芥子油苷(4MSB、4MTB、3MSP和8MSO)和一种吲哚类芥子油苷(I3M)的含量在wrky20突变体叶片的非主脉部分显著增加(图7中C)。植物叶片主脉组织烟粉虱喜欢取食的部位，wrky20突变体内吲哚类芥子油苷的减少，说明表达WRKY20能够提高植物对烟粉虱的抗性；而非主脉组织是棉铃虫和二斑叶螨喜欢取食的部位，wrky20突变体内脂肪类芥子油苷的增加，说明降低WRKY20的表达反而提高植物对棉铃虫和二斑叶螨等的抗性。

三、拟南芥WRKY20对激素途径相关的抗性基因表达的调控作用

用茉莉酸甲酯处理拟南芥植物后进行取样，随后用RNA提取试剂盒提取样品RNA，并用反转录试剂盒反转得到cDNA，检测拟南芥野生型植物Col-0和wrky20突变体植物体内与激素途径相关的抗性基因的表达。

结果如图8所示，相比AtMYC2对昆虫取食的快速响应，AtWRKY20是一个晚期表达的基因，并且WRKY20和MYCs在植物抗虫性的应用中存在负反馈调控。在wrky20突变体中茉莉酸和乙烯途径协同调控的植物防御素基因AtPDF1.2(图9中A)被显著抑制，说明过表达WRKY20能够提高植物对烟粉虱的抗性。植物茉莉酸途径的毒性蛋白基因AtVSP1(图9中B)、MYCs基因(图8中C)和水杨酸途径相关基因AtSID2(图10中A)、AtPAL1(图10中B)、AtEDS5(图10中C)、AtPAD4(图10中D)或者AtPR1(图10中E)在wrky20突变体中高表达，说明了拟南芥WRKY20是植物多激素途径(如茉莉酸、乙烯和水杨酸)调控的节点，通过对不同激素途径的协调调控，实现对各种病虫害不同的抗性作用。

四、WRKY20蛋白在植物体内高度保守

通过NCBI网站上的BLAST找出与拟南芥AtWRKY20蛋白氨基酸序列11同源性比较高的其他蛋白accession number并找出它们的相应编码蛋白的氨基酸序列如下：棉花GhWRKY20-1，AIE43819.1，蛋白氨基酸序列为3；棉花GhWRKY20-2，AIE43818.1，蛋白氨基酸序列为4；水稻OsWRKY30，NP_001062148.1；水稻OsWRKY78，NP_001060116.1，；本式烟NbWRKY20，BAS69353.1；番茄SlWRKY20-1，XP_004251909.1；番茄SlWRKY20-2，XP_004244048.1；油菜BnWRKY20，ACI14387.1。

利用ClustalX2程序和MEGA6构建植物WRKY20蛋白的系统发育树。如图11所示，番茄、油菜、棉花和本式烟中的WRKY20蛋白与拟南芥AtWRKY20蛋白均具有很高的序列同源性，这说明植物中的WRKY20蛋白序列具有高度保守性，也说明其他植物物种中与拟南芥WRKY20同源的WRKY20蛋白，可能在植物抗虫性和/或抗病性的应用中具有与拟南芥WRKY20基因相似的抗虫和/或抗病功能。

实施例5、棉花GhWRKY20-1和GhWRKY20-2基因的克隆以及病毒诱导的基因沉默(VIGS)GhWRKY20-1 VIGS和GhWRKY20-2 VIGS表达载体的构建

本实施例提供了来源于棉花的GhWRKY20-1和GhWRKY20-2基因，棉花GhWRKY20-1和GhWRKY20-2基因的基因组DNA的核苷酸序列分别为序列9和10，棉花GhWRKY20-1和GhWRKY20-2基因编码区DNA的核苷酸序列分别为序列11和12，编码的GhWRKY20-1和GhWRKY20-2蛋白的氨基酸序列分别为序列13和14。

一、目标片段的制备

以棉花叶片cDNA为模板，用上游引物GhWRKY20-1F和下游引物GhWRKY20-1R进行PCR扩增，得到约450bp的PCR扩增产物，记为GhWRKY20-1片段。引物如下：

上游引物GhWRKY20-1F：5’-CAAGTCTAGACAACATGTATGGCCAGATG-3’(序列15)；

下游引物GhWRKY20-1R：5’-CAAGGGATCCAGTGCATTTACAGTTACTGG-3’(序列16)。

以棉花叶片cDNA为模板，用上游引物GhWRKY20-2F和下游引物GhWRKY20-2R进行PCR扩增，得到约450bp的PCR扩增产物，记为GhWRKY20-2片段。引物如下：

上游引物GhWRKY20-2F：5’-CAAGTCTAGATTGCGGTTATGGCCAGATGG-3’(序列17)；

下游引物GhWRKY20-2R：5’-CAAGGGATCCGGCCCACACATTGCTACTGG-3’(序列18)。

二、GhWRKY20-1 VIGS和GhWRKY20-2 VIGS载体的构建

将上述一得到的450bp的PCR扩增产物GhWRKY20-1和GhWRKY20-2片段分别利用XbaI和BamHI双酶切后与将psTRV2载体利用XbaI和BamHI双酶切后得到的骨架载体相连，将得到的含有GhWRKY20-1和GhWRKY20-2片段的序列正确的重组载体分别记为psTRV2-GhWRKY20-1和psTRV2-GhWRKY20-2，psTRV2-GhWRKY20-1和psTRV2-GhWRKY20-2即为分别沉默棉花GhWRKY20-1和GhWRKY20-2基因的VIGS载体。psTRV2-GhWRKY20-1含有序列表中序列11的第945-1394位所示的DNA片段，psTRV2-GhWRKY20-2含有序列表中序列12的第938-1387位所示的DNA片段。

实施例6、棉花GhWRKY20-1和GhWRKY20-1在调控植物抗虫性中的应用

一、棉花GhWRKY20-1和GhWRKY20-2病毒诱导的基因沉默植物的构建

将实施例5制备的基因沉默载体psTRV2-GhWRKY20-1和psTRV2-GhWRKY20-2以及psTRV1和psTRV2空载体通过电击的方式分别单个转化到农杆菌EHA105菌株中，然后将含有psTRV1的菌液和含有psTRV2的菌液混合(作为对照)，将含有psTRV1的菌液和含有psTRV2-GhWRKY20-1的菌液混合，将含有psTRV1的菌液和含有psTRV2-GhWRKY20-2的菌液混合，菌液混合体积比均为1:1，得到三种重组混合菌液，然后用注射的方式分别将三种重组混合菌液浸润2周大的棉花栽培品种Xinhai 21植株的子叶，放置在植物温室中进行生长，生长到一定时期后用定量PCR进行沉默基因的检测，从利用含有psTRV1的菌液和含有psTRV2-GhWRKY20-1的菌液得到的植株中筛选出GhWRKY20-1基因不表达的植株，从利用含有psTRV1的菌液和含有psTRV2-GhWRKY20-2的菌液得到的植株中筛选得到GhWRKY20-2基因不表达的植株，即分别获得了GhWRKY20-1 VIGS和GhWRKY20-2 VIGS基因沉默的棉花植株。

二、棉花GhWRKY20-1 VIGS和GhWRKY20-2 VIGS植物的抗虫性检测

按照实施例2的步骤二来检测利用psTRV1和psTRV2得到的空载体对照棉花植株、GhWRKY20-1 VIGS或GhWRKY20-2 VIGS基因沉默的棉花植株对烟粉虱和棉铃虫的作用。

结果如图12中A所示，与在空载体对照棉花植株上取食相比，在GhWRKY20-1 VIGS或GhWRKY20-2 VIGS基因沉默的棉花植株上烟粉虱的产卵量显著提高；而与在空载体对照棉花植株上取食相比，棉铃虫在GhWRKY20-1 VIGS或GhWRKY20-2 VIGS基因沉默的棉花植株上取食时其体重更轻，在取食到第5天的时候，棉铃虫体重大约是空载体对照棉花植物上棉铃虫体重的65％(图12中B)。此外，GhWRKY20VIGS基因沉默棉花抗棉铃虫的作用和含有Bt(Bacillus thuringiensis)基因的BD18陆地棉植株相似(图12中C)。这说明沉默棉花GhWRKY20-1或GhWRKY20-2基因的表达会增加植物对烟粉虱的易感性但是提高植物对棉铃虫的抗性，表明，提高WRKY20表达能够提高锦葵科植物对烟粉虱的抗性，而降低WRKY20表达却提高锦葵科植物对棉铃虫的抗性。

三、棉花GhWRKY20-1和GhWRKY20-2调控棉酚合成相关基因的表达

杜松烯合酶(CAD)是一种倍半萜烯环化酶，催化法尼基二磷酸环化生成杜松烯，这是棉花中棉酚合成途径中的限速反应，含棉酚高的棉花是一种很好的抗虫种质资源,其棉酚对棉铃虫具有很好的抑制生物活性。用植物RNA提取试剂提取棉花样品的RNA，并用反转录试剂盒反转得到cDNA，检测空载体对照棉花植株、GhWRKY20-1 VIGS或GhWRKY20-2 VIGS的棉花植株中与杜松烯合酶基因GhCAD3和GhCAD4的表达。

结果如图12中D-F所示，GhWRKY20-1 VIGS或GhWRKY20-2 VIGS的棉花植株中GhCAD3和GhCAD4的基因表达水平更高，增加植株对棉铃虫的抗性。

实施例7、番茄SlWRKY20-1基因的克隆以及病毒诱导的基因沉默(VIGS)SlWRKY20-1 VIGS表达载体的构建

本实施例提供了来源于番茄的SlWRKY20-1基因，番茄SlWRKY20-1基因的基因组DNA的核苷酸序列为序列19，番茄SlWRKY20-1基因编码区DNA的核苷酸序列为序列20，编码的SlWRKY20-1蛋白的氨基酸序列为序列21。

