CN117430678A

CN117430678A - 一种来自小麦条锈菌的免疫诱抗蛋白质及其相关生物材料与应用

Info

Publication number: CN117430678A
Application number: CN202310838201.8A
Authority: CN
Inventors: 郭军; 赵国森; 郭嘉; 柏星轩; 杨倩; 康振生
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2023-07-10
Filing date: 2023-07-10
Publication date: 2024-01-23

Abstract

本发明公开了一种来自小麦条锈菌的免疫诱抗蛋白质及其相关生物材料与应用，属于遗传工程技术领域。该蛋白质为下述任一种：A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5的蛋白质；A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；A4)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。本发明初步鉴定了一种新的条锈菌PAMP分子，这将为小麦条锈病防治提供潜在的理论基础，以期将来用于生产实践。

Description

一种来自小麦条锈菌的免疫诱抗蛋白质及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明属于遗传工程领域，具体涉及一种来自小麦条锈菌的免疫诱抗蛋白质及其相关生物材料与应用。

背景技术

小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia stiiformis f.sp.tritici)引起的小麦重大病害。利用抗病品种或使用杀菌剂仍然是目前比较传统的防治方式。但由于存在小麦抗病材料的创制速度相对滞后于条锈菌生理小种的变异速度，且化学药剂的使用导致尖锐的生态与环境问题。小麦条锈病的绿色持久防控是目前世界科技前沿热点和难点问题。因此，急需探索抗病新策略及创制持久抗病新材料以实现对小麦条锈病持久控制。随着植物免疫机制被深入解析，植物免疫原理被广泛应用于农作物的病虫害防控。植物免疫诱抗剂创制关键技术是我国绿色植保发展战略的重要发展方向之一。因此，鉴定免疫诱抗物质、研发靶向药剂成为绿色持久防控小麦条锈病的新思路。

在与植物互作过程中，病原菌能够向寄主体内分泌一类小分子蛋白，该类蛋白一旦被寄主细胞表面的模式识别受体识别，就会触发寄主的免疫反应，具有广谱和持久性，这类小分子蛋白被称为病原相关分子模式(Pathogen associated molecular Pattern，PAMP)。目前，一些病原菌PAMP分子已成功应用于增强植物的抗病性中，对于植物病害防治起到了重要的作用。因此，鉴定并利用病原菌的PAMP分子已经成为了防治病害的一个重要策略。而锈菌相关PAMP分子的种类和生物学功能尚未见报道，锈菌PAMP分子激发植物免疫的机制仍不清楚。

病原菌PAMP分子被分泌至植物细胞的质外体与植物表面受体识别，这就使得能够在体外培养基培养的细菌、卵菌及部分真菌PAMP分子的筛选鉴定显得较为容易。这些病原菌的培养液可直接通过色谱法进行分离从而初步筛选到候选PAMP分子，然后再结合PAMP分子激活的如ROS迸发、胼胝质积累、MAPK激酶级联反应等免疫反应进行进一步筛选鉴定。而对于活体营养寄生真菌来讲，其不能在体外培养基中培养，导致其PAMP分子的筛选及鉴定较为复杂且滞后。近些年，随着研究技术的不断更新，科研人员探索出一套初步筛选PAMP分子的体系：首先通过生物信息学从病原菌基因组中筛选出一批包含信号肽的小分子蛋白，然后借助农杆菌在烟草中瞬时过表达候选蛋白，将能够诱导烟草细胞坏死的蛋白作为候选PAMP分子，如苹果腐烂菌PAMP分子VmE02的筛选。同时，病毒介导的基因沉默技术已成功应用于挖掘PAMP分子的受体。这为锈菌PAMP分子的鉴定和其激发的植物免疫机制研究奠定了基础。

因此，挖掘小麦条锈菌PAMP分子并研究其功能和诱导抗病性的机理，对病害的绿色持久防控具有重要指导意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是挖掘条锈菌中能够诱导植物抗病性的PAMP分子。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种蛋白质，该蛋白质的编码基因小麦条锈菌基因组中的ID是Pst12786，所述蛋白质为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质(短肽)；

A3)氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质(短肽)；

A4)氨基酸序列是SEQ ID No.1中第92到148位的蛋白质；

A5)氨基酸序列是SEQ ID No.1中第175到196位的蛋白质；

A6)将A1)-A5)任一种所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与其所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A7)在A1)-A5)任一种所示的氨基酸的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质Pst12786的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质Pst12786的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质Pst12786且具有蛋白质Pst12786功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本发明还提供了与前述蛋白质相关的生物材料，为下述任一种：

B1)、抑制或降低或下调所述蛋白质的编码基因的表达的RNA分子或抑制或降低或下调所述蛋白质的活性或含量的RNA分子；

B2)、表达B1)所述RNA分子的编码基因；

B3)、含有B2)所述基因的表达盒；

B4)、含有B2)所述基因的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；

B5)、含有B2)所述基因的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B6)、含有B2)所述基因的转基因植物细胞系、或含有B3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B7)、含有B2)所述基因的转基因植物组织、或含有B3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；

B8)、含有B2)所述基因的转基因植物器官、或含有B3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B4)所述重组载体的转基因植物器官；

B9)、编码前述蛋白质的核酸分子；

B10)、含有B9)所述核酸分子的表达盒；

B11)、含有B9)所述核酸分子的重组载体、或含有B10)所述表达盒的重组载体；

B12)、含有B9)所述核酸分子的重组微生物、或含有B10)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B13)、含有B9)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B10)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B14)、含有B9)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B10)所述表达盒的转基因植物组织；

B15)、含有B9)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B10)所述表达盒的转基因植物器官。

上述生物材料中，所述含有编码Pst12786的核酸分子的表达盒(Pst12786基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达Pst12786的DNA，该DNA不但可包括启动Pst12786转录的启动子，还可包括终止Pst12786转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

可用现有的表达载体构建含有所述Pst12786基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1305、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为pGR106和BSMV:γ。

