CN104164450A - 泛素受体蛋白OsDSK2b在提高植物耐逆性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种泛素受体蛋白OsDSK2b在提高植物耐逆性中的应用。本发明的基因转化水稻可显著提高水稻对干旱、盐胁迫的耐受性。本发明的蛋白及其编码基因对于提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，在植物的耐逆基因工程改良中具有广阔的应用前景。

Description

泛素受体蛋白OsDSK2b在提高植物耐逆性中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及泛素受体蛋白及其在提高植物耐逆性中的应用。

背景技术

干旱与盐害严重影响作物的生长发育、高产与稳产、限制品种的生态分布。随着社会经济发展、人口增加及自然气候条件的恶化，水资源短缺、土壤次生盐渍化的趋势将日益加剧，特别是我国可耕地中有5-6亿亩盐渍化土地，造成我国西部和沿海滩涂等土壤资源难以有效利用。我国是一个旱灾多发性国家、且淡水资源不足世界人均水平的四分之一，常年平均受旱面积达3亿多亩，我国北方主要粮食产区每年因缺水减产700－800亿公斤。据估算，盐碱、干旱对作物产量的影响达50%，因而，干旱和盐碱已成为农作物产量和质量下降的主要环境因素。

由于灌溉方式不当，水稻稻田盐渍化加剧，而水稻作为我国重要的粮食作物，用水量占农业用水量的70%；随着水资源匮乏及频发性季节性干旱，加剧了缺水/干旱条件下高盐危害，高盐/干旱协同胁迫已成为影响水稻高产、稳产的重要限制因子。为了提高水稻的耐盐性和耐旱性，传统的育种手段对于作物的耐逆性改良虽有一定效果，但由于其选育周期长且性状表型预见性差；而通过生物技术培育耐逆性水稻品种可以按照预先的设计对特定基因进行改造和转移，能使育种过程更为精确、更有预见性、效率更高，因而更具发展潜力，成为新品种培育的重要途径。因此，挖掘水稻的抗逆性潜力、充分利用耐逆基因资源培育耐逆的水稻品种，已成为我国粮食生产可持续发展的重要举措。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是通过基因重组获得植物耐逆性提高的植物。

本发明提供的技术方案是：一种泛素受体蛋白OsDSK2b在提高植物耐逆性中的应用。

本发明提供的蛋白质（OsDSK2b蛋白），来自粳稻品种日本晴（Japonica rice Oryza sativa cv. Nipponbare），是可以分离的、合成的或重组的多肽，其包括：

a)    SEQ ID NO:1所示序列；b) SEQ ID NO:1的序列由575个氨基酸残基组成；c) SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且与水稻株高性状相关的由SEQ ID NO:1序列衍生的多肽。

本发明提供所述蛋白的基因（OsDSK2b基因）可以是分离的、合成的或重组的DNA分子，其包括：

a)    cDNA序列如SEQ ID NO:2所示序列或基因组DNA序列如SEQ ID NO:3所示序列；b) SEQ ID NO:2所示的DNA分子由1728个核苷酸组成，其编码的多肽与SEQ ID NO:1所示序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽；c)与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其蛋白活性片段的序列；d)与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示序列互补的序列；e)止于遗传密码的简并性而衍生自所示序列的序列之一。

SEQ ID NO:3所示的DNA分子由4806个核苷酸组成，自5’端1-118位为5’UTR，119-383为第一外显子，384-1893为第一内含子，1894-2622为第二外显子，2623-2699为第二内含子，2700-2989为第三外显子，2990-3079为第三内含子，3080-3193为第四外显子，3194-3265为第四内含子，3266-3324为第五外显子，3325-3428为第五内含子，3429-3457为第六外显子，3458-4248为第六内含子，4249-4341为第七外显子，4342-4415为第七内含子，4416-4564为第八外显子，4565-4806为3’UTR。

为了使上述蛋白质便于纯化，可在上述多肽的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的一个或几个标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag Ⅱ	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述多肽可以是人工合成的，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述多肽也可通过将SEQ ID NO:2所示序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5’端或3’端连上表1所示的标签的编码序列得到。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明提供的OsDSK2b含有典型的类泛素（UBL, Ubiquitin like）结构域和泛素结合（UBA, Ubiquitin associate）结构域，UBL结构域为第32到100氨基酸残基，UBA结构域为第533到569氨基酸残基。且OsDSK2b可在体外与K48或K63形式连接的多聚泛素链结合。