一、目标片段的制备

以番茄叶片cDNA为模板，用上游引物SlWRKY20-1F和下游引物SlWRKY20-1R进行PCR扩增，得到约433bp的PCR扩增产物。引物如下：

上游引物SlWRKY20-1F：5’-CAAGGGATCCCCTAATCCCAGGAGTTAT-3’(序列22)；

下游引物SlWRKY20-1R：5’-CAAGTCTAGAGCCAGTGCCCTGAACACG-3’(序列23)。

二、番茄SlWRKY20-1 VIGS表达载体的构建

将上述一得到的约432bpPCR扩增产物利用XbaI和BamHI双酶切后与将psTRV2载体，利用XbaI和BamHI双酶切后得到的骨架载体相连，将得到的序列正确的重组载体记为psTRV2-SlWRKY20-1，即沉默番茄SlWRKY20-1基因的VIGS载体，psTRV2-SlWRKY20-1含有序列表中序列20的第1333-1765位所示的DNA片段。

实施例8、番茄SlWRKY20-1基因在调控植物抗虫性中的应用

一、番茄SlWRKY20-1基因病毒诱导的基因沉默植物的构建

将实施例7制备的基因沉默载体psTRV2-SlWRKY20-1以及psTRV1和psTRV2空载体分别通过电击的方式转化到农杆菌EHA105菌株中，然后将含有psTRV1的菌液和含有psTRV2的菌液混合(作为对照)，将含有psTRV1的菌液和含有psTRV2-SlWRKY20-1的菌液混合，菌液混合体积比均为1:1，得到两种重组混合菌液，然后用注射的方式分别将两种重组混合菌液浸润2周大的番茄子叶，放置在植物温室中进行生长，生长到一定时期后用定量PCR进行沉默基因的检测，从利用含有psTRV1的菌液和含有psTRV2-SlWRKY20-1的菌液得到的植株中筛选出SlWRKY20-1基因不表达的植株，即获得SlWRKY20-1 VIGS基因沉默的番茄植株。所用番茄为栽培品种中杂9号(Solanumlycopersicum)。

二、番茄SlWRKY20-1 VIGS植物的抗虫性检测

按照实施例3的二来检测利用psTRV1和psTRV2得到的空载体对照番茄植株或SlWRKY20-1 VIGS基因沉默的番茄植株对烟粉虱的作用。

结果如图13所示，与空载体对照番茄植株上取食相比，在SlWRKY20-1 VIGS的番茄植株上烟粉虱的产卵量显著提高。这说明沉默番茄SlWRKY20-1基因的表达会增加植物对烟粉虱的易感性，表明，提高WRKY20表达能够提高茄科植物对烟粉虱的抗性。

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> WRKY20蛋白质及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用