上述生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

具体而言，B1)所述RNA分子靶向于如b1)、b2)或b3)所示的基因转录的mRNA：

b1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

b2)编码链的编码序列是SEQ ID No.4所示的DNA分子；

b3)编码链的编码序列是SEQ ID No.6所示的DNA分子。

具体而言，B9)所述核酸分子为编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

本发明还提供了前述蛋白质或生物材料的下述任一种应用：

D1)增加植物抗病性；

D2)制备提高植物抗病性的产品；

D3)培育抗病性提高的植物；

D4)制备培育抗病性提高的植物的产品；

D5)改良高抗病性植物或制备高抗病性植物的产品；

D6)植物育种；

D7)抑制条锈菌的生长发育；

D8)制备抑制条锈菌的生长发育的产品；

D9)诱导植物细胞坏死；

D10)制备诱导植物细胞坏死的产品；

D11)诱导植物抗病性。

上述应用中，所述诱导抗病性是指通过施用Pst12786蛋白或其衍生物触发寄主植物对病原物的抗病性；所述诱导抗病性具体体现在如下(1)-(3)中任一种：(1)在外源施用Pst12786蛋白或其多肽蛋白或其衍生物后，侵染寄主的病原物毒力水平显著降低；(2)病原物胁迫条件下，寄主植物的病程相关基因的表达水平显著升高；(3)病原物胁迫条件下，侵染寄主的病原菌菌丝侵染面积显著降低。所述病原物为能够侵染指定寄主的任何真菌、卵菌和细菌。

上述应用中，所述抗病性为抗包括小麦条锈病、小麦赤霉病、小麦白粉病在内的其它小麦真菌病害。所述条锈病具体为条形柄锈菌小麦专化型所引发的病害。

本发明的第二个目的是提供一种能够利用条锈菌免疫诱抗蛋白Pst12786触发拟南芥基础免疫反应的转基因拟南芥材料。

本发明提供的材料及方法，为如下1)或2)：

1)所述的材料：可由地塞米松(DEX)诱导Pst12786在拟南芥中过表达的转基因拟南芥材料；

2)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中编码Pst12786蛋白的核酸分子SEQID No.2的表达，得到转基因植物；

所述转基因植物受到DEX诱导后，植物免疫响应高于所述野生型植物。

上述方法中，所述提高目的植物中上述蛋白的含量和/或活性，或，提高目的植物中编码上述蛋白的核酸分子的表达，均通过将上述核酸分子SEQ ID No.2导入目的植物实现。

在本发明的实施方式中，Pst12786蛋白质的编码基因通过含有Pst12786蛋白质的编码基因的表达盒的重组载体pTA7001-DEST-Pst12786导入农杆菌GV3101中。所述重组载体pTA7001-DEST-Pst12786是用同源重组的方法将Pst12786的DNA片段SEQ ID No.2插入pTA7001-DEST载体且保持pTA7001-DEST载体的其他序列不变。

上述方法中，所述植物免疫响应包括PTI标志基因的上调表达，胼胝质的积累，活性氧的迸发。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述Pst12786基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明还提供了一种免疫诱抗蛋白或短肽，在寄主植物中过表达该蛋白或短肽后能够上调或增强或提高寄主植物免疫应答基因表达量的物质。

该免疫诱抗短肽通过触发寄主植物对病原物的抗病性发挥作用；所述诱导抗病性具体体现在如下(1)-(3)中任一种：(1)在外源施用Pst12786蛋白或其多肽蛋白或其衍生物后，侵染寄主的病原物毒力水平显著降低；(2)病原物胁迫条件下，寄主植物的病程相关基因的表达水平显著升高；(3)病原物胁迫条件下，侵染寄主的病原菌菌丝侵染面积显著降低。所述病原物为能够侵染指定寄主的任何真菌、卵菌和细菌。

本文所述的植物为如下任一种：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)禾本目植物或管状花目；

M3)禾本科植物或茄科；

M4)小麦属或蕃茄属或辣椒属植物；

M5)小麦或番茄或辣椒。

上述核酸分子也属于本发明保护的范围。

本发明的实验证明，本发明发现的Pst12786在烟草中瞬时表达能够引起烟草细胞死亡，同时还能引起番茄和辣椒细胞死亡。Pst12786蛋白N端的信号肽序列对其诱导细胞死亡的功能是必需的，缺乏信号肽的Pst12786丧失引起烟草细胞死亡的能力。在拟南芥中过表达Pst12786后引起活性氧迸发、胼胝质积累和细胞死亡，并诱导了拟南芥中PTI标志基因的显著上调表达，暗示Pst12786在拟南芥中异源表达能够激活拟南芥免疫应答。在小麦与条锈菌互作过程中，瞬时沉默Pst12786削弱了其毒力水平，产孢减少。此外为明确PAMP分子Pst12786能够引起烟草细胞坏死的功能基序或肽段，发明人筛选到至少两条短肽Pst12786-M1和Pst12786-M2发挥与Pst12786全长蛋白相当的作用。本发明提供的蛋白和基因为绿色防控植物病害的发生发展提供了新的免疫诱抗资源。

附图说明

图1为条锈菌侵染小麦过程中Pst12786基因的表达水平。

图2为Pst12786信号肽的分泌功能验证。其中，不含和含pSUC2空载体的YTK12均作为阴性对照。携带pSUC2-Avr1b的YTK12作为阳性对照。TTC为2,3,5-氯化三苯基四氮唑。

图3为信号肽对Pst12786诱导细胞坏死是必须的。A，在烟草中表达Pst12786和无信号肽Pst12786(Pst12786(ΔSP))的细胞坏死。携带Pst12786-pGR106，Pst12786(ΔSP)-pGR106或eGFP-pGR106的农杆菌注射到烟草叶片，5d后进行拍照记录。右边显示的是用乙醇脱色后叶子的表型。B，蛋白质免疫印迹分析烟草中Pst12786、Pst12786(ΔSP)和eGFP的表达。C，通过测量电解质渗透率来定量注射5天后的细胞坏死。数值代表9个独立样本的平均值±标准差。采用t检验进行显著性分析。***代表P<0.001。

图4为Pst12786信号肽的功能验证及关键短肽筛选。A，载体结构示意图。B，瞬时表达疫霉激发子INF1、无信号肽INF1(INF1(△SP))和融合突变体Pst12786SP-INF1的烟草叶片上的细胞坏死。C，瞬时表达删除突变体触发烟草细胞死亡。农杆菌注射5天后进行表型拍照。

