CN113968898B - 植物抗病相关蛋白TaBZR2及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了植物抗病相关蛋白TaBZR2及其编码基因与应用。本发明提供一种蛋白，为如下(1)或(2)：(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。本发明发现的TaBZR2基因受条锈菌诱导表达，且将TaBZR2基因导入小麦中得到的转基因小麦，其对条锈菌多个生理小种的抗性高于野生型小麦。本发明提供的蛋白和基因为人为控制抗病相关基因的表达提供了基础，将在培育广谱抗病的植物中发挥重要的作用。

Description

植物抗病相关蛋白TaBZR2及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及植物抗病相关蛋白TaBZR2及其编码基因与应用。

背景技术

小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia stiiformis f.sp.tritici)引起的小麦重大病害，在世界范围内危害严重。利用抗病品种进行防治仍然是目前最经济最有效的方式。因此，挖掘小麦抗病基因，了解小麦在条锈菌胁迫下的应答与信号传导机制，提高小麦的抗病性，成为小麦条锈病的可持续控制的重要手段。

条锈菌是一种专性营养寄生菌，其生长和繁殖完全依赖于寄主植物，水分和营养物质必须从寄主植物中获得。不同的条锈菌小种对寄主的影响不同。由于条锈菌夏孢子除了在一段有限的时间内可存活外，其余时间需利用寄主植物已完成其生活史。在侵染过程中，寄主植物诱导产生防卫反应以防止更多的毒性生理小种或是其他病原微生物的侵染。但是寄主植物的生长发育状况也发生了改变。当寄主植物的防卫反应被诱导产生后，植物中的能量和相关营养物质代谢均发生改变，营养和水的摄取均减少从而使得寄主植物的生长发育受到抑制。条锈菌侵染进入寄主植物后，寄主植物出现了黄萎和坏死等症状或真菌在寄主表面产生了大量的夏孢子堆时，绿色叶片和组织减少，导致了植物的光合作用大大降低。宏观上，条锈菌的侵染可减弱寄主植物的活力，减少寄主植物的分蘖数、穗数和种子数，并可降低植株株高和种子的重量和质量。经济上，条锈菌的侵染导致了农作物产量的降低，同时增加了作物的管理成本，农业上，由于条锈菌是小麦，大麦和部分草场上最重要的病害之一，可引起大规模的病害流行。对于小麦，由于条锈病的流行，一般年份可造成10-70％的产量损失，而在大发生时甚至能够绝收。中国是世界上最大的条锈病流行区，年均发病面积约400万公顷。历史上在1950、1964、1990和2002年全国范围内条锈病有四次大流行，分别造成产量损失产60亿，36亿，25亿和10亿kg。种植抗病品种被认为是防治条锈病最为经济有效的措施。近年来，随着优良品种的推广和水肥条件的改善，小麦生产水平大幅度提高。然而由于气候环境的变化、人为不合理的栽培措施以及小麦条锈菌的毒性小种发生变异，可能会导致我国主要抗病品种抗性的丧失，给我过主要麦区带来巨大的生产安全隐患。

