CN103254293B - 一种液泡膜定位序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种液泡膜定位序列及其应用。本发明人首次分离到一段细胞液泡膜专一性定位的信号序列(Tonoplast Targeting Sequence，TTS)，该序列可引导蛋白精确高效地定位于细胞内液泡膜上。利用该序列可进行目的蛋白的定位改造，减少或阻止目的蛋白表达于液泡膜以外的其它部位。

Description

一种液泡膜定位序列及其应用

技术领域

本发明属于生物技术以及植物学领域；更具体地，本发明涉及一种液泡膜定位序列及其应用。

背景技术

细胞是各种生命形式的基本组成单位，形形色色的蛋白质根据其自身的特性有序地分布在细胞的每个分区中行使相应的生物学功能(Cavalier-Smith，2009)。植物细胞的主要分区包括质膜和其它内膜系统、细胞核、细胞质以及位于其中的线粒体、叶绿体、高尔基体、内质网、核糖体、过氧化物酶体、液泡等各种细胞器。这些构成细胞的微小结构或分区统称为亚细胞结构。在植物细胞中，每个亚细胞结构上都分布着多种具有生物活性的蛋白质。蛋白质亚细胞定位的研究对于系统地理解植物形态建成、生长发育以及对环境的适应等方面都是必不可少的环节，不仅已成为功能基因组学的重要研究内容，而且具有生物工程上的实际应用价值。植物中各种蛋白质都是依据其自身基因编码的氨基酸序列所包含的定位信息，通过各种精确的分子机制定位到细胞特定的亚细胞部位的。人们通过各种定位技术，对各亚细胞结构中蛋白质的分布情况了解的越来越多。质膜和细胞内膜是一个蛋白质种类较多的区域，膜上的蛋白质主要有载体蛋白、通道蛋白、离子转运蛋白和蛋白受体等，还分布着一些重要的酶以及某些植物逆境相关蛋白；细胞质中分布着各种代谢活动所需的相关酶类；线粒体是有氧呼吸的主要场所，主要含有与有氧呼吸相关的酶类；叶绿体是植物光合作用的场所，因此也是光合作用所需酶类的主要存在部位；细胞核中也含有种类繁多的蛋白质，包括控制遗传信息合成、复制、代谢的酶与一些核定位信号相关的蛋白质等。

液泡是细胞质中由单层膜包围的充满水溶液的泡状结构，是植物细胞中普遍存在并具有多种功能的重要细胞器(Wink M(1993)The plant vacuole：amultifunction compartment.J Exp Bot 44：231-246)。大部分植物细胞没有液泡就难以存活。植物液泡的形成起源于内质网-高尔基体-反式高尔基网络等内膜系统，通过生物合成、分泌途径的运输以及自体吞噬形成植物细胞特有的中央大液泡(Zouhar J，Rojo E(2009)Plant vacuoles：where did they come from and whereare they heading？Curr Opin Plant Biol 12：677-684)。随着细胞生物学与分子生物学研究的深入，人们逐渐认识到液泡不仅仅是简单的物料储藏室或者蛋白降解库，它参与调节细胞代谢与生长发育，控制细胞内物质累积和运输，维持细胞内环境稳定性，并提高植物适应环境变化和的生命活力。一般认为蛋白质在内质网上加工后通过分泌与内吞途径(secretory and endocytic pathways)运输到液泡内。在分泌途径的早期，高尔基体的分泌出芽点就已经将定位于液泡中的可溶性蛋白和膜蛋白与即将运送到细胞表面的蛋白质区分开来。液泡可溶性蛋白需要一类特殊的定位信号(vacuolar sorting determinant，VSD)加以标记，以便离开高尔基体后被相应的分拣受体蛋白VSR或类受体蛋白RMR等受体识别，从而顺利地向液泡进行运输。液泡分拣信号VSD主要包括序列特异性信号(ssVSD)、C-末端定位信号(ctVSD)和结构定位信号(psVSD)这三种类型。它们可以单独或者共同起作用。例如，在大豆11S球蛋白中，多种VSD共同决定了它液泡定位的特性。尽管目前人们对蛋白的液泡定位机制有一定的认识，然而目前对于液泡膜上蛋白的亚细胞定位决定因子的研究非常缺乏，国际上也罕有相关报道。液泡膜具有较为复杂的结构，其上的蛋白数量也很多，在拟南芥蛋白质组的研究中鉴定出有195种不同的蛋白整合在液泡膜上(Carter C，Pan S，Zouhar J，Avila EL，Girke T，Raikhel NV(2004)The vegetative vacuole proteomeof Arabidopsis thaliana reveals predicted and unexpected proteins.Plant Cell 16：3285-3303)。液泡膜上的蛋白不仅参与膜电位平衡与渗透调节，还负责运输储存营养元素，调控代谢过程并参与细胞的信号转导。

