CN111154799A

CN111154799A - TaDSK2a蛋白在调控小麦抗条锈病中的应用

Info

Publication number: CN111154799A
Application number: CN202010127092.5A
Authority: CN
Inventors: 张相岐; 席海秀; 范仁春; 刘亚培; 沈前华
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2040-02-28
Also published as: CN111154799B

Abstract

本发明公开了TaDSK2a蛋白在调控小麦抗条锈病中的应用。本发明提供了TaDSK2a蛋白或其相关生物材料在调控植物对条锈病抗性中的应用；所述相关生物材料为能够表达所述TaDSK2a蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。TaDSK2a基因能够调控小麦对条锈病抗性。本发明对于培育条锈病高抗小麦品种具有重要意义。

Description

TaDSK2a蛋白在调控小麦抗条锈病中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及TaDSK2a蛋白在调控小麦抗条锈病中的应用。

背景技术

小麦条锈病是由小麦条锈菌侵染引起的一种世界性真菌病害。小麦条锈菌属于柄锈菌属的条形柄锈菌小麦专化型(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)，是一种活体寄生真菌。

条锈病是危害中国及世界小麦生产的严重病害。尽管化学药剂可以有效控制小麦病害造成的经济损失，但出于对环境安全和人类健康的考虑，培育并推广抗病品种依然被认为是最根本、最经济和最安全的途径(Line and Chen,1995；Xu et al.,2013)。抗病基因的克隆与功能研究对于小麦抗病分子机制的研究和进行分子抗病育种具有十分重要的意义。

UBL(Ubiquitin-like)-UBA(Ubiquitin-associated)类型的蛋白作为一类泛素受体蛋白，结合被多聚化泛素链标记的蛋白并传递至蛋白酶体降解途径(Su and Lau,2009)。UBL-UBA类蛋白包括Rad23、Dsk2、Ddi和NUB1等类别，在蛋白的N段为UBL结构域，在蛋白的C段包含UBA结构域。DMOINANT SUPPRESSOR OF KAR 2(DKS2)在哺乳动物、酵母和植物中都广泛存在，除了包含UBA和UBL结构域外，在DSK蛋白中部还包含有数个STI1(heat shockshaperon-binding)结构域，在生物体中能够同时参与蛋白酶体介导的蛋白降解和细胞自噬通路。在拟南芥中，存在有两个DSK2同源基因(DSK2a，DSK2b)，其UBL结构域可以和26S蛋白酶体相互作用，而UBA结构域可以结合泛素链蛋白的的K48和K63残基，从而参与泛素/26S蛋白酶体降解通路(Fatimababy et al.,2010；Lin et al.,2011)。相比于人类，酵母和拟南芥，小麦中关于DSK2蛋白的报道还十分罕见，Kovalchuk等人(Kovalchuk et al.,2009)利用酵母双杂交筛选TaPR60的互作蛋白，发现TaUbiL可以和TaPR60的信号肽相互作用，Bhowmik等人(Bhowmik et al.,2018)利用CRISPR-Cas9系统创制了TaUbiL的突变体，但都没有对TaUbiL的功能及其调控方式进行进一步的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种TaDSK2a蛋白在调控小麦抗条锈病中的应用。

第一方面，本发明要求保护TaDSK2a蛋白或其相关生物材料在调控植物对条锈病抗性中的应用。

所述相关生物材料为能够表达所述TaDSK2a蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述TaDSK2a蛋白为TaDSK2a-1A蛋白、TaDSK2a-1B蛋白和/或TaDSK2a-1D蛋白。

所述TaDSK2a-1A蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

所述TaDSK2a-1B蛋白为如下任一所示蛋白质：

(B1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

(B2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(B3)与(B1)-(B2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(B4)在(B1)-(B3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

所述TaDSK2a-1D蛋白为如下任一所示蛋白质：

(D1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；

(D2)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(D3)与(D1)-(D2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(D4)在(D1)-(D3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在所述应用中，所述TaDSK2a蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量降低，植物对条锈病抗性降低；所述TaDSK2a蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物对条锈病抗性提高。

上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

第二方面，本发明要求保护一种培育对条锈病抗性提高的植物品种的方法。

本发明要求保护的培育对条锈病抗性提高的植物品种的方法，可包括使受体植物中TaDSK2a蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。所述TaDSK2a蛋白为TaDSK2a-1A蛋白、TaDSK2a-1B蛋白和/或TaDSK2a-1D蛋白。所述TaDSK2a-1A蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所述的蛋白质。所述TaDSK2a-1B蛋白为前文(B1)-(B4)中任一所述的蛋白质。所述TaDSK2a-1D蛋白为前文(D1)-(D4)中任一所述的蛋白质。

所述方法中，一般情况下，只要在受体植物中提高其中一个TaDSK2a蛋白(即TaDSK2a-1A蛋白、TaDSK2a-1B蛋白或TaDSK2a-1D蛋白)的表达量和/或活性，就会有对条锈病抗性提高的表型。

第三方面，本发明要求保护一种培育对条锈病抗性降低的植物品种的方法。

本发明要求保护的培育对条锈病抗性降低的植物品种的方法，可包括使受体植物中TaDSK2a蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。所述TaDSK2a蛋白为TaDSK2a-1A蛋白、TaDSK2a-1B蛋白和/或TaDSK2a-1D蛋白。所述TaDSK2a-1A蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所述的蛋白质。所述TaDSK2a-1B蛋白为前文(B1)-(B4)中任一所述的蛋白质。所述TaDSK2a-1D蛋白为前文(D1)-(D4)中任一所述的蛋白质。

所述方法中，一般情况下，需要在受体植物中同时降低三个TaDSK2a蛋白(即TaDSK2a-1A蛋白、TaDSK2a-1B蛋白和TaDSK2a-1D蛋白)的表达量和/或活性，就会有对条锈病抗性降低的表型。

第四方面，本发明要求保护一种培育对条锈病抗性提高的转基因植物的方法。

本发明要求保护的培育对条锈病抗性提高的转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达TaDSK2a蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对条锈病抗性提高。所述TaDSK2a蛋白为TaDSK2a-1A蛋白、TaDSK2a-1B蛋白和/或TaDSK2a-1D蛋白。所述TaDSK2a-1A蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所述的蛋白质。所述TaDSK2a-1B蛋白为前文(B1)-(B4)中任一所述的蛋白质。所述TaDSK2a-1D蛋白为前文(D1)-(D4)中任一所述的蛋白质。

所述方法中，一般情况下，只要在受体植物中过表达其中一个TaDSK2a蛋白(即2a-1A蛋白、TaDSK2a-1B蛋白或TaDSK2a-1D蛋白)的编码基因，所得转基因植物就会有对条锈病抗性提高的表型。

其中，向所述受体植物中导入能够表达所述TaDSK2a蛋白的核酸分子，可通过任何能够实现这一目的技术手段实现。

在本发明的具体实施方式中，具体是通过向所述受体植物中导入含有能够表达所述TaDSK2a蛋白的核酸分子的重组载体实现的。所述重组载体具体为将能够表达所述TaDSK2a蛋白的核酸分子插入到pLGY-02载体后得到的重组质粒。

第五方面，本发明要求保护一种培育对条锈病抗性降低的转基因植物的方法。

本发明要求保护的培育对条锈病抗性降低的转基因植物的方法，可包括如下步骤：对受体植物中能够表达TaDSK2a蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对条锈病抗性降低。所述TaDSK2a蛋白为TaDSK2a-1A蛋白、TaDSK2a-1B蛋白和/或TaDSK2a-1D蛋白。所述TaDSK2a-1A蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所述的蛋白质。所述TaDSK2a-1B蛋白为前文(B1)-(B4)中任一所述的蛋白质。所述TaDSK2a-1D蛋白为前文(D1)-(D4)中任一所述的蛋白质。

