CN102911262B - 植物耐逆性相关蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。将所述蛋白的编码基因导入植物，可以增加植物的耐旱性。本发明的方法对植物耐旱分子机制的研究，植物耐旱品种的选育及植物耐旱性分子育种具有重要的理论及实际意义，为提高植物的耐旱性提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
水资源短缺和土壤盐渍化是全球农业生产面临的严峻事实。由于旱灾频繁，我国年平均受旱面积达3.27亿亩，随着全球气候变暖，旱灾将日趋严重，受旱灾威胁农田面积可能超过7亿亩。据估算，干旱、低温和盐碱等非生物胁迫对作物产量的影响达40％，我国北方主要粮食产区每年因缺水造成减产700-800亿公斤；季节性干旱在降水量丰富的南方也频繁发生，如广东每年受旱面积超过750万亩；四川省2006年作物受旱面积达2100万亩，占播种面积的35％，绝收397万亩，造成直接经济损失达61亿元。水稻作为我国重要的粮食作物，用水量占农业用水量的70％，因此水资源匮乏及干旱、低温和盐碱等非生物胁迫已成为影响水稻高产稳产的重要限制因子。植物抗逆机制十分复杂，传统的育种手段对于作物的抗逆性改良虽有一定效果，但离人们期望的目标还有很大距离。通过生物技术培育耐逆水稻品种是充分利用我国盐碱地、缓解水资源短缺、保证水稻高产稳产最经济和有效的途径，对保障农业可持续发展具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白，命名为ZmbZIP72蛋白，来自玉米(Zea mays L.)，属于bZIP(basic region/leucine zipper)类转录因子，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白的基因(ZmbZIP72基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因可为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：
1)序列表的序列2自5’末端第181至1074位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表的序列2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体具体可为将所述基因插入质粒pCAMBIA3301的多克隆位点得到的重组质粒。
扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物和/或脱落酸敏感性高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。所述耐逆性具体可为为耐旱。所述耐旱具体可体现为在干旱条件下植株的存活率增高或植株叶片的失水速率降低。所述脱落酸敏感性具体可为在脱落酸存在的条件下植株种子的萌发率降低。
bZIP类转录因子是一类能够与ABRE(ABA responding elements)作用元件特异结合的蛋白因子。本发明发现，ZmbZIP72基因受到ABA、盐及脱水处理诱导表达。将ZmbZIP72基因转化植物能够引起植株对ABA的超敏感性。将ZmbZIP72基因转化植物，能够增加植株的抗旱性，转基因植株通过降低自身失水速率等方式来提高逆境下的存活率。
本发明的方法对植物耐旱分子机制的研究，植物耐旱品种的选育及植物耐旱性分子育种具有重要的理论及实际意义，为提高植物的耐旱性提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。
附图说明
图1为重组质粒pCAMBIA3301-35S::ZmbZIP72的构建流程图。
图2为重组农杆菌的菌液PCR鉴定电泳图菌液PCR鉴定电泳图；M表示DNA marker，左侧箭头指向1000bp条带；泳道1表示以重组质粒pCAMBIA3301-35S::ZmbZIP72为模板的正对照；泳道2和3分别表示以YEB液体培养基(含卡那霉素)和水为模板的负对照；泳道4-9表示重组农杆菌，目的产物如图中右侧箭头所示。
图3为转基因拟南芥的的PCR鉴定；M表示DNA marker，左侧箭头指向500bp的条带；泳道1表示以H2O为模板的负对照；泳道2表示哥伦比亚生态型拟南芥；泳道3表示pCAMBIA3301-35S::ZmbZIP72(正对照)；泳道4-12分别表示9个T1代转基因株系的植株，目的产物如图中右侧箭头所示。
图4为RT-PCR鉴定ZmbZIP72基因的表达情况；WT表示哥伦比亚生态型拟南芥(阴性对照)；5-2、6-1、11-3、12-3分别代表不同转基因株系的植株。
图5为野生型拟南芥与T3代转基因株系在脱落酸处理下的表型。
图6为野生型拟南芥与T3代转基因株系在自然干旱处理两周后的表型鉴定。
图7为野生型拟南芥与T3代转基因株系在自然干旱处理两周并复水一周后的存活率统计。
图8为野生型拟南芥与转基因株系的叶片在自然干旱处理如图所示时间点时失水速率的统计结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