本领域目前尚未有报道表明在植物中分离到决定液泡膜定位的专一性信号序列。因此，迫切需要找到一种液泡膜的专一性信号序列，以填补本领域的空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种液泡膜定位序列及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽(液泡膜定位多肽)，其是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的多肽；

(b)氨基酸序列如SEQ ID NO：3中第1～(20-50)位所示的多肽；

(c)氨基酸序列如SEQ ID NO：5中第1～(20-50)位所示的多肽；

(d)将(a)多肽经过一个或多个(如1-5个；较佳地1-4个；更佳地1-3个；更佳地1-2个)氨基酸残基的取代或添加而形成的，且具有液泡膜定位功能的多肽；

(e)将(b)或(c)多肽经过一个或多个(如1-5个；较佳地1-4个；更佳地1-3个；更佳地1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有液泡膜定位功能的多肽；或

(f)与(a)或(b)或(c)多肽的氨基酸序列相同性高于50％(较佳地高于60％；更佳地高于70％；更佳地高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于99％)，且具有液泡膜定位功能的多肽。

在一个优选例中，(b)中，所述的多肽是氨基酸序列如SEQ ID NO：3中第1～(20-28)位(如第1-21位，第1-22位，第1-23位，第1-24位，第1-25位，第1-26位，第1-27位)所示的多肽；或

(c)中，所述的多肽是氨基酸序列如SEQ ID NO：5中第1～(20-28)位(如第1-21位，第1-22位，第1-23位，第1-24位，第1-25位，第1-26位，第1-27位)所示的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸(液泡膜定位核酸)，其编码所述的多肽。

在一个优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中第1～(57-150)位所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于引导目的蛋白定位到细胞的液泡膜(即：用于目标蛋白的液泡膜亚细胞定位)。

在一个优选例中，所述的多肽用于减少或防止目的蛋白表达于细胞的液泡膜以外的其它部位(包括细胞器)。

在本发明的另一方面，提供一种表达构建物，其中含有所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的表达构建物不含有全长的编码SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的表达构建物中，所述的多核苷酸(液泡膜定位核酸)的5′端和/或3′端，还包括多克隆位点(限制性内切酶位点)，用于连接编码目的蛋白的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的表达构建物中还含有与所述的多核苷酸操作性连接的编码目的蛋白的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的目的蛋白是外源蛋白。

在另一优选例中，所述的目的蛋白是可溶性蛋白。

在另一优选例中，所述的目的蛋白是结构蛋白、调控蛋白、转录因子等任何需要定位于液泡膜的蛋白(如植物品质、性状、抗性或代谢相关的蛋白)。

在另一优选例中，所述的编码目的蛋白的多核苷酸位于所述的多核苷酸(液泡膜定位核酸)的下游，且与所述的多核苷酸的间隔小于500bp；优选的，小于300bp；更优选的，小于200bp；更优选的，小于100bp；更优选的，小于50bp；更优选的，小于30bp。

在另一优选例中，所述的表达构建物是表达载体。

在另一优选例中，所述编码目的蛋白的多核苷酸位于所述的多核苷酸(液泡膜定位核酸)的5′端和/或3′端。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞：