所述方法中，一般情况下，需要在受体植物中对三个TaDSK2a蛋白(即TaDSK2a-1A蛋白、TaDSK2a-1B蛋白和TaDSK2a-1D蛋白)的编码基因同时进行抑制表达，才会有对条锈病抗性降低的表型。

其中，对所述受体植物中能够表达所述TaDSK2a蛋白的核酸分子进行抑制表达，可通过任何能够实现这一目的技术手段实现。

在本发明的具体实施方式中，具体是通过向所述受体植物中导入BSMV病毒载体α、BSMV病毒载体β和重组BSMV病毒载体γ来实现的；所述重组BSMV病毒载体γ含有SEQ IDNo.6自5'端第984-1115位所示的DNA分子或含有SEQ ID No.6自5'端第1279-1366位所示的DNA分子。

其中，SEQ ID No.6自5'端第984-1115位所示的DNA分子与SEQ ID No.4中对应片段(自5'端第996-1127位)相比，仅有1个碱基的差别，与SEQ ID No.5中对应片段(自5'端第996-1127位)相比，仅有2个碱基的差别，且差别碱基均位于中间部分。SEQ ID No.6自5'端第1279-1366位所示的DNA分子与SEQ ID No.4中对应片段(自5'端第1291-1378位)和SEQID No.5中对应片段(自5'端第1291-1378位)完全一致。因此，向所述受体植物中导入BSMV病毒载体α、BSMV病毒载体β和所述重组BSMV病毒载体γ后，所述受体植物中的所述TaDSK2a-1A、TaDSK2a-1B和TaDSK2a-1D三个蛋白的编码基因的表达均会受到抑制。

在上述各方面中，能够表达所述TaDSK2a-1A蛋白的核酸分子或所述TaDSK2a-1A蛋白的编码基因具体可为如下(a1)-(a3)中任一所述的DNA分子：

(a1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；

(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码所述TaDSK2a-1A蛋白的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述TaDSK2a-1A蛋白的DNA分子。

在上述各方面中，能够表达所述TaDSK2a-1B蛋白的核酸分子或所述TaDSK2a-1B蛋白的编码基因具体可为如下(b1)-(b3)中任一所述的DNA分子：

(b1)SEQ ID No.5所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码所述TaDSK2a-1B蛋白的DNA分子；

(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述TaDSK2a-1B蛋白的DNA分子。

在上述各方面中，能够表达所述TaDSK2a-1D蛋白的核酸分子或所述TaDSK2a-1D蛋白的编码基因具体可为如下(d1)-(d3)中任一所述的DNA分子：

(d1)SEQ ID No.6所示的DNA分子；

(d2)在严格条件下与(d1)限定的DNA分子杂交且编码所述TaDSK2a-1D蛋白的DNA分子；

(d3)与(d1)或(d2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述TaDSK2a-1D白的DNA分子。

上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNa₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

在上述各方面中，所述对条锈病抗性提高体现均可体现为：提高受体植物中所述TaDSK2a蛋白的表达量和/或活性后，植株上的条锈病菌孢子数增多。

在上述各方面中，所述对条锈病抗性降低均可体现体现为：降低受体植物中所述TaDSK2a蛋白的表达量和/或活性后，植株上的条锈病菌孢子数减少。

在上述各方面中，所述条锈病均可为由条锈病菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)生理小种CYR17和/或CYR33引起的条锈病。所述条锈病菌均可为条锈病菌(Blumeriagraminis f.sp.tritici)生理小种CYR17和/或CYR33。

在上述各方面中，所述植物均可为单子叶植物。进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。更进一步地，所述禾本科植物可为小麦。

在本发明的具体实施方式中，所述小麦具体为小麦品种水原11(抗条锈菌系CYR17的品种)或小麦品种Fielder(感条锈菌系CYR33的品种)。

实验证明，通过病毒诱导的基因沉默，降低TaDSK2a基因在小麦叶片中的表达，使小麦品种水原11对无毒条锈菌小种CYR17的侵染，反应型由0-0；级变为3-4级。由此证明小麦的TaDSK2a基因参与了小麦对条锈菌的抗性调控。进一步，在小麦品种Fielder中过量表达TaDSK2a基因，提高小麦中TaDSK2a基因的表达水平，使小麦品种Fielder对毒性条锈菌小种CYR33的侵染由3-4级变为2级。可见，TaDSK2a基因能够调控小麦对条锈病抗性。本发明对于培育条锈病高抗小麦品种具有重要意义。

附图说明

图1为BSMV-VIGS下调TaDSK2a基因表达后普通小麦品种水原11叶片中TaDSK2a基因的相对表达量。图示沉默片段TaDSK2a-1和TaDSK2a-2均可极显著下调TaDSK2a基因的表达，“**”代表P≤0.01。Mock：模拟接种的空白对照植株；BSMV:GFP：转GFP基因的阴性对照植株；BSMV:TaDSK2a-1和BSMV:TaDSK2a-2分别代表利用沉默片段TaDSK2a-1和沉默片段TaDSK2a-2下调TaDSK2a基因表达的植株。

图2为BSMV-VIGS下调TaDSK2a基因表达的水原11植株接种无毒小麦条锈菌生理小种CYR17后14天的叶片表型。示下调TaDSK2a基因表达的水原11失去对CYR17的抗性，沦为高感(反应型为3-4)。Mock：模拟接种的空白对照植株；BSMV:GFP：转GFP基因的阴性对照植株；BSMV:TaDSK2a-1和BSMV:TaDSK2a-2分别代表利用沉默片段TaDSK2a-1和沉默片段TaDSK2a-2下调TaDSK2a基因表达的植株。

图3为TaDSK2a-1D基因在转基因小麦中的相对表达量。示在转基因植株中TaDSK2a-1D的表达量较对照植株显著提高。OETaDSK2a-L11，OETaDSK2a-L13和OETaDSK2a-L16代表3个不同的转基因系；Null为转基因后阴性系；WT代表受体小麦品种Fielder。

图4为过表达TaDSK2a基因的感病小麦品种Fielder接种生理小种CYR33后的叶片表型。示过表达TaDSK2a基因的Fielder转基因系植株对条锈菌小种CYR33的抗性显著提高，反应型由高感变为中抗(不同株系的反应型为2级)。OETaDSK2a-L11，OETaDSK2a-L13和OETaDSK2a-L16为3个不同的过表达转基因株系；Null为转基因后阴性系；WT代表受体小麦品种Fielder。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的BSMV-VIGS病毒载体(包括α、β和γ质粒)和γ-GFP质粒在文献“Holzberg S,Brosio P,Gross C,Pogue G.Barley stripe mosaic virus-induced genesilencing in a monocot plant.Plant J.,2002,30:315-327.”中公开过。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验室用，不得他用。

下述实施例中的条锈菌(Blumeriagraminis f.sp.tritici)生理小种CYR17，CYR33在文献“Hu X,Li J,Wang Y,Wang B,Li Q,Kang Z,Yang M,Peng Y,Liu T,Chen W,etal.Race composition of Puccinia striiformis f.sp.tritici in Tibet,China.PlantDis,2012,96,1615-1620.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验室用，不得他用。

下述实施例中的小麦品种水原11(Triticum aestivum var.Suwon 11)在文献“杨作民.小麦对条锈病抗性遗传的研究.作物学报，1981，7(2)：81-90。”中公开过。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验室用，不得他用。