<160> 23

<170> Patent In version 3.5

<210> 1

<211> 3992

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 1

ggattgttta catcttctaa ttgtttttgt caactttaac gtttgttgtt gttgctttag 60

aaattgataa agctaaataa aggagaaaaa gaagaagaag aaaataaatt attaaaaaaa 120

tgaaaaggaa aaacaaagaa ttaagagagg tgtgaagtca atatcgttct ttcatctttc 180

actacaatct tcactaacgc agagaccaaa atctctctca tttcgccata gctgagagct 240

tcttctactt tcccttagct tcttttttcc ttcatttttg ttctaccctt gcgaatctct 300

gaaatgaacc ctcaagctaa tgaccggaag gagtttcagg gagattgttc ggcgacggga 360

gatctcacgg caaagcacga ttcagctgga ggaaacggag gtggaggtgc taggtataag 420

ctgatgtcac cggccaagct tccgatctcg aggtcgactg atatcacgat tcctcctggg 480

ttgagtccga cttcgttttt ggaatctcct gttttcatct ccaacatcaa ggtttaagca 540

gctactttac tatctctttc ttcttcttct tcttcgattt tggtaaatgc aatcacagtt 600

tcacctcatt tttgttgtcg atttgagaaa ttaggttttc tgatttcata tttttaagac 660

ctaaaggatt tttcatgaaa ttggattgtg ccattttgaa actgagtttg gaattggaat 720

tgattcataa cattgacatt ttgtcccact tgttcggttt ctcgttgctt caatttcgat 780

ttggatcact gttcatgtta gtggggaatt tctggtaatt tggtggagat gctctctgct 840

tgctcactag gaaaaacatt ggacttgggt ttccattttt gtttcttagt ccattacaag 900

tgattaaaaa actatgattt gtttgcttac gttagggact ttggccaaga ttctgattct 960

ttgtgctact atactctgca ttggtttgca tttgtgtccg ttcagattgt tctttcgaat 1020

aaaccttttt tttttatcat gttctattgg tgctggatac tttatttata tcctcttgct 1080

ctttgtcgtt tcttcttcat actgtctagt gtctatcttc catgtgtttg gtgcttctct 1140

tttctttttc cattctttgt acatttaggt ttcggttagc tgcgtctgtg tggggattcc 1200

ttttacttat atgagctatt gaatgattct gttggtgaga aaatgtactt tactcgcatg 1260

ttcaccattt agatctatag agtattcgtt ttgttcaatt aagttatgaa taataggtta 1320

tatgctatgt gctcaatttt attttgcatc tcttagttat atcttcttat cccttgattg 1380

aacaagatat tgtttttgtt tttagaagac tgtttttttt aaaacatcat gtttattgat 1440

agatcaggtt catgttttac aaaatctgat atgtattgtt ttattcatgc cattaataat 1500

atgccacttt ctttaacttt cagccagaac cttcccctac tactggttct ttgttcaagc 1560

ctcgaccagt gcacatttct gctagctcaa gttcttatac aggcaggggg ttccatcaga 1620

acacctttac tgagcagaag tccagtgaat ttgagttcag acctcctgca tcaaatatgg 1680

tattgtccaa aacaatgctg tttgttatgc tttgcatgta atgtactgtt cagatagtcg 1740

acgacatatg aaccccgaac agtggctgac ctaatttttc tgcacgaagt ctatttattc 1800

agcgcttgga ttgcttgtaa atctcaaaat ctttcgcctt tgcatacata taataccatg 1860

ccagccttaa attgtttcat aaggagcctt gtatccaaaa gctcacagtt tataagttac 1920

ttgtatattg ttgggggatg actttgtcta aacatcttta ttgatttcaa ggtatatgca 1980

gagcttggca agattagaag tgagccacca gtacattttc aaggccaggg ccatggatcc 2040

tcacactcac cttcttcgat cagtgatgct gcaggttcct caagtgagct aagccggcca 2100

actcctcctt gtcagatgac accaacgagc tcagatattc cggctggatc tgatcaagag 2160

gaatcaatcc agacttccca aaatgactcc agaggaagca ctccatccat cttggctgat 2220

gatggttata actggagaaa atatggtcaa aagcatgtca aagggagtga atttccccgg 2280

agctattata aatgtacaca tcctaattgt gaagtgaaaa agttatttga aagatctcat 2340

gatgggcaga tcaccgatat tatatacaag ggtacacatg accatcctaa acctcaacct 2400

ggtcgccgaa actctggtgg tatggctgca caagaagaaa ggctagacaa gtatccttct 2460

tcaactggcc gagatggtaa tcataactaa aacttgagac aaatatgcac ttactccctt 2520

ggcaatatct ataacttttt ccttctactc ttatgtctgc atacagagaa gggatctggc 2580

gtctacaact tgtctaaccc caatgaacaa actggtaacc ctgaagtacc tcctatctca 2640

gcatctgacg atggtggaga agcggcagcg tcaaatagga ataaagatga gccggacgat 2700

gatgatccat tctcaaaacg gaggtattag agtttaacaa aggattcagg tgcttgattt 2760

gaatctgtga tttgacatga ttaaaacttt attttaactt tatgtaggag gatggagggt 2820

gcgatggaaa taactccact agtgaaaccc atccgggagc ctcgggttgt tgttcaaact 2880

ctgagtgagg ttgacattct ggatgatggt tatagatggc gcaaatatgg gcagaaagtc 2940

gtaaggggga acccaaatcc caggtttgta cagcattaaa gcttttaaca ccccaaaaaa 3000

ttccttgctt ttttctcgaa tgaacataca taaacataac ttgcgagttc aaaatggtag 3060

ctagaacagt ttagtccttg tcttcaggac ctagttattt gacatgtgca taaagtgttg 3120

cttcttttag gaatttggtt tggaatatgg aagatagtga tcttaacaga ctcaacatgt 3180

gcgcaatgga gatattatgt ttcatgatgt tcctcggcct tttgtaggag ctactacaaa 3240

tgcacagctc atggatgccc agtgagaaaa cacgtggaga gagcatcaca tgatccaaaa 3300

gctgtaataa caacatacga aggcaaacac gatcatgatg ttcccacttc aaagtctagc 3360

agcaatcacg aaatccagcc tcggttcaga ccagatgaaa cagacaccat cagcctcaat 3420

cttggtgttg gaatctcatc tgatggacct aaccacgctt ccaacgaaca tcagcaccag 3480

aatcaacaac ttgtcaacca aactcaccca aatggagtca atttcaggtt tgttcatgct 3540

agtcccatgt catcctacta tgctagctta aatagcggta tgaatcagta cggccagaga 3600

gaaacaaaga acgagactca aaatggtgac atctcgtcct tgaacaattc atcttaccca 3660

tatccgccca acatggggag agtacaatcg ggtccgtaaa acaaaaagta agcaacatta 3720

tgtacgggat cttcttaggt taggaatggg acgaggcctt gttctatata attcctattt 3780

cttcacagag agctgatctt gattcaaact atctccacca tatatatttg tttgtgtcac 3840

ctgtattgag ttccaaaaat gttatgtaaa aatacacaac aagatgttaa tgcttttatt 3900

taaacaagaa acagcaatat tactacaaac tatttcttct tcaccgtaat tagatatgct 3960

ccatgaaaga aacaccacga cggtacttaa gc 3992

<210> 2

<211> 1674

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 2

atgaaccctc aagctaatga ccggaaggag tttcagggag attgttcggc gacgggagat 60

ctcacggcaa agcacgattc agctggagga aacggaggtg gaggtgctag gtataagctg 120

atgtcaccgg ccaagcttcc gatctcgagg tcgactgata tcacgattcc tcctgggttg 180

agtccgactt cgtttttgga atctcctgtt ttcatctcca acatcaagcc agaaccttcc 240

cctactactg gttctttgtt caagcctcga ccagtgcaca tttctgctag ctcaagttct 300

tatacaggca gggggttcca tcagaacacc tttactgagc agaagtccag tgaatttgag 360

ttcagacctc ctgcatcaaa tatggtatat gcagagcttg gcaagattag aagtgagcca 420

ccagtacatt ttcaaggcca gggccatgga tcctcacact caccttcttc gatcagtgat 480

gctgcaggtt cctcaagtga gctaagccgg ccaactcctc cttgtcagat gacaccaacg 540

agctcagata ttccggctgg atctgatcaa gaggaatcaa tccagacttc ccaaaatgac 600

tccagaggaa gcactccatc catcttggct gatgatggtt ataactggag aaaatatggt 660

caaaagcatg tcaaagggag tgaatttccc cggagctatt ataaatgtac acatcctaat 720

tgtgaagtga aaaagttatt tgaaagatct catgatgggc agatcaccga tattatatac 780

aagggtacac atgaccatcc taaacctcaa cctggtcgcc gaaactctgg tggtatggct 840

gcacaagaag aaaggctaga caagtatcct tcttcaactg gccgagatga gaagggatct 900

ggcgtctaca acttgtctaa ccccaatgaa caaactggta accctgaagt acctcctatc 960

tcagcatctg acgatggtgg agaagcggca gcgtcaaata ggaataaaga tgagccggac 1020

gatgatgatc cattctcaaa acggaggagg atggagggtg cgatggaaat aactccacta 1080

gtgaaaccca tccgggagcc tcgggttgtt gttcaaactc tgagtgaggt tgacattctg 1140

gatgatggtt atagatggcg caaatatggg cagaaagtcg taagggggaa cccaaatccc 1200

aggagctact acaaatgcac agctcatgga tgcccagtga gaaaacacgt ggagagagca 1260

tcacatgatc caaaagctgt aataacaaca tacgaaggca aacacgatca tgatgttccc 1320

acttcaaagt ctagcagcaa tcacgaaatc cagcctcggt tcagaccaga tgaaacagac 1380

accatcagcc tcaatcttgg tgttggaatc tcatctgatg gacctaacca cgcttccaac 1440

gaacatcagc accagaatca acaacttgtc aaccaaactc acccaaatgg agtcaatttc 1500

aggtttgttc atgctagtcc catgtcatcc tactatgcta gcttaaatag cggtatgaat 1560

cagtacggcc agagagaaac aaagaacgag actcaaaatg gtgacatctc gtccttgaac 1620

aattcatctt acccatatcc gcccaacatg gggagagtac aatcgggtcc gtaa 1674

<210> 3

<211> 1986

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 3

atgatggtgt ggttatgtga aggggacaac acctttttga actttggaaa ttttcatgca 60

aacttttccg tttctagatt ttcttagagt tttttaatta ccaaaaaaaa acagttatcg 120

agtttttcct tatttcttct gttaatctag acattaaatt taatatgtaa aaatgacaag 180

actatgtata tgatatgagt gttgcaccaa gaaaaaatta ctatctaaaa tcttcactag 240

tcacatattt ttgaatagtt atgatatatt ttctgttgct ttatcatttt accgagttac 300

ccactttcga attatcagtt tttatcaaaa catggattga taattattta aaatacaagt 360

aaaacaattg ttggtttaga aaagaattac atagttttat tctgaaacgg cattgaacag 420

tattgagaga tatatacaca tattcttctt atcttttaca cattttggaa gttttacaac 480

caaagaaaca tgtttttttt tttttttgaa aaattctcta acaagatttg aggtggacca 540

acttggatcc agaatgtcac cactcaccat tatatatcct aactgttatc cacgcaaata 600

gaacacaacc gctaccccac aagataaacc aatagcttaa atttttaaca aaaaaaattc 660

gattcaactc ccacataatt tggtaggtaa tttgactcaa gggcctaggc ccatttaaac 720

caatgaaaga aactgagaac ggcccaaaga tatctcacac atatcctctc tatataatac 780

ataatcatag catatcaatt tcattatcac cgatcaaatt agggtttctc tttcgattac 840

agagtttcac ttgtttggag ccaacaatca tactctgcaa ccaaaatcca aaacaagaaa 900

aaaatggcct gtctcaacga tgataagaag aagaagtttc acctagtcct tgacttggac 960

cacacgcttg tccactcggt acttgtttcg gacctttccg aagagcagaa gtatctaatc 1020

gaaggagctg attcaaggtc agatctgtgg agaatcaaca gagatccact cccagcgaat 1080

atatgataaa gctacgacct tttcttcatg aatttctatt agaagccaac aagcgtttca 1140

tcatgcacgt atacacaatg ggtgattcta gttacgctca gaccgtgttg aagtggattg 1200

atccggaaaa aaatatactt tggagatcga gtcctagcca gagaacaaag tccttatgag 1260

aagacactcg atcttcttgc tgttgatgag cgtagagtgg taattgtcga tgatgcgatt 1320

gatatttggc ctcatcacaa tagaaacttg ttacaaatca gcaaatacat ttatttcagc 1380

gtcggtattg aactattgat aaacatcgca gaagataaga tagacgagag tcgaagcaac 1440

ggatcattgg cgcacaaaag attcaaaaag gtaagtttta aaagacctga gactgttgat 1500

acctgatcct taattatcat caacaatact gcttctgact gtgtcaatct accaatgcta 1560

caacactctt actttgagat ttaggatgtt tctggttcca acaactcttt aaacaagcaa 1620

ttttgattac actaactttt ttatctttta cattttgaca aatgtacatg agaaaaaaaa 1680

agaggattgt ttacatcttc taattgtttt tgtcaacttt aacgtttgtt gttgttgctt 1740

tagaaattga taaagctaaa taaaggagaa aaagaagaag aagaaaataa attattaaaa 1800

aaatgaaaag gaaaaacaaa gaattaagag aggtgtgaag tcaatatcgt tctttcatct 1860

ttcactacaa tcttcactaa cgcagagacc aaaatctctc tcatttcgcc atagctgaga 1920

gcttcttcta ctttccctta gcttcttttt tccttcattt ttgttctacc cttgcgaatc 1980

tctgaa 1986

<210> 4

<211> 557

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 4

Met Asn Pro Gln Ala Asn Asp Arg Lys Glu Phe Gln Gly Asp Cys Ser

1 5 10 15

Ala Thr Gly Asp Leu Thr Ala Lys His Asp Ser Ala Gly Gly Asn Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ala Arg Tyr Lys Leu Met Ser Pro Ala Lys Leu Pro Ile

35 40 45

Ser Arg Ser Thr Asp Ile Thr Ile Pro Pro Gly Leu Ser Pro Thr Ser

50 55 60

Phe Leu Glu Ser Pro Val Phe Ile Ser Asn Ile Lys Pro Glu Pro Ser

65 70 75 80

Pro Thr Thr Gly Ser Leu Phe Lys Pro Arg Pro Val His Ile Ser Ala

85 90 95

Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Gly Arg Gly Phe His Gln Asn Thr Phe Thr

100 105 110

Glu Gln Lys Ser Ser Glu Phe Glu Phe Arg Pro Pro Ala Ser Asn Met

115 120 125

Val Tyr Ala Glu Leu Gly Lys Ile Arg Ser Glu Pro Pro Val His Phe

130 135 140

Gln Gly Gln Gly His Gly Ser Ser His Ser Pro Ser Ser Ile Ser Asp

145 150 155 160

Ala Ala Gly Ser Ser Ser Glu Leu Ser Arg Pro Thr Pro Pro Cys Gln

165 170 175

Met Thr Pro Thr Ser Ser Asp Ile Pro Ala Gly Ser Asp Gln Glu Glu

180 185 190

Ser Ile Gln Thr Ser Gln Asn Asp Ser Arg Gly Ser Thr Pro Ser Ile

195 200 205

Leu Ala Asp Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys His Val

210 215 220

Lys Gly Ser Glu Phe Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr His Pro Asn

225 230 235 240

Cys Glu Val Lys Lys Leu Phe Glu Arg Ser His Asp Gly Gln Ile Thr

245 250 255

Asp Ile Ile Tyr Lys Gly Thr His Asp His Pro Lys Pro Gln Pro Gly

260 265 270

Arg Arg Asn Ser Gly Gly Met Ala Ala Gln Glu Glu Arg Leu Asp Lys

275 280 285

Tyr Pro Ser Ser Thr Gly Arg Asp Glu Lys Gly Ser Gly Val Tyr Asn

290 295 300

Leu Ser Asn Pro Asn Glu Gln Thr Gly Asn Pro Glu Val Pro Pro Ile

305 310 315 320

Ser Ala Ser Asp Asp Gly Gly Glu Ala Ala Ala Ser Asn Arg Asn Lys

325 330 335

Asp Glu Pro Asp Asp Asp Asp Pro Phe Ser Lys Arg Arg Arg Met Glu

340 345 350

Gly Ala Met Glu Ile Thr Pro Leu Val Lys Pro Ile Arg Glu Pro Arg

355 360 365

Val Val Val Gln Thr Leu Ser Glu Val Asp Ile Leu Asp Asp Gly Tyr

370 375 380

Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Val Arg Gly Asn Pro Asn Pro

385 390 395 400

Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Ala His Gly Cys Pro Val Arg Lys His