自然界中，植物进化出成熟的防御机制来抵御病原微生物的侵染。当病原微生物识别出合适的寄主后，会破坏寄主的组成型防卫屏障，穿透其表皮组织和细胞壁，激活病原菌诱导的防卫机制。这种防卫机制是通过直接识别病原微生物或者是通过识别其侵染期间对寄主造成的危害来启动的。在植株细胞表面的受体蛋白能够识别病原菌中的病菌相关分子模块(Microbe/Pathogen-associated molecular patterns，MAMPs/PAMPs)或是寄主自己形成的损害相关分子模块(Damage-associated molecularpatterns，DAMPs)，激活寄主植物的防卫反应(PAMP-triggered immunity，PTI)。然而，一些特定病原微生物为了抑制PTI产生了效应蛋白(effectors)从而干扰了寄主抗性并产生了由效应蛋白触发的寄主感病性(Effector-triggered susceptibility，ETS)。植物为了抵御效应蛋白的作用，进化出“R”基因介导的专化抗性。在该专化抗性中，“R”基因不仅能直接识别相应的效应蛋白而且能识别效应蛋白对寄主靶标蛋白的修饰作用。大多数“R”基因编码与核苷酸结合的富含亮氨酸重复序列(NB-LRR)蛋白。“R”基因介导的专化抗性也称为效应蛋白诱导的防卫反应(Effector-triggered immunity，ETI)，通常伴随着过敏性坏死反应的发生(Hypersensitive response，HR)。HR是植物中最常见的抗病形式，具体表现为侵染点局部形成枯死并限制病原菌的生长。由于MAMPs、PAMPs或者是DAMPs非常保守，因此PTI很容易的被大部分病原菌识别，而效应蛋白具有高度的特异性，从而使ETI在不同物种或是不同生理小种间存在差异(Dodds and Rathjen 2010)。尽管激活ETI和PTI的方式不同，但是两者均能诱导一系列的植物免疫反应，包括脂膜上的离子流动、细胞内钙离子浓度的增长、活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的形成、激活MAPK(Mitogen-activated proteinkinase)信号通路等。随后引起的反应包括：抗菌蛋白的分泌、细胞壁木质化等。

油菜素类固醇(BR)是一种比生长素(IAA)、赤霉素(GA)、细胞分裂素(CTK)、脱落酸(ABA)、乙烯(ET)等具有更高的生理活性的植物特异性甾体激素。BR合成基因的过表达或缺失对植物生长发育及产量、品质等农业性状产生严重影响。BR信号转导受阻的植物表现出矮化、延迟开花、早熟等不良表型。BZR/BES是BR信号通路中的重要转录因子。BR与细胞表面结合后，BRI(Brassinosteroid-insensitive 1)与共受体BAK1(BRI1-associatedreceptor kinase 1)结合形成异源二聚体。异源二聚体激活BSU1(BRI1 suppressor 1)，抑制下游BIN2(Brassinosteroid-insensitive 2)活性。BIN2促进BZR1/BES1的磷酸化，使其丧失进入细胞核并与DNA结合的能力。而去磷酸化的BZR1/BES1则在细胞核中积累并激活下游基因转录，从而调控BR靶基因的表达。类似地，OsBZR1在水稻BR信号通路中起正向调节作用，14-3-3蛋白抑制OsBZR1在细胞核积累，负向调节BR信号。

BZR/BES转录因子在调节植物生长和抗逆性的信号转导途径有重要功能。如OsBES1/BZR1可抑制叶腋分生组织生长发育基因的表达，促进小穗发育，提高水稻产量。AtBES1/BZR1可以调控拟南芥分生组织发育相关基因的表达和根的发育。GmBZR1促进大豆种子大小和重量，增加大豆产量。同时BZR/BES转录因子影响花药的形成，AtBZRs在花药发育中具有BR信号独立的调控作用，通过影响拟南芥中SPL的表达来调控胞内发育。BZR/BES还参与了光信号通路，在拟南芥中，AtBES1/BZR1与AtPIF4(光敏色素相互作用因子4)相互作用形成异源二聚体并参与光合作用。去磷酸化的AtBES1与AtUVR8(抗紫外线位点8)相互作用，调节光合作用。AtBES1-AtBEE1(BR增强表达1)-AtFT(开花位点T)模式是近年来发现的调控开花光周期的信号通路。蓝光介导的AtCRY1(隐花色素1)-AtBIN2(BR不敏感2)-AtBZR1模式调节蓝光与BR信号之间的关系。在玉米中，ZmBES/BZRs参与光信号通路。

发明内容

本发明一个目的是提供一种蛋白。

本发明提供的蛋白，名称为TaBZR2，来源于小麦品种水源11(Triticumaestivum)，为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

为了使(1)中的TaBZR2蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1为标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(2)中的TaBZR2蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(2)中的TaBZR2蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述蛋白的核酸分子也是本发明保护的范围。