下述实施例中的小麦品种Fielder(Triticum aestivum var.Fielder)在文献“尹米琦，张双喜，范春捆，王坤杨，王静，王轲，杜丽璞，叶兴国.不同化学试剂和处理方式加倍小麦单倍体植株的效果.中国农业科学，2018，51(5)：811-820。”中公开过。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验室用，不得他用。

下述实施例中的质粒pLGY-02在文献“梁芳，刘亦菲，崔钟池，王海燕，刘大群.利用农杆菌介导法快速鉴定小麦病程相关蛋白基因TaPR1的功能.河北农业大学学报，2019，42(2)：12-17。”中公开过。小麦幼胚转化由转化平台完成。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验室用，不得他用。

文中所述对于小麦条锈病抗病性的反应型分级标准，在文献“Li ZQ,ShangHS.Wheat rusts and their control.1989,Shanghai Science and Technology Press,Shanghai,China.”中有详细描述，按照0-4级反应型将条锈病抗病性分为无症状，为免疫级(0级)；产生枯死斑点或失绿反应，不产生夏孢子堆，为近免疫级(0；级)；夏孢子堆很小，数量很少，周围有枯死反应，为抗病级(1级)；夏孢子堆小到中等，周围有枯死和失绿反应，为中抗级(2级)；夏孢子堆中等大小，周围无枯死反应，但有轻微失绿现象，为中感级(3级)；夏孢子堆大而且多，无枯死反应，失绿现象不明显，为感病级(4级)。

下述实施例中的GKP Buffer含有50mM甘氨酸(glycine)、30mM K₂HPO₄(pH9.2)、1％(质量百分比)膨润土(bentonite)和1％(质量百分比)硅藻土(celite)。

实施例1、TaDSK2a基因cDNA序列的克隆

1、小麦cDNA序列的获得

(1)小麦总RNA的提取

采用RNA提取试剂盒提取普通小麦品种水原11的总RNA。RNA提取试剂盒为PEXBIO公司产品(货号：A010400)，具体的提取操作步骤和条件要求按照产品说明书进行。

(2)RNA的反转录

利用Takara公司的反转录试剂盒(货号：RR047A)对上述步骤(1)中获得的小麦叶片总RNA进行反转录，获得cDNA。具体的操作步骤和条件要求按照产品说明书进行。

2、TaDSK2a cDNA序列的PCR扩增与测序

以上述步骤1中获得的cDNA为模板，利用引物对DSKCDS-F和DSKCDS-R1、R2，以小麦品种水原11(抗条锈菌菌系CYR17)cDNA为模板进行PCR扩增。

DSKCDS-F：5’-ATGGGCGGAGCAGGCGACG-3’；

DSKCDS-R1：5’-CTACTGGCCAAAGTTCCCGAGAAG-3’(用于扩增TaDSK2a-1A和TaDSK2a-1D)；

DSKCDS-R2：5’-TTAAACGAATTGGCCCTTCACAGC-3’(用于扩增TaDSK2a-1B)。

PCR反应体系：cDNA模板0.5μL，dNTP(2.5mM)4μl，DSKCDS-F(10μM)1μl，DSKCDS-R1(10μM)1μl或DSKCDS-R2(10μM)1μl，5×TransStartFastPfu Buffer 10μl，TransStartFastPfu DNA Polymerase 1μl(2.5U)，最后用水补足至50μl。PCR反应程序：95℃预变性2min；然后95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。

将上述PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶分离纯化后连接到

ZeroCloning Vector(Transgen CB501)载体上，得到重组质粒pEASY-T-TaDSK2a，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，并用通用引物M13F对细菌克隆进行一代测序。

大量测序结果表明，PCR扩增得到的PCR产物有3个，其对应的长度分别为1707bp，1695bp和1695bp的cDNA序列即为普通小麦的3个TaDSK2a基因的编码区全长序列，三个不同的基因拷贝分别命名为TaDSK2a-1A(1707bp)、TaDSK2a-1B(1695bp)和TaDSK2a-1D(1695bp)。

TaDSK2a基因三个拷贝的基因编码区全长序列分别为SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6。相应地将TaDSK2a基因编码的蛋白分别命名为TaDSK2a-1A、TaDSK2a-1B和TaDSK2a-1D蛋白。TaDSK2a-1A蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；TaDSK2a-1B蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；TaDSK2a-1D蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

实施例2、利用BSMV-VIGS实验验证TaDSK2a基因的抗条锈病功能

一、沉默TaDSK2a基因小麦的获得

1、诱导TaDSK2a基因下调BSMV-VIGS载体系统的构建

(1)根据实施例1中TaDSK2a-1D基因序列(SEQ ID No.6)，选取了两个不同位置沉默片段，一个片段具体位置为+984bp～+1115bp，长132bp，命名为沉默序列TaDSK2a-1，利用引物对V-TaDSK-F1和V-TaDSK.2-R1进行PCR扩增获得。另一个片段起始于+1279bp，到+1366bp结束，长88bp，命名为沉默序列TaDSK2a-2，利用引物对V-TaDSK-F2和V-TaDSK-R2进行PCR扩增获得。

V-TaDSK-F1：5’-CTAGCTAGCGCAAGGAACAACACGGTCA-3’；

V-TaDSK-R1：5’-CTAGCTAGCGCAGCACCAGTTCTTGCAT-3’。

V-TaDSK-F2：5’-CTAGCTAGCCCAAATGCACGTAGCCTGA-3’；

V-TaDSK-R2：5’-CTAGCTAGCCTGGGGATGCCATCTGG-3’。

下划线序列即为限制性内切酶NheI的酶切识别位点。

(2)按照常规分子生物学方法，参见“颜子颖，王海林译《精编分子生物学实验指南》，2001，科学出版社”中的方法进行载体构建。具体操作步骤如下所述。

将上述步骤1获得的沉默序列TaDSK2a-1和TaDSK2a-2分别反向插入BSMV-VIGS病毒载体γ的NheI酶切位点处，且保持其它序列不变，得到重组载体γ-TaDSK2a-1和γ-TaDSK2a-2。

以引物对V-TaDSK2a-F1和γ-strain-p对重组载体γ-TaDSK2a-1进行PCR扩增和测序鉴定，阳性克隆即为将SEQ ID No.6自5'端第984-1115位核苷酸的序列按基因表达的相反方向插入BSMV-VIGS病毒载体γ链的NheI酶切位点处，且保持其它序列不变的TaDSK2a基因沉默载体γ-TaDSK2a-1。

以引物对V-TaDSK2a-F2和γ-strain-p对重组载体γ-TaDSK2a-2进行PCR扩增和测序鉴定，阳性克隆即为将SEQ ID No.6自5’末端起第1279-1366位核苷酸的序列按基因表达的相反方向插入BSMV-VIGS病毒载体γ链的NheI酶切位点处，且保持其它序列不变的TaDSK2a基因沉默载体γ-TaDSK2a-2。

γ-strain-p：5’-CAACTGCCAATCGTGAGTAGG-3’。

BSMV-VIGS病毒载体α、β和γ-GFP载体共同构成病毒载体系统BSMV:GFP。

BSMV-VIGS病毒载体α、β和重组载体γ-TaDSK2a-1共同构成可沉默TaDSK2a基因的病毒沉默载体系统BSMV:TaDSK2a-1。

BSMV-VIGS系统载体α、β和重组载体γ-TaDSK2a-2共同构成可沉默TaDSK2a基因的病毒沉默载体系统BSMV:TaDSK2a-2。

2、BSMV体外转录

(1)用MluI酶切BSMV病毒载体α、γ-GFP载体、重组载体γ-TaDSK2a-1和重组载体γ-TaDSK2a-2，用SpeI酶切BSMV病毒载体β，分别得到线性化质粒。