含有外源的所述的多核苷酸；或

含有所述的表达构建物。

在一个优选例中，所述的宿主细胞为不能简单地借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物合成碳水化合物、蛋白质来维系生存的细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为非植物繁殖材料。

在本发明的另一方面，提供所述的表达构建物的用途，用于在细胞的液泡膜上表达目的蛋白。

在本发明的另一方面，提供一种在细胞的液泡膜上表达目的蛋白的方法，包括：

(1)提供所述的表达构建物；

(2)将(1)的表达构建物转化细胞。

在本发明的另一方面，提供一种制备转基因植物的方法，所述植物的细胞的液泡膜上特异表达目的蛋白，所述方法包括：将所述的表达构建物转入植物中。

在一个优选例中，通过农杆菌转化的方法将所述的表达构建物转入植物中。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、拟南芥CBL2与CBL3蛋白的亚细胞定位。

(A)CBL2与CBL3在拟南芥原生质体中的亚细胞定位；

(B)转基因拟南芥植株35S:CBL2-YFP的亚细胞定位；

(C)转基因拟南芥植株35S:CBL3-YFP的亚细胞定位(Bar＝10μm)。

图2、CBL2的N端前16个氨基酸是其亚细胞定位所必需的。

图3、CBL2的N端前19个氨基酸(TTS序列)能够决定蛋白的液泡膜定位。

图4、TTS序列在融合蛋白中的位置不影响其决定的液泡膜亚细胞定位。

图5、TTS序列引导目标蛋白(CBL5，CIPK14，eIF4A，SND2)定位于植物细胞液泡膜应用实例。

具体实施方式

本发明人致力于细胞或组织专一性信号序列的研究，经过广泛的研究，分离到一段细胞液泡膜专一性定位的信号序列(Tonoplast Targeting Sequence，TTS)，该序列可引导蛋白精确高效地定位于细胞内液泡膜上。利用该序列可进行目的蛋白的定位改造，减少或阻止目的蛋白表达于液泡膜以外的其它部位(包括液泡膜以外的其它细胞器)。

术语

所述的“氨基酸”为同时含有一个或多个氨基和羧基的脂肪族有机酸，其根据氨基和羧基的位置，有α氨基酸和β氨基酸等类型。氨基酸是构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使它的分子具有生化活性。参与蛋白质合成的常见氨基酸是20种L-α-氨基酸。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

所述的“液泡”包括植物细胞中的各种类型液泡，如中央大液泡、水解液泡、储藏液泡、囊泡状小液泡等。植物“液泡”也涵盖不同细胞类型与植物不同发育时期中的各种液泡。

所述的“液泡膜”是指细胞质与液泡相隔的界面上存在的一层生物膜。它的组成和特性与细胞的质膜相同，主要由蛋白质和磷脂组成，其中磷脂形成磷脂双分子层，是膜的基本骨架，蛋白质分子以各种方式分布于其中，在功能上具有选择透过性。这里的液泡膜包括植物细胞中所有类型的液泡外层的生物膜。

本发明中，所述的“植物(或作物)”没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：十字花科、禾本科、蔷薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于：十字花科芸薹属的大白菜、小白菜，十字花科鼠耳芥属植物如拟南芥，禾本科的水稻、小麦、玉米等，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。

如本文所用，所述的“目的蛋白”是指生物工程操作中的对象蛋白，包括任何可由本发明的液泡膜定位蛋白引导表达于液泡膜的蛋白。只要能够与所述的液泡膜定位蛋白相融合、结合或偶联的蛋白均可作为目的蛋白。例如，所述的目的蛋白包括但不限于：改良植物品质、性状、抗性或代谢相关的基因。较佳地，所述的目的蛋白是可溶性蛋白。所述的目的蛋白本身也可以是一种融合蛋白。