405 410 415

Val Glu Arg Ala Ser His Asp Pro Lys Ala Val Ile Thr Thr Tyr Glu

420 425 430

Gly Lys His Asp His Asp Val Pro Thr Ser Lys Ser Ser Ser Asn His

435 440 445

Glu Ile Gln Pro Arg Phe Arg Pro Asp Glu Thr Asp Thr Ile Ser Leu

450 455 460

Asn Leu Gly Val Gly Ile Ser Ser Asp Gly Pro Asn His Ala Ser Asn

465 470 475 480

Glu His Gln His Gln Asn Gln Gln Leu Val Asn Gln Thr His Pro Asn

485 490 495

Gly Val Asn Phe Arg Phe Val His Ala Ser Pro Met Ser Ser Tyr Tyr

500 505 510

Ala Ser Leu Asn Ser Gly Met Asn Gln Tyr Gly Gln Arg Glu Thr Lys

515 520 525

Asn Glu Thr Gln Asn Gly Asp Ile Ser Ser Leu Asn Asn Ser Ser Tyr

530 535 540

Pro Tyr Pro Pro Asn Met Gly Arg Val Gln Ser Gly Pro

545 550 555

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caagggtacc atgaaccctc aagctaatga ccg 33

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caaggcggcc gcggacccga ttgtactct 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caagggtacc atgatggtgt ggttatgtg 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caagctcgag ttcagagatt cgcaagggt 29

<210> 9

<211> 5890

<212> DNA

<213> 棉花（Gossypium spp）

<220>

<221> misc_feature

<222> (570)..(570)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 9

tttaatttta gtgaaataat attatctaat tattagagtt gtttttaata aggtataata 60

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taaaaaataa acatataaca atttttgaaa gctacttata gaataaaaaa tatacattgt 180

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agcaggttgt tagtttttct ttgtttattt taataagtct taaaagtata tctactacaa 300

agagtcttga ctcgtaaagg agtgagatta aaatttttta tcataaattt aatataggtt 360

gaaatcctac cctacaactc ccatctacta tgaggatgaa agggacaaaa aaaaaatgga 420

aaactatttt ttataaagaa ttttaaaaaa taatttttca tatacaaata aaaaaattaa 480

acatttttta ttgaaaagac tatatgtaag agggtagttt ttttttaaat tgcattttat 540

gattttatat aaaatataca cccttataan acttaattta tatataaaaa aattaataat 600

ttttttacag aattactata taattagctc ctaatgtcag ttcaataaaa attttaaata 660

aaaatataga tataaatcaa tagttaaatt ttgagctaaa caattttttc attaataaac 720

aatttttgaa ttttaaataa attaatatgt atgaaattac aaatgtatcc tatataagac 780

atcaatgtca aattctgttg cgctcttgtg acaatcatct catactttaa tgacttgaac 840

aattttgaag ctttaatttt taattaaaga caactcaaaa aaaatgtaaa aacttaattt 900

acttatatac ccctccctcc ttttttttcc ccttctaatt gacaaaaaaa tcaaatccat 960

tttgactctt tttctttagc tgccttgttt tcctctttga caatggagga acaaatacta 1020

gcttcttctt cagctgctgc tgctgctgct gctgcttctg cttctgcttc tgctactcag 1080

cacgatctat cggcttcagc tgcttctagt ggagctcgct acaagctggt ggctccggct 1140

aagctaccga tctcaaggtc ggcttgtatt acgatcccgc ctgggcttag tccttcttct 1200

tttttggagt ctcctgttct tctttcagat gttaaggtta gacctccttt tttatgtctt 1260

tttggggttg gatcggtttt gggttgtgtt tgtttcctga gaaaatagag gaaaagctgg 1320

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gtttttgaat gaagttattg gatttatttt aagctaaaga gatgcttaag aaaaacaaaa 1560

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attattctga aaatatgtct tgttctcact ctctctccct atatatataa atattggttt 5040

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atgtgaattg tgaaccattt gaaaagaacc ttttagaaga acaaaagaaa acatgcttag 5640

tattttgtca cattctagac tagagacaaa tctttcataa agtgtctaat ttgttatctc 5700

actggtatgg atgaatttct ggtttgaaac tgctttcgag cacacttcaa gaattttttt 5760

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<210> 10

<211> 5932

<212> DNA

<213> 棉花（Gossypium spp）

<220>

<221> misc_feature

<222> (681)..(681)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 10

ctaggtaaga tattgcttgt gaaagtaccc aatgcttaaa tttgatttaa cttttagtgg 60

caaattcgct tcaacctcag ccctaccttt acctttattt gtatatatag ctacttattt 120

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aaaggaggtt ttccaaagct caaatttgtt tactttaatt aataaagaaa agagaggtgt 480

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aacaagtcaa actctgtcca tctcctctga cagccttctc caacacactc aaacagtaaa 780

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ttattatttt attatttaac cttaatttac taatctaacc ctcctttctt tttccttaca 900

gacataaaag ctaaatcaac tccattttga ctctcttcac tgtcttgtct tttttttttt 960

tttaattttc ttttctttgc tgtgttgtaa attgtaaatg gaggagcaaa tattagcatc 1020

ttcttcttct tcatcatctt cttcttcggc tgttgctgcg gctactatgc agcacgatct 1080

atcgggttcg gctggttctg gtggagctcg gtacaagctt gtggctccag ctaagctacc 1140

catctcaagg tcggcttgta ttacgattcc acctgggctt agtccttctt ctttcttgga 1200

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gataaattat gaaatatggc ttctcaggtc catggatttg tatattgcgg gaggaataaa 1740

gtttttccat ttttaaaagt gttgttagta taaaaattct agattggacc ttctttttct 1800

atattctatg tgttttttaa tgccaatgtt gttttttcac acaatgaatc tctccctttt 1860

gattatggga attgtggctt ctttatatgt acacacacac ttaatattta tgtgattttc 1920

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gagccttcac cgactactgg ttctcttatc aagcctcaag cagtacacgc ctctgttgct 2580

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acaaaggtac acatgatcat cctaaacctc agcctagccg ccgatattct tctggtaata 3540

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cgaattaatg ctttcttttt caccatttta gacaagtcat attgcggtta tggccagatg 3720

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attaaaaatc aatgatgata gatttagaat atcacactta caagtcatct tttaatacgc 4140