(2)以上述步骤(1)获得的线性化质粒为模板进行体外转录，分别得到体外转录的BSMV病毒载体α、β、γ-GFP、γ-TaDSK2a-1和γ-TaDSK2a-2。体外转录反应按照RiboMAX^TMLarge Scale RNA Production System-T7(Promega公司产品，货号：P1300)说明书进行操作。转录反应体系和条件分别为：反应总体积20.0μl，包括线性化质粒(1.0μg)和无RNase水共6.5μl，5×Transcription Buffer 4.0μl，m7G(5')ppp(5')G 1.5μl(Promega公司产品，货号：P1718)，rNTPPreMix 6.0μl，Enzyme Mix 2.0μl，37℃反应4h，转录产物置-70℃保存备用。其中rNTPPreMix是由试剂盒中四种试剂dATP(100mM)15μl，dCTP(100mM)15μl，dUTP(100mM)15μl，dGTP(100mM)1.2μl，及13.8μl ddH₂O混合而成。

3、BSMV接种

将小麦品种水原11播种于营养土中，待生长至二叶期，各取8μl BSMV:TaDSK2a-1重组病毒载体溶液和BSMV:TaDSK2a-2重组病毒载体溶液分别涂抹接种于水原11平展的第二叶上，10min后用灭菌超纯水喷施叶面，覆保鲜膜保湿24h，之后转为22℃正常条件培养，分别得到转BSMV:TaDSK2a-1植株和BSMV:TaDSK2a-2植株。同时，部分植株接种BSMV:GFP重组病毒载体溶液，得到转BSMV:GFP植株，部分植株涂抹1×GKP Buffer，得到模拟接种植株。

上述BSMV:TaDSK2a-1重组病毒载体溶液是将体外转录的BSMV-VIGS载体α、β和γ-TaDSK2a-1经无RNase水稀释3倍后等量混合，再加入等体积的2×GKP Buffer得到的溶液。

上述BSMV:TaDSK2a-2重组病毒载体溶液是将体外转录的BSMV-VIGS载体α、β和γ-TaDSK2a-2用无RNase水稀释3倍后等体积混合，再加入等体积的2×GKP Buffer得到的溶液。

上述BSMV:GFP重组病毒载体溶液是将体外转录的BSMV-VIGS载体α、β和γ-GFP用无RNase水稀释3倍后等体积混合，再加入等体积的2×GKP Buffer得到的溶液。

上述转BSMV:TaDSK2a-1和BSMV:TaDSK2a-2的植株即为沉默TaDSK2a基因的小麦植株，转BSMV:GFP的植株即为阴性对照植株，涂抹1×GKP Buffer的模拟接种植株即为空白对照植株。

4、沉默TaDSK2a基因小麦的RT-PCR验证

BSMV-VIGS系统沉默TaDSK2a基因效果的具体检测方法如下：将上述步骤(3)获得的转BSMV:TaDSK2a-1植株和BSMV:TaDSK2a-2植株、转BSMV:GFP植株及模拟接种植株(Mock)在正常条件下培养10天后，取第三叶提取总RNA，反转录后通过定量PCR检测TaDSK2a基因的相对表达量，设置TaEF-1α为内参基因，相对表达量通过ΔΔCT法计算得到，由ABI7500型荧光定量PCR仪自带计算公式计算。

检测TaDSK2a相对表达量的定量PCR引物对为QTaDSK2a-F和QTaDSK2a-R，检测内参基因TaEF-1α的定量PCR引物对为qTaEF-F和qTaEF-R。

QTaDSK2a-F：5’-ACAGCTTGGCCAAAATCAACC-3’；

QTaDSK2a-R：5’-GTTGCGTTGCATAGAGTTCCTCC-3’。

qTaEF-F：5’-TGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGT-3’；

qTaEF-R：5’-ACTCATGGTGCATCTCAACGGACT-3’。

引物对QTaDSK2a-F和QTaDSK2a-R可以同时检测TaDSK2a-1A、TaDSK2a-1B和TaDSK2a-1D三个基因的相对表达量。

TaDSK2a基因的相对表达量的检测结果如图1所示。从图可以看出，与转BSMV植株以及Mock植株相比，转BSMV:TaDSK2a-1和转BSMV:TaDSK2a-2植株中TaDSK2a基因的相对表达量较阴性对照植株(BSMV:GFP)和空白对照植株(Mock)都极显著地降低了，说明本实验所选择的两个沉默片段TaDSK2a-1和TaDSK2a-2都是有效的。

二、TaDSK2a基因沉默植株的条锈病抗性分析

将有效沉默了TaDSK2a基因表达的植株(BSMV:TaDSK2a-1和BSMV:TaDSK2a-2)、阴性对照植株(BSMV:GFP)，以及空白对照植株(Mock)在第三叶展开后(约14天龄)接种条锈病菌菌系CYR17(收集新鲜小麦条锈病菌夏孢子0.1g，放于培养皿中加入50ml清水，并加入25μl吐温20，用玻璃棒轻轻搅拌，后导入喷壶中，摇匀，配成孢子悬浮液。用喷壶将配好的孢子悬浮液在上述处理的小麦叶片上均匀喷雾接种。避光保湿24小时后放置在22℃培养室中进行条锈病培养)，接种14天后观察第三叶发病情况。

结果如图2所示。模拟接种的空白对照植株(Mock)的叶片没有任何症状，反应型为0级，有部分细胞坏死。转BSMV:GFP的阴性对照植株叶片可见明显的病毒过敏反应(HR)斑，但没有孢子产生，反应型为0-0；级。而TaDSK2a基因沉默效果明显的转BSMV:TaDSK2a-1植株和转BSMV:TaDSK2a-2植株没有明显的HR反应，出现大量的条锈病菌孢子堆，反应型为3-4级，呈高感表型。

以上结果表明TaDSK2a基因表达量的降低使得水原11对条锈病菌菌系CYR17的抗性完全丧失，沦为高感。由此证明TaDSK2a是一个参与小麦抗条锈病反应过程的重要基因。

实施例3、利用农杆菌介导的转基因方法验证TaDSK2a基因的抗条锈病功能

一、TaDSK2a基因过表达植株的获得

1、TaDSK2a基因过表达载体引物设计和载体构建

为验证TaDSK2a基因在小麦抗条锈病中的功能，本发明以玉米泛素启动子(UBi1)驱动(pLGY-02中自带的启动子)，将TaDSK2a-1D基因构建至pLGY-02载体。设计过表达载体引物OETaDSK2a-F和OETaDSK2a-R。

OETaDSK2a-F：5’-CTAGAGGATCCCCGGGTACC-ATGGGCGGAGCAGGCGACGGCGAGG-3’；

OETaDSK2a-R：5’-GCTCTCTAGAACTAGT-CTACTGGCCAAAGTTCCCGAGAAG-3’。

PCR反应体系：实施例1中得到的SEQ ID No.6序列产物DNA 0.5μL(<0.5μg)，dNTP(2.5mM)4μl，OETaDSK2a-F(10μM)1μl，OETaDSK2a-R(10μM)1μl，5×TransStartFastPfuBuffer 10μl，TransStartFastPfu DNA Polymerase 1μl(2.5U)，最后用水补足至50μl。PCR反应程序：95℃预变性2min；然后95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸5min。扩增产物OEDSK2a(与SEQ ID No.6序列一致)于冰上放置备用。

pLGY-02质粒预先利用KpnI和SpeI限制性内切酶进行酶切线性化：5μL

buffer，2μg pLGY-02载体质粒，1μL KpnI和1μL SpeI(20U/μL)，加ddH₂O至50μL，混合均匀，于37℃反应30min，加入10μL 6×Gel loading dye终止反应；用1％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化；利用诺唯赞(Vazyme，货号：C115)一步法重组试剂盒进行重组连接：1μl上述酶切回收后的线性化pLGY-02，4μl上述全长片段OEDSK2a，50℃反应5min，构建成基因过表达载体pLGY-02-DSK2a。

