CN103694327B - 植物耐旱相关蛋白dsm1及其编码基因和应用 - Google Patents

植物耐旱相关蛋白dsm1及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物耐旱相关蛋白DSM1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱能力相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明提供了一种来源与水稻的新蛋白及其编码基因。将本发明提供的基因导入植物，可以显著提高植物的抗旱性。本发明对于培育抗旱植物具有重大价值。

Description

植物耐旱相关蛋白DSM1及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及一种植物耐旱相关蛋白DSM1及其编码基因和应用。
背景技术
随着全球水资源的缺乏和极端气候事件频率的不断上升，干旱所造成的渗透胁迫对作物的产量和品质的负作用日趋显著，抗旱以及其它抗逆性状的改良成为今后作物改良的一个重要方向。
水稻（Oryzasativa）属于半水生性植物，耐旱性介于旱生性植物与水生性植物之间，是世界上主要的粮食作物之一。随着全球水资源的日益匮乏，干旱成为多数地区所面临的最严重的自然灾害之一，而这一现状严重影响了水稻的正常生长，制约了水稻生产的持续发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐旱相关蛋白DSM1及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，来源于水稻（Oryzasativa），命名为DSM1蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱能力相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述DSM1蛋白的基因（DSM1基因）也属于本发明的保护范围。
所述基因具体可为如下（1）或（2）或（3）或（4）的DNA分子：
（1）编码区如序列表的序列2自5’末端第132-1880位核苷酸所示的DNA分子；
（2）序列表的序列2所示的DNA分子；
（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码植物抗旱相关蛋白的DNA分子；
（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码植物抗旱相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
含有所述DSM1基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于进行鉴定及筛选，可对所述重组表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。所述重组载体具体可为将所述DSM1基因插入pCambia2300载体的多克隆位点得到的重组质粒pCambia2300-DSM1。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述DSM1基因导入目的植物中，得到抗旱能力高于所述目的植物的转基因植株。所述方法中，携带有所述DSM1基因的重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述DSM1基因具体可通过所述重组质粒pCambia2300-DSM1导入所述目的植物中。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体为水稻，如水稻品种日本晴。
本发明提供了一种来源与水稻的新蛋白及其编码基因。将本发明提供的基因导入植物，可以显著提高植物的抗旱性。本发明对于培育抗旱植物具有重大价值。
附图说明
图1为dsm1和WT的表型照片。
图2为野生型和dsm1干旱胁迫前后的表型及含水量比较。
图3为功能回补实验中的植株表型照片。
图4为过表达实验中的植株表型照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。水稻品种日本晴(OryzasativaL.ssp.Japonica)，又称野生型，用WT表示：中国水稻杂交育种中心(中国，长沙)。pCambia2300载体：pCAMBIA公司。农杆菌AGL1：中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心。
实施例1、DSM1蛋白及其编码基因的发现
一、dsm1的发现
构建水稻品种日本晴的T-DNA插入突变体库，发现了一个对干旱极度敏感突变体（droughtsensitivemutant1，简称dsm1）。营养生长阶段和生殖生长阶段，dsm1与野生型均没有显著区别。dsm1和WT分蘖晚期的全株表型照片见图1A，可见株高没有显著区别，均为约110厘米。dsm1和WT的剑叶表型照片见图1B（dsm1的剑叶长度为26.9cm，剑叶宽度为1.0cm；WT的剑叶长度为27cm，剑叶宽度为1.2cm），可见叶片宽度没有显著区别。
图2A为野生型和dsm1苗期叶片干旱胁迫前比较图。图2B为野生型和dsm1苗期叶片20%PEG处理10天后比较图。图2C为野生型和dsm1苗期叶片20%PEG处理15天后比较图。图2D为野生型和dsm1苗期叶片20%PEG处理20天后比较图。图2E为野生型和dsm1苗期叶片干旱复水3天的比较图。图2F为野生型与dsm1不同处理时间的含水量测定比较。
二、基因定位
将dsm1与籼稻品种Dular(OryzasativaL.ssp.Indica)组配杂交组合，这样产生的多态性将更加丰富，产生Fl代，Fl代自交产生F2代分离群体。