图5为Pst12786在拟南芥、番茄和辣椒中的过表达可诱导细胞坏死。

图6为在拟南芥中过表达Pst12786可诱导细胞坏死。A，Pst12786过表达拟南芥植株叶片中ROS的积累。30μmol/L的DEX预处理的野生型WT和Pst12786过表达植株，3天后DAB染色的叶片观察。B，30μmol/L的DEX处理的野生型WT和Pst12786过表达植株7天后的表型。

图7为Pst12786诱导细胞死亡不依赖BAK1和SOBIR1。A，接种TRV病毒17天后烟草表型。B，在本氏烟草上接种TRV病毒(TRV:GFP,TRV:NbBAK1或TRV:NbSOBIR1)进行病毒诱导基因沉默试验。接毒17天后，在沉默植株叶片上瞬时表达INF1和Pst12786，4天后拍照。实验进行三次独立重复，每次每种TRV病毒包括六株植物。C，VIGS处理后植株上BAK1和SOBIR1表达水平的qRT-PCR分析。NbEF1α作为内参基因。数值代表三个独立样本的平均值±标准差。采用t检验进行显著性分析。*代表P<0.05，**代表P<0.01；D，蛋白质免疫印迹分析烟草中Pst12786的表达。

图8为通过病毒诱导基因沉默技术分析Pst12786在小麦与条锈菌互作过程中的功能。A，接种CYR31后14天第四叶片的表型。植物分别接种病毒BSMV:γ和BSMV:Pst12786。B，在接种CYR31120h时，基因Pst12786在沉默植株上的相对转录水平。C，在接种CYR31120h时，小麦叶片上侵染点菌丝面积的统计。数值代表三个独立样本的平均值±标准差。采用t检验进行显著性分析。*代表P<0.05，**代表P<0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

下述实施例中的小麦条锈菌生理小种CYR31在文献“王凤乐,吴立人,徐世昌,金社林,贾秋珍,袁文焕,杨家秀.中国条锈菌新小种条中30、31号的研究[J].植物保护学报,1996(01):39-44.”中公开过。公众可从西北农林科技大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的小麦品种水源11在文献“曹张军,井金学,王美南,等.国内重要抗源品种水源11,水源92及Hybrid46抗条锈基因关系分析[J].西北植物学报,2003,23(1):64-68.”中公开过。公众可从西北农林科技大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

申请人实验室筛选到一个诱导细胞坏死反应的条锈菌候选蛋白Pst12786。在本申请中，烟草瞬时过表达试验确定Pst12786的信号肽对于其诱导细胞坏死反应是必需的，这就意味着Pst12786被分泌至植物细胞外发挥作用，并且能够诱导ROS的迸发、胼胝质的积累、PTI标志基因的诱导表达等，因此初步推测其为PAMP分子。另外，Pst12786在条锈菌的致病进程中发挥着一定的作用。此外发明人还筛选到了两条短肽，能够触发烟草细胞的死亡，很有可能作为免疫诱抗剂的有效成分发挥作用，具体如下：

实施例1、一种小麦条锈菌免疫诱抗蛋白Pst12786的鉴定及转基因拟南芥创制

一、mRNA的分离及Pst12786的扩增

采集接种条锈菌CYR31的水源11小麦叶片，用液氮速冻，-80℃保存备用。

利用多糖多酚植物RNA提取试剂盒(华越洋生物科技有限公司)提取小麦叶片总RNA，并利用反转录第一链cDNA合成试剂盒(华越洋生物科技有限公司)合成cDNA。以Pst12786的cds序列设计基因克隆引物Pst12786-F和Pst12786-R，以前述cDNA为模板，利用PCR技术克隆Pst12786全长序列，将获得的PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，得到651bp的PCR产物。扩增引物Pst12786-F和Pst12786-R序列如下：

Pst12786-F:5`-ATGTTCGCCAAACCCGCCTCCTTG-3`；

Pst12786-R:5`-CTCCAAGAGCTCAATCTCTCTGCG-3`。

经过测序，该PCR产物具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸，该核苷酸具有的基因命名为Pst12786基因，编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，该蛋白命名为Pst12786蛋白。

SEQ ID NO.1

MFAKPASLVLLLAVFLQVTFGSFALSTAGNPQIEIGRRQSIVSSSASTVSTFIQQWSEVRTEFSRCQNVFNSGASVEVAIRSVQTLYHSCQTVSNQYSTCDSCANAASSQVTAFKSTIEVSFQTWQQILIIGQQHYATVWKSQFAFVFQQFSTWVTAAKTACSSLNLQLDVILKGLNLNLNLFLGININLSSLLGGVLGGVRSLVGGLLGRREIELLE

SEQ ID NO.2

ATGTTCGCCAAACCCGCCTCCTTGGTGTTGCTTCTAGCTGTGTTCTTGCAAGTGACCTTCGGTAGCTTTGCCCTTAGCACCGCCGGCAACCCTCAAATTGAAATTGGCCGCCGACAGTCAATCGTGTCAAGCTCAGCTTCAACCGTCTCCACCTTCATTCAGCAATGGAGTGAGGTTCGCACCGAGTTTAGCCGATGTCAAAACGTCTTCAACTCGGGAGCAAGTGTCGAGGTGGCTATTAGATCGGTCCAGACCCTTTACCACTCCTGTCAAACTGTTTCCAACCAGTACTCCACTTGTGACAGCTGTGCTAATGCCGCTTCAAGTCAAGTTACTGCCTTCAAATCAACCATCGAAGTCTCCTTCCAGACCTGGCAACAAATCCTCATTATCGGCCAACAACACTATGCTACCGTGTGGAAGTCCCAGTTTGCTTTTGTCTTCCAACAATTCTCTACCTGGGTCACGGCCGCGAAGACCGCATGCTCGTCCCTCAATCTTCAGTTGGATGTGATCTTAAAGGGCCTCAATTTAAACTTGAACCTCTTTCTCGGTATCAACATCAACCTATCCAGTCTCCTCGGCGGCGTCCTTGGCGGGGTACGATCTCTGGTCGGAGGTCTCCTTGGCCGCAGAGAGATTGAGCTCTTGGAGTAG二、RT-PCR检测Pst12786表达模式