上述核酸分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列1由1002个核苷酸组成，编码序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码TaBZR2的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的TaBZR2的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码TaBZR2且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒或重组微生物或重组转基因植物细胞系也是本发明保护的范围。

上述生物材料中，所述含有编码TaBZR2的核酸分子的表达盒(TaBZR2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TaBZR2的DNA，该DNA不但可包括启动TaBZR2转录的启动子，还可包括终止TaBZR2转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

可用现有的表达载体构建含有所述TaBZR2基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1305、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

上述蛋白、上述核酸分子或上述重组载体、表达盒或重组微生物或重组转基因植物细胞系在调控植物抗病性中的应用也是本发明保护的范围。所述调控为提高。

上述蛋白、上述核酸分子或上述重组载体、表达盒或重组微生物或重组转基因植物细胞系在培育抗病性植物中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述抗病性为抗条锈病；所述提高植物抗条锈病具体体现在如下(1)-(3)中任一种：(1)在条锈菌胁迫条件下，侵染转基因小麦的条锈菌产孢量低于受体植物；(2)条锈菌胁迫条件下，转基因植物的病程相关基因的表达水平高于受体植物；(3)条锈菌胁迫条件下，侵染转基因小麦的条锈菌菌丝侵染面积低于受体植物。所述条锈菌胁迫为亲和或非亲和处理，亲和处理用CYR31菌种，非亲和处理用CYR23菌种。

上述应用中，由于条锈菌数据专性寄生真菌，因此选择小麦为研究对象，小麦品种Fielder作为转基因的受体以及研究对象，同时寄主抗病性鉴定得出Fielder对CYR23为非亲和、对CYR31为亲和。

本发明另一个目的是提供一种培育抗病性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为如下1)或2)：

1)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中上述蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；

2)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中编码上述蛋白的核酸分子的表达，得到转基因植物；

所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物。

上述方法中，所述提高目的植物中上述蛋白的含量和/或活性，或，提高目的植物中编码上述蛋白的核酸分子的表达，均通过将上述核酸分子导入目的植物实现。

在本发明的实施方式中，TaBZR2蛋白质的编码基因(即序列2自5’1-1002所示的核苷酸)通过含有TaBZR2蛋白质的编码基因的表达盒的重组载体CUB-TaBZR2导入农杆菌EHA105中。所述重组载体CUB-TaBZR2是用同源重组的方法将为将TaBZR2的DNA片段插入CUB载体且保持CUB载体的其他序列不变。

上述方法中，所述抗病性为抗条锈病。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述TaBZR2基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明的实验证明，本发明发现的TaBZR2基因受条锈菌诱导表达，且将TaBZR2基因导入小麦中得到的转基因小麦，其对条锈菌多个生理小种的抗性高于野生型小麦。本发明提供的蛋白和基因为人为控制抗病相关基因的表达提供了基础，将在培育广谱抗病的植物中发挥重要的作用。

附图说明

图1为TaBZR2在小麦与条锈菌互作组合中的表达特征。

图2为TaBZR2在小麦原生质体中的定位结果,标尺＝20μm。

图3为TaBZR2过表达小麦T3代的PCR鉴定结果。

图4为TaBZR2转基因小麦的抗病性鉴定鉴定(CYR23和CYR31)。

图5为生理小种CYR31在48h和120h时菌丝生长情况。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

下述实施例中所使用的试剂配方如下：

表2、为纤维素酶解液配方

/>

表3为PEG4000溶液(一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量)

表4为W5溶液

表5为MMG溶液

/>

表6为WI溶液

Cellulase R10(YaKult Honsha)纤维素酶(Yakult，C6270-1g)

Mecerozyme R10(YaKult Honsha)果胶酶(荣兴生物，RX-L0042-100mg)

mannitol甘露醇(北京梦怡美商贸中心，M0122-500g)

KOH(北京溪洋汇智科技有限公司，XYHZ-2017-05185)

KCl(北京宝瑞杰科技有限公司，7447-40-7)

MES(北京拜尔迪生物技术有限公司，DE-E169-100g)

CaCl₂(北京拜尔迪生物技术有限公司，031-00435)

NaCl(北京拜尔迪生物技术有限公司，7647-14-5)

MgCl₂(北京拜尔迪生物技术有限公司，DE-0288-500g)

Glucose(北京拜尔迪生物技术有限公司，049-31165)

PEG4000(北京拜尔迪生物技术有限公司，BR-0084)

BSA牛血清蛋白(北京泽平科技有限责任公司，0219989980.)