重组表达载体pLGY-02-DSK2a经测序可知其结构描述为：将SEQ ID No.6所示DNA片段插入到pLGY-02载体的酶切位点KpnI和SpeI之间后所得重组质粒。

2、TaDSK2a过表达植株的获得

将步骤1构建的基因过表达载体质粒pLGY-02-DSK2a转化至农杆菌菌株EHA105，用以侵染普通小麦品种Fielder的幼胚。小麦幼胚经愈伤组织诱导和分化培养，同时用潮霉素进行筛选获得了再生植株，通过实时荧光定量PCR鉴定(实施例2，步骤一，步骤4)，获得T0代阳性植株，在阳性植株中有3个株系OEDSK2a-T0-L11、OEDSK2a-T0-L13和OEDSK2a-T0-L16中TaDSK2a的表达较高，同时确定了一个阴性植株OEDSK2a-T0-L8(Null)。因此这四个系用于后续的研究分析。转化过程由济南邦地生物工程有限公司完成，公众可商业化联系该平台完成转化。将获得的T0代突变株系，移栽到营养土中进行常规培养。T0代植株经自交1次获得T0代TaDSK2a基因过表达植株的种子。

二、TaDSK2a基因过表达植株的抗条锈病鉴定

1、荧光定量PCR检测TaDSK2a基因过表达植株中TaDSK2a基因的表达

将上述步骤一中获得的T0代种子，分别播种于10cm方形花盆中，对生长7天左右的T1代过表达株系及对照株系，剪取叶片，按照实施例1和实施例2中的方法，进行RNA提取、RNA反转录和荧光定量PCR，检测TaDSK2a基因的相对表达量(实施例2，步骤一，步骤4)。定量PCR检测结果如图3所示，与空白对照相比，TaDSK2a基因的表达量在T1代过表达植株中显著提高。

2、TaDSK2a基因过表达植株条锈病抗性检测

对生长10天左右的Fielder野生型、TaDSK2a基因过表达植株及其Null株系进行条锈菌菌系CYR33的接菌(同实施例2步骤二)，14天后观察叶片表型。大量接菌鉴定结果如图4所示。对照植株叶片上有大量条锈菌孢子的出现，TaDSK2a基因过表达T1代株系出现大量坏死，只有少量条锈菌孢子出现。TaDSK2a基因过表达使感条锈病的小麦品种Fielder对毒性条锈菌小种CYR33的侵染由3-4级变为2级。

以上结果表明，在小麦中过量表达TaDSK2a基因，使小麦品种Fielder由感条锈菌系CYR33转为中抗条锈菌系CYR33。由此证明小麦TaDSK2a基因参与小麦对条锈病的抗性过程，对小麦抗性育种具有利用价值。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> TaDSK2a蛋白在调控小麦抗条锈病中的应用

<130> GNCLN200094

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 568

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Gly Gly Ala Gly Asp Gly Glu Gly Ala Gly Ser Glu Ser Pro Pro

1 5 10 15

Ser Gly Ala Arg Ala Thr Leu Asn Ile Arg Cys Ala Asn Gly Ala Lys

20 25 30

Phe Thr Leu Gln Ala Asp Leu Gly Glu Thr Val Gly Ala Phe Lys Glu

35 40 45

Ala Val Ala Ala Ser Cys Asp Val Pro Ala Pro Gln Gln Arg Leu Ile

50 55 60

Tyr Lys Gly Arg Ile Leu Lys Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ser Tyr Gly

65 70 75 80

Val Glu Thr Asp His Thr Ile His Leu Val Arg Gly Val Ala Gln Pro

85 90 95

Ala Ala Ser Gly Ala Pro Ala Ala Ser Ser Pro Gln Ala Ser Thr Thr

100 105 110

Pro Thr Ser Gly Pro Ala Gly Gly Leu Gly Gly Leu Phe Pro Gly Leu

115 120 125

Gly Ala Thr Gly Ala Ala Ser Gly Arg Pro Ala Gly Leu Phe Gly Ala

130 135 140

Gly Leu Pro Glu Leu Asp Gln Met Gln Gln Gln Leu Ser Gln Asn Pro

145 150 155 160

Asn Leu Met Arg Glu Ile Met Asn Met Pro Met Met Gln Ser Leu Met

165 170 175

Asn Asn Pro Asp Leu Ile Arg Asn Met Ile Met Asn Asn Pro Gln Met

180 185 190

Arg Asp Ile Ile Asp Arg Asn Pro Asp Leu Ala His Val Leu Asn Asp

195 200 205

Pro Ser Val Leu Arg Gln Thr Leu Glu Ala Ala Arg Asn Pro Glu Ile

210 215 220

Met Arg Glu Met Met Arg Asn Thr Asp Arg Ala Met Ser Asn Ile Glu

225 230 235 240

Ala Ser Pro Glu Gly Phe Asn Met Leu Arg Arg Met Tyr Glu Thr Val

245 250 255

Gln Glu Pro Phe Leu Asn Ala Thr Thr Met Gly Gly Gly Gly Glu Gly

260 265 270

Thr Pro Ala Ser Asn Pro Phe Ala Ala Leu Leu Gly Asn Gln Gly Pro

275 280 285

Asn Gln Ala Gly Asn Ala Ala Thr Asn Ala Pro Ile Thr Gly Pro Glu

290 295 300

Ser Thr Thr Gly Thr Pro Val Pro Asn Thr Asn Pro Leu Pro Asn Pro

305 310 315 320

Trp Ser Asn Asn Ala Gly Gly Ala Gln Gly Thr Pro Arg Ser Gly Pro

325 330 335

Ala Ala Ser Thr Arg Ala Gly Ala Thr Gly Gly Pro Gly Gly Leu Gly

340 345 350

Ser Ala Asp Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gly Leu Gly Gly Asn Ala Arg

355 360 365

Thr Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser Ala Asp Leu Gly

370 375 380

Ser Met Leu Gly Gly Pro Pro Asp Ala Ala Leu Leu Ser Gln Met Leu

385 390 395 400

Gln Asn Pro Ala Met Met Gln Met Met Gln Asn Ile Met Ser Asp Pro

405 410 415

Gln Ser Met Asn Gln Leu Leu Ser Met Asn Pro Asn Ala Arg Ser Leu

420 425 430

Met Glu Ser Asn Thr Gln Leu Arg Asp Met Phe Gln Asn Pro Glu Phe

435 440 445

Leu Arg Gln Met Ala Ser Pro Glu Ala Leu Gln Gln Leu Leu Ser Leu

450 455 460

Gln Gln Thr Met Ser Ser Gln Leu Gly Gln Asn Gln Pro Ser Gln Ala

465 470 475 480

Gly Asn Leu Gly Gly Asn Gly Thr Gly Thr Arg Gly Asn Val Gly Leu

485 490 495

Asp Thr Leu Met Gly Met Leu Ser Gly Leu Gly Ala Gly Gly Gly Leu

500 505 510

Gly Val Pro Asn Ala Ser Asn Val Pro Pro Glu Glu Leu Tyr Ala Thr

515 520 525

Gln Leu Gly Gln Leu Gln Glu Met Gly Phe Phe Asp Thr Ala Glu Asn

530 535 540

Ile Arg Ala Leu Met Ala Thr Ser Gly Asn Val His Ala Ala Val Glu

545 550 555 560

Arg Leu Leu Gly Asn Phe Gly Gln

565

<210> 2

<211> 564

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Gly Gly Ala Gly Asp Gly Glu Gly Ala Gly Ser Glu Ser Pro Pro