所述的“可溶性蛋白”指可以以小分子状态溶于水或其他溶剂的蛋白，这里也代表生物体内具有生物活性的亲水性蛋白。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果TTS序列与目的蛋白序列的组合通常不是天然存在的，则TTS序列对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，术语“专一性定位”、“专一性表达”、“特异性定位”、“特异性表达”是指目的蛋白在特定的细胞器(如液泡膜)上表达。通常，如果在某组织或器官(如液泡膜)中蛋白量比在其它组织或器官中高至少5倍，优选至少高10倍，更优选至少高100倍，最优选至少高1000倍，则该蛋白被认为是组织或器官专一性定位的。

液泡膜定位多肽(TTS)

本发明提供一种液泡膜定位多肽，其是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2(MSQCIDGFKHVCSSFFRCF，如图2下图CBL3前19位)所示的多肽；

(b)氨基酸序列如SEQ ID NO：3中第1～(20-50)位所示的多肽；

(c)氨基酸序列如SEQ ID NO：5中第1～(20-50)位所示的多肽。

其中，氨基酸序列如SEQ ID NO：3(或SEQ ID NO：5)中第1～(20-50)位指定了一系列的序列，所述序列起始于SEQ ID NO：3(或SEQ ID NO：5)中第1位，终止于SEQ ID NO：3(或SEQ ID NO：5)中第20位至第50位中的任一位的氨基酸。

本发明的TTS多肽(蛋白)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括TTS的衍生物和类似物(如TTS的保守性变异多肽)。如本文所用，术语“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的TTS相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

TTS的衍生物和类似物包括(但并不限于)：若干个(通常为1-5个，较佳地1-4个，更佳地1-3个，最佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(如50个以内，较佳地为30个以内，较佳地为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或减少一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。氨基酸的取代或替换最好根据表1进行。

表1

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser

Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明TTS多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：4(或SEQ ID NO：6)中第1～(57-150)位所示的核苷酸序列相同或者是简并的变异体。所述的SEQ ID NO：4(或SEQ ID NO：6)中第1～(57-150)位所示的核苷酸序列指定了一系列的序列，所述序列起始于SEQ ID NO：4(或SEQ ID NO：6)中第1位，终止于SEQ ID NO：4(或SEQ ID NO：6)中第57位至第150位中的任一位的碱基。

编码TTS多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

液泡膜定位多肽(TTS)的用途

在本发明的实例中，本发明人发现，在所述的TTS的指导下，可以使黄色荧光蛋白(YFP)特异地在细胞的液泡膜上表达。因此可见，本发明的TTS是一种器官专一性定位的多肽。所述的多肽对于引导蛋白专一性定位于液泡膜是有用的；其对于阻止蛋白在不需要表达的部位表达也是特别有用的。

本发明的TTS的编码核酸可以被可操作地连接到目的蛋白的编码核酸上(可连接在5’端和/或3’端)，该目的蛋白相对于TTS而言可以是外源(异源)的。将这种连接的(融合的)核酸转化入细胞中，可以获得目的蛋白被专一性定位于液泡膜的细胞。

在有必要的情况下，所述的TTS的编码核酸可以以单拷贝或多拷贝的形式与单拷贝或多拷贝的目的蛋白的编码核酸相连。可以理解，多拷贝的TTS序列仍然可以实现液泡膜定位的功能。

在有必要的情况下，所述的TTS的编码核酸与目的蛋白的编码核酸之间，还可包括编码“其它蛋白”的多核苷酸，如连接子的编码序列、纯化标签(Tag)的编码序列，只要该“其它蛋白”被表达后不会影响TTS的定位引导功能和/或不影响目的蛋白的活性。

本发明的TTS的编码核酸还可以被可操作地连接到被改进的目的蛋白的编码核酸上。所述的目的蛋白可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的蛋白可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻译，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。

任何一种前述的TTS的编码核酸和/或目的蛋白的编码核酸可被包含在重组载体中。

作为一种方式，所述的重组载体包括TTS编码核酸，在所述TTS的编码核酸的上游或下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的蛋白时，将目的蛋白的编码核酸连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的蛋白的编码核酸与TTS编码核酸可操作地连接，用于在细胞内表达或进行转基因操作。