β-Mercaptoethanol巯基乙醇(北京瑞德百奥生物科技有限公司，0482-100ML)

下述实施例中的16318hGFP(绿色荧光蛋白)载体记载于文献“谷子WRKY36转录因子的分子特性及功能鉴定[J].中国农业科学,2015,48(5):851-860.”，公众可从申请人处获得。

下述实施例中的小麦条锈菌生理小种CYR23在文献“Liu P,Guo J,Zhang R,etal.TaCIPK10 interacts with and phosphorylates TaNH2 to activate wheat defenseresponses to stripe rust[J].Plant biotechnology journal,2019,17(5):956-968.”中公开过。公众可从申请人处获得。

下述实施例中的小麦条锈菌生理小种CYR31在文献“王凤乐,吴立人,徐世昌,金社林,贾秋珍,袁文焕,杨家秀.中国条锈菌新小种条中30、31号的研究[J].植物保护学报,1996(01):39-44.”中公开过。公众可从申请人处获得。

下述实施例中的小麦品种水源11在文献“曹张军,井金学,王美南,等.国内重要抗源品种水源11,水源92及Hybrid46抗条锈基因关系分析[J].西北植物学报,2003,23(1):64-68.”中公开过。公众可从申请人处获得。

下述实施例中的小麦品种Fielder材料来源于中国农业科学院作物科学研究所，记载在如下文献中：Cui Xiaoyu等2019年发表在Plant Physiology题为A Pivotal Roleof BES/BZR Family Transcription Factor TaBZR2 in Regulation of DroughtResponse的文章。公众可从申请人处获得。

实施例1、TaBZR2蛋白及其编码基因的获得

一、mRNA的分离及TaBZR2的扩增

取正常生长的7天大的小麦水源11幼苗，用液氮速冻，-80℃保存备用。

利用多糖多酚植物RNA提取试剂盒(华越洋生物科技有限公司)提取小麦叶片总RNA，第一链cDNA合成用反转录酶XL(AMV)。采用SMART法合成cDNA，PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。扩增引物为：

TaBZR2-F:ATGCCGACGTGCAGGGAGAGGGAGA；

TaBZR2-R:TCAGCTCCTCGTCCTGGAGCTTCCG。

得到996bp的PCR产物。

经过测序，该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，该核苷酸具有的基因命名为TaBZR2基因，编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2所示，该蛋白命名为TaBZR2蛋白。

二、RT-PCR检测TaBZR2受条锈菌诱导表达情况

1、实验材料的准备

条锈菌接种参照康振生等(1984，西北农学院学报)描述的方法。小麦水源11叶片分别接种CYR23(非亲和)和CYR31(亲和)组成非亲和和亲和互作组合，接种无菌水作为对照。

分别于接种后0h、3h、6h、9h、12h、18h、24h、48h、72h、96h、120h、168h和216h取样，对照取样时间点与处理保持一致。取样时，剪取新鲜叶片，用锡铂纸包好，投入液氮中速冻，后置于-80℃保存备用。采用Trizol法(TianGen)提取小麦叶片总RNA，第一链cDNA合成用反转录酶XL(AMV)。采用SMART法合成cDNA。

2、RT-PCR检测TaBZR2的表达量

根据小麦TaBZR2和延伸因子基因TaEF-1α的序列(GenBank登陆号：U76744)设计特异的定量PCR引物。

RT-PCR引物序列为：

Qbzr2-F：5’-TGTCGTCAAACCCATTCAGCG-3’