1 5 10 15

Ser Gly Ala Arg Ala Thr Leu Asn Ile Arg Cys Ala Asn Gly Ala Lys

20 25 30

Phe Thr Leu Gln Ala Asp Leu Gly Glu Thr Val Gly Ala Phe Lys Glu

35 40 45

Val Val Ala Gly Ser Cys Asp Val Pro Ala Pro Gln Gln Arg Leu Ile

50 55 60

Tyr Lys Gly Arg Ile Leu Lys Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ser Tyr Gly

65 70 75 80

Val Glu Thr Asp His Thr Ile His Leu Val Arg Gly Val Ala Gln Pro

85 90 95

Ala Ala Ser Gly Ala Pro Ala Ala Ala Ser Pro Gln Ala Ser Thr Thr

100 105 110

Pro Thr Ser Gly Pro Ala Gly Gly Leu Gly Gly Leu Phe Pro Gly Leu

115 120 125

Gly Ala Thr Gly Ala Ala Ser Gly Arg Pro Ala Gly Leu Phe Gly Ala

130 135 140

Gly Leu Pro Glu Leu Asp Gln Met Gln Gln Gln Leu Ser Gln Asn Pro

145 150 155 160

Asn Leu Met Arg Glu Ile Met Asn Met Pro Met Met Gln Ser Leu Met

165 170 175

Asn Asn Pro Asp Leu Ile Arg Asn Met Ile Met Asn Asn Pro Gln Met

180 185 190

Arg Asp Ile Ile Asp Arg Asn Pro Asp Leu Ala His Val Leu Asn Asp

195 200 205

Pro Ser Val Leu Arg Gln Thr Leu Glu Ala Ala Arg Asn Pro Glu Ile

210 215 220

Met Arg Glu Met Met Arg Asn Thr Asp Arg Ala Met Ser Asn Ile Glu

225 230 235 240

Ala Ser Pro Glu Gly Phe Asn Met Leu Arg Arg Met Tyr Glu Thr Val

245 250 255

Gln Glu Pro Phe Leu Asn Ala Thr Thr Met Gly Gly Gly Gly Glu Gly

260 265 270

Thr Pro Ala Ser Asn Pro Phe Ala Ala Leu Leu Gly Asn Gln Gly Pro

275 280 285

Asn Gln Ala Gly Asn Ala Ala Thr Asn Ala Pro Thr Thr Gly Pro Glu

290 295 300

Ser Thr Thr Gly Thr Pro Val Pro Asn Thr Asn Pro Leu Pro Asn Pro

305 310 315 320

Trp Ser Asn Asn Ala Gly Gly Ala Gln Gly Thr Pro Arg Ser Gly Pro

325 330 335

Ala Ala Ser Thr Arg Ala Gly Ala Thr Gly Gly Pro Gly Gly Leu Gly

340 345 350

Ser Ala Asp Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gly Leu Gly Gly Asn Ala Arg

355 360 365

Thr Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser Ala Asp Leu Gly

370 375 380

Ser Met Leu Gly Gly Pro Pro Asp Ala Ala Leu Leu Ser Gln Met Leu

385 390 395 400

Gln Asn Pro Ala Met Met Gln Met Met Gln Asn Ile Met Ser Asp Pro

405 410 415

Gln Ser Met Asn Gln Leu Leu Ser Met Asn Pro Asn Ala Arg Ser Leu

420 425 430

Met Glu Ser Asn Thr Gln Leu Arg Asp Met Phe Gln Asn Pro Glu Phe

435 440 445

Leu Arg Gln Met Ala Ser Pro Glu Ala Leu Gln Gln Leu Leu Ser Phe

450 455 460

Gln Gln Thr Leu Ser Ser Gln Leu Gly Gln Asn Gln Pro Ser Gln Ala

465 470 475 480

Gly Asn Leu Gly Gly Asn Gly Thr Gly Thr Arg Gly Asn Val Gly Leu

485 490 495

Asp Thr Leu Met Gly Met Leu Ser Gly Leu Gly Ala Gly Gly Gly Leu

500 505 510

Gly Val Pro Asn Ala Ser Asn Val Pro Pro Glu Glu Leu Tyr Ala Thr

515 520 525

Gln Leu Gly Gln Leu Gln Glu Met Gly Phe Phe Asp Thr Ala Glu Asn

530 535 540

Ile Arg Ala Leu Met Ala Thr Ser Gly Asn Val His Ala Ala Val Lys

545 550 555 560

Gly Gln Phe Val

<210> 3

<211> 564

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Met Gly Gly Ala Gly Asp Gly Glu Gly Ala Gly Ser Glu Ser Pro Pro

1 5 10 15

Ser Gly Ala Arg Ala Thr Leu Asn Ile Arg Cys Ala Asn Gly Ala Lys

20 25 30

Phe Thr Leu Gln Ala Asp Leu Gly Glu Thr Val Gly Ala Phe Lys Glu

35 40 45

Val Val Ala Gly Ser Cys Asp Val Pro Ala Pro Gln Gln Arg Leu Ile

50 55 60

Tyr Lys Gly Arg Ile Leu Lys Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ser Tyr Gly

65 70 75 80

Val Glu Thr Asp His Thr Ile His Leu Val Arg Gly Val Ala Gln Pro

85 90 95

Ala Ala Ser Gly Ala Pro Ala Ala Ala Ser Pro Gln Ala Ser Thr Thr

100 105 110

Pro Thr Ser Gly Pro Ala Gly Gly Leu Gly Gly Leu Phe Pro Gly Leu

115 120 125

Gly Ala Thr Gly Ala Ala Ser Gly Arg Pro Ala Gly Leu Phe Gly Ala

130 135 140

Gly Leu Pro Glu Leu Asp Gln Met Gln Gln Gln Leu Ser Gln Asn Pro

145 150 155 160

Asn Leu Met Arg Glu Ile Met Asn Met Pro Met Met Gln Ser Leu Met

165 170 175

Asn Asn Pro Asp Leu Ile Arg Asn Met Ile Met Asn Asn Pro Gln Met

180 185 190

Arg Asp Ile Ile Asp Arg Asn Pro Asp Leu Ala His Val Leu Asn Asp

195 200 205

Pro Ser Val Leu Arg Gln Thr Leu Glu Ala Ala Arg Asn Pro Glu Ile

210 215 220

Met Arg Glu Met Met Arg Asn Thr Asp Arg Ala Met Ser Asn Ile Glu

225 230 235 240

Ala Ser Pro Glu Gly Phe Asn Met Leu Arg Arg Met Tyr Glu Thr Val

245 250 255

Gln Glu Pro Phe Leu Asn Ala Thr Thr Met Gly Gly Gly Gly Glu Gly

260 265 270

Thr Pro Ala Ser Asn Pro Phe Ala Ala Leu Leu Gly Asn Gln Gly Pro

275 280 285

Asn Gln Ala Gly Asn Ala Pro Thr Thr Gly Pro Glu Ser Thr Thr Gly

290 295 300

Thr Pro Val Pro Asn Thr Asn Pro Leu Pro Asn Pro Trp Ser Asn Asn

305 310 315 320

Ala Gly Gly Ala Gln Gly Thr Thr Arg Ser Gly Pro Ala Ala Ser Pro

325 330 335

Arg Ala Gly Ala Thr Gly Gly Pro Gly Gly Leu Gly Ser Ala Asp Leu

340 345 350

Ser Ser Leu Leu Gly Gly Leu Gly Gly Asn Ala Arg Thr Gly Ala Ala

355 360 365

Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser Ala Asp Leu Gly Ser Met Leu Gly