1、实验材料的准备

将生长至一叶一心的水源11叶片接种条锈菌CYR31，并于接菌后0h、6h、12h、18h、24h、48h、72h、120h、168h取样进行RNA提取。利用多糖多酚植物RNA提取试剂盒(华越洋生物科技有限公司)提取小麦叶片总RNA，并利用反转录第一链cDNA合成试剂盒(华越洋生物科技有限公司)合成cDNA。反转录时RNA用量为3μg。反转录产物加超纯水进行10倍稀释后作为定量模板。

2、RT-PCR检测Pst12786的表达量

根据小麦Pst12786和延伸因子基因PstEF1的序列设计特异的定量PCR引物。定量PCR引物在使用前需检测其扩增产物的特异性及扩增效率(≥90％)，PstEF1在Real-timePCR分析中作为内参基因。

RT-PCR引物序列为：

QPst12786-F：5`-TGAGGTTCGCACCGAGTTT-3`；

QPst12786-R：5`-TGAAGCGGCATTAGCACAG-3`。

qRT-PstEF1-F：5`-TTCGCCGTCCGTGATATGAGACAA-3`；

qRT-PstEF1-R：5`-ATGCGTATCATGGTGGTGGAGTGA-3`。

以上述cDNA为模板，用上述RT-PCR引物分别进行RT-PCR扩增。

使用ChamQ SYBR Qpcr Master Mix(20uL/rxn)(Vazyme，中国南京)和Bio-RadCFX Manager定量PCR仪器(Bio-rad，Hercules，California)，参照说明书，分别以各处理取样点的cDNA为模板进行实时定量PCR扩增。每个反应至少做3个重复，各个重复的Ct值及其平均值和标准差通过手动调节基线由定量PCR仪生成。每个反应做3个重复，Ct值取平均值，采用Delta Delta Ct法分析实验数据，确定基因的相对表达量。

Pst12786在小麦水源11分别接种条锈菌亲和反应小种CYR31后的qRT-PCR的结果如图1所示，表达模式表现出接种后侵染前期上调表达。

上述结果表明，Pst12786在条锈菌侵染小麦过程中上调表达。

三、Pst12786功能分析

1、Pst12786信号肽具有分泌功能

pSUC2载体：pSUC2记载于文献“Yang Q,Huai B,LuY,Cai K,Guo J,Zhu X,Kang Z,Guo J.A stripe rust effector Pst18363 targets and stabilises TaNUDX23 thatpromotes stripe rust disease.New Phytol.2020Jan；225(2):880-895.doi:10.1111/nph.16199.Epub 2019 Oct 16.PMID:31529497.”，公众可从西北农林科技大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

YTK12空菌：购于普因特生物工程有限公司，货号PG1073。

卵菌Avr1b的信号肽：参考文献“Shan W,Cao M,Leung D,Tyler BM.The Avr1blocus ofPhytophthora sojae encodes an elicitor and a regulator required foravirulence on soybean plants carrying resistance gene Rps1b.Mol Plant MicrobeInteract.2004 Apr；17(4):394-403.doi:10.1094/MPMI.2004.17.4.394.PMID:15077672.”设计，其在文献中记载的名称为“Avr1b”。

Pst12786信号肽：利用signalP 6.0软件预测Pst12786信号肽序列，氨基酸序列为MFAKPASFVLLLAVFLQVTFG，核苷酸序列为ATGTTCGCCAAACCCGCCTCCTTGGTGTTGCTTCTAGCTGTGTTCTTGCAAGTGACCTTCGGT。

pSUC2-Avr1b：Avr1b的序列参考“TheAvr1b locus ofPhytophthora sojaeencodes an elicitor and a regulator required for avirulence on soybean plantscarrying resistance gene Rps1b”，其在文献中记载的名称为“Avr1b”，pSUC2-Avr1b是以前述Avr1b所示的DNA序列替代pSUC2的EcoRI和XhoI之间的序列，且保持pSUC2其他序列不变得到重组表达载体，该重组表达载体表达Avr1b信号肽。

pSUC2-Pst12786：是以如上所示的Pst12786信号肽的DNA序列替代pSUC2的EcoRI和XhoI之间的序列，且保持pSUC2其他序列不变得到重组表达载体，该重组表达载体表达Pst12786信号肽。

利用酵母蔗糖酶分泌系统验证前述Pst12786的信号肽序列的分泌功能。以YTK12空菌、含pSUC2空载体的YTK12为阴性对照，以含有pSUC2-Avr1b的YTK12为阳性对照，含有pSUC2-Pst12786的YTK12为实验组进行分泌试验。结果如图2所示，只有携带信号肽Pst12786及信号肽Avr1b的YTK12使TTC试剂显红色。综上所述，表明Pst12786的信号肽序列确实具有分泌活性。

2、信号肽对于Pst12786诱导细胞坏死是必须的(1)信号肽对Pst12786诱导细胞坏死是必须的

pGR106载体：记载于文献“Yang Q,Huai B,LuY,Cai K,Guo J,Zhu X,Kang Z,GuoJ.A stripe rust effector Pst18363 targets and stabilises TaNUDX23 thatpromotes stripe rust disease.New Phytol.2020 Jan；225(2):880-895.doi:10.1111/nph.16199.Epub 2019 Oct 16.PMID:31529497.”，公众可从西北农林科技大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

Pst12786(ΔSP)-pGR106载体：是以SEQ ID.2中第64到654位所示核苷酸序列替代pGR106载体的限制性核酸内切酶SmaI和NotI识别位点之间的片段，且保持pGR106其他序列不变得到重组表达载体，该重组表达载体不表达上述所示Pst12786蛋白的信号肽。

Pst12786-pGR106载体：是以SEQ ID.2所示核苷酸序列替代pGR106载体的限制性核酸内切酶SmaI和NotI识别位点之间的片段，且保持pGR106其他序列不变得到重组表达载体，该重组表达载体表达SEQ ID.1所示蛋白质。

含有Pst12786(ΔSP)-pGR106载体的农杆菌：将Pst12786(ΔSP)-pGR106载体利用化学转化法转入根癌农杆菌GV3101中，获得含有Pst12786(ΔSP)-pGR106载体的农杆菌。