本发明的另一目的是提供一种提高植物耐逆性的方法，本发明所提供的提高植物耐逆性的方法，是将OsDSK2b蛋白的编码基因导入出发植物中，得到耐逆性高于所述出发植物的转基因植物；所述OsDSK2b蛋白由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性

在上述提高植物耐逆性的方法中，本发明中水稻与耐逆性相关的OsDSK2b基因既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列；与所述基因具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA或基因组基因序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或加强，而且在一些应用（如反义或共抑制技术）中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

本发明的一个实施例中，所述重组原核表达载体具体为将所述基因（SEQ ID No.2所示序列）插入载体pET-30a(+)的多克隆位点而获得的。

本发明的一个实施例中，所述重组植物表达载体将所述基因（SEQ ID No.2所示序列）通过SpeI和SalI酶切位点连接到pCAMBIA1307(6×Myc)载体，得到pCAMBIA1307(6×Myc)-OsDSK2b载体；所述干扰载体将人工设计的SEQ ID No.4所示的DNA片段及其反向互补序列通过pNW55中间载体连接起来，然后通过多克隆位点连接到植物表达载体pCAMBIA5300中，得到pCAMBIA5300-RNAi-OsDSK2b载体。所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

所述植物可为单子叶植物，也可为双子叶植物，如水稻等农作物。在本发明的一个实施例中，所述植物为单子叶植物水稻，具体为水稻品种日本晴。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过获得转OsDSK2b基因水稻株系以及干扰株系得到实验表型：过表达OsDSK2b能明显地提高水稻幼苗对干旱和盐胁迫的耐性，使植物在遇到干旱和盐等非生物胁迫时能正常生长，过表达转基因株系相对于野生型叶片萎蔫出现晚，经过一段时间胁迫处理后，存活率较高；干扰OsDSK2b基因使其表达降低后使水稻幼苗对干旱和盐胁迫的耐受性降低，干扰转基因株系相对于野生型叶片较早萎蔫，且存活率明显下降。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

 

附图说明

图1所示为OsDSK2b基因超表达和干扰植株中OsDSK2b基因表达检测结果。

图2所示为OsDSK2b转基因植株的耐旱性分析。

图3所示为OsDSK2b转基因植株的耐盐性分析。

图4所示为OsDSK2b蛋白的体外泛素结合特性检测结果。

 

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1：OsDSK2b超表达载体和人工microRNA干扰载体的获得

一、 OsDSK2b超表达载体pCAMBIA1307(6×Myc)-OsDSK2b的构建

从OsDSK2b基因（Gene ID: 4349264）的编码起始位点ATG开始设计5’端引物，于终止密码子前设计3’端引物：

引物1：5’-GGACTAGTATGGGCGGCGGAGGAGGCGA-3’

引物2：5'-GCGTCGACCTACTGGCCAAGATTGCCAAGA-3'

引物1中的ACTAGT序列为限制性内切酶SpeI的酶切位点，下划线标识的序列为OsDSK2b基因的编码序列；引物2中GTCGAC序列为限制性内切酶SalI的酶切位点，下划线标识的序列为OsDSK2b基因的编码序列。

以粳稻品种日本晴的cDNA为模板，用上述特异性引物进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，用限制性内切酶SpeI和SalI进行双酶切，回收酶切产物；用限制性内切酶SpeI和SalI双酶切pCAMBIA1307(6×Myc)，回收骨架载体；将所述酶切产物和所述骨架载体进行连接，然后进行测序，测序结果表明，得到了pCAMBIA1307(6×Myc)-OsDSK2b载体。

二、   OsDSK2b人工microRNA干扰载体的构建

利用OsDSK2b基因的转录本序列，在WMD3 网站（http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi）分析该基因的microRNA靶位点，然后从候选的amiRNA 中挑选出特异性较好的序列构建到中间载体pNW55 上，过程就是通过三对引物：引物Ⅰ和引物Ⅳ、引物G-4368 和引物Ⅱ、引物Ⅲ和引物G-4369，以pNW55 为模板分别扩增得到三个片段，然后以这三个片段为模板通过引物G-4368 和引物G-4369 扩增得到含有两个可以互补的microRNA 的大片段，然后通过多克隆位点连接到植物表达载体pCAMBIA5300 中，得到了pCAMBIA5300-RNAi-OsDSK2b载体。