Qbzr2R：5’-CGTCAGAAACCACGTCCATCA-3’。

QTaEF-F：5’-TGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGT-3’

QTaEF-R：5’-ACTCATGGTGCATCTCAACGGACT-3’

定量PCR引物在使用前需检测其扩增产物的特异性及扩增效率(≥90％)，TaEF-1α在Real-time PCR分析中作为内参基因。

以上述cDNA为模板，用上述RT-PCR引物分别进行RT-PCR扩增。

使用AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，中国南京)和Bio-Rad CFXManager定量PCR仪器(Bio-rad，Hercules，California)，参照说明书，分别以各处理取样点的cDNA为模板进行实时定量PCR扩增。每个反应至少做3个重复，各个重复的Ct值及其平均值和标准差通过手动调节基线由定量PCR仪生成。每个反应做3个重复，Ct值取平均值，采用Delta Delta Ct法分析实验数据，确定基因的相对表达量。

qRT-PCR的结果如图1所示，TaBZR2在小麦水源11分别接种条锈菌非亲和小种CYR23和条锈菌亲和小种CYR31后的表达模式，其中TaBZR2在非亲和组合和亲和组合中表现出接种后侵染前期上调表达。

上述结果表明，TaBZR2受条锈菌诱导表达。

三、TaBZR2亚细胞定位分析

1、载体构建

将上述一扩增到的PCR产物TaBZR2基因连接到经过BamH I酶切后的16318hGFP(绿色荧光蛋白)载体上，得到重组载体TaBZR2-GFP，表达融合蛋白TaBZR2-GFP。

用于TaBZR2亚细胞定位，酶切位点为BamH I，引物为：(下划线表示酶切位点)

TaBZR2-GFP-F:5’-TATCTCTAGAGGATCCATGGCAAACAGAGGGAAGATTCT-3’

TaBZR2-GFP-R:5’-TGCTCACCATGGATCCCTCTAGCTGCTGCTGGTGGT-3’。

2、原生质体制备

1)、小麦原生质体制备转化方法

⑴土培室播种种植的水源11小麦。

⑵生长良好情况下，在未开花前取叶片制备原生质体。

⑶剪取中部生长良好的叶片，用刀片切成0.5-1mm宽的叶条。

⑷将切好叶条放入预先配好的表2所示的纤维素酶解液中(每5-10ml酶解液大约需10-20片叶子)。用镊子使叶子完全浸入酶解液。

⑸真空泵于黑暗中(锡箔纸包裹)抽真空30分钟。(此时可配制表3所示PEG4000溶液，200ul和1000ul枪头去尖，使操作时吸打缓和)

⑹在室温中无须摇动，继续黑暗条件下酶解至少3h(小麦50rpm 28℃摇)。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。(此时预冷一定量W5溶液)

⑺显微镜下检查溶液中的原生质体，小麦叶肉原生质体大小大约30-50um。

⑻在过滤除去未溶解的叶片前用等量的表4所示W5溶液稀释含有原生质体的酶液。

⑼先用W5溶液润湿35-75um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。

⑽用30ml的圆底离心管100g，1-2min，4℃离心，沉淀原生质体，尽量去除上清。然后用10ml冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。

⑾在冰上静至原生质体30分钟。

以下操作在室温23℃下进行

⑿100g离心8-10min，使原生质体沉淀。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液(1m,表5)重悬原生质体，使之最终浓度在2X10⁵个/ml。