含有Pst12786-pGR106载体的农杆菌：将Pst12786-pGR106载体利用化学转化法转入根癌农杆菌GV3101中，获得含有Pst12786-pGR106载体的农杆菌。

含有eGFP-pGR106载体的农杆菌：将eGFP-pGR106载体利用化学转化法转入根癌农杆菌GV3101中，获得含有eGFP-pGR106载体的农杆菌。eGFP-pGR106载体是将商业载体pCAMBIA1302中包含的GFP标签的序列克隆后替代pGR106载体的限制性核酸内切酶SmaI和NotI识别位点之间的片段，且保持pGR106载体其他序列不变得到重组表达载体。

为了验证Pst12786是否需要被分泌至细胞质外体才能发挥诱导细胞坏死反应，利用农杆菌在烟草中进行瞬时过表达试验，4-5天后观察表型。结果发现，浸染含有Pst12786-pGR106载体的农杆菌诱导烟草叶片细胞坏死，而浸染含有Pst12786(ΔSP)-pGR106载体的农杆菌和浸染含有eGFP-pGR106载体的农杆菌(阴性对照)均不诱导烟草细胞坏死(图3A)，并且免疫印迹分析证实浸染含有Pst12786-pGR106载体的农杆菌、含有Pst12786(ΔSP)-pGR106载体的农杆菌和含有eGFP-pGR106载体的农杆菌的烟草叶片细胞中分别存在Pst12786、Pst12786(ΔSP)、eGFP蛋白的表达(图3B)。另外，通过叶片电解质渗透率的测定发现，浸染含有Pst12786-pGR106载体的农杆菌的烟草叶片的电解质渗透率明显高于浸染含有Pst12786(ΔSP)-pGR106载体的农杆菌和浸染含有eGFP-pGR106载体的农杆菌(阴性对照)的烟草叶片(图3C)。综上结果表明，信号肽对于Pst12786诱导细胞坏死是必须的。

(2)Pst12786信号肽的功能验证及关键短肽筛选

1)各信号肽序列

疫霉激发子INF1：氨基酸序列如GenBank:AAV92919.1所示，核苷酸序列如GenBank:AY830094.1所示。无信号肽疫霉激发子INF1(ΔSP)：氨基酸序列如疫霉激发子INF1的氨基酸的第21到118位所示，核苷酸序列如疫霉激发子INF1的核苷酸的第61到354位所示。突变体Pst12786SP-INF1：是将SEQ ID No.2所示核苷酸序列的第1到63位添加在无信号肽疫霉激发子INF1(ΔSP)的核苷酸序列的5’端，得到突变体Pst12786SP-INF1序列。Pst12786^92-148，SEQ ID No.2所示核苷酸序列的第1到63位添加在SEQ ID No.2的第274到444位的核苷酸序列的5’端得到的突变体序列命名为Pst12786^92-148，Pst12786^92-148的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。Pst12786^175-196：SEQ ID No.2所示核苷酸序列的第1到63位添加在SEQ ID No.2的第523到588位的核苷酸序列的5’端得到的突变体序列命名为Pst12786^175-196，Pst12786^175-196的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

Pst12786^92-148的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：

MFAKPASLVLLLAVFLQVTFGTVSNQYSTCDSCANAASSQVTAFKSTIEVSFQTWQQILIIGQQHYATVWKSQFAFVF

Pst12786^92-148的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)：

ATGTTCGCCAAACCCGCCTCCTTGGTGTTGCTTCTAGCTGTGTTCTTGCAAGTGACCTTCGGTACTGTTTCCAACCAGTACTCCACTTGTGACAGCTGTGCTAATGCCGCTTCAAGTCAAGTTACTGCCTTCAAATCAACCATCGAAGTCTCCTTCCAGACCTGGCAACAAATCCTCATTATCGGCCAACAACACTATGCTACCGTGTGGAAGTCCCAGTTTGCTTTTGTCTTC

Pst12786^175-196的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：

MFAKPASLVLLLAVFLQVTFGGLNLNLNLFLGININLSSLLGG

Pst12786^175-196的核苷酸序列(SEQ ID NO.6)：

ATGTTCGCCAAACCCGCCTCCTTGGTGTTGCTTCTAGCTGTGTTCTTGCAAGTGACCTTCGGTGGCCTCAATTTAAACTTGAACCTCTTTCTCGGTATCAACATCAACCTATCCAGTCTCCTCGGCGGC

2)过表达载体制备

含INF1的过表达载体：将如GenBank:AY830094.1所示的INF1完整核苷酸序列替代pGR106载体的限制性核酸内切酶SmaI和NotI识别位点之间的片段，且保持pGR106载体的其他序列不变得到过表达载体，命名为INF1，该过表达载体INF1蛋白。

含INF1(ΔSP)的过表达载体：将如GenBank:AY830094.1所示的INF1核苷酸序列第61到357位替代pGR106载体的限制性核酸内切酶SmaI和NotI识别位点之间的片段，且保持pGR106载体的其他序列不变得到过表达载体，命名为INF1(ΔSP)，该过表达载体表达INF1(ΔSP)所示肽段。

含SEQ ID NO.3的过表达载体：将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的Pst12786^92-148核苷酸序列替代pGR106载体的限制性核酸内切酶SmaI和NotI识别位点之间的片段，且保持pGR106载体的其他序列不变得到过表达载体，命名为Pst12786^92-148，该过表达载体表达SEQID NO.3所示短肽。

含SEQ ID NO.5的过表达载体：将核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的Pst12786¹⁷⁵ ^-196核苷酸序列替代pGR106载体的限制性核酸内切酶SmaI和NotI识别位点之间的片段，且保持pGR106载体的其他序列不变得到过表达载体，命名为Pst12786^175-196，该过表达载体表达SEQ ID NO.5所示短肽。

3)瞬时转染

将前述重组表达载体利用农杆菌在烟草中进行瞬时过表达试验，具体表达方法如下：将上述各个过表达载体转化至农杆菌GV3101菌株，28℃培养箱培养3天，PCR检测阳性克隆，并利用含卡那霉素和利福平的LB培养基摇菌16h，收菌后利用10mM MgCl₂溶液重悬，调整菌液OD为0.5，并加入乙酰丁香酮至终浓度100mM，室温孵育2h后利用1mL无菌注射器注射烟草叶片。瞬时表达4天后观察表型。