此外，所述的重组载体中还可包括其它用于表达或调控的元件，例如包括：引导基因转录的启动子，转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子等。

用于制备重组载体的方法是本领域熟知的。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的TTS编码核酸和/或目的蛋白编码核酸的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)等。

包含上述适当的TTS编码核酸和/或目的蛋白编码核酸的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

作为一种方式，制备转基因植物的方法是：将携带TTS编码核酸和目的蛋白编码核酸的载体转入农杆菌，农杆菌再将含TTS编码核酸和目的蛋白编码核酸的片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是拟南芥、烟草、棉花、水稻、小麦等等。所获得的转基因植物的细胞中，目的蛋白被表达于液泡膜上。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、基因的克隆及重组载体的构建

1、CBL2与CBL3基因的克隆

抽取14天野生型拟南芥(Col-0)RNA，经ReverTra Ace反转录酶(TOYOBO，Japan)反转录成cDNA，以该cDNA为模板分别扩增CBL2与CBL3的基因序列。所用引物如下：

CBL2F：CTAATGTCGCAGTGCGTTGACGGT(SEQ ID NO：7)；

CBL2R：GCCGCTGCTTGCTTTTGCTTTTG(SEQ ID NO：8)；

CBL3F：CATATGTCGCAGTGCATAGACGGT(SEQ ID NO：9)；

CBL3R：TTCCCAAATTGTCTCCTCTGCTAA(SEQ ID NO：10)。

全长的基因序列都连入经EcoRV酶切的pBluescript KS(pKS)质粒(Invitrogen)中并测序。

2、CBL2-YFP与CBL3-YFP载体的构建与转基因植株的获得

分别以含有CBL2与CBL3的pKS质粒为模板，用高保真Taq酶KOS-plus扩增CBL2与CBL3的CDS序列，并且在扩增始末端去除终止密码子并引入SpeI(ACTAGT)的酶切位点，PCR产物克隆至pKS载体并测序后，经SmaI与SpeI酶切后连入pA7-YFP载体(Liu H，et al.AtNHX3is a vacuolar K+/H+ antiporterrequired for low-potassium tolerance in Arabidopsis thaliana.Plant Cell Environ.33：1989-1999，2010)用于瞬时表达；或者连入1300SUPER-YFP载体(改造的pCambia1300载体(CAMBIA，Canberra，Australia)，改造方法为：将35S启动子替换成SUPER启动子)用于稳定表达；分别获得CBL2-YFP与CBL3-YFP的瞬时表达重组载体以及稳定表达重组载体。获得的重组载体导入农杆菌菌株GV3101(Invitrogen)用于植物的遗传转化。

原生质体瞬时表达：利用PEG介导的植物叶片原生质体转化的方法(YooSD，Cho YH，Sheen J(2007)；Arabidopsis mesophyll protoplasts：a versatile cellsystem for transient gene expression analysis.Nat Protoc 2：1565-1572)在拟南芥、杨树、烟草原生质体中瞬时表达。

制备获得稳定表达的转基因植株：转化拟南芥时，制备好含有植物表达载体质粒的农杆菌菌液100mL，室温，6000rpm离心5min，弃上清，沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基(5％蔗糖，Silwet L-77200μl/L，pH5.7)中，重悬后的菌液OD₆₀₀在0.8左右。将农杆菌悬浮液倒在小烧杯中，用移液器吸取农杆菌悬浮液滴在拟南芥花序上用不透明的保鲜膜封好以保持湿度，放在恒温室培养过夜。根据情况可再浸染一到两次。转化子的筛选时，拟南芥种子用10％NaClO(v/v)消毒液消毒5min，无菌水冲洗3-5次后，置于灭菌的吸水纸上晾干后均匀分散到固体筛选培养基(MS培养基加入30mg/L潮霉素)表面，4℃冰箱放置两天后放入恒温组织培养室培养。约10天后即可区分转化株与未转化株，转化株移栽到土中，单株收取T1代种子，T2代后开始收纯合体植株。