⒀加入10ul或者20ul DNA(10-20微克约5-10kb的重组载体TaBZR2-GFP)至2ml EP管中。

⒁加入100ul原生质体(2x10⁴个)，轻柔混合。

⒂加入110ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合(每次大约可以转化6-10个样品)。

⒃诱导转化混合物20-30min(转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更长转化时间)。

⒄室温下用400-440ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好，以终止转化反应。

⒅室温下100g离心2min，然后除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心2min去上清。

⒆用1ml WI溶液(表6)轻柔重悬原生质体于多孔组织培养皿中。

⒇室温下(20-25℃)诱导原生质体18小时以上。

以转入16318hGFP载体为对照。

之后在激光共聚焦显微镜下观察GFP标签表达。

3、小麦原生质体镜检：

将暗培养18h之后的原生质体压片，然后在激光扫描共聚焦显微镜(Bio-RadMicroRadiance)(Laser scanning confocal microscopy,LSMC)观察GFP(绿色荧光蛋白)荧光，并进行扫描照像。LSCM的工作参数为：Ex＝488nm,Em＝525±15nm，Power＝10％,Zoom7,中速扫描，Frame512×512。软件为TIME-COURSE和PHOTOSHOP5.0。

结果见图2，上面的为转入重组载体16318hGFP空载体原生质体的对照(16318-GFP)；下面的为转入重组载体TaBZR2-GFP的原生质体(TaBZR2-GFP)中TaBZR2定位图，由图可知TaBZR2定位于细胞质和细胞核中。

实施例2、TaBZR2基因在提高植物抗条锈病中的应用

一、转TaBZR2基因小麦的获得

1、TaBZR2基因过表达载体的构建

将TaBZR2基因同源重组片段利用ClonExpress II One Step Cloning Kit(vazyme)同源重组连接到经过BamH I酶切后CUB载体(记载在如下文献中：谢书章等，2015年28卷3期，西南农业学报，农杆菌介导抗虫基因GmCry1F转化玉米的研究。)载体上，得到重组载体TaBZR2-CUB。

TaBZR2基因同源重组片段按照如下方法制备：

以序列1所示的TaBZR2全长CDS为模板，用如下引物扩增，得到的片段即为TaBZR2基因同源重组片段。

TaBZR2-CUB-F:5’-CAGGTCGACTCTAGAGGATCCATGCCGACGTGCAGGGAGAG-3’

TaBZR2-CUB-R:5’-GAGCTCGGTACCCGGGGATCCGCTCCTCGTCCTGGAGCTTC-3’。

用于TaBZR2转基因小麦转化，酶切位点为BamH I，引物为：(下划线表示酶切位点)。

2、转TaBZR2基因小麦的获得

将重组载体TaBZR2-CUB利用农杆菌侵染野生型小麦Fielder籽粒愈伤组织，得到T0代转TaBZR2基因小麦。

培育T0代转TaBZR2基因小麦直至得到T3代转TaBZR2基因小麦(过表达TaBZR2的T3代小麦)2个株系。

3、PCR验证

利用CTAB法分别提取T3代转TaBZR2基因小麦2个株系和野生型小麦(Fielder)叶片的基因组DNA，利用TaBZR2过表达检测F：TCGTCAAACCCATTCAGCGT；BESNOS2-R:AATTGCGGGACTCTAATCATA对转基因T3代植株进行分子检测(上游引物位于基因上，下游引物位于NOS终止子上)。以水为空白对照。每个株系随机取10株。

结果如图3所示，得到464bp的为阳性株系，过表达TaBZR2的T3代小麦两株系(TaBZR2过表达株系9和TaBZR2过表达株系11)均为阳性株系，命名为TaBZR2过表达株系9、TaBZR2过表达株系11。

二、转TaBZR2基因小麦的条锈病抗性分析

将野生型小麦Fielder(受体对照)、T3代转空载体小麦、TaBZR2过表达株系9和TaBZR2过表达株系11种植于25/23℃白天/黑夜温度,16小时光照/8小时黑暗光周期的培养箱第二叶展开后(图4A)分别接种条锈菌生理小种CYR23和CYR31，接种方法记载在文献“康振生,李振岐.洛夫林10常温致病新菌系的发现[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),1984(04):18-28.”，在接菌后0小时，24小时，48小时和120小时分别取接种部位叶片作为RNA提取样品，于48小时和120小时取接种部位叶片作为组织学样品，于接菌后14d观察发病表型。每个株系30株。