结果如图4所示，在烟草上瞬时过表达INF1、Pst12786SP-INF1、Pst12786^175-196和Pst12786^175-196后可以诱导叶片细胞坏死，而过表达INF1(ΔSP)不诱导细胞坏死(图4B)。由此说明，Pst12786的信号肽与INF1的信号肽功能相同，可将自己的成熟蛋白分泌到胞外发挥功能，SEQ ID NO.3所示短肽和SEQ ID NO.5所示短肽与Pst12786蛋白具有相同功能，都可诱导细胞坏死。

3、Pst12786触发多种植物细胞坏死

(1)Pst12786在拟南芥、番茄和辣椒中瞬时过表达可诱导细胞坏死

1)载体制备

过表达Pst12786的载体：即“2、信号肽对于Pst12786诱导细胞坏死是必须的(1)信号肽对Pst12786诱导细胞坏死是必须的”中的Pst12786-pGR106载体

过表达eGFP的载体：即“2、信号肽对于Pst12786诱导细胞坏死是必须的(1)信号肽对Pst12786诱导细胞坏死是必须的”中的eGFP-pGR106载体。

2)农杆菌侵染

利用农杆菌GV3101菌株在番茄、辣椒和拟南芥叶片上瞬时过表达eGFP和Pst12786，具体方法如下：将上述过表达载体转化至农杆菌GV3101菌株，28℃培养箱培养3天，PCR检测阳性克隆，并利用含卡那霉素和利福平的LB培养基摇菌16h，收菌后利用10mMMgCl₂溶液重悬，调整菌液OD为0.5，并加入乙酰丁香酮至终浓度100mM，室温孵育2h后利用1mL无菌注射器注射烟草叶片。

结果如图5所示，过表达Pst12786能诱导拟南芥叶片细胞(图5的A)、番茄的叶片细胞(图5的B)和辣椒叶片细胞(图5的C)发生坏死反应，而对照eGFP不能诱导细胞坏死反应。综上可以说明，Pst12786可以诱导多种植物细胞坏死。

(2)在拟南芥中过表达Pst12786可诱导细胞坏死并促进ROS迸发

1)载体制备

过表达Pst12786的载体：是以SEQ ID.2所示核苷酸序列替代pTA7001-DEST载体的attR1和attR2位点之间的片段，且保持pTA7001-DEST载体其他序列不变得到重组表达载体，该重组表达载体表达SEQ ID.1所示蛋白质。pTA7001-DEST载体记载于文献“Gu Y,InnesRW.The KEEP ON GOING protein of Arabidopsis recruits the ENHANCED DISEASERESISTANCE1 protein to trans-Golgi network/early endosome vesicles.PlantPhysiol.2011Apr；155(4):1827-38.doi:10.1104/pp.110.171785.Epub 2011Feb22.PMID:21343429；PMCID:PMC3091131.”，公众可从西北农林科技大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

2)农杆菌侵染和地塞米松(DEX)处理

利用农杆菌将过表达Pst12786的载体转入拟南芥，获得过表达Pst12786的拟南芥植株Pst12786-2和Pst12786-6，具体方法如下：(1)将拟南芥于条件为22℃，光周期16h/8h(光照/黑暗)的培养箱中培养；(2)待拟南芥苗子长有多个花序时，选用生长状态良好的植株，进行转化试验；(3)将含有过表达Pst12786的载体的菌落PCR检测后，挑阳性菌斑至含利福平的LB液体培养基中，28℃，220rpm过夜，获得含有过表达Pst12786的载体的农杆菌母液；(4)将前述农杆菌母液按1：100的体积比转接至新的含利福平壮观的LB液体培养基中，培养条件同(3)，培养12h左右；(5)8000rpm离心10min收集菌体，弃去上清；(6)加50mL含5％蔗糖转化液并加0.75μL的Silwet L-77重悬菌体，得到含过表达Pst12786的载体的农杆菌的转化液；(7)将选好的拟南芥的花序浸泡在含过表达Pst12786的载体的农杆菌的转化液中18s左右，然后将拟南芥平放在带盖透明容器中并喷水雾，保湿24h；(8)将拟南芥放正培养，5天后，按照(7)将花序重复浸泡一次，继续正常培养；(9)待种子成熟时，收集并干燥种子，即为T0代，置4℃备用。最终筛选到两株阳性转基因过表达植株Pst12786-2和Pst12786-6。将拟南芥野生型植株、拟南芥植株Pst12786-2和Pst12786-6分别种植于22℃，光周期16h/8h(光照/黑暗)的培养箱中，4周后，用30μmol/L的DEX处理野生型WT、过表达转基因拟南芥植株Pst12786-2和Pst12786-6，处理3天后采取叶片进行DAB染色，处理7天后观察植物表型。

结果如图6所示，拟南芥植株Pst12786-2和Pst12786-6的叶片中ROS积累明显高于WT植株叶片(图6中A)，并且7天后拟南芥植株Pst12786-2和Pst12786-6的叶片出现严重坏死表型(图6中B)。由此可见，Pst12786在植物中可激发免疫反应。

4、Pst12786诱导坏死不依赖于BAK1和SOBIR1

(1)载体构建或来源

TRV:GFP载体(用于沉默GFP)、TRV:NbBAK1载体(用于沉默BAK1)、TRV:NbPDS载体(用于沉默PDS)和TRV:NbSOBIR1载体(用于沉默SOBIR1)均记载于文献“Nie J,Zhou W,LiuJ,Tan N,Zhou JM,Huang L.A receptor-like protein from Nicotiana benthamianamediates VmE02 PAMP-triggered immunity.New Phytol.2021 Feb；229(4):2260-2272.doi:10.1111/nph.16995.Epub 2020 Nov 4.PMID:33037676.”，公众可从西北农林科技大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