引物Ⅰ：5’-agTAATAGTCAAATACGACACGGcaggagattcagtttga-3’

引物Ⅱ：5’-tgCCGTGTCGTATTTGACTATTActgctgctgctacagcc-3’

引物Ⅲ：5’-ctCCGTGACGTTTTTGACTATTAttcctgctgctaggctg-3’

引物Ⅳ：5’-aaTAATAGTCAAAAACGTCACGGagagaggcaaaagtgaa-3’

引物G-4368：5’- CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3’ 

引物G-4369：5’- GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’

实施例2：OsDSK2b转基因植物的获得

一、    利用电击法将重组表达载体pCAMBIA1307(6×Myc)-OsDSK2b和pCAMBIA5300-RNAi-OsDSK2b导入农杆菌AGL0，得到重组农杆菌。

二、    将含有pCAMBIA1307(6×Myc)-OsDSK2b和pCAMBIA5300-RNAi-OsDSK2b的农杆菌AGL0分别浸染日本晴水稻愈伤组织；将浸染的愈伤在无菌的滤纸上吸干，再转到共培养基上24℃暗培养2-4天；清洗的愈伤组织转到含潮霉素的选择培养基上进行抗性筛选；经选择后的抗性愈伤转到预分化培养基7-10天后再转到分化培养基因进行光照培养；待小苗长至2-4cm时转到装有生根培养基的试管中生长2-3周，生长良好的小苗经2-3天的炼苗后便可移栽至温室中（T₀代）。分别将小苗传代，得到T1代。

三、    分别取2周的野生型水稻（日本晴）和T1代水稻幼苗，提取mRNA进行反转录，获得cDNA后通过荧光定量PCR技术分析水稻中OsDSK2b的表达水平（上游引物：5’-ATTACTCTCGTTCCAGCAGACA-3’；下游引物：5’-CCTCCTTGGCTACCATCCT-3’）。将野生型水稻中OsDSK2b基因的表达量作为1，超表达株系OE45、OE46、OE47以及干扰株系RNAi8、RNAi11、RNAi13中OsDSK2b基因的表达水平如图1所示。结果表明：三个超表达株系中OsDSK2b基因的表达量是野生型水稻的1.2-1.6倍，三个干扰株系中OsDSK2b基因的表达量是野生型水稻的40%左右。

实施例3：OsDSK2b转基因植株的耐逆性分析

收获OsDSK2b的T1代转基因水稻种子，分别选取三个超表达株系（OE45、OE46、OE47）和三个干扰株系（RNAi8、RNAi11、RNAi13）进行干旱胁迫处理。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50 mg/L潮霉素进行抗性筛选，萌发3天后将幼苗移至土壤进行土培或移至96孔板进行水培，以同期生长的野生型日本晴作为对照，试验重复3次。

一、            OsDSK2b转基因植株的耐旱性分析

对生长至2周的土培苗进行干旱处理（连续8天不浇水），然后观察水稻叶片。干旱处理8 天时野生型开始出现萎蔫，而超表达株系生长正常；与之相反，干扰株系相对野生型则是先出现萎蔫，说明OsDSK2b可以提高水稻对干旱胁迫的耐受性。结果如图2所示。

二、  OsDSK2b转基因植株的耐盐性分析

选取萌发一致的种子种于剪掉底部的96孔平板上，然后将平板放于水中，12小时光照28℃/12小时黑暗23℃生长三天后，将水换成营养液，营养液包括MS培养基中的大量、微量和铁盐，对2周大小的幼苗进行盐胁迫处理（营养液中含150 mM NaCl）,处理3天后，将含盐的营养液换掉，用正常的营养液继续培养，观察叶片。盐处理后超表达株系比野生型表现更强的耐盐性，而干扰株系比野生型表现出耐盐性降低，说明OsDSK2b可以提高水稻对盐胁迫的耐受性。结果如图3所示。

实施例4：OsDSK2b蛋白体外泛素结合特性分析

一、     按实施例1中方法用引物3和引物2得到带有EcoRI和SalI酶切位点的OsDSK2a序列的片段，然后用限制性内切酶EcoRI和SalI

酶切pET-30a(+)，回收骨架，与上述片段连接，得到pET-30a(+)-OsDSK2b载体。

引物3：5'-GGAATTCATGGGCGGCGGAGGAGGCGA-3'