表型结果如图4A和4B所示，在条锈菌CYR23侵染条件下，在所有处理的叶片上均观察到可见的过敏性坏死反应，TaBZR2过表达株系的条锈病严重度低于对照植株(受体对照)。在条锈菌CYR31侵染条件下，在所有处理的叶片上均观察到明显的孢子堆，TaBZR2过表达植株的抗病表型优于对照植株。

同时检测了在条锈菌侵染过程中Fielder(受体对照)、TaBZR2过表达株系9和TaBZR2过表达株系11中TaBZR2的表达量，以接菌后不同时间RNA为模板，参照实施例1的RT-PCR检测方法检测。

结果如图4C所示，TaBZR2过表达株系始终比对照高2～3倍。

3、生物量检测

通过对接种条锈菌后7天的各个株系的小麦进行条锈菌生物量检测。生物量的检测方法记载在文献“Qi Tuo等，Stripe Rust Effector PstGSRE1 Disrupts NuclearLocalization of ROS-Promoting Transcription Factor TaLOL2 to Defeat ROS-Induced Defense in Wheat，2019”。

结果如图4D所示，发现过表达小麦中条锈菌生物量明显降低(图4D)。

上述抗病性鉴定结果表明在CYR23和CYR31两个生理小种处理条件下，转基因小麦显示出较强的抗性。这在生产应用方面具有佷大优势。

三、菌丝生长情况统计

将上述阳性转TaBZR2基因小麦(TaBZR2过表达株系9和TaBZR2过表达株系11)以及对照植株(Fielder)在第二叶展开后接种条锈菌生理小种CYR31后，分别于48h和120h取接种部位叶片，进行WGA染色，用于观测条锈菌发育情况(图5A)。

对48h样品显微观察菌丝长度、吸器母细胞数，并进行统计(统计30至50个侵染点)，发现并无明显差异(图5B，5C),同时对侵染120h样品显微观察菌落面积，并进行统计，发现TaBZR2过表达株系9和TaBZR2过表达株系11的侵染面积明显减小(图5D)。

由此证明TaBZR2是一个参与小麦抗条锈病反应过程的重要基因，过表达该基因得到条锈病抗性提高小麦。

SEQUENCE LISTING

<110> 西北农林科技大学

<120> 植物抗病相关蛋白TaBZR2及其编码基因与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1002

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atgccgacgt gcagggagag ggagaacaac aagcgcaggg agcggcggcg gcgcgcgatc 60

gccgccaaga tattctccgg cctgcgggcg cacggcgggt acaagctgcc caagcactgc 120

gacaacaacg aggtcctcaa ggccctctgc aacgaggccg gctgggtcgt cgagcccgac 180

ggcaccacct accgcaaggg atgcagaccc gcagagcgca tggatgggat tgggtgctca 240

gtgtcaccaa gcccatgctc ctcctatcag ccgagtccgc gggcatcata caatgcaagc 300

cctacttcct cttcattccc cagcggcgca tcgtcgccct tcctcccgca ttccaacaac 360

atggtaaatg gcgtcgatgc aactcccatc ctaccatggc tccagacgtt ctccaattcg 420

acggcgtcga ataagcggcc gcatcttccc ccgctgctga ttcacggtgg ctccattagc 480

gccccggtga ctcctccact gagctcaccg actgctcgca cccctcgcat gaagacggac 540

tgggacgagt cggtgatcca gccaccatgg catggttcaa acagtccctg cgtggtgaac 600

tccaccccgc cgagccccgg gcgtcagatg gttcctgacc cggcatggct ggccggtatc 660

cagatctcgt caacgagccc ttcatcgccc accttcagtc tcatgtcgtc aaacccattc 720

agcgtcttca aagaagcgat tccgggcggt ggttcgtcga ggatgtgcac gccagggcag 780

agcggcacct gctcgccggt gattcccggc atggcgcggc acccggacgt tcacatgatg 840

gacgtggttt ctgacgagtt tgcgtttgga agcagcacca acggcggcgc tcagcaggcc 900

accgccggat tggtgagggc gtgggagggc gagaggatcc acgaggactc cggatcggac 960

gagctggagc tcactctcgg aagctccagg acgaggagct ga 1002

<210> 2

<211> 333

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Pro Thr Cys Arg Glu Arg Glu Asn Asn Lys Arg Arg Glu Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Ala Ile Ala Ala Lys Ile Phe Ser Gly Leu Arg Ala His Gly