tcatatgttt caacatatac cttcttgaaa cactatgttg gtggcttact ggcatgttga 4200

cttttgtgct ttgtcataaa ttagatatga gaattgagtg ttttaggatc ttttattcag 4260

tttatcttga gtattatttg tattttgttg tctcgctatg gctttattgc atgccgattt 4320

cgaggctcat atttgagtcg tatgcatgac tactcttgac cataggtttt tgtttcttta 4380

ttttattatt gtttcttaca tcagttattt atgatgttat tttttctgct tactttttat 4440

gtaggagtta ttataagtgc acaaatgccg gttgtcctgt tagaaaacac gttgagaggg 4500

catctcatga tccgaaagcc gttataacca catacgaggg aaaacacaat cacgatgtgc 4560

caactgcaaa aactggtagt catgatacag caggaccagt agcaatgtgt gggccatcaa 4620

gggttagatc agaagaaaat gatgccatta gccttgatct tggtgttggt attagttccg 4680

ttcccgaaca tgcttcaaat gagcaacaac aattggattc tgaactggtc caaagccgcc 4740

cacaggctgg tggttcaagt ttcaaatttg ttcaaccaac tatgatggca tattacggtg 4800

ctctaaatgg cagcatgaat cagtatgttt ctagagaaaa tccgagcgaa ggccgtggtg 4860

ttgaaattac acccctaaat cactcttatg catttccaca gagcatggga agaatactaa 4920

ccggtccgta aaaatctatt aacaacgaag gtgaggatga ataaaaatat ggactggatt 4980

tcatttctcc atctttttca ctggtaaaag ggaaggttaa aattgtattc tgaaaattcg 5040

gatttttcta catatgtatg tatgtatgta tgtaatgtat gtattagttt accatctcag 5100

cttatctcaa tcatgttgcc aatcactgtt tgtattaact tgggagtttg tacaaaagtg 5160

gaacggatac aggtattatt ttctcacagg aaaatgttgt aaaacaaatt cttgaaatga 5220

tatttgtaag aatataatat atatgtatta tccatcttgt ggttaagaat ttgtgagtag 5280

tacatagtat ttttctttaa cattgcctct tagataatgc cccacaaagc caatctttgc 5340

ttacacattt tgatggaaaa ttctcacaca ttatctacag ttattgctgg aggctatgaa 5400

attttggtat cagaccaaag gattgatcag acattttaag aatccgaggt tatgaatttt 5460

gatccttttg atgttctgat cgttgattca gggctgagat tcaattgcag acaacttgtt 5520

ccaggtcctg ttgactgcct aattgaactt tattttttaa ttttcttcaa cacttggatt 5580

ggattatatt tttctagcag aaaaggataa aagaaatggt gaaaatacac caaaatcaac 5640

aatcaggaaa agatatctag aacaaatcca acaggttatc caacatttac aaattgaccg 5700

ttgatataat ccaaaaccca tttggactaa tcggtcattg ttttggcagg gattgtagaa 5760

gagcacatgt atcatgctgt ggcccatatc tccacttgga acttacgaag tctaccatct 5820

caaaaactaa tatgaaactg aaagccgtag ttttggccat catcaacttg gagaaatccc 5880

tttggccagg ccaaattggt cagtctttgc ctctcatttc atccaacatg tt 5932

<210> 11

<211> 1713

<212> DNA

<213> 棉花（Gossypium spp）

<400> 11

atggaggaac aaatactagc ttcttcttca gctgctgctg ctgctgctgc tgcttctgct 60

tctgcttctg ctactcagca cgatctatcg gcttcagctg cttctagtgg agctcgctac 120

aagctggtgg ctccggctaa gctaccgatc tcaaggtcgg cttgtattac gatcccacct 180

aggcttagtc cttcttcttt cttggagtct cctgttcttc tttcagatgt taaggcagag 240

ccttcaccga ctactggttc tctcattaag cctcaggcag tgcatggctc tgttaattct 300

agtacatatt cagtgactgc tgcatgttct aatgcttttg atgaaagaaa tccaagctgc 360

tttgagttta gaccccatcc tagatcaaat ctggcacctg cagatttaaa ccatcttaga 420

agcgaacaat ctctgcagat ccaaggtcaa taccagacta tatcatataa ttcatcagct 480

ttggttaaga gcgagatggc aggctcctca aatgagttga gtctctcggt accatttcat 540

acagctactt ctgtggctag tgcttctgct gaaatcgatg tagacgaatt aaaccagagt 600

gggaactcaa atagtgggat gctgtcaggg cagactgatc atagagtaag tggctcatcc 660

acgatatcag atgatggata caactggaga aagtatggac agaaacatgt taaaggaagt 720

gaatttccac gcagttatta caaatgtaca catcctaatt gtgaagtgaa aaagctattt 780

gagcgatctc atgatggaca gattacggag ataatataca aaggtacaca tgatcatcct 840

aaacctcaac ctagccgccg gtattcttct ggaaatacaa tgtctgtaca agaggaaaga 900

tttgacaagg tgccaccttt gactggtaga gatgacaagt catccaacat gtatggccag 960

atggctcata gtattgaacc aaataataca gcagattcat ctccggtcac agctaatgat 1020

gataatgtgg atgatgttga tgatgatgat cctttctcaa agcgaaggaa gatggatggg 1080

gggattgata tcattcctgt ggtgaagcct atacgggaac cacgtgttgt tgtacagact 1140

ttgagtgaag ttgatatcct tgatgatggg tatcgatggc gcaagtatgg gcaaaaagta 1200

gtgagaggaa atcctaatcc taggagttat tataagtgca caagtgctgg ttgccctgtt 1260

agaaaacaca ttgagagggc gtctcatgat ccgaaagcag ttataaccac gtatgaggga 1320

aaacacaatc atgatgtacc tactgcaaag accagtagcc atgatatagc cggaccagta 1380

actgtaaatg cactatcaag gattagatca gaagaaaatg atgccattag ccttgatctt 1440

ggtggtggga ttagccctgc tcccgagaat agttcgaacg agcatcagca attgcattct 1500

gaactgctcc aaagccacca tcagactggt ggttctagtt tcaaactaca tcaagtgact 1560

ccaatgacag catactatgg tgttcctaat ggtggcatga accagtatgg atctagagaa 1620

gctccgagtg aaggtcgcac tgttgacatt acaccactaa atcattctta tgcatattca 1680

cagaccatgg gaagaatact aacaggtcca taa 1713

<210> 12

<211> 1704

<212> DNA

<213> 棉花（Gossypium spp）

<400> 12

atggaggagc aaatattagc atcttcttct tcttcatcat cttcttcttc ggctgttgct 60

gcggctacta tgcagcacga tctatcgggt tcggctggtt ctggtggagc tcggtacaag 120

cttgtggctc cagctaagct acccatctca aggtcggctt gtattacgat tccacctggg 180

cttagtcctt cttctttctt ggagtctcca gttcttcttt ctgacgttaa ggcggagcct 240

tcaccgacta ctggttctct tatcaagcct caagcagtac acgcctctgt tgcttgtagt 300

acatattcag caaccactgc gtgttctaat gcttttgacg aaagaaatcc aagcaccttt 360

gagtttagac ctcatcctag atcaaatatg gctcctgcag atttagaccc gcagagaagt 420

gagcaatctc ggcagatcca aattcaatat cagaccatat cattcaattc atcagcttca 480

gttaagagtg agatggcagg ctcctcgaat gtattgagcc tttccgtacc tgttcataca 540

gctacttcta tggctagcgc tcatgctgaa gtcgatgcag aggaattaaa ccagataggt 600

aacccaaatg gtgggatgcc atctgggcag tctgatcata gaggagttgg gcctgtgtca 660

tctgaagatg gatacaactg gagaaagtat ggacagaaac atgtgaaagg atgtgaattt 720

ccacgcagtt attacaaatg tacacatcct aattgtgaag tgaaaaagct gtttgagcga 780

tctcatgatg gacagattac tgagataata tacaaaggta cacatgatca tcctaaacct 840

cagcctagcc gccgatattc ttctggtaat atcatgtctg gccaagaaga aagatctgac 900

aaggtctcat ctttgaatgg tagagatgac aagtcatatt gcggttatgg ccagatggct 960

catagtattg agccaaatag tactgcagat atatctcctg tcacagctaa tgatgataat 1020

ttagatgagg ttgaagatga tgatccattc tcgaaacgga ggaagatgga tggtgggatt 1080

gatatcactc ctgtggtgaa gccaatccgg gaaccacgtg ttgttgttca gactgtgagt 1140

gaagttgata taatggatga tgggtatcgt tggcgcaaat atgggcaaaa agtagtgaga 1200

ggaaatccta atcctcggag ttattataag tgcacaaatg ccggttgtcc tgttagaaaa 1260

cacgttgaga gggcatctca tgatccgaaa gccgttataa ccacatacga gggaaaacac 1320

aatcacgatg tgccaactgc aaaaactggt agtcatgata cagcaggacc agtagcaatg 1380

tgtgggccat caagggttag atcagaagaa aatgatgcca ttagccttga tcttggtgtt 1440

ggtattagtt ccgttcccga acatgcttca aatgagcaac aacaattgga ttctgaactg 1500

gtccaaagcc gcccacaggc tggtggttca agtttcaaat ttgttcaacc aactatgatg 1560

gcatattacg gtgctctaaa tggcagcatg aatcagtatg tttctagaga aaatccgagc 1620

gaaggccgtg gtgttgaaat tacaccccta aatcactctt atgcatttcc acagagcatg 1680

ggaagaatac taaccggtcc gtaa 1704

<210> 13

<211> 570

<212> PRT

<213> 棉花（Gossypium spp）

<400> 13

Met Glu Glu Gln Ile Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Thr Gln His Asp Leu Ser Ala Ser

20 25 30

Ala Ala Ser Ser Gly Ala Arg Tyr Lys Leu Val Ala Pro Ala Lys Leu

35 40 45

Pro Ile Ser Arg Ser Ala Cys Ile Thr Ile Pro Pro Arg Leu Ser Pro

50 55 60

Ser Ser Phe Leu Glu Ser Pro Val Leu Leu Ser Asp Val Lys Ala Glu

65 70 75 80

Pro Ser Pro Thr Thr Gly Ser Leu Ile Lys Pro Gln Ala Val His Gly

85 90 95

Ser Val Asn Ser Ser Thr Tyr Ser Val Thr Ala Ala Cys Ser Asn Ala

100 105 110

Phe Asp Glu Arg Asn Pro Ser Cys Phe Glu Phe Arg Pro His Pro Arg

115 120 125

Ser Asn Leu Ala Pro Ala Asp Leu Asn His Leu Arg Ser Glu Gln Ser

130 135 140

Leu Gln Ile Gln Gly Gln Tyr Gln Thr Ile Ser Tyr Asn Ser Ser Ala

145 150 155 160

Leu Val Lys Ser Glu Met Ala Gly Ser Ser Asn Glu Leu Ser Leu Ser

165 170 175

Val Pro Phe His Thr Ala Thr Ser Val Ala Ser Ala Ser Ala Glu Ile

180 185 190

Asp Val Asp Glu Leu Asn Gln Ser Gly Asn Ser Asn Ser Gly Met Leu

195 200 205

Ser Gly Gln Thr Asp His Arg Val Ser Gly Ser Ser Thr Ile Ser Asp

210 215 220

Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys His Val Lys Gly Ser

225 230 235 240

Glu Phe Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr His Pro Asn Cys Glu Val

245 250 255

Lys Lys Leu Phe Glu Arg Ser His Asp Gly Gln Ile Thr Glu Ile Ile

260 265 270

Tyr Lys Gly Thr His Asp His Pro Lys Pro Gln Pro Ser Arg Arg Tyr

275 280 285

Ser Ser Gly Asn Thr Met Ser Val Gln Glu Glu Arg Phe Asp Lys Val

290 295 300

Pro Pro Leu Thr Gly Arg Asp Asp Lys Ser Ser Asn Met Tyr Gly Gln

305 310 315 320

Met Ala His Ser Ile Glu Pro Asn Asn Thr Ala Asp Ser Ser Pro Val

325 330 335

Thr Ala Asn Asp Asp Asn Val Asp Asp Val Asp Asp Asp Asp Pro Phe

340 345 350

Ser Lys Arg Arg Lys Met Asp Gly Gly Ile Asp Ile Ile Pro Val Val

355 360 365

Lys Pro Ile Arg Glu Pro Arg Val Val Val Gln Thr Leu Ser Glu Val

370 375 380

Asp Ile Leu Asp Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val

385 390 395 400

Val Arg Gly Asn Pro Asn Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Ser Ala