引物3中的GAATTC序列为限制性内切酶EcoRI的酶切位点，下划线标识的序列为OsDSK2b基因的编码序列。

二、     OsDSK2b-HIS融合蛋白的原核诱导表达

将pET-30a(+)-OsDSK2b电转化大肠杆菌BL21，将获得的阳性克隆接种于LB培养基，当其生长至OD600为0.4时，加入终浓度为0.5 μM的IPTG诱导OsDSK2b蛋白的表达，16℃，150 rpm培养6小时，收集菌体，超声破碎细胞后，得到蛋白粗提液。

三、     OsDSK2b-HIS与多聚泛素链的体外结合

1. 通过HIS 亲和层析柱填料用Bio-Rad蛋白低压层析系统纯化OsDSK2b-HIS 体外重组蛋白；

2. 取纯化的OsDSK2b-HIS重组蛋白6 μg 分别与5 μg K48 或K63 连接的Ub2-7（BOSTONBIOCHEM）混匀；

3. 用Buffer A 洗涤50 μL HIS 亲和层析柱填料，然后与上一步的蛋白混液混匀，用Buffer A 补足到500 μL 体系，室温孵育2 h；

4. 用Buffer A 洗涤三次，最后用40 μL Buffer A 重悬，加10 μL 5×loading buffer；

5. 沸水浴煮10 min，然后离心取上清进行SDS-PAGE 电泳；

6. 用anti-ubiquitin 抗体进行western blot 检测。

Buffer A:

Tris-HCl（pH7.5） 50 mM

NaCl 100 mM

Na2EDTA 1 mM

NP40 0.1%

检测结果如图4所示，OsDSK2b在体外可以与K48和K63形式连接的多聚泛素结合。

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120>泛素受体蛋白OsDSK2b在提高植物耐逆性中的应用

<160> 3

<210> 1

<211>575

<212> 氨基酸

<400> 1

 