(2)侵染液制备

TRV:GFP，TRV:NbBAK1，TRV:NbPDS，TRV:NbSOBIR1和TRV1是病毒介导的基因沉默载体。将这些沉默载体分别转入农杆菌GV3101，得到含TRV1的农杆菌、含TRV:GFP的农杆菌、含TRV:NbBAK1的农杆菌、含TRV:NbPDS的农杆菌、含TRV:NbSOBIR1的农杆菌。

过表达INF1的农杆菌：将过表达INF1的质粒转入农杆菌GV3101，得到过表达INF1的农杆菌。过表达INF1的质粒即“(2)Pst12786信号肽的功能验证及关键短肽筛选”中的含INF1的过表达载体。

过表达Pst12786的农杆菌：将过表达Pst12786的质粒转入农杆菌GV3101，得到过表达Pst12786的农杆菌。过表达Pst12786的质粒即“2、信号肽对于Pst12786诱导细胞坏死是必须的(1)信号肽对Pst12786诱导细胞坏死是必须的”中的Pst12786-pGR106载体。

将含TRV1的农杆菌的和含TRV:GFP的农杆菌，含TRV1的农杆菌和TRV:NbBAK1的农杆菌，含TRV1的农杆菌和含TRV:NbPDS的农杆菌，含TRV1的农杆菌和含TRV:NbSOBIR1的农杆菌分别按照体积比1:1混匀，得到4组混合菌液，将4组混合菌液置于25℃培养箱中静置暗培养3h，得到用以沉默基因的侵染液。

(3)瞬时表达

将步骤(2)中制备的4组侵染液分别接种于本氏烟草，17天后肉眼可见接种阳性对照TRV1和TRV:NbPDS的烟草叶片出现漂白，说明基因被有效沉默。随后将OD为0.5的过表达INF1的农杆菌和过表达Pst12786的农杆菌注射上述沉默的烟草，4天后拍照。实验进行三次独立重复，每次每种TRV病毒包括六株植物。提取前述各植株的叶片的总RNA并进行qRT-PCR检测。同时提取前述各植株叶片的总蛋白进行蛋白质免疫印迹分析。

结果如图7所示，接种病毒TRV:NbPDS的烟草表现出漂白褪绿现象(图7A)，说明TRV病毒介导的基因沉默试验是成功的。在沉默植株叶片上瞬时过表达Pst12786和对照INF1后，结果如图7中B所示，对照GFP植株上Pst12786与INF1都能正常诱导细胞坏死，在BAK1和SOBIR1沉默植株上INF1不能诱导细胞坏死，而过表达Pst12786仍能正常诱导细胞坏死。qRT-PCR分析表明BAK1和SOBIR1在各自沉默植株中都被有效地沉默(图7中C)，蛋白质免疫印迹分析表明Pst12786成功表达(图7中D)。由此可见，Pst12786诱导坏死不依赖于BAK1和SOBIR1，暗示其可能通过其它新的途径参与调节细胞内信号传导。

5、Pst12786抑制条锈菌的毒力功能

1)载体来源或信息

BSMV:γ载体，BSMV:α载体，BSMV:β载体和BSMV:PDS载体均记载于文献“Yuan C,LiC,Yan L,Jackson AO,Liu Z,Han C,Yu J,Li D.A high throughput barley stripemosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots anddicots.PLoS One.2011；6(10):e26468.doi:10.1371/journal.pone.0026468.Epub 2011Oct 21.PMID:22031834；PMCID:PMC3198768.”，公众可从西北农林科技大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

重组病毒载体BSMV:Pst12786是将SEQ ID No.2的第417到567位核苷酸序列所示DNA片段反向互补的DNA分子插入BSMV:γ载体的限制性核酸内切酶MluI识别位点，且保持BSMV:γ载体的其他序列不变得到重组载体。

2)BSMV相关载体线性化

将病毒载体BSMV:γ、BSMV:α、BSMV:β、BSMV:PDS和重组病毒载体BSMV:Pst12786进行线性化处理。对BSMV:γ、BSMV:α处理体系如下：

表1

试剂	用量
		载体质粒	1μg
MluⅠ	1μL
		R Buffer(10×)	1μL
ddH₂O	To 10μL

对BSMV:β处理体系如下：

表2

试剂	用量
		载体质粒	1μg
SpeⅠ	1μL
		Tango Buffer(10×)	1μL
ddH₂O	To10μL

对BSMV:Pst12786、BSMV:PDS处理体系如下：

表3

在PCR管中按照上述加样完毕后，放入37℃金属浴中反应4h，之后吸取1μL酶切产物于新的PCR管，向新的PCR管中加入1μL 5×DNA loading buffer和5μL ddH₂O，吹打混匀后通过琼脂糖凝胶电泳检测线性化是否成功。

3)、BSMV相关载体线性化产物的体外转录

将上述线性化检测成功的剩余线性化产物置于冰上，使用RiboMAX Large ScaleRNA Production System-T7、Ribom 7G Cap Analog Caps体外转录试剂盒进行接下来的实验，实验全程在超净工作台中进行，所用试剂需全程放置冰上，实验人员全程佩戴口罩，具体操作如下：

表4

试剂	用量
		线性化质粒	4μL
rATP	0.5μL
		rGTP	0.5μL
rCTP	0.5μL
		rUTP	0.5μL
T7 Transcription Buffer(5×)	2μL
		RNase Inhibitor	0.5μL
Ribom 7G Cap Analog Caps	0.5μL
		Enzyme	1μL

将上述试剂加入RNAase-free PCR管中，放入PCR仪中，37℃反应2h，之后于超净工作台中吸取1μL反应产物于新的PCR管，向新的PCR管中加入1μL 5×DNA loading buffer和5μL ddH₂O，吹打混匀后通过琼脂糖凝胶电泳检测体外转录是否成功，随后向体外转录成功的RNAase-free PCR管中加入20μL RNAase-free H₂O，吸打混匀后放入-80℃冰箱保存备用，分别得到BSMV-α体外转录RNA、BSMV-β体外转录RNA、BSMV-γ体外转录RNA、BSMV:PDS体外转录RNA和BSMV：Pst12786体外转录RNA。