20 25 30

Gly Tyr Lys Leu Pro Lys His Cys Asp Asn Asn Glu Val Leu Lys Ala

35 40 45

Leu Cys Asn Glu Ala Gly Trp Val Val Glu Pro Asp Gly Thr Thr Tyr

50 55 60

Arg Lys Gly Cys Arg Pro Ala Glu Arg Met Asp Gly Ile Gly Cys Ser

65 70 75 80

Val Ser Pro Ser Pro Cys Ser Ser Tyr Gln Pro Ser Pro Arg Ala Ser

85 90 95

Tyr Asn Ala Ser Pro Thr Ser Ser Ser Phe Pro Ser Gly Ala Ser Ser

100 105 110

Pro Phe Leu Pro His Ser Asn Asn Met Val Asn Gly Val Asp Ala Thr

115 120 125

Pro Ile Leu Pro Trp Leu Gln Thr Phe Ser Asn Ser Thr Ala Ser Asn

130 135 140

Lys Arg Pro His Leu Pro Pro Leu Leu Ile His Gly Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Ala Pro Val Thr Pro Pro Leu Ser Ser Pro Thr Ala Arg Thr Pro Arg

165 170 175

Met Lys Thr Asp Trp Asp Glu Ser Val Ile Gln Pro Pro Trp His Gly

180 185 190

Ser Asn Ser Pro Cys Val Val Asn Ser Thr Pro Pro Ser Pro Gly Arg

195 200 205

Gln Met Val Pro Asp Pro Ala Trp Leu Ala Gly Ile Gln Ile Ser Ser

210 215 220

Thr Ser Pro Ser Ser Pro Thr Phe Ser Leu Met Ser Ser Asn Pro Phe

225 230 235 240

Ser Val Phe Lys Glu Ala Ile Pro Gly Gly Gly Ser Ser Arg Met Cys

245 250 255

Thr Pro Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ser Pro Val Ile Pro Gly Met Ala

260 265 270

Arg His Pro Asp Val His Met Met Asp Val Val Ser Asp Glu Phe Ala

275 280 285

Phe Gly Ser Ser Thr Asn Gly Gly Ala Gln Gln Ala Thr Ala Gly Leu

290 295 300

Val Arg Ala Trp Glu Gly Glu Arg Ile His Glu Asp Ser Gly Ser Asp

305 310 315 320

Glu Leu Glu Leu Thr Leu Gly Ser Ser Arg Thr Arg Ser

325 330

Claims (6)

1.一种蛋白或编码所述蛋白的核酸分子在提高小麦抗病性中的应用；

所述蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

所述抗病性为抗条锈病。

2.一种蛋白或编码所述蛋白的核酸分子在培育抗病性小麦中的应用；

所述蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

所述抗病性为抗条锈病。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为序列表中序列1所示的DNA分子。

4.一种培育抗病性提高的转基因小麦的方法，为如下1）或2）：

1）所述的方法包括如下步骤：提高目的小麦中一种蛋白的含量，得到转基因小麦；

2）所述的方法包括如下步骤：提高目的小麦中编码蛋白的核酸分子的表达，得到转基因小麦；

所述蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

所述转基因小麦的抗病性高于所述目的小麦；

所述抗病性为抗条锈病。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述提高目的小麦中权所述蛋白的含量，或，提高目的小麦中编码蛋白的核酸分子的表达，均通过将编码所述蛋白的核酸分子导入目的小麦实现。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述核酸分子为序列表中序列1所示的DNA分子。

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