3、CBL2的不同长度N端与YFP融合载体的构建

采用前述“2”相同的方法，获得CBL2ΔN16(CBL2的N端前16个氨基酸去除，序列如图2)的编码序列，同样连接入PA-YFP载体中，导入农杆菌菌株GV3101。

获得CBL2N16(由CBL2的N端前16个氨基酸构成)的编码序列，连接入PA-YFP载体中，导入农杆菌菌株GV3101。

同样地，获得CBL2N17(由CBL2的N端前17个氨基酸构成)、CBL2N18(由CBL2的N端前18个氨基酸构成)、CBL2N19(由CBL2的N端前19个氨基酸构成，MSQCVDGIKHLCTSVLGCF(SEQ ID NO：1))、...、CBL2N28(由CBL2的N端前28个氨基酸构成)的编码序列，同样连接入PA-YFP载体中，导入农杆菌菌株GV3101。

采用两条引物退火的方法将不同长度的CBL2的N端氨基酸对应的核苷酸通过BamHI与SpeI位点融合连入PA7-YFP载体。载体经过测序后用于植物原生质体瞬时表达的研究。

4、TTS处于不同位置的YFP融合载体的构建

TTS在融合蛋白N端的载体构建与前述“2”中CBL2-YFP的瞬时表达重组载体完全相同，融合载体中相关结构的结构示意图如图4右图上排所示。

TTS在融合蛋白中间的载体构建即把YFP通过PCR的方法克隆后引入到pKS载体上，去除终止密码子并在C端引入NdeI位点，构建出pKS-YFP。将CBL2通过NdeI与SalI从pKS上切下后转移至pKS-YFP上，从而得到pKS-YFP-CBL2。最后将YFP-CBL2融合的大片段通过XhoI与SacI切下后替换掉pA7-YFP上的YFP，融合载体中相关结构的结构示意图如图4右图中排所示。

TTS在融合蛋白C端的载体将TTS序列(由CBL2的N端前28个氨基酸构成)通过引物退火的方法连入pKS-YFP，进而再将pA-YFP载体上的YFP替换为YFP-TTS，融合载体中相关结构的结构示意图如图4右图下排所示。

5、TTS与外源蛋白融合载体的构建

将CBL2的N端前19个氨基酸构成的TTS序列与其它蛋白进行融合。将该19个氨基酸构成的序列所对应的57个核苷酸采用引物退火的方法连入pKS载体中，并在末端加入NdeI酶切位点，构建成pKS-TTS亚克隆。分别将CBL5、CIPK14、SND2、eIF4A、PIP2A、SCAMP1、GONST1通过PCR的方法克隆到pKS载体上并在N端引入NdeI位点，C端去除终止密码子后引入SpeI位点。之后分别将目标蛋白对应的基因以NdeI与SalI切下连入pKS-TTS亚克隆，进而用SmaI与SpeI切下连入pA7-YFP载体的多克隆位点中。获得表达CBL5-YFP、TTS-CBL5-YFP、eIF4A-YFP、TTS-eIF4A-YFP、CIPK14-YFP、TTS-CIPK14-YFP、SND2-YFP、TTS-SND2-YFP等的融合表达载体。用于进行植物的原生质体瞬时表达。克隆CBL5、CIPK14、SND2、eIF4A、PIP2A、SCAMP1、GONST1的引物分别如下：