370 375 380

Gly Pro Pro Asp Ala Ala Leu Leu Ser Gln Met Leu Gln Asn Pro Ala

385 390 395 400

Met Met Gln Met Met Gln Asn Ile Met Ser Asp Pro Gln Ser Met Asn

405 410 415

Gln Leu Leu Ser Met Asn Pro Asn Ala Arg Ser Leu Met Glu Ser Asn

420 425 430

Thr Gln Leu Arg Asp Met Phe Gln Asn Pro Glu Phe Leu Arg Gln Met

435 440 445

Ala Ser Pro Glu Ala Leu Gln Gln Leu Leu Ser Phe Gln Gln Thr Leu

450 455 460

Ser Ser Gln Leu Gly Gln Asn Gln Pro Ser Gln Ala Gly Asn Leu Gly

465 470 475 480

Gly Asn Gly Thr Gly Thr Arg Gly Asn Val Gly Leu Asp Thr Leu Met

485 490 495

Gly Met Leu Ser Gly Leu Gly Ala Gly Gly Gly Leu Gly Val Pro Asn

500 505 510

Ala Ser Asn Val Pro Pro Glu Glu Leu Tyr Ala Thr Gln Leu Gly Gln

515 520 525

Leu Gln Glu Met Gly Phe Phe Asp Thr Ala Glu Asn Ile Arg Ala Leu

530 535 540

Met Ala Thr Ser Gly Asn Val His Ala Ala Val Glu Arg Leu Leu Gly

545 550 555 560

Asn Phe Gly Gln

<210> 4

<211> 1707

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

atgggcggag caggcgacgg cgagggggcc gggagcgagt ccccgccctc gggggcgcgg 60

gcgacgctca acatccggtg cgccaacggc gccaagttca ccctgcaggc ggacctgggc 120

gagacggtcg gggcgttcaa ggaggccgtg gccgccagct gcgacgtgcc ggcgccgcag 180

cagcgcctga tctacaaggg ccggatcctc aaggacgagc aaaccctaga aagctacggt 240

gttgagacag atcacaccat tcacttggtg cgaggcgttg cccaaccagc agcatcagga 300

gcacctgctg catcaagccc ccaagcttca actactccta ccagtggccc tgcaggtggt 360

cttggaggct tatttccagg ccttggtgct actggagctg ctagtggcag gccagcaggt 420

ttatttgggg ctggacttcc ggaattagat caaatgcagc aacagttgag ccagaatccc 480

aaccttatga gggagataat gaacatgcca atgatgcaga gtctcatgaa taaccctgat 540

ctaatacgca atatgattat gaataatcca caaatgcgtg atattattga tcggaatcca 600

gatcttgccc atgtcctcaa tgaccctagt gttctccgcc agacccttga agctgcaaga 660

aaccctgaaa ttatgaggga gatgatgcgg aacacagaca gagcaatgag caacattgaa 720

gcttcccctg aagggtttaa tatgctccgg cgtatgtatg aaactgtaca ggagcctttt 780

cttaatgcaa caacaatggg agggggtggg gaaggcaccc cggcctctaa cccgtttgca 840

gctcttcttg gaaatcaggg gcctaaccaa gccggcaatg ctgctacaaa tgctccaatt 900

accggcccag agtccacaac aggaacccct gttccaaata ctaatccact tccaaacccc 960

tggagcaaca atgctggggg tgcgcaagga acaccacggt caggtcctgc tgctagtacc 1020

agggctggtg caactggtgg cccaggaggg ctgggttcag cagatttgag cagcctgctc 1080

ggtggtcttg gtgggaatgc aagaactggt gctgcaggtg gtctaggagg gttgggttca 1140

gcagatttgg ggagtatgct tggtggtcca cctgatgctg ctcttttgag tcagatgctg 1200

caaaaccctg ctatgatgca gatgatgcag aacattatgt ctgacccaca gtcaatgaac 1260

cagttgctta gcatgaaccc aaatgcacgc agcctgatgg agtcaaacac tcagttgagg 1320

gatatgttcc aaaacccaga atttcttcgc cagatggcat ccccagaggc tttgcagcaa 1380

ttactctcat tacagcagac aatgtcatca cagcttggcc aaaatcaacc tagccaggct 1440

ggtaacctag gaggcaatgg cacaggcacg cggggaaatg ttggtctgga caccttgatg 1500

ggcatgctta gtgggcttgg tgctggaggt ggcttaggtg taccaaatgc ctccaatgtg 1560

ccaccggagg aactctatgc aacgcaactt ggccagctcc aagaaatggg gttctttgac 1620

accgcagaga atattcgggc actgatggcc acttctggga acgtacatgc tgctgtggag 1680

cgccttctcg ggaactttgg ccagtag 1707

<210> 5

<211> 1695

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

atgggcggag caggcgacgg cgagggggcc gggagcgagt ccccgccctc gggggcgcgg 60

gcgacgctca acatccggtg cgccaacggc gccaagttca ccctgcaggc cgacctgggc 120

gagacggtcg gggcgttcaa ggaggtcgtg gccgggagct gcgacgtgcc ggcgccgcag 180

cagcgcctga tctacaaggg ccggatcctc aaggacgagc aaaccctaga aagctacggt 240

gttgagacag atcacaccat tcacttggtg cgaggcgttg cccaaccagc agcatcagga 300

gcacctgctg cagcaagccc ccaagcttca accactccta ccagtggccc tgcaggtggt 360

cttggaggct tatttccagg ccttggtgct actggagctg ctagtggcag gccagcaggt 420

ttatttgggg ctggacttcc ggaattagat caaatgcagc aacagttgag ccagaatccc 480

aaccttatga gggagataat gaacatgcca atgatgcaga gcctcatgaa taaccctgat 540

ctaatacgca atatgattat gaataatcca caaatgcgtg atattattga tcggaatcca 600

gatcttgccc atgtcctcaa tgatcctagt gttctccgcc agacccttga agctgcaaga 660

aaccctgaaa ttatgaggga gatgatgcgg aacacagaca gagcaatgag caacatcgaa 720

gcttcccctg aagggtttaa tatgctccgg cgtatgtatg aaactgtaca ggagcctttt 780

cttaatgcaa caacaatggg agggggtggg gaaggcaccc cggcctctaa cccgtttgca 840

gctcttcttg gaaatcaggg gcctaaccaa gccggcaatg ctgctacaaa tgctccaact 900

accggcccag agtccacaac aggaacccct gttccaaata ctaatccact tccaaacccc 960

tggagcaaca acgctggggg tgcgcaagga acaccacggt caggtcctgc tgctagtacc 1020

agggctggtg caactggagg cccaggaggg ctgggttcag cagatttgag cagcctgctc 1080

ggtggtcttg gtgggaatgc aagaactggt gctgcaggtg gtctaggagg gttgggttca 1140

gcagatttgg ggagtatgct tggtggtcca cctgatgctg ctcttttgag tcagatgctg 1200

caaaaccctg ctatgatgca gatgatgcag aacattatgt ctgacccaca gtcaatgaac 1260

cagttgctta gcatgaaccc aaatgcacgt agcctgatgg agtcaaacac tcagttgagg 1320

gatatgttcc aaaacccaga atttcttcgc cagatggcat ccccagaggc tttgcagcaa 1380

ttactctcat tccagcagac actgtcatca cagcttggcc aaaatcaacc tagccaggct 1440

ggtaacctag gaggcaatgg cacaggcacg cggggaaatg ttggcctgga caccttgatg 1500

ggcatgctta gtgggcttgg tgctggaggt ggcttaggtg taccaaatgc ctccaatgtg 1560

ccaccggagg aactctatgc aacgcaactc ggccagctcc aagaaatggg gttcttcgac 1620