4)、BSMV病毒的接种

①挑选15-16粒籽粒饱满的水源11的种子，均匀种植于方形盆中，适宜条件下进行培养，约2周后小麦幼苗长至两叶一心期时，将病毒接种至二叶中间部位。其中病毒分别为BSMV-α处理所用病毒、BSMV-β处理所用病毒、BSMV:γ处理所用病毒、BSMV:PDS处理所用病毒、BSMV:Pst12786处理所用病毒。每种病毒接种15株小麦幼苗。

BSMV:γ处理所用病毒的制备：将BSMV-α体外转录RNA、BSMV-β体外转录RNA和BSMV:γ体外转录RNA和Fes缓冲液按照表5进行混合，得到BSMV:γ处理所用病毒。

BSMV:PDS处理所用病毒的制备：将BSMV-α体外转录RNA、BSMV-β体外转录RNA和BSMV:PDS体外转录RNA和Fes缓冲液按照表5进行混合，得到BSMV:PDS处理所用病毒。

BSMV:Pst12786处理所用病毒的制备：将BSMV-α体外转录RNA、BSMV-β体外转录RNA和BSMV:Pst12786体外转录RNA和Fes缓冲液按照表5进行混合，得到BSMV:Pst12786处理所用病毒。

②接种病毒时需佩戴口罩，使用RNAase-free专用枪头按照比例吸取下列试剂混合于新PE手套上，轻轻吹打混匀，用枪头分开成若干滴进行接种。所加试剂比例如下：

表5

Fes缓冲液配方如下：

表6

试剂	用量/每株小麦
		焦磷酸钠	1g
硅藻土	1g
		甘氨酸	0.75g
斑脱土	1g
		磷酸氢二钾	1.05g
0.1％DEPC水溶液	To100mL

将Fes缓冲液按照配方加入250mL锥形瓶中，30℃、200rpm恒温培养24h。培养后用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min，于超净工作台中分装至2mL离心管中，于-80℃保存备用；

③接种时使用新的小号乳胶手套，蘸取PE手套上的混合物摩擦小麦二叶，以发出轻微吱吱声为佳。接毒完毕后，25摄氏度黑暗保湿24h后转入正常光周期，25℃持续高温高湿培养；

④接种病毒后10d左右，观察病毒症状，BSMV:PDS出现光漂白现象，BSMV:γ、BSMV:Pst12786出现马赛克花叶现象，即为发毒正常，将进行接下来的接菌实验。

5)、小麦条锈菌的接种及样品的采集与处理

①剔除没有发毒的植株，选取步骤3)中发毒正常的植株，待接毒2周后接种CYR31，接菌部位选择小麦植株四叶，提前用记号笔标记接菌部位，以方便后续接菌及样品的采集；

②在接种小麦条锈菌后120h采集组织学样品以及RNA样品，随后使用qRT-PCR检测Pst12786的转录水平。定量PCR引物在使用前需检测其扩增产物的特异性及扩增效率(≥90％)，前述PstEF1在Real-time PCR分析中作为内参基因。使用ChamQ SYBR Qpcr MasterMix(20uL/rxn)(Vazyme，中国南京)和Bio-Rad CFX Manager定量PCR仪器(Bio-rad，Hercules，California)，参照说明书，分别以各处理取样点的cDNA为模板进行实时定量PCR扩增。每个反应至少做3个重复，各个重复的Ct值及其平均值和标准差通过手动调节基线由定量PCR仪生成。采用Delta Delta Ct法分析实验数据，确定基因的相对表达量。Pst12786定量引物序列和内参定量引物如下：

RT-PCR引物序列为：

QPst12786-F：5｀-TGAGGTTCGCACCGAGTTT-3`；

QPst12786-R：5`-TGAAGCGGCATTAGCACAG-3`。

qRT-PstEF1-F：5`-TTCGCCGTCCGTGATATGAGACAA-3`；

qRT-PstEF1-R：5`-ATGCGTATCATGGTGGTGGAGTGA-3`。

6)侵染点面积统计

在接种CYR31120h时，参照如下方法统计小麦叶片上侵染点菌丝面积：在取样时间点前6-8h剪下接菌的小麦叶片；将其形态学下端浸入含1mg/mL的DAB溶液中(将DAB溶于PH为3.8的HCl中配制成1mg/mL的浓度)；将采好的组织样在光照(最好是强光)下反应约8h，使染液吸收到叶片形态学上端则染色完毕；将小麦叶片剪成约0.5cm左右的叶段，置于新的装有脱色液的2mL离心管中，待完全脱色后放入水饱和氯醛中固定；将透明过的小麦组织学样品用50％乙醇冲洗2次，每次15min；然后用蒸馏水冲洗1～2次，每次10min；将样品转入1M的KOH，高压灭菌(121℃，5min)。其目的是使叶片组织变软，使后面的荧光染料能进入到叶肉细胞。然后用蒸馏水冲洗1～2次，每次10min；将样品转入0.05mol/L的Tris-HCl(pH＝7.0)缓冲液中浸泡大约30min；用20μg/mL的WGA荧光染液避光染色30min以上；将处理过的样品，用蒸馏水冲洗2～3次，每次10min，处理完成后转入50％甘油保存；用OlympusBX-53微分干涉显微镜在荧光和微分干涉条件下进行观察。

结果如图8所示，与对照接种病毒BSMV:γ的植株叶片相比，在接种病毒Pst12786的植株叶片上产孢数量略有减少(图8中A)。同时，与接种病毒BSMV:γ的植株叶片相比，在接种病毒Pst12786的植株叶片上Pst12786的转录水平明显降低，且降低幅度为65.7％(图8中B)，说明Pst12786基因被有效沉默。另外，与对照接种病毒BSMV:γ的植株叶片相比，在接种病毒Pst12786的植株叶片上条锈菌的侵染面积明显降低(图8中C)，说明Pst12786的沉默抑制了条锈菌侵染过程中菌丝在叶片中的扩展。

以上结果证明：条锈菌Pst12786(SEQ ID NO:1)是一个新的免疫诱抗蛋白，能够触发强烈的植物过敏性坏死反应，并在转基因拟南芥中迸发活性氧，暗示其能够作为小麦条锈菌中一种新的免疫诱抗分子，在将来免疫诱抗剂的应用中可能会发挥重要作用。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims

1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；

A3)氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质；