MetGlyGlyGlyGlyGlyGluAlaGlyGlyGlyAspGlyGlyGluSerSerProAlaAla

AlaAlaAlaAlaAlaValAlaGlyAlaAlaAlaLeuHisIleArgCysAlaAsnGlySer

LysPheThrValArgAlaAspLeuAspAlaThrValGlyAlaPheLysGluValValAla

GlySerCysAspValProAlaAlaGlnGlnArgLeuIleTyrLysGlyArgIleLeuLys

AspGluGlnThrLeuGluSerTyrGlyValGluThrAspHisThrIleHisMetValArg

GlyAlaGlyProProAlaGlySerAlaAlaProAlaAlaAlaSerProGlnAlaSerAla

AlaProSerSerGlyProThrAspGlyLeuGlySerLeuPheProGlyLeuGlyGlyThr

GlyThrAlaGlyThrArgProSerGlyLeuPheGlySerGlyPheProGluLeuAspGln

MetGlnGlnGlnLeuSerGlnAsnProAsnLeuMetArgGluIleMetAsnMetProMet

MetGlnAsnLeuMetAsnAsnProAspLeuIleArgAsnMetIleMetAsnAsnProGln

MetArgAspIleIleAspArgAsnProAspLeuAlaHisValLeuAsnAspProSerVal

LeuArgGlnThrLeuGluAlaAlaArgAsnProGluIleMetArgGluMetMetArgAsn

ThrAspArgAlaMetSerAsnIleGluSerSerProGluGlyPheAsnMetLeuArgArg

MetTyrGluThrValGlnGluProPheLeuAsnAlaThrThrMetGlyGlyGluGlyAsn

ThrAlaProAsnProPheSerAlaLeuLeuGlyAsnGlnGlySerAsnGlnProArgAsp

ProAlaThrAsnAlaProAsnThrGlySerGluSerThrThrGlyThrProAlaProAsn

ThrAsnProLeuProAsnProTrpSerSerAsnAlaGlyGlyAlaGlnGlyAlaThrArg

AlaGlySerThrGlyAsnAlaArgThrGlyAlaThrGlyGlyLeuGlyGlyLeuGlySer

AlaAspLeuSerSerLeuPheGlyGlyLeuAlaGlyAsnThrGlyThrGlyAlaThrGly

GlyLeuGlyGlyLeuGlySerAlaAspLeuGlySerLeuLeuGlyGlySerProAspSer

SerSerLeuSerGlnIleLeuGlnAsnProValMetMetGlnMetMetGlnAsnIleMet

SerAspProGlnSerMetAsnGlnLeuLeuAsnPheAsnProAsnThrArgAsnLeuMet

GluSerAsnThrGlnLeuArgGluMetPheGlnAsnProGluPheIleArgGlnLeuThr

SerProGluThrMetGlnGlnLeuLeuSerPheGlnGlnThrLeuLeuSerGlnLeuGly

GlnAsnGlnProArgGlnAspGlySerGlnGlyGlyAsnAlaThrGlyMetArgGlyAsn

ValSerLeuAspThrLeuMetGlyMetLeuSerGlyLeuGlyAlaGlyGlyGlyIleGly

ValProAsnThrSerAsnValProProGluGluLeuTyrAlaThrGlnLeuThrGlnLeu

ArgGluMetGlyPheIleAspThrAlaGluAsnIleGlnAlaLeuValAlaThrAlaGly

AsnValAsnAlaAlaValGluArgLeuLeuGlyAsnLeuGlyGln

 

 

<210> 2

<211>1728

<212> DNA

<400> 2

ATGGGCGGCGGAGGAGGCGAGGCCGGGGGCGGCGACGGAGGGGAGTCCTCTCCTGCTGCGGCTGCGGCGGCGGCGGTGGCGGGGGCCGCGGCGCTGCACATCCGGTGCGCGAACGGGTCCAAGTTCACCGTGCGGGCCGACCTCGACGCCACGGTGGGGGCGTTCAAGGAGGTGGTGGCGGGGAGCTGCGACGTGCCGGCGGCGCAGCAGCGCCTGATCTACAAGGGCCGGATCCTCAAGGACGAGCAAACCCTAGAAAGCTATGGTGTTGAAACAGATCATACCATTCATATGGTGCGTGGCGCTGGTCCCCCAGCCGGATCAGCTGCACCTGCTGCAGCCAGCCCCCAAGCTTCAGCTGCTCCTAGCAGCGGCCCAACAGATGGTCTTGGAAGTTTGTTTCCTGGCCTTGGTGGTACAGGAACTGCTGGTACCAGGCCATCTGGTCTTTTTGGGTCTGGATTTCCAGAATTGGATCAAATGCAGCAGCAGTTAAGCCAAAACCCCAACTTAATGAGGGAAATAATGAATATGCCAATGATGCAGAATCTCATGAATAACCCTGATTTAATTCGTAACATGATCATGAACAATCCTCAAATGCGTGATATCATCGACCGGAATCCAGATCTTGCTCATGTTCTCAATGATCCAAGTGTTCTCCGCCAGACCCTTGAAGCAGCCAGAAACCCTGAAATCATGAGGGAGATGATGCGGAACACAGACAGAGCAATGAGCAACATTGAGTCTTCTCCTGAAGGGTTTAATATGCTCCGACGCATGTATGAAACTGTCCAGGAGCCTTTCCTAAATGCGACAACAATGGGTGGAGAAGGCAACACAGCTCCAAACCCATTCTCAGCTCTTCTTGGAAATCAGGGTTCTAACCAACCAAGGGATCCTGCTACAAATGCTCCAAATACTGGCTCAGAGTCTACAACAGGAACCCCTGCTCCAAACACTAATCCACTTCCAAATCCTTGGAGCTCCAATGCTGGAGGTGCGCAAGGAGCAACACGGGCAGGTTCTACTGGCAATGCAAGAACCGGTGCCACTGGGGGCCTTGGAGGGTTGGGGTCAGCTGATCTGAGCAGTTTATTTGGTGGTCTTGCCGGTAATACAGGAACTGGTGCTACTGGTGGTCTAGGAGGGTTGGGTTCAGCAGATTTGGGAAGTTTGCTTGGTGGTTCTCCTGATTCTTCTTCCTTGAGCCAGATTTTGCAAAACCCTGTTATGATGCAGATGATGCAGAATATCATGTCTGATCCACAGTCCATGAACCAGTTGCTTAACTTCAACCCAAATACACGCAACCTCATGGAATCAAACACTCAGTTGAGGGAAATGTTCCAAAATCCAGAATTTATTCGCCAGCTTACATCCCCAGAAACTATGCAGCAATTACTCTCGTTCCAGCAGACATTATTATCACAGCTTGGTCAAAATCAACCTAGGCAGGATGGTAGCCAAGGAGGCAATGCGACAGGCATGCGGGGAAATGTTAGCCTCGACACCTTGATGGGCATGCTTAGTGGGCTTGGTGCTGGAGGTGGCATAGGTGTACCCAATACATCCAATGTTCCACCGGAAGAACTGTATGCAACACAGCTCACTCAGCTCCGAGAGATGGGTTTCATCGACACTGCAGAGAACATCCAGGCGCTAGTCGCAACTGCTGGGAATGTGAATGCTGCGGTGGAGCGTCTTCTTGGCAATCTTGGCCAGTAG