CBL5：

正向：5’CATATGGGATGTGTTTGCAGCAAG 3’(SEQ ID NO：11)；

反向：5’ACTAGTCCGGAGAAAGGTTGGGA 3’(SEQ ID NO：12)；

CIPK14：

正向：5’CATATGGTAGATTCTGACCCGGTG 3’(SEQ ID NO：13)；

反向：5’ACTAGTCGACGTCGTATGTACTTGAGTTG 3’(SEQ ID NO：14)；

SND2：

正向：5’CATATGACTTGGTGCAATGACTGC 3’(SEQ ID NO：15)；

反向：5’ACTAGTGGGGATAAAAGAAGATCCA 3’(SEQ ID NO：16)；

eIF4：

正向：5’CATATGGCAGGATCTGCACCAGA 3’(SEQ ID NO：17)；

反向：5’ACTAGTCAGCAGATCGGCCACGT 3’(SEQ ID NO：18)；

PIP2A：

正向：5’CATATGGCAAAGGATGTGGAAGC 3’(SEQ ID NO：19)；

反向：5’ACTAGTGACGTTGGCAGCACTTCTG 3’(SEQ ID NO：20)；

SCAMP1：

正向：5’CATATGGGTGGTCGTTACGATCG 3’(SEQ ID NO：21)；

反向：5’ACTAGTTATGGCAGCTCTCATGGCTC 3’(SEQ ID NO：22)；

GONST1：

正向：5’CATATGAAATTGTACGAACACGATG 3’(SEQ ID NO：23)；

反向：5’ACTAGTGGACTTCTCCCTCATTTTG 3’(SEQ ID NO：24)。

实施例2、细胞定位

通过分子克隆技术分离克隆了双子叶植物拟南芥中CBL2与CBL3基因并且构建了瞬时表达CBL2-YFP与CBL3-YFP的重组载体。

利用PEG介导的植物叶片原生质体转化的方法(Yoo SD，Cho YH，Sheen J(2007)；Arabidopsis mesophyll protoplasts：a versatile cell system for transientgene expression analysis.Nat Protoc 2：1565-1572)在拟南芥原生质体中瞬时表达了35S:CBL2-YFP蛋白与35S:CBL3-YFP蛋白。接着在荧光共聚焦显微镜下观察融合荧光蛋白的位置。

结果显示，35S:CBL2-YFP与35S:CBL3-YFP的信号都清晰地定位于拟南芥细胞的液泡膜上，如图1A。

为了排除瞬时表达效果以及高渗透势环境的影响，本发明人又构建了稳定表达CBL2-YFP与CBL3-YFP的重组载体，获得了稳定表达35S:CBL2-YFP与35S:CBL3-YFP转基因拟南芥植株。通过对纯合体根部细胞的观察，发现荧光信号均处于质膜凹陷部位内侧的膜状结构中，另外在很多囊泡状结构中也有很强的荧光信号(图1B，C)。这进一步确认并说明CBL2与CBL3不仅定位于植物细胞中央大液泡的膜上，还定位于很多囊泡类的小液泡的液泡膜上。

实施例3、液泡膜定位相关序列

序列比较显示，CBL2与CBL3比同一个家族中的CBL1等质膜定位的蛋白多出16个氨基酸，这对于它的液泡膜定位可能十分重要(图2下图，方框标注)。由于CBL2与CBL3蛋白高度同源，本发明人进一步地以CBL2作为对象来研究它们液泡膜定位的决定因素。构建了表达CBL2的N端16个氨基酸及YFP融合蛋白(CBL2N16-YFP)的重组载体、表达去除CBL2的N端16个氨基酸的CBL2及YFP融合蛋白(CBL2ΔN16-YFP)的重组载体。在拟南芥原生质体中瞬时表达后，在荧光共聚焦显微镜下观察融合荧光蛋白的位置。

结果发现，将CBL2前端的16个氨基酸去除后，该蛋白无法专一地定位于液泡膜上，而变得像可溶性的YFP空载体的导入一样，遍在分布于植物细胞中，然而单独的这16个氨基酸却也无法将YFP定位于液泡膜上(图2)。这些结果说明前16个氨基酸这一段序列是液泡膜定位必需的但并不是其充分条件。