405 410 415

Gly Cys Pro Val Arg Lys His Ile Glu Arg Ala Ser His Asp Pro Lys

420 425 430

Ala Val Ile Thr Thr Tyr Glu Gly Lys His Asn His Asp Val Pro Thr

435 440 445

Ala Lys Thr Ser Ser His Asp Ile Ala Gly Pro Val Thr Val Asn Ala

450 455 460

Leu Ser Arg Ile Arg Ser Glu Glu Asn Asp Ala Ile Ser Leu Asp Leu

465 470 475 480

Gly Gly Gly Ile Ser Pro Ala Pro Glu Asn Ser Ser Asn Glu His Gln

485 490 495

Gln Leu His Ser Glu Leu Leu Gln Ser His His Gln Thr Gly Gly Ser

500 505 510

Ser Phe Lys Leu His Gln Val Thr Pro Met Thr Ala Tyr Tyr Gly Val

515 520 525

Pro Asn Gly Gly Met Asn Gln Tyr Gly Ser Arg Glu Ala Pro Ser Glu

530 535 540

Gly Arg Thr Val Asp Ile Thr Pro Leu Asn His Ser Tyr Ala Tyr Ser

545 550 555 560

Gln Thr Met Gly Arg Ile Leu Thr Gly Pro

565 570

<210> 14

<211> 567

<212> PRT

<213> 棉花（Gossypium spp）

<400> 14

Met Glu Glu Gln Ile Leu Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

1 5 10 15

Ser Ala Val Ala Ala Ala Thr Met Gln His Asp Leu Ser Gly Ser Ala

20 25 30

Gly Ser Gly Gly Ala Arg Tyr Lys Leu Val Ala Pro Ala Lys Leu Pro

35 40 45

Ile Ser Arg Ser Ala Cys Ile Thr Ile Pro Pro Gly Leu Ser Pro Ser

50 55 60

Ser Phe Leu Glu Ser Pro Val Leu Leu Ser Asp Val Lys Ala Glu Pro

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Gly Ser Leu Ile Lys Pro Gln Ala Val His Ala Ser

85 90 95

Val Ala Cys Ser Thr Tyr Ser Ala Thr Thr Ala Cys Ser Asn Ala Phe

100 105 110

Asp Glu Arg Asn Pro Ser Thr Phe Glu Phe Arg Pro His Pro Arg Ser

115 120 125

Asn Met Ala Pro Ala Asp Leu Asp Pro Gln Arg Ser Glu Gln Ser Arg

130 135 140

Gln Ile Gln Ile Gln Tyr Gln Thr Ile Ser Phe Asn Ser Ser Ala Ser

145 150 155 160

Val Lys Ser Glu Met Ala Gly Ser Ser Asn Val Leu Ser Leu Ser Val

165 170 175

Pro Val His Thr Ala Thr Ser Met Ala Ser Ala His Ala Glu Val Asp

180 185 190

Ala Glu Glu Leu Asn Gln Ile Gly Asn Pro Asn Gly Gly Met Pro Ser

195 200 205

Gly Gln Ser Asp His Arg Gly Val Gly Pro Val Ser Ser Glu Asp Gly

210 215 220

Tyr Asn Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys His Val Lys Gly Cys Glu Phe

225 230 235 240

Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr His Pro Asn Cys Glu Val Lys Lys

245 250 255

Leu Phe Glu Arg Ser His Asp Gly Gln Ile Thr Glu Ile Ile Tyr Lys

260 265 270

Gly Thr His Asp His Pro Lys Pro Gln Pro Ser Arg Arg Tyr Ser Ser

275 280 285

Gly Asn Ile Met Ser Gly Gln Glu Glu Arg Ser Asp Lys Val Ser Ser

290 295 300

Leu Asn Gly Arg Asp Asp Lys Ser Tyr Cys Gly Tyr Gly Gln Met Ala

305 310 315 320

His Ser Ile Glu Pro Asn Ser Thr Ala Asp Ile Ser Pro Val Thr Ala

325 330 335

Asn Asp Asp Asn Leu Asp Glu Val Glu Asp Asp Asp Pro Phe Ser Lys

340 345 350

Arg Arg Lys Met Asp Gly Gly Ile Asp Ile Thr Pro Val Val Lys Pro

355 360 365

Ile Arg Glu Pro Arg Val Val Val Gln Thr Val Ser Glu Val Asp Ile

370 375 380

Met Asp Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Val Arg

385 390 395 400

Gly Asn Pro Asn Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Ala Gly Cys

405 410 415

Pro Val Arg Lys His Val Glu Arg Ala Ser His Asp Pro Lys Ala Val

420 425 430

Ile Thr Thr Tyr Glu Gly Lys His Asn His Asp Val Pro Thr Ala Lys

435 440 445

Thr Gly Ser His Asp Thr Ala Gly Pro Val Ala Met Cys Gly Pro Ser

450 455 460

Arg Val Arg Ser Glu Glu Asn Asp Ala Ile Ser Leu Asp Leu Gly Val

465 470 475 480

Gly Ile Ser Ser Val Pro Glu His Ala Ser Asn Glu Gln Gln Gln Leu

485 490 495

Asp Ser Glu Leu Val Gln Ser Arg Pro Gln Ala Gly Gly Ser Ser Phe

500 505 510

Lys Phe Val Gln Pro Thr Met Met Ala Tyr Tyr Gly Ala Leu Asn Gly

515 520 525

Ser Met Asn Gln Tyr Val Ser Arg Glu Asn Pro Ser Glu Gly Arg Gly

530 535 540

Val Glu Ile Thr Pro Leu Asn His Ser Tyr Ala Phe Pro Gln Ser Met

545 550 555 560

Gly Arg Ile Leu Thr Gly Pro

565

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caagtctaga caacatgtat ggccagatg 29

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

caagggatcc agtgcattta cagttactgg 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

caagtctaga ttgcggttat ggccagatgg 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