 

<210> 3

<211>4806

<212> DNA

<400> 3

AAAAAAGAAA AGAAAAAGAA AAAAAAAACT CGAGCTCACG CGCACACGCA CGCGACGCGA CGCGACCCCG AATCGGAGGCGAGGCCGCCG ACTCCGAGCG GATCGGGCCG AGGTCGACGG CATGGGCGGC GGAGGAGGCG AGGCCGGGGG CGGCGACGGAGGGGAGTCCT CTCCTGCTGC GGCTGCGGCG GCGGCGGTGG CGGGGGCCGC GGCGCTGCAC ATCCGGTGCG CGAACGGGTC CAAGTTCACC GTGCGGGCCG ACCTCGACGC CACGGTGGGG GCGTTCAAGG AGGTGGTGGC GGGGAGCTGC GACGTGCCGG CGGCGCAGCA GCGCCTGATC TACAAGGGCC GGATCCTCAA GGACGAGCAA ACCCTAGAAA GCTATGGTGA GTGTCTAGGA CTGTTAGGTA GAGGAGGAGA AAAAAAACCC ATCAAATCGT CAGGATTTTT GGTCCGATGG GTTGGAATTG ACATGCTACG TGCTCGATTT CAGTCGTGTA GTTGTAAGAA GCCGCGATTT AGCTTTGTCG ATGCAATGCC TGTTTATACC TGGGGCTCCT GTTCATGGGG GACAAGGTGC AGCAATCCGC TTCGGTGCCC TATGCATGCT AGCGAAACAG ATTCGTCGAT ATGCTTTGCT TCTCTACACA GTTATTGGTG ATTGGGTGAT GCGAGTATAG AGTGTGTAGT GTATTAATGA TAATGTATAC TGCGAACGGA ACGGTTACTC TTACGTAGCG TATAAGATGA TGAAGAAGCT GAAGGCAGCT CATCTTGTCG CGACTCGAAT ATAGTTCCAA ATGTTATGGA CTTATGGGGC CATGTAAGCT ACTGCTCGTA TTAGTTACGC ATACGTTGTT ATTATGTCGC AATGTGTGAC ATCTTAGAAT CTTCTTGGAG TTGTAGTGAA AGTTAATTTA TTTTCTCATG AAGCATCATA TGGGCTTTAT TTTTATCTGT GAACTTTGGG TAGAGTGCAC TTTATTATTG AATGTAGTTT ATGAAGTGCA AATACAAGTA AATACTTCAA TTTGTTGTTT GCAATGCAAC TGAACAATTT TTCTTAAACA CTATTTGGTT AAGTGCACAA CCCTGCTATG GAAATGGGTT CACCAAATGT AAAATCATCC TTTTCTTTCC GTTGATTACA AAGTAGTGAC CGAGAACAGT AAACCAAACA ATTGTTCTGT TTAATGGAAC TAAGCAGTGG GCTGTCTTTT GAAAAAAAAG GAAAACGTGA ATCTGTTTCT CTAGTGCTAC TGTTACAATA AATTAGTACG TTTGCTGATT CGCAGGAAGT GTATATATGT TTGGAACTCG TATTTATGTC AGCTCATGGT TTCATATTTA TTTTCAGCGG GTAATGATGC TAACTAATTA TTACATTGAT TATGATTGTA GCTTCTTGCT ATGCAAAAAC TTCCATATGA GGAAAACGTT AGTTAGTTAA TTGGCCAATC GTGCATGTGT ATTTGAGGAA AAGAAGGGAA CAACTTTCAA AAGACATGTT CTGAACATCC TTACATGGTG GAATGCTGCT AAATAAATGC GTTGAATCAA TGATGCCTTA ACAAAAAAGA AAAACATCTT CTGGGAAAAT TGTTACCTTT TATGAGAGAG TACCAAGTAA TTCTCATGTA ATACGAAATA TTGGGCACGC TAAGTATGTT AACATGCCAT AAATGAGGAT TTATGGCATA GTCATCCGAT GCACTATCTT CTTTAGTCTC TCACATGTGA ATTCTTTAGA AGTTTTCATT TGTAATTCTC TTGTATATGA TTACATCAGA TATTGGAATA TTCTTTGTTT ATGTAGATAT GCTGGCCCGC TGTTCAAATT TCTGACTTAT CAAGCATAAT TCTTTTCTTG CTTCTCACAC TCCTTATATT TTGTAGGTGT TGAAACAGAT CATACCATTC ATATGGTGCG TGGCGCTGGT CCCCCAGCCG GATCAGCTGC ACCTGCTGCA GCCAGCCCCC AAGCTTCAGC TGCTCCTAGC AGCGGCCCAA CAGATGGTCT TGGAAGTTTG TTTCCTGGCC TTGGTGGTAC AGGAACTGCT GGTACCAGGC CATCTGGTCT TTTTGGGTCT GGATTTCCAG AATTGGATCA AATGCAGCAG CAGTTAAGCC AAAACCCCAA CTTAATGAGG GAAATAATGA ATATGCCAAT GATGCAGAAT CTCATGAATA ACCCTGATTT AATTCGTAAC ATGATCATGA ACAATCCTCA AATGCGTGAT