T1代表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株。T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株。T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。
农杆菌GV3101：公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献：Wang MY，Gu D，Liu TS，Wang ZQ，Guo XY，Hou W，Bai YF，Chen XP，Wang GY.2007.Overexpression of a putative maize calcineurin B-like protein in Arabidopsisconfers salt tolerance.Plant Mol Biol.65：733-746.。
质粒pCAMBIA3301(简称p3301)：公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献：Canberra，Australia，Wang MY，Gu D，Liu TS，Wang ZQ，Guo XY，Hou W，Bai YF，Chen XP，Wang GY.2007.Overexpression of a putative maize calcineurinB-like protein in Arabidopsis confers salt tolerance.Plant Mol Biol.65：733-746.。
哥伦比亚生态型拟南芥拟南芥(Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia；Columbia-0)：公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献：Zhang X，Henriques R，Lin SS，Niu QW，Chua NH(2006)Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.NatureProtocols 1：641-646.。
玉米(Zea mays L.)品种CN165：该品种为现有品种，是中国农业科学院作物科学研究所王天宇研究员创制的；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献：李会勇，黄素华，赵久然，王凤格，张中保，毛毅辉，王秀堂，石云素，宋燕春，王国英，黎裕，王天宇。应用抑制差减杂交法分离玉米幼苗期叶片土壤干旱诱导的基因。中国农业科学2007，40(5)：882-888.。
实施例1、ZmbZIP72蛋白及其编码基因的发现
通过大量性状观察和分子检测从玉米品种CN165中中发现一个新蛋白。
将序列表的序列1所示蛋白质命名为ZmbZIP72蛋白。将ZmbZIP72蛋白的编码基因命名为ZmbZIP72基因，其cDNA如序列表的序列2所示，开放阅读框为序列表的序列2自5’末端第181至1074位核苷酸。
实施例2、转基因植物的获得
一、重组表达载体的构建
重组质粒pCAMBIA3301-35S::ZmbZIP72的构建流程图见图1。
1、提取玉米品种CN165的总RNA，反转录为cDNA。
2、以步骤1提取的cDNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-TTAAGATCTATGGACGAGCTGCTCCAG-3’；
R1：5’-TATGGTCACCTCACCAGGGGGCCGTCAACGT-3’。
3、用限制性内切酶Bgl II和BstE II双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Bgl II和BstE II双酶切质粒pCAMBIA3301，回收载体骨架(约9265bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pCAMBIA3301-35S::ZmbZIP72。根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA3301-35S::ZmbZIP72进行结构描述如下：骨架载体为质粒pCAMBIA3301，在骨架载体的Bgl II和BstE II酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第181至1074位核苷酸所示的DNA。
二、转基因植物的获得
1、用重组质粒pCAMBIA3301-35S::ZmbZIP72转化农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。重组农杆菌的菌液PCR鉴定(采用bar-F和bar-R组成的引物对，靶序列约100bp)，电泳图见图2。
bar-F：5’-GCGGTCTGCACCATCGTC-3’；
bar-R：5’-GTACCGGCAGGCTGAAGTCCA-3’。
2、28℃过夜培养步骤1的重组农杆菌并调整其浓度为OD600＝0.8的菌液。
3、通过花浸泡法(花浸在步骤2的菌液中30秒)将重组质粒pCAMBIA3301-35S::ZmbZIP72分别导入60株哥伦比亚生态型拟南芥(Columbia-0)，收获的种子即为T0代拟南芥的种子。
