CN110452896A

CN110452896A - 一种植物抗虫相关蛋白OsPAL6和OsPAL8及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN110452896A
Application number: CN201910730195.8A
Authority: CN
Inventors: 万建民; 刘裕强; 何俊; 江玲; 赵志刚; 王益华; 陈亮明; 刘世家; 刘喜; 田云录
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-08-08
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2019-11-15
Anticipated expiration: 2039-08-08
Also published as: CN110452896B

Abstract

本发明公开了一种植物抗虫相关蛋白OsPAL6和OsPAL8及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2氨基酸所示的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗虫相关的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。本发明的植物抗虫相关蛋白影响植物的抗虫性。提高该蛋白编码基因的表达可导致感虫植物抗虫，从而可以培育植物抗虫转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种植物抗虫相关蛋白OsPAL6和OsPAL8及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗病虫相关蛋白OsPAL6和OsPAL8及其编码基因与应用。

背景技术

褐飞虱(Nilaparvata lugens)又称褐稻虱，属同翅目(Homoptera)飞虱科(Delphacide)，是水稻的主要害虫之一，广泛分布于各水稻种植区，常群居稻株基部，吸食汁液，引起植株萎焉枯死，严重影响水稻的产量及其品质。除此以外，褐飞虱还是草状丛矮病(rice grassy stunt virus，RGSV)和齿叶矮缩病(rice ragged stunt virus，RRSV)的传播媒介，而针对上述病害尚无特效农药，且此类病毒病在东南亚等国家呈上升趋势。目前褐飞虱及其传播病毒病的主要防治措施是使用化学杀虫剂，而长期大量化学杀虫剂的使用，不仅污染环境，危害人类健康，也促使害虫对化学杀虫剂产生抗性，杀死天敌，危及生物多样性，破坏生态平衡。因此，改变化学农药为主的防虫策略，寻求新的抗虫途径势在必行。抗虫品种的应用通常被认为是防治褐飞虱最经济有效的措施。近年来，随着分子标记的发展和水稻高密度连锁图谱的构建，分别在水稻第2、3、4、6、11和12染色体定位了多个水稻抗褐飞虱主基因，并克隆了多个水稻抗褐飞虱基因，但水稻抗褐飞虱的分子机制还有待进一步研究。

苯丙氨酸代谢途径是植物重要的次生代谢途径之一，参与植物细胞壁重要组分木质素、植物抗性相关重要激素水杨酸和类黄酮(Flavonoid)等次生代谢产物的合成。苯丙氨酸裂解酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)是苯丙氨酸代谢途径的起始酶和限速酶，有研究表明， PAL的表达及酶活显著受蚜虫或褐飞虱等刺吸式害虫取食诱导，暗示PAL介导的代谢途径可能参与植物刺吸式害虫抗性反应，但尚无研究证明PAL是否参与水稻褐飞虱抗性。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗褐飞虱相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的植物抗病毒相关蛋白(OsPAL6和OSPAL8)，来源于IR64水稻(Oryzasativa L.indica.cv)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2氨基酸序列所示的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗虫相关的由序列1和2衍生的蛋白质。

上述(b)中的OsPAL6和OSPAL8可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsPAL6和OSPAL8的编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的cDNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签的编码序列得到。

编码上述植物抗虫相关蛋白的基因OsPAL6和OSPAL8也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)～6)的DNA分子：

1)序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

2)序列表中SEQ ID NO.4所示的DNA分子；

3)序列表中SEQ ID NO.5所示的DNA分子；

4)序列表中SEQ ID NO.6所示的DNA分子

5)在严格条件下与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6 限定的DNA序列杂交且编码植物抗虫相关蛋白的DNA分子；

6)与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6限定的DNA 序列具有90％以上同源性，且编码植物抗虫相关蛋白的DNA分子。

序列表中的SEQ ID NO.3由2145个核苷酸组成。序列表中的SEQ ID NO.4由2103个核苷酸组成。序列表中的SEQ ID NO.5由2745个核苷酸组成。序列表中的SEQ ID NO.4由2255个核苷酸组成。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有以上任一所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到 mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS 基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