ATCATCGACC GGAATCCAGA TCTTGCTCAT GTTCTCAATG ATCCAAGTGT TCTCCGCCAG ACCCTTGAAG CAGCCAGAAA CCCTGAAATC ATGAGGGAGA TGATGCGGAA CACAGACAGA GCAATGAGCA ACATTGAGTC TTCTCCTGAA GGGTTTAATA TGCTCCGACG CATGTATGAA ACTGTCCAGG AGCCTTTCCT AAATGCGACA ACAATGGGTG GAGAAGGCAA CACAGCTCCA AACCCATTCT CAGCTCTTCT TGGAAATCAG GGTTCTAACC AACCAAGGGA TCCTGCTACA AATGCTCCAA ATACTGGCTC AGAGTCTACA ACAGGAACCC CTGCTCCAAA CACTAATCCA CTTCCAAATC CTTGGAGCTC CAATGGTATG TTCTCAATCC TCTTGTTTAT TCTGTTTTTG ATAATCTATA TATCTATTGT TTTTTCACAC TTAAATTGAC AGCTGGAGGT GCGCAAGGAG CAACACGGGC AGGTTCTACT GGCAATGCAA GAACCGGTGC CACTGGGGGC CTTGGAGGGT TGGGGTCAGC TGATCTGAGCAGTTTATTTG GTGGTCTTGC CGGTAATACA GGAACTGGTG CTACTGGTGG TCTAGGAGGG TTGGGTTCAG CAGATTTGGG AAGTTTGCTT GGTGGTTCTC CTGATTCTTC TTCCTTGAGC CAGATTTTGC AAAACCCTGT TATGATGCAG ATGATGCAGA ATATCATGTC TGATCCACAG TCCATGAACC AGGTACGGTA TTTCTTAACT TATTTTGTTA TATAACTTTG ATGATGTTAG AGTCATAACT TCAGATCATT CTGTAATTTA AAATGTCCAC AGTTGCTTAA CTTCAACCCA AATACACGCA ACCTCATGGA ATCAAACACT CAGTTGAGGG AAATGTTCCA AAATCCAGAA TTTATTCGCC AGCTTACATC CCCAGAAACT ATGCAGGTAA CATATGTTAC GTTTTATGTA TGTGGCTAGC TCCATCTCTA TCTAGATTAA CTTTCCCTTT TTTGGCAGCA ATTACTCTCG TTCCAGCAGA CATTATTATC ACAGCTTGGT CAAAATCAAC CTAGGCAGTG AGTAACTCTT GTTCAACAGT ACCTGAATTG CATCTAGCTC ATTTATACTG TATTTCTTTC ATTATGTGTT TGTTAATTAT CTTTTGATTT TCTTGATTCA GGGATGGTAG CCAAGGAGGC AATGCGACAG GTATTTTCTC TTGATTGTTT TTTTAATATG CACCATCTAA TATCTTTTCT TGTTTTAAGA TGGATTAGTA TGTCAGGTTT TACATAAGTT TTAGTGCGTA CTGAGTTATC TTTTAGTGGT GGTTCGTTCT AGCACCAATA GTTGCCTTTC TTTCACTGCT TGGTTGACCT GTATTAGTTC TTCAAGATTT CCGTTCTTCC ATAAGGCCAT TACATTATAT AAACACATTA TGATGATTAT TACTAGTGGT TGATTCTTGA CACTACCTTA TTGTGGTGCA TAACATTGGA ATTTCTAAAT TTGAGTTTCC TTGAAATATT GGAAAAAAAG AAATATCAAT GATCGATATG GTGCGACCGT GCGACCAGGC CTCGTTTTGG GGATCGCAAA ACAAGGTCTT TGGGGTGATG CGTGACACAT GTATGATTTT TTTTCCTTAC TTAGAAATGG AAATGGGTTG CCTATGACTG AATGCTGCTT GTGGATTTGA TTATTGGAGA ATGGATGAGA GCTCCCTACA CCTTTAGTCA CAACCATAGT TCCATTTAAG TAATCTGTTA TGTGTTGAAC GTGTCTGAGC TCTTTAGCTG CTTGACTGTG CTATATTGGT ATGGAAGAGA TTATACGAGT TGTTTGTGTA GTCAACTGTA CTGCCTTCTA AATTGTGGAG CAATGTTAGA TGTGTAGTGG TAATTCGAGT ACTGAGCATT TGATAATTAA ATTCTTACAA ATGCATTTTT TTTCACCTTT TTGTTAAGTA ATGTGGCAAA TGCCAATGAA ATAAAATGCA GGCATGCGGG GAAATGTTAG CCTCGACACC TTGATGGGCA TGCTTAGTGG GCTTGGTGCT GGAGGTGGCA TAGGTGTACC CAATACATCC AATGGTTTGT ATAGTAACTC TTATCATCTT CCATGTTTTT GTATCATCAC TAATTATGGT TTTACACTTG TGATTCAGTT CCACCGGAAG AACTGTATGC AACACAGCTC ACTCAGCTCC GAGAGATGGG TTTCATCGAC ACTGCAGAGA ACATCCAGGC GCTAGTCGCA ACTGCTGGGA ATGTGAATGC TGCGGTGGAG CGTCTTCTTG GCAATCTTGG CCAGTAGCTA AAGCGTACCA GACGCTGCCC ATAACGTCAC CAACTCCGCT CTTTTGCAAG AGGTTTTTTA GCCCCTCCAA GTTCAAACGC AGCGTCTGTC TACAGTCTCA GGAGAAAATA AAACAAAGAA ATCCCACCCC CACCATTAAC TTTTCCATAC ATGGTCGTCA TGCCTTTGTT TTTACCGTGT TGTATTTGAC TATTTGGGTT GATGTACATA CATATGAAAT TATCGGATCT TACCGC