4、将T0代拟南芥的种子播种于含卡那霉素(20mg/L)的MS培养基上进行筛选，得到30株具有卡那霉素抗性的T1代拟南芥。
5、待T1代拟南芥长至4-6片叶子时将其移栽到蛭石上生长45天(24℃；16小时/光照+8小时/黑暗)，分别提取30株T1代拟南芥叶子的DNA，用F2和R2组成引物对进行PCR鉴定，如果显示约500bp的PCR扩增产物，则植株为转基因植株。
F2：5’-CTCTGGAGGAGTTCTTGGTCA-3’；
R2：5’-CCTGATTCTGCTCTCTGAGTTTC-3’。
结果见图3。
如果T1代植株均为转基因植株，则可以推断其T0代植株为纯合的转基因植株。共获得9株纯合的T0代转基因植株，相应的获得9个转基因株系。
三、转空载体对照植株的获得
用质粒pCAMBIA3301代替重组质粒pCAMBIA3301-35S::ZmbZIP72进行步骤二，得到转空载体对照植株。
实施例3、转基因植物的鉴定
一、RT-PCR鉴定
分别提取9个转基因株系和哥伦比亚生态型拟南芥的T3代植株的总RNA，通过RT-PCR鉴定ZmbZIP72基因的表达情况。RT-PCR鉴定的引物对由F3和R3组成，靶序列约为100bp。
F3：5’-GCTTATACAATGGAGTTAGAAGCCG-3’；
R3：5’-CTCGTTGTTCTGCATTTCCATAATTTC-3’。
四个转基因株系(TL5-2、TL6-1、TL11-3、TL12-3)的结果见图4。结果表明，哥伦比亚生态型拟南芥没有得到预期条带，鉴定为阴性结果。9个转基因株系的植株都得到了预期条带，鉴定为阳性结果。
二、脱落酸胁迫实验
将转基因株系TL6-1的种子(T3代植株)、转基因株系TL12-3的种子(T3代植株)、转空载体对照植株的种子(T3代植株)和哥伦比亚生态型拟南芥(WT)的种子进行如下脱落酸处理(实验共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株均分别为30株)：将种子置于培养皿中，培养皿底为浓度为1.5μM脱落酸(ABA)水溶液，作为实验组；同时用水代替脱落酸水溶液，作为对照组；光照培养3天后拍照并统计萌发率。每组实验设3次重复结果取平均值。
哥伦比亚生态型拟南芥和转基因株系TL12-3的照片见图5。转空载体对照植株与哥伦比亚生态型拟南芥一致，转基因株系TL6-1与转基因株系TL12-3一致。脱落酸处理后，哥伦比亚生态型拟南芥的萌发率为74％，转空载体对照植株的萌发率为70％，TL6-1株系植株的萌发率为42％，TL12-3株系植株的萌发率为37％。脱落酸条件下哥伦比亚生态型拟南芥和转空载体对照植株的萌发率明显高于转基因植株的萌发率。
三、干旱胁迫实验
将2个转基因株系(TL6-1和TL12-3)的T3代植株、转空载体对照植株的T3代植株和哥伦比亚生态型拟南芥(WT)的3周龄苗置于26-28℃、相对湿度为15-20％、连续光照下，14天不浇水(第14天观察表型并拍照)，然后恢复正常浇水7天(第7天进行存活率统计)。实验共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株均分别为30株。每组实验设3次重复结果取平均值。
照片见图6。由图可见，14天不浇水处理后，哥伦比亚生态型拟南芥大部分萎蔫、死亡，而转基因植株大部分能维持生长。
存活率统计比较见图7。哥伦比亚生态型拟南芥的存活率为16％，转空载体对照植株的存活率为18％，TL6-1株系植株的存活率为82％，TL12-3株系植株的存活率为80％。干旱条件下哥伦比亚生态型拟南芥和转空载体对照植株的存活率明显低于转基因植株的存活率。
四、失水速率实验
实验材料为2个转基因株系(TL6-1和TL12-3)的T3代植株和哥伦比亚生态型拟南芥(WT)的4周龄苗。取盘座叶10至14片，置于干净的滤纸上立即称重(C0)，随后于22℃条件下固定间隔时间(30分钟)连续称重(Ct)，计算转基因植株及哥伦比亚生态型叶片的失水速率；失水速率＝(C0-Ct)/C0×100％。每组实验设3次重复结果取平均值。结果见图8。干旱条件下哥伦比亚生态型拟南芥和转空载体对照植株的失水速率明显低于转基因植株。
Claims (9)
1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1）至2）中任一所述的DNA分子：
1）序列表的序列2自5’末端第181至1074位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表的序列2所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求2或3所述基因插入质粒pCAMBIA3301的多克隆位点得到的重组质粒。
6.扩增权利要求2或3所述基因的全长的引物对。
7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐旱性高于所述目的植物和/或脱落酸敏感性高于所述目的植物的转基因植物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述目的植物中。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
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