首先用F2分离群体进行定位，植株生长至成熟期，突变性状表现明显，取突变体植株叶片提取基因组DNA进行基因定位。首先取100个F2突变体植株进行粗定位，在水稻12个连锁群上大约每隔约20cM选取多态性较好的分子标记，用40个突变体植株进行连锁分析，找到与DSM1连锁的分子标记后，用200个突变体植株进一步验证。验证正确后，上大群体进行染色体步移，进一步精细定位目的基因。共用2000个F2突变体植株将DSM1定位于200K区段内，在这个小区段内预测共有16个完整的ORF，对16个ORF进行基因结构分析并全部进行测序分析，确定候选基因。
基于上述步骤，发现一个来源于水稻品种日本晴的新蛋白，将其命名为DSM1蛋白，如序列表的序列1所示。将编码DSM1蛋白的基因命名为DSM1基因，如序列表的序列2所示，其开放阅读框如序列表的序列2自5’末端第132-1880位核苷酸所示。
实施例2、功能回补实验
一、重组质粒的构建
1、提取水稻品种日本晴的总RNA并反转录为cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，用BucdsF和BucdsR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
BucdsF：5’-CCCGGGCGCTTTCGGCATTCGTTATCTACC-3’；
BucdsR：5’-TCTAGAGGGATCCGGCAATGGTGTATATCA-3’。
3、用限制性内切酶SmaI和XbaI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶SmaI和XbaI双酶切pCambia2300载体，回收载体骨架。
5、将步骤3得到的酶切产物和步骤4得到的载体骨架连接，得到重组质粒pCambia2300-DSM1。根据测序结果，对重组质粒pCambia2300-DSM1进行结构描述如下：在pCambia2300载体的SmaI和XbaI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。
二、互补系植株的获得
1、将重组质粒pCambia2300-DSM1导入农杆菌AGL1，得到重组农杆菌。
2、取步骤1得到的重组农杆菌，重悬于液体共培养培养基（YEP液体培养基+100mg/L乙酰丁香酮，pH5.2），得到OD600nm=1.0的菌液。
3、取dsm1的胚性愈伤组织，用步骤2得到的菌液浸泡30min，然后经共培养、筛选、生根、壮苗，得到T0代植株。
4、T0代植株自交获得T1代种子，T1代种子长成的植株即为T1代植株（互补系）。
三、互补系植株的鉴定
取生长状态一致（出芽后生长1个月的植株）的日本晴、步骤一得到的4个互补系（bu-1、bu-2、bu-3和bu-4）的T1代植株及dsm1，浇水至饱和后停止浇水，用20g/100mlPEG2000水溶液进行处理20天，然后复水，定期观察。PEG2000处理20天后，日本晴、dsm1、互补系均出现萎蔫，复水10天后，dsm1不能复活，而日本晴和互补系大部分水稻植株几乎全部能够复活。各个株系的存活率见表2。
表2各个株系的存活率
存活率
日本晴（ck） 96%
dsm1 0
bu-1 95%
bu-2 94%
bu-3 96%
bu-4 97%
表型照片见图3。图3A为生长1个月的植株，在PEG2000干旱处理前。图3B为PEG2000处理20天后的植株。图3C为复水10天后的植株。
实施例3、过表达实验
一、过表达植物的获得
1、将实施例2的步骤一得到的重组质粒pCambia2300-DSM1导入农杆菌AGL1，得到重组农杆菌。
2、取步骤1得到的重组农杆菌，重悬于液体共培养培养基（YEP液体培养基+100mg/L乙酰丁香酮，pH5.2），得到OD600nm=1.0的菌液。
3、取水稻品种日本晴的胚性愈伤组织，用步骤2得到的菌液浸泡30min，然后经共培养、筛选、生根、壮苗，得到T0代植株。
4、T0代植株自交获得T1代种子，T1代种子长成的植株即为T1代植株；T1代植株自交获得T2代种子，T2代种子长成的植株即为T2代植株。
5、取T1代植株和T2代植株的叶片，提取基因组DNA并采用BucdsF和BucdsR组成的引物对进行PCR鉴定（如果显示约2.1-2.2kb的扩增条带，说明鉴定结果为阳性），对于某一T1代植株来说，如果其抽样检测的T2代植株均为阳性结果，该T1代植株为纯合的转基因植株，该植株及其自交后代为纯合的转基因株系（又称过表达株系）。
二、转空载体植株的获得
用pCambia23A载体代替重组质粒pCambia2300-DSM1进行步骤一，得到转空载体植株。
三、过表达植株的鉴定
随机取3个纯合的转基因株系的T2代植株（OV1株系、OV2株系和OV3株系，每个株系20株），取转空载体植株的T2代植株（20株），取水稻品种日本晴（20株），分别进行如下抗旱鉴定：
1、在Hoagland营养液中培养植株（每3天更换新的Hoagland营养液）。
2、干旱处理
取步骤1中生长状态一致（出芽后生长1个月）的植株，转移至20g/100mlPEG2000水溶液中并培养40天（每3天更换新的20g/100mlPEG2000水溶液），此时可以观察到植株均萎蔫。
3、复水
完成步骤2后，再将植株转移至Hoagland营养液中并培养10天（每3天更换新的Hoagland营养液），拍照并统计存活率，照片见图4，存活率结果见表3。结果表明，过表达DSM1基因能够提高植物的抗旱性，这在生产上有重要的应用前景。
表3各个株系的存活率
存活率
日本晴 0
转空载体植株 0
OV-1株系 45%
OV-2株系 44%
OV-3株系 52%

Claims (4)

1.一种基因在培育抗旱能力增强植物中的应用；所述基因编码序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述基因为如下(1)或(2)的DNA分子：
(1)编码区如序列表的序列2自5’末端第132-1880位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表的序列2所示的DNA分子。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为水稻。
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