accgcagaga atatccgggc gctgatggcc acttctggga acgtacatgc tgctgtgaag 1680

ggccaattcg tttaa 1695

<210> 6

<211> 1695

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

atgggcggag caggcgacgg cgagggggcc gggagcgagt ccccgccctc gggcgcgcgg 60

gcgacgctca acatccggtg cgccaacggc gccaagttca ccctgcaggc ggacctgggc 120

gagacggtcg gggcgttcaa ggaggtcgtg gccgggagct gcgacgtgcc ggcgccgcag 180

cagcgcctga tctacaaggg ccggatcctc aaggacgagc aaaccctaga aagctacggt 240

gttgagacag atcacaccat tcacttggtg cgaggcgttg cccaaccagc agcatcagga 300

gcacctgctg cagcaagccc ccaagcttca actactccta ccagtggccc tgcaggtggt 360

cttggaggct tatttccagg ccttggtgct actggagctg ctagtggcag gccagcaggt 420

ttatttgggg ctggacttcc ggaattagat caaatgcagc aacagttgag ccagaatccc 480

aaccttatga gggagataat gaacatgcca atgatgcaga gtctcatgaa taaccctgat 540

ctaatacgca atatgattat gaataatcca caaatgcgtg atattattga tcggaatcca 600

gatcttgccc atgtcctcaa tgatcctagt gttctccgcc agacccttga agctgcaaga 660

aaccctgaaa ttatgaggga gatgatgcgg aacacagaca gagcaatgag caacatcgaa 720

gcttcccctg aagggtttaa tatgctccgg cgtatgtatg aaactgtaca ggagcctttt 780

cttaatgcaa caacaatggg agggggtggg gaaggcaccc cggcctctaa cccgtttgca 840

gctcttcttg gaaatcaggg gcctaaccaa gccggcaatg ctccaactac cggcccagag 900

tccacaacag gaacccctgt tccaaatact aatccacttc caaacccctg gagcaacaat 960

gctgggggtg cgcaaggaac aacacggtca ggtcctgctg ctagtcccag ggctggtgca 1020

actggtggcc caggagggct gggttcagca gatttgagca gcctgctcgg tggtcttggt 1080

gggaatgcaa gaactggtgc tgcaggtggt ctaggagggt tgggttcagc agatttgggg 1140

agtatgcttg gtggtccacc tgatgctgct cttttgagtc agatgctgca aaaccctgct 1200

atgatgcaga tgatgcagaa cattatgtct gacccacagt caatgaacca gttgcttagc 1260

atgaacccaa atgcacgtag cctgatggag tcaaacactc agttgaggga tatgttccaa 1320

aacccagaat ttcttcgcca gatggcatcc ccagaggctt tgcagcaatt actctcattc 1380

cagcagacac tgtcatcaca gcttggccaa aatcaaccta gccaggctgg taacctaggg 1440

ggcaatggca caggcacgcg gggaaatgtt ggcctggaca ccttgatggg catgcttagt 1500

gggcttggtg ctggaggtgg cttaggtgta ccaaatgcct ccaatgtgcc accggaggaa 1560

ctctatgcaa cgcaactcgg ccagctccaa gaaatggggt tcttcgacac tgcagagaat 1620

atccgggcac tgatggccac ttctgggaac gtacatgctg ctgtggagcg ccttctcggg 1680

aactttggcc agtag 1695

Claims

1.TaDSK2a蛋白或其相关生物材料在调控植物对条锈病抗性中的应用；

所述TaDSK2a蛋白为TaDSK2a-1A蛋白、TaDSK2a-1B蛋白和/或TaDSK2a-1D蛋白；

所述TaDSK2a-1A蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述TaDSK2a-1B蛋白为如下任一所示蛋白质：

(B1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

(B4)在(B1)-(B3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述TaDSK2a-1D蛋白为如下任一所示蛋白质：

(D1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述TaDSK2a蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量降低，植物对条锈病抗性降低；所述TaDSK2a蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物对条锈病抗性提高。

3.一种培育对条锈病抗性提高的植物品种的方法，包括使受体植物中TaDSK2a蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

所述TaDSK2a-1A蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述TaDSK2a-1B蛋白为如下任一所示蛋白质：

(B1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

所述TaDSK2a-1D蛋白为如下任一所示蛋白质：

(D1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；

4.一种培育对条锈病抗性降低的植物品种的方法，包括使受体植物中TaDSK2a蛋白的表达量和/或活性降低的步骤；

所述TaDSK2a-1A蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述TaDSK2a-1B蛋白为如下任一所示蛋白质：

(B1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

所述TaDSK2a-1D蛋白为如下任一所示蛋白质：

(D1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；

5.一种培育对条锈病抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达TaDSK2a蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对条锈病抗性提高；

所述TaDSK2a-1A蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述TaDSK2a-1B蛋白为如下任一所示蛋白质：

(B1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

所述TaDSK2a-1D蛋白为如下任一所示蛋白质：

(D1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；

6.一种培育对条锈病抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中能够表达TaDSK2a蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对条锈病抗性降低；

所述TaDSK2a-1A蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述TaDSK2a-1B蛋白为如下任一所示蛋白质：

(B1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

所述TaDSK2a-1D蛋白为如下任一所示蛋白质：

(D1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；

7.根据权利要求1-5中任一所述的应用或方法，其特征在于：能够表达所述TaDSK2a-1A蛋白的核酸分子或所述TaDSK2a-1A蛋白的编码基因为如下(a1)-(a3)中任一所述的DNA分子：

(a1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述TaDSK2a-1A蛋白的DNA分子；

能够表达所述TaDSK2a-1B蛋白的核酸分子或所述TaDSK2a-1B蛋白的编码基因为如下(b1)-(b3)中任一所述的DNA分子：

(b1)SEQ ID No.5所示的DNA分子；

(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述TaDSK2a-1B蛋白的DNA分子；

能够表达所述TaDSK2a-1D蛋白的核酸分子或所述TaDSK2a-1D蛋白的编码基因为如下(d1)-(d3)中任一所述的DNA分子：

(d1)SEQ ID No.6所示的DNA分子；

8.根据权利要求2-6中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述对条锈病抗性提高体现为：提高受体植物中所述TaDSK2a蛋白的表达量和/或活性后，植株上的条锈病菌孢子数增多；

所述对条锈病抗性降低体现为：降低受体植物中所述TaDSK2a蛋白的表达量和/或活性后，植株上的条锈病菌孢子数减少。

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述条锈病为由条锈病菌生理小种CYR17和/或CYR33引起的条锈病；

所述条锈病菌为条锈病菌生理小种CYR17和/或CYR33。

10.根据权利要求1-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物；

进一步地，所述单子叶植物为禾本科植物；

更进一步地，所述禾本科植物为小麦。