扩增所述基因OSPAL6和OSPAL8全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明还提供所述的基因、蛋白、重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用，特别是在培育抗虫性特高的植物育种中的应用。

本发明还提供所述的基因、蛋白、重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在水稻育种中的应用，特别是在培育抗虫性特高的水稻育种中的应用。

发明还提供所述的基因、蛋白、重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在培育抗褐飞虱的水稻育种中的应用。

本发明的植物抗虫相关蛋白影响植物抗病反应。将所述蛋白的编码基因导入植物中，可以获得抗虫性提高的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1为OsPAL RNAi家系和背景亲本IR64褐飞虱抗性比较。

图2OsPAL8过表达家系与感虫背景亲本02428的褐飞虱抗性比较。

图3OsPAL6表达下调家系和与感虫背景亲本02428的褐飞虱抗性比较。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、植物抗虫相关蛋白及其编码基因的发现

一、抗感品种表达谱分析

为发掘水稻抗褐飞虱相关基因，利用基因芯片对接虫24小时后的抗虫品种RathuHeenati(RH)和感虫品种02428进行了表达谱分析，结果发现与感虫品种02428相比，共计有2422个基因在抗虫品种中显著上调，Gene Ontology(GO)enrichment分析表明上调基因参与了多个次生代谢途径(见图1)。

为进一步排除背景影响，从RH与02428的F₂群体中挑选10株极抗和10株极感单株，分别构建抗感池，进行接虫前后的转录组分析。与没有接虫的抗性池(RN) 相比，有348个基因在接虫后的抗性池(RB)中显著上调。与接虫后的感虫池(SB) 相比，有227个基因在接虫后的抗性池中显著上调。其中在三组对比分析中(RH vs 02428,RB vs RN,and RB vs SB)，有29个基因均上调表达，包括4PALs和4萜烯类植保素合成相关基因。

进一步分析了褐飞虱取食对水稻中9个注释为OsPAL g表达的影响，结果表明其中有7个基因的表达受褐飞虱取食诱导，特别是OsPAL6和OsPAL8，氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、RNAi载体的构建

根据8个PALs基因的同源序列设计2对引物RNAi1和RNAi2(分别加入Sac1 和Nco1、Spe1和BamH1酶切位点)，扩增2个完全同源的长度为201bp的cDNA 片段，分别连入pEASY-blunt克隆载体转化到DH5α中，挑取单克隆测序正确后利用双切双连的方法先将RNAi1片段插入到载体PA7-GFP的SalI和SpeI之间，构成 PA7-GFP-RNAi1，再将RNAi2片段插入到PA7-GFP-RNAi1的BamHI和XbaI位点之间，构成PA7-GFP-RNAi1-RNAi2。之后利用引物1305-RNAi-F和1305-RNAi-R从 PA7-GFP-RNAi1-RNAi2扩增片段，插入到载体pCAMBIA1305.1的HindIII和EcoRI 位点之间，完成PALs-RNAi载体的构建。

PCR引物序列如下：

RNAi 1F(下划线所示的序列为Sac1重组位点)：

TAGAGCTCGCTCGTCCGCATCAACACACT；

RNAi 1R(下划线所示的序列为Nco1重组位点)：

TACCATGGCGTTCACCTTGCTGCCATCTG

RNAi 2F(下划线所示的序列为Spe1重组位点)：

AGACTAGTGCTCGTCCGCATCAACACACT；

RNAi 2R(下划线所示的序列为BamH1重组位点)：

ATGGATCCCGTTCACCTTGCTGCCATCTG

二、含有OsPAL6和OsPAL8编码区cDNA过表达载体构建

用KpnⅠ和SpeⅠ双酶切潮霉素抗性表达载体pCUbi1390(中国农科院生物所路铁钢研究员提供；中国农科院博士论文，彭昊，2005)，回收载体片段，备用；以PCR 介导，以IR64的cDNA为模板，进行PCR扩增获得OsPAL6(SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5)和OsPAL8基因(SEQID NO.4或SEQ ID NO.6)。同时将OsPAL6和OsPAL8的 cDNA序列两端分别加入重组接头重组接入pCUbi1390载体，测序确认。