caagggatcc ggcccacaca ttgctactgg 30

<210> 19

<211> 6585

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 19

aatcccataa ccatcccccg tccctttcat gcccccacca cgccctaccc caccctaccc 60

cacatcccca tcccgtttct cccccttttg actgtgtctc ctcctacctc caaaatctct 120

tctgaatccg tcaatggaag attctcagtc tcactcccac tctcacccta accaatacaa 180

cctctcagct ccactccttt ccatcaatga atcttcacag caacttaagt ttgcaagctc 240

cgatgctgct ttctctcaca ccgtctcctc cgccgttgga tccaacaccg gtgctaggta 300

caagctaatg tcacctgcta agctcccgat ctctcgctcc tccgcatgta tcaccatccc 360

tcctggtctc agtccatcat cctttctcga atctcccgtt cttctatcga acatcaaagt 420

tagtcctact tctcatcaca tgaaaattca ctttcagatt tgggaaccga cacactaatt 480

agatgtattt tgcttgtaaa gaaaatgaaa ttggatatct taactaatat tttgattgct 540

gttttcaaat tgttttcctt atttgatact ctctggagtg gagtggagga ccggaggaat 600

ttttttgatg tgattgatgc tttcttaaag tacattttga actattaatt atatgtttgg 660

ttgttttcat tttattgcaa tttgttgttt gattcctttt ccccacctga atgctatttt 720

ggggaatact tgtatatata tagatttgtg tgctatttgc aaccgtaggt tttgatgctt 780

acattaggat gctggtgtat gattattctt ttaaattttc gtagaattat attctgtctt 840

cctctgcgta tatagccgtc agtgtgtttc ttcaaatgtt gaatcttcct tttggcaagg 900

tgctcaactt accactaagt tgttccatag agaaaaaaga tactggtgat atgaatgtgg 960

acataataat ggcatcagaa agttatatac tcttttgtta ttttaaccag tatgattatt 1020

ataagcatgt gtgcttcatg tgtcactaag tcttatattg aaaggttcca acttcagtgg 1080

ttggtgatga atcacctatg aaactattat aagtagcacc tatttttctt gaaagcatct 1140

gtacccacca ctgagatgga atgataattg ataaagaaag atagcgaaca gaaaaaaaaa 1200

ggtttcttcc cctataaaga ggaggaagct ggggtaaaag aggcaaattt gtatcacttt 1260

ggttatccta tgttcagatg ctacttctat tttggaaagg agattgtgat cactgaatag 1320

tatttcttat aacttgcagg ctgagccgtc tcctaccaca ggttccttct ccaaatttca 1380

agtaatgcaa ggctctagtg ggagtgctgc tttttcatat ttgagaagct gttcaagtgg 1440

aaatgtatat ggtgaaacga ccggcgaatt tgagttcaaa tttgctattg catctaattc 1500

tacatcagga tcactggcga atgaagctgc agtggtaatg cgcttgactg ttatccttgg 1560

cattgttgaa aataaattat ctagatttta ttcaaagcgt atatgctcga attagattag 1620

aaacaaggaa atacaacaag accactattg aatattagtt attttctctc cccctttaaa 1680

acttctgaat gagccaatcc attccttaaa ttgaactgtg cttgattcag aaatttgctt 1740

aaaaatctga ctttggtgtt cttgaaattc tctctctctc tctctctcac ccactcacta 1800

acttgccaca tctcatttgt gaaaggattg agacacaact cttaccaata ataaaaagga 1860

ctataacaca attctttgca cttgatgcct gttgtatgct tgtaattata acatgaaatg 1920

tcagtcaaag tcaaagttat tctgttgatc ttcttgtata tgcatttcaa acatacaaaa 1980

ggtatctgca agtgagagat aacttctttg tgtctaaagt tgtgggaaca gggtgggttg 2040

ttggttaatt ctttctttag caagaaaata aaatggttac aatgattgca ccttttgttt 2100

tgtttgtttg tttgttttca gtttctgtaa caaggtgatt acatctcttt tttgttgata 2160

gttcaagacc cttaaatgaa ttaattttga agattgactt tataaaaaag ttgaaaagaa 2220

tgagagtgta gctgttaaaa gtatagtcaa aaggtgttaa ctcattgcca ggaaaatgat 2280

gatttgtttg catagtgtgt ttggtttcca aatatgtcac cagttttttc ctcttggttt 2340

tatttgtttt cttctacatt tgagtggatg tgttgttaag atgaattgct catctcactt 2400

gagtgatact ttggggtttg gaagcatttt ctttctttct acattttatg gatttaatga 2460

cagaggatac aacaacaata agaaggctct gcagatttag ttttttattt tcttttagta 2520

cctaaagaag caatatgtga gcttcattat tattttaact gagttgactt gagttaattc 2580

ctaatacact gttgtaatga agatttctgc aggttccaac caacagcaaa gtgaacctct 2640

gattcaagtt caagatcgat atctttctca atcattagca ccttcagttc ttgttgaaac 2700

cgagatgcct gattcaaaag agctgagtct acctgcacct gttagtttag aagcctcgtc 2760

aattagtact tctgctgctg caactgataa tgaagaaaca aatcagagag gtcaatcaaa 2820

tacaagcacg caagggtcac atgctgataa taaagatgta tcatcgataa ctgctgagag 2880

atcatcagaa gatgggtata actggagaaa gtatggccag aaacttgtta aaggaagtga 2940

attcccaagg agctactaca aatgtacata cccaaactgt gaagttaaaa agatatttga 3000

gcgctctcct gatggacaaa taacagagat tgtgtataaa ggttcccatg atcatcctaa 3060

accccagccc agccgtaggt ttactcctgg tgtgcttact tccatccaag aagacagagg 3120

tgagagagat gcatgcctca ctggtcaaga aggtaaattg aattgctctt taagggttgt 3180

ttctctactc aacaaatgta tgacatggta gtctttattg aagcttcttt gatctcatat 3240

ggagttattc ctctctgttt tatcttttct tgaagacaaa ttcaacacta atgcccagac 3300

tagtaacact gagcccggcg gtaatccact atcacctcga caagcaggtg atgatggtct 3360

tgaaggtaca gtgtctcagt tgcatagtgc taatgatcag atggacgagg atgatccatt 3420

tgcaaaaaga aggtaaaaac caagggtcct aaatttattc ctgtgtagta gtccggttta 3480

acaattgagt ctttaagcag gaaaatggat ggtggcatgg atattacacc aattgttaag 3540

cctatccgtg aaccacgtgt tgttgttcaa actgtgagtg aagttgatat attggatgat 3600

ggatacaggt ggcggaaata tggtcaaaag gtggtccgtg gtaatcctaa tcccaggtat 3660

ttaaagcatt gtgtggcatc taatggctaa atgtctgaag ttcatgtggt tactggttaa 3720

gagattgttt tatggtccaa aatgaatcaa tacttttagg gggagttccc cataatgttc 3780

taagccatct ttctagtcga ctcgataggt tcccctttca ataacagtgt tacttagcaa 3840

agttaaagaa atagatagtc aactattgtt ttgggtgaga tgagaataat catgagatgt 3900

agtggtgata tcttattaag ctctgaactg aaacttattt acaatcccat acaaccataa 3960

ctggaaacat tgggaagtca tgtgttatag cagatagttt tgggtctgta acatagtcgg 4020

cttagaatgt aaacactttc aactaattaa actgtctaaa tgaggtctta gatgagtccg 4080

tacaaactgt tgagaagtga tttgaaatca tttatatgtc aattttcatt gctttgtagc 4140

catgtgcata aatcaaataa agtttattct gtagaatgaa catatttagc tctccaaccc 4200

tcctctcccc atctagcagt ctcttctgac tttcttttcc acctattttt tttgtttgat 4260

attttatgtt atattattta tactcaattt tggtccatta gatttttttg gttctgattt 4320

ctgaatccac tcttattttt atttatcgca ttattaatat tacaaaacaa catacccagt 4380

gtaatcaaac aaagtggggt ctggggagga cagagtgtac gcatacctta ccccaacctt 4440

ggagttagag agacatatca tagtattaat aatacgtatg aaaattggca gtgttaatga 4500

aatattaagg gcagcagtac gattattgaa tgtattactt tgacaacttt tttggctaga 4560

agtgattgag agggtaatta ccacttgatg ccctgtaggt taagttggag catgtgaaat 4620

tgccattaga aacagtcact taaataatca tttatatcca atctgtgttt ttcgctgctc 4680

atttaattgt tggtactctg cgctaatagc ttaatggcct aaagtatttg gaggtcctag 4740

attcaactct catacccttg aaatgctgaa gtaaagcaag gtttaacgtg cacctccatg 4800

actgcgtgtg aaccttgtgc ttctataata tagtaagttg gaccactaag tatttcatta 4860

atttgtcaaa cgcgtgattg taatgccctt gtttcagcag cagaccatag agttctatat 4920

acagcttatt aaacaaacaa ttcagaatga gctgaatgaa cttctagtga gacatctaag 4980

tagtagaggg tgaatggttt tcaggcttga tcgatcatct tcaggtaaat gtttaattag 5040

gaatatagga caagcgaata aaaccttttt tgtgactaga ttcatacacg cctagatcta 5100

ttgtattaat taaatgaaga aaatcatata gaatattcta taggatatct caggatattc 5160

tatttaatta tagaacattt acttccttta ttagcatagg aattgataac tattatgtat 5220

taagtcaatt gaaaattttc tattttcaca gtatgaatat ctgatctcct aaattttctt 5280

tctgaaactc aaaataccct taattagctt tcatggaaat ggctaaactg aagacagagc 5340

aggcagagtg atcacgcatc taacaattca tcaaatctct gataaacttc tgaatatctt 5400

tgcatggagg acctggtgat gttttcgtta atttgcgtac tttaaacagg aaagggaaat 5460

aacatagatt tgttgacctc tcttccgatt ttgtagtctt aggaaggagt atgattattt 5520

agctatcatt ttagatatag aaaatagtcg gtttacctct aaaattgtta agtctacatc 5580

caaaattcaa tgaacctggt cttggtgtga gtttcttatg tttttatggt gttcatgtga 5640

atgtgatgta ggagttatta caagtgcacc aatgctggat gccctgtcag gaaacacgtg 5700

gagagggcat cccatgatcc caaatctgta attactacat atgaggggaa acacaatcac 5760

gatgtaccag cagctaggac taataaccat gaaatggcag gatcagcatc tgtaactggg 5820

ggttcaaggg tcaggacgga agagaatggc tcagttagct tgaatctagg tgttggtatt 5880

ggttatggta tggagaatag gcgcaatgga caactgcaca cactgcctgc agaaactgca 5940

catagccaag ttcaggtttc aagttctagt atgatgttag tacagccagc tacagttgca 6000

gcatgctaca acattgtaaa tggtggaatg agccggtttg gaactatgga aaatcgtgtt 6060

cagggcactg gctttgagac tctgcccttg caatcatctg ctcaatgtcc tcaaaactat 6120

ggaaggatac ttttgggccc gtgaatgttt cttccctcag gcaaaaactt aaaaataaga 6180

agcttccatc cgttttcttt ttcagcttct cggtgggatt acagagggct gcatctcttg 6240

ttggcgtaac ctcgcttcag gattaagtac ccagcatgtt gtatgataca gtttcaccaa 6300

atgttcatta tgtaattagc tttaatatca ctgttgcttt atactgacag tatgctacaa 6360

aatgtaacaa ctatggatgt tctgagtaga tgtgaacgtc aatatattcc ctaaaagtag 6420

gctaaatttg ctcgccctag ctgtgaagaa cttggaagta ttggctcatt taggaaatta 6480

tagaatactt gaatatgttg tattttatgt aatatggtag tagacccatg tgaaatgtaa 6540

tttcctgtta taggttccat agaatatacc cttgtgaaat gtgca 6585

<210> 20

<211> 1836

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 20

atggaagatt ctcagtctca ctcccactct caccctaacc aatacaacct ctcagctcca 60

ctcctttcca tcaatgaatc ttcacagcaa cttaagtttg caagctccga tgctgctttc 120