 

<210> 4

<211>21

<212> DNA

<400> 4

CCGTGTCGTATTTGACTATTA

Claims (10)

1.一种提高植物耐逆性的方法，将OsDSK2b蛋白的编码基因导入出发植物中，得到耐逆性高于所述出发植物的转基因植物；所述OsDSK2b蛋白由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过重组表达载体导入所述植物中的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体pCAMBIA1307(6×Myc)的多克隆位点得到的。

3.如权利要求1至2所述的方法，其特征在于：所述出发植物为双子叶植物或单子叶植物，优选为水稻。

4.一种植物表达载体，该载体包含SEQ ID No.2所示的DNA片段。

5.如权利要求3所述的载体，其特征在于，其出发载体pCAMBIA1307(6×Myc)载体。

6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，将SEQ ID No.2所示的DNA片段通过SpeI和SalI酶切位点连接，得到的pCAMBIA1307(6×Myc)-OsDSK2b载体。

7.一种干扰载体，该载体将人工设计的SEQ ID No.4所示的DNA片段及其反向互补序列通过pNW55中间载体连接起来，然后通过多克隆位点连接到植物表达载体pCAMBIA5300中，得到pCAMBIA5300-RNAi-OsDSK2b载体。

8.如下任一物质在提高植物耐逆性中的应用：

（1）SEQ ID No.1所示的蛋白；

（2）SEQ ID No.1所示蛋白的编码基因；

（3）含有（2）所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物，优选为水稻。