PCR引物序列如下：

OsPAL6 F(下划线所示的序列为KpnⅠ重组位点)：

5'-TTACTTCTGCACTAGGTACCGAGCAACCACCACTCGTTACAGC-3'；

OsPAL6 R(下划线所示的序列为SpeⅠ重组位点)：

5'-TAGCGTTAACACTAGTCAGCAATCAGCAGATGGGCAGA-3'；

OsPAL8 F(下划线所示的序列为KpnⅠ重组位点)：

5'-TTACTTCTGCACTAGGTACCATGGAGTGTGAGACCGGT-3'；

OsPAL8 R(下划线所示的序列为SpeⅠ重组位点)：

5'-TAGCGTTAACACTAGTTCAGCTAAGTGGCAGGGGC-3'；

三、农杆菌介导转化

以农杆菌菌株EHA105(购自美国英俊公司)为介导，将上述构建的OsPAL6和OsPAL8基因重组载体导入感病品种02428。

(1)28℃培养含重组的农杆菌16hr，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L的 N6液体培养基中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液；

(2)将培养至一个月的水稻成熟胚胚性愈伤组织与上述菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司购买)中，24℃共培养3天；

(3)将上述愈伤接种在含有150mg/L潮霉素B(Sigma公司购买)的N6固体筛选培养基上第一次筛选16天；

(4)挑取健康愈伤转入200mg/L潮霉素B的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；

(5)挑取抗性愈伤转入含有150mg/L潮霉素B的分化培养基上分化；

(6)分化成苗的再生水稻植株即为所获得的OsPAL6和OsPAL8基因的转基因植株。

四、转基因植株的表达量分析

分别提取以02428为背景的OsPAL6和OsPAL8转基因植株、以IR64为背景的 RNAi家系、02428及IR64的mRNA，反转为cDNA，以此cDNA为模板通过qRT-PCR 进行PAL基因的表达分析。结果表明，与IR64相比，RNAi家系中多个PALs基因的表达均显著下调。OsPAL8转基因植株中OsPAL8的表达水平较背景亲本02428上调了10倍以上，而OsPAL6的表达却显著下调，上述结果表明OsPAL6转基因植株中该基因的表达受到了共抑制。

qRT-PCR引物序列如下：

OsPAL6 RT-F：

5'-GCTCTTCCGCACACACAACTC-3'；

OsPAL6 RT-R：

5'-TTGCTCGAGCGGTTTGC-3'；

OsPAL8 RT-F：

5'-CGGTGTCAACGGCTCAGGG-3'；

OsPAL8 RT-R

5'-GAGGTGGCTCCCCGCAAC-3'；

三、转基因植株的抗虫性鉴定

将待鉴定转OsPAL6、OsPAL8的材料、RNAi转基因材料及感虫受体品种02428(转基因方式如前所述)和抗虫受体亲本IR64分别浸种催芽，播种于直径5.8cm、高6.0cm, 盛满营养土的圆形塑料钵中(钵底有一小孔,便于渗透吸水)。置于65cm×44cm×14cm 的塑料周转箱内(保持水层约2cm)。每钵播种30粒已露白的萌动种子，接虫前4d间苗，淘汰病、弱苗，每钵保留20棵整齐一致的健苗用于接种褐飞虱幼虫。2次重复。当秧苗长至两叶一心时，进行接种鉴定。按每苗10头2-3龄褐飞虱接种。接种后的苗置于温室周转箱内或移栽到大田内生长，注意水肥管理。

抗虫品种IR64的死苗率约为17％，而RNAi家系的死苗率达70％以上(图1)；当感虫受体品种02428的死苗率仅为10％时，转OsPAL6家系已达的90％，上述结果表明下调OsPAL6的表达显著降低褐飞虱抗性(图3)。当感虫受体品种02428的死苗率为 90％时，转OsPAL8家系的死苗率在6％-25％之间。上述结果表达上调OsPAL8的表达可显著提高褐飞虱抗性(见图2)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种植物抗虫相关蛋白OsPAL6和OsPAL8及其编码基因与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 714

<212> PRT

<213> IR64水稻(Oryza sativa L. indica. cv)