tctcacaccg tctcctccgc cgttggatcc aacaccggtg ctaggtacaa gctaatgtca 180

cctgctaagc tcccgatctc tcgctcctcc gcatgtatca ccatccctcc tggtctcagt 240

ccatcatcct ttctcgaatc tcccgttctt ctatcgaaca tcaaagctga gccgtctcct 300

accacaggtt ccttctccaa atttcaagta atgcaaggct ctagtgggag tgctgctttt 360

tcatatttga gaagctgttc aagtggaaat gtatatggtg aaacgaccgg cgaatttgag 420

ttcaaatttg ctattgcatc taattctaca tcaggatcac tggcgaatga agctgcagtg 480

atttctgcag gttccaacca acagcaaagt gaacctctga ttcaagttca agatcgatat 540

ctttctcaat cattagcacc ttcagttctt gttgaaaccg agatgcctga ttcaaaagag 600

ctgagtctac ctgcacctgt tagtttagaa gcctcgtcaa ttagtacttc tgctgctgca 660

actgataatg aagaaacaaa tcagagaggt caatcaaata caagcacgca agggtcacat 720

gctgataata aagatgtatc atcgataact gctgagagat catcagaaga tgggtataac 780

tggagaaagt atggccagaa acttgttaaa ggaagtgaat tcccaaggag ctactacaaa 840

tgtacatacc caaactgtga agttaaaaag atatttgagc gctctcctga tggacaaata 900

acagagattg tgtataaagg ttcccatgat catcctaaac cccagcccag ccgtaggttt 960

actcctggtg tgcttacttc catccaagaa gacagaggtg agagagatgc atgcctcact 1020

ggtcaagaag acaaattcaa cactaatgcc cagactagta acactgagcc cggcggtaat 1080

ccactatcac ctcgacaagc aggtgatgat ggtcttgaag gtacagtgtc tcagttgcat 1140

agtgctaatg atcagatgga cgaggatgat ccatttgcaa aaagaaggaa aatggatggt 1200

ggcatggata ttacaccaat tgttaagcct atccgtgaac cacgtgttgt tgttcaaact 1260

gtgagtgaag ttgatatatt ggatgatgga tacaggtggc ggaaatatgg tcaaaaggtg 1320

gtccgtggta atcctaatcc caggagttat tacaagtgca ccaatgctgg atgccctgtc 1380

aggaaacacg tggagagggc atcccatgat cccaaatctg taattactac atatgagggg 1440

aaacacaatc acgatgtacc agcagctagg actaataacc atgaaatggc aggatcagca 1500

tctgtaactg ggggttcaag ggtcaggacg gaagagaatg gctcagttag cttgaatcta 1560

ggtgttggta ttggttatgg tatggagaat aggcgcaatg gacaactgca cacactgcct 1620

gcagaaactg cacatagcca agttcaggtt tcaagttcta gtatgatgtt agtacagcca 1680

gctacagttg cagcatgcta caacattgta aatggtggaa tgagccggtt tggaactatg 1740

gaaaatcgtg ttcagggcac tggctttgag actctgccct tgcaatcatc tgctcaatgt 1800

cctcaaaact atggaaggat acttttgggc ccgtga 1836

<210> 21

<211> 611

<212> PRT

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 21

Met Glu Asp Ser Gln Ser His Ser His Ser His Pro Asn Gln Tyr Asn

1 5 10 15

Leu Ser Ala Pro Leu Leu Ser Ile Asn Glu Ser Ser Gln Gln Leu Lys

20 25 30

Phe Ala Ser Ser Asp Ala Ala Phe Ser His Thr Val Ser Ser Ala Val

35 40 45

Gly Ser Asn Thr Gly Ala Arg Tyr Lys Leu Met Ser Pro Ala Lys Leu

50 55 60

Pro Ile Ser Arg Ser Ser Ala Cys Ile Thr Ile Pro Pro Gly Leu Ser

65 70 75 80

Pro Ser Ser Phe Leu Glu Ser Pro Val Leu Leu Ser Asn Ile Lys Ala

85 90 95

Glu Pro Ser Pro Thr Thr Gly Ser Phe Ser Lys Phe Gln Val Met Gln

100 105 110

Gly Ser Ser Gly Ser Ala Ala Phe Ser Tyr Leu Arg Ser Cys Ser Ser

115 120 125

Gly Asn Val Tyr Gly Glu Thr Thr Gly Glu Phe Glu Phe Lys Phe Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Ser Thr Ser Gly Ser Leu Ala Asn Glu Ala Ala Val

145 150 155 160

Ile Ser Ala Gly Ser Asn Gln Gln Gln Ser Glu Pro Leu Ile Gln Val

165 170 175

Gln Asp Arg Tyr Leu Ser Gln Ser Leu Ala Pro Ser Val Leu Val Glu

180 185 190

Thr Glu Met Pro Asp Ser Lys Glu Leu Ser Leu Pro Ala Pro Val Ser

195 200 205

Leu Glu Ala Ser Ser Ile Ser Thr Ser Ala Ala Ala Thr Asp Asn Glu

210 215 220

Glu Thr Asn Gln Arg Gly Gln Ser Asn Thr Ser Thr Gln Gly Ser His

225 230 235 240

Ala Asp Asn Lys Asp Val Ser Ser Ile Thr Ala Glu Arg Ser Ser Glu

245 250 255

Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Leu Val Lys Gly Ser

260 265 270

Glu Phe Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Tyr Pro Asn Cys Glu Val

275 280 285

Lys Lys Ile Phe Glu Arg Ser Pro Asp Gly Gln Ile Thr Glu Ile Val

290 295 300

Tyr Lys Gly Ser His Asp His Pro Lys Pro Gln Pro Ser Arg Arg Phe

305 310 315 320

Thr Pro Gly Val Leu Thr Ser Ile Gln Glu Asp Arg Gly Glu Arg Asp

325 330 335

Ala Cys Leu Thr Gly Gln Glu Asp Lys Phe Asn Thr Asn Ala Gln Thr

340 345 350

Ser Asn Thr Glu Pro Gly Gly Asn Pro Leu Ser Pro Arg Gln Ala Gly

355 360 365

Asp Asp Gly Leu Glu Gly Thr Val Ser Gln Leu His Ser Ala Asn Asp

370 375 380

Gln Met Asp Glu Asp Asp Pro Phe Ala Lys Arg Arg Lys Met Asp Gly

385 390 395 400

Gly Met Asp Ile Thr Pro Ile Val Lys Pro Ile Arg Glu Pro Arg Val

405 410 415

Val Val Gln Thr Val Ser Glu Val Asp Ile Leu Asp Asp Gly Tyr Arg

420 425 430

Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Val Arg Gly Asn Pro Asn Pro Arg

435 440 445

Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Ala Gly Cys Pro Val Arg Lys His Val

450 455 460

Glu Arg Ala Ser His Asp Pro Lys Ser Val Ile Thr Thr Tyr Glu Gly

465 470 475 480

Lys His Asn His Asp Val Pro Ala Ala Arg Thr Asn Asn His Glu Met

485 490 495

Ala Gly Ser Ala Ser Val Thr Gly Gly Ser Arg Val Arg Thr Glu Glu

500 505 510

Asn Gly Ser Val Ser Leu Asn Leu Gly Val Gly Ile Gly Tyr Gly Met

515 520 525

Glu Asn Arg Arg Asn Gly Gln Leu His Thr Leu Pro Ala Glu Thr Ala

530 535 540

His Ser Gln Val Gln Val Ser Ser Ser Ser Met Met Leu Val Gln Pro

545 550 555 560

Ala Thr Val Ala Ala Cys Tyr Asn Ile Val Asn Gly Gly Met Ser Arg

565 570 575

Phe Gly Thr Met Glu Asn Arg Val Gln Gly Thr Gly Phe Glu Thr Leu

580 585 590

Pro Leu Gln Ser Ser Ala Gln Cys Pro Gln Asn Tyr Gly Arg Ile Leu

595 600 605

Leu Gly Pro

610

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

caagggatcc cctaatccca ggagttat 28

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

caagtctaga gccagtgccc tgaacacg 28

Claims (10)

1.下述M1-M3中的任一种在调控植物抗逆性中的应用：

M1、WRKY20蛋白质；

M2、调控WRKY20蛋白质含量和/或活性的物质；

M3、与WRKY20蛋白质相关的生物材料；所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码WRKY20蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)抑制WRKY20蛋白质编码基因表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：WRKY20蛋白质来源于E1)、E2)、E3)或E4)：

E1)植物；

E2)双子叶植物或单子叶植物；

E3)十字花科植物或锦葵科植物或茄科植物；

E4)拟南芥或棉花或番茄；

和或，所述调控植物WRKY20蛋白质含量的物质为调控WRKY20蛋白质编码基因表达的物质。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：WRKY20蛋白质为如下A1)、A2)、A3)、A4)、A5)或A6)：

A1)氨基酸序列是序列4的蛋白质；

A2)氨基酸序列是序列13的蛋白质；

A3)氨基酸序列是序列14的蛋白质；

A4)氨基酸序列是序列21的蛋白质；

A5)将序列表中序列1或序列13或序列14或序列21所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A6)在A1)或A2)或A3)或A4)或A5)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

B1)所述核酸分子为如下b1)-b15)中的任一种：

b1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2)序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b3)序列表中序列1的第304-3696位所示的cDNA分子或DNA分子；

b4)序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b5)编码序列是序列表中序列11的cDNA分子或DNA分子；

b6)序列表中序列11的cDNA分子或DNA分子；

b7)序列表中序列9的cDNA分子或DNA分子；

b8)编码序列是序列表中序列12的cDNA分子或DNA分子；

b9)序列表中序列12的cDNA分子或DNA分子；

b10)序列表中序列10的cDNA分子或DNA分子；

b11)编码序列是序列表中序列20的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列20的cDNA分子或DNA分子；

b13)序列表中序列19的cDNA分子或DNA分子；

b14)与b1)-b13)中任一种限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码WRKY20蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

b15)在严格条件下与b1)-b14)中任一种限定的核苷酸序列杂交，且编码WRKY20蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

B8)所述核酸分子的序列为序列表中序列11的第945-1394位或序列12的第938-1387位或序列20的第1333-1765位。

4.根据权利要求1-3中任一所述应用，其特征在于：所述植物抗逆性为如下F1)、F2)或F3)的抗逆性：

F1)双子叶植物或单子叶植物；

F2)十字花科植物或锦葵科植物或茄科植物；

F3)拟南芥或棉花或番茄。

5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗病性和/或抗虫性。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述抗虫为抗烟粉虱、棉铃虫、蚜虫或二斑叶螨；

所述抗病为抗真菌病害或双生病毒病害。

7.下述M1或M2或M3的方法：

M1、培育抗虫转基因植物的方法，所述抗虫为抗棉铃虫、蚜虫或二斑叶螨，所述方法包括降低目的植物中WRKY20蛋白质的活性、降低目的植物中WRKY20蛋白质的含量、抑制目的植物中WRKY20蛋白质的编码基因的表达或敲除目的植物中WRKY20蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物抗棉铃虫、蚜虫或二斑叶螨性高于所述目的植物；

M2、培育抗虫转基因植物的方法，所述抗虫为抗烟粉虱，所述方法包括增加目的植物中WRKY20蛋白质的活性、增加目的植物中WRKY20蛋白质的含量、促进目的植物中WRKY20蛋白质的编码基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物抗烟粉虱性高于所述目的植物；

M3、培育抗病转基因植物的方法，包括增加目的植物中WRKY20蛋白质的活性、增加目的植物中WRKY20蛋白质的含量、促进目的植物中WRKY20蛋白质的编码基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物抗病性高于所述目的植物；

WRKY20蛋白质为权利要求1-3中任一所述WRKY20蛋白质；

所述WRKY20蛋白质的编码基因为权利要求1-3中任一所述编码WRKY20蛋白质的核酸分子。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述降低目的植物中WRKY20蛋白质的含量通过将与权利要求1-3中任一所述的抑制WRKY20蛋白质编码基因表达的核酸分子导入所述目的植物中实现；

和/或，所述抗病为抗真菌病害或双生病毒病害。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述目的植物为如下F1)、F2)或F3)：

F1)双子叶植物或单子叶植物；

F2)十字花科植物或锦葵科植物或茄科植物；

F3)拟南芥或棉花或番茄。

10.下述P1)或P2)或P3)的产品：

P1)权利要求1-3中任一所述WRKY20蛋白质；

P2)权利要求1-3中任一所述生物材料；

P3)植物抗虫或抗病产品，包括权利要求1-3中任一所述WRKY20蛋白质或所述生物材料。