进一步地，本发明人将CBL2的N端前28氨基酸连接到荧光蛋白YFP前面，结果发现它足以将YFP专一地定位在液泡膜上(图3)。为了分离出液泡膜定位信号所需的最短序列，本发明人从CBL2的N端前16个氨基酸构成的序列开始、每次增加一个氨基酸递增连入YFP前端，发现到了CBL2的N端前19个氨基酸构成的序列就已经能够将荧光蛋白YFP较好地定位到植物细胞的液泡膜上(图3)，因此本发明人将分离出的包含CBL2的N端至少19～28个氨基酸的序列命名为液泡膜定位序列(Tonoplast Targeting Sequence，TTS)。

实施例4、TTS序列与其它蛋白融合的位置研究

进一步地，本发明人将TTS序列置于融合蛋白的不同位置，研究其位置是否影响在液泡膜上的定位。所构建的各融合载体中相关结构的结构示意图如图4右图。在拟南芥原生质体中瞬时表达后，在荧光共聚焦显微镜下观察融合荧光蛋白的位置。

结果如图4左图，表明TTS序列无论在融合荧光蛋白的前端、后端或者中间都可以引导目标蛋白正确地定位到植物细胞的液泡膜上。

实施例5、应用实例

可将TTS与一系列其它可溶性蛋白连接以构建融合蛋白，最终实现其引导其它可溶性蛋白液泡膜定位的性能。

1、与CBL5蛋白融合定位

CBL5是CBL2同一家族的其它成员，其前端缺少TTS序列时，其遍在地分布于细胞中；将其N端之前加上TTS序列后构成的TTS-CBL5-YFP融合蛋白可以定位到烟草原生质体细胞的液泡膜上，如图5A。

2、与CIPK14蛋白融合定位

CIPK14蛋白是一个蛋白激酶，它与CBL2具有相互作用，一般情况下，它的亚细胞定位是遍在分布于细胞内部的。本发明人在CIPK14的N端之前加上TTS序列，新的融合蛋白TTS-CIPK14-YFP则由原先的遍在定位模式转变成了烟草原生质体细胞液泡膜特异的定位模式，如图5B。

3、与eIF4A蛋白融合定位

翻译起始因子eIF4A是真核生物蛋白翻译起始过程中不可缺少的辅助因子之一，它在植物中主要定位于细胞质内。通过在其N端之前加上TTS序列，使得融合蛋白TTS-eIF4A-YFP显著地定位于杨树原生质体细胞的液泡膜上，如图5C。

4、与SND2蛋白融合定位

接着，研究了TTS对转录因子SND2定位的影响，转录因子的功能主要是调节核内基因的转录，因此一般都专一定位于细胞核中。转录因子一般也具有强烈的核定位信号。通过在其N端之前加上TTS序列，可见TTS-SND2-YFP融合蛋白能够定位于杨树原生质体细胞的液泡膜上，如图5D。

上述结果说明，TTS具有很强的引导液泡膜定位的特性，它的作用甚至强于一般的核定位信号，具有显著的高效性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种分离的多肽，其是： 

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；或 

(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:3中第1～28位所示的多肽。 

2.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1所述的多肽。 

3.权利要求1所述的多肽的用途，用于引导目的蛋白定位到细胞的液泡膜。 

4.一种表达构建物，其中含有权利要求2所述的多核苷酸。 

5.如权利要求4所述的表达构建物，其特征在于，其中还含有与权利要求2所述的多核苷酸操作性连接的编码目的蛋白的多核苷酸。 

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞： 

含有外源的权利要求2所述的多核苷酸；或 

含有权利要求4-5任一所述的表达构建物； 

且，所述的宿主细胞为非植物繁殖材料。 

7.权利要求4或5所述的表达构建物的用途，用于在细胞的液泡膜上表达目的蛋白。 

8.一种在细胞的液泡膜上表达目的蛋白的方法，包括： 

(1)提供权利要求5所述的表达构建物； 

(2)将(1)的表达构建物转化细胞。 

9.一种制备转基因植物的方法，所述植物的细胞的液泡膜上特异表达目的蛋白，所述方法包括：将权利要求5所述的表达构建物转入植物中。