<400> 1

Met Glu Cys Glu Asn Gly His Val Ala Ala Ala Ala Asn Gly Ser Ser

1 5 10 15

Leu Cys Val Ala Lys Pro Arg Ala Asp Pro Leu Asn Trp Gly Lys Ala

20 25 30

Ala Glu Glu Leu Ser Gly Ser His Leu Asp Ala Val Lys Arg Met Val

35 40 45

Glu Glu Tyr Arg Arg Pro Val Val Thr Ile Glu Gly Ala Ser Leu Thr

50 55 60

Ile Ala Gln Val Ala Ala Val Ala Ser Ala Gly Ala Ala Arg Val Glu

65 70 75 80

Leu Asp Glu Ser Ala Arg Gly Arg Val Lys Ala Ser Ser Asp Trp Val

85 90 95

Met Asn Ser Met Met Asn Gly Thr Asp Ser Tyr Gly Val Thr Thr Gly

100 105 110

Phe Gly Ala Thr Ser His Arg Arg Thr Lys Glu Gly Gly Ala Leu Gln

115 120 125

Arg Glu Leu Ile Arg Phe Leu Asn Ala Gly Ala Phe Gly Asn Gly Asp

130 135 140

Asp Gly His Val Leu Pro Ala Ala Ala Thr Arg Ala Ala Met Leu Val

145 150 155 160

Arg Ile Asn Thr Leu Leu Gln Gly Tyr Ser Gly Ile Arg Phe Glu Ile

165 170 175

Leu Glu Thr Ile Ala Thr Leu Leu Asn Ala Asn Val Thr Pro Cys Leu

180 185 190

Pro Leu Arg Gly Thr Ile Thr Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser

195 200 205

Tyr Ile Ala Gly Leu Val Thr Gly Arg Pro Asn Ser Val Ala Val Thr

210 215 220

Pro Asp Gly Arg Lys Val Asp Ala Ala Glu Ala Phe Lys Ile Ala Gly

225 230 235 240

Ile Gln His Gly Phe Phe Glu Leu Gln Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met

245 250 255

Val Asn Gly Thr Ala Val Gly Ser Gly Leu Ala Ser Met Val Leu Phe

260 265 270

Glu Ala Asn Val Leu Gly Val Leu Ala Glu Val Leu Ser Ala Val Phe

275 280 285

Cys Glu Val Met Asn Gly Lys Pro Glu Tyr Thr Asp His Leu Thr His

290 295 300

Lys Leu Lys His His Pro Gly Gln Ile Glu Ala Ala Ala Ile Met Glu

305 310 315 320

His Ile Leu Glu Gly Ser Ser Tyr Met Met Leu Ala Lys Lys Leu Gly

325 330 335

Glu Leu Asp Pro Leu Met Lys Pro Lys Gln Asp Arg Tyr Ala Leu Arg

340 345 350

Thr Ser Pro Gln Trp Leu Gly Pro Gln Ile Glu Val Ile Arg Ala Ala

355 360 365

Thr Lys Ser Ile Glu Arg Glu Ile Asn Ser Val Asn Asp Asn Pro Leu

370 375 380

Ile Asp Val Ser Arg Gly Lys Ala Leu His Gly Gly Asn Phe Gln Gly

385 390 395 400

Thr Pro Ile Gly Val Ser Met Asp Asn Thr Arg Leu Ala Ile Ala Ala

405 410 415

Ile Gly Lys Leu Met Phe Ala Gln Phe Ser Glu Leu Val Asn Asp Phe

420 425 430

Tyr Asn Asn Gly Leu Pro Ser Asn Leu Ser Gly Gly Arg Asn Pro Ser

435 440 445

Leu Asp Tyr Gly Phe Lys Gly Ala Glu Ile Ala Met Ala Ser Tyr Cys

450 455 460

Ser Glu Leu Gln Phe Leu Ala Asn Pro Val Thr Asn His Val Gln Ser

465 470 475 480

Ala Glu Gln His Asn Gln Asp Val Asn Ser Leu Gly Leu Ile Ser Ser

485 490 495

Arg Lys Thr Ala Glu Ala Ile Asp Val Leu Lys Leu Met Ser Ser Thr

500 505 510

Phe Leu Ile Ala Leu Cys Gln Ala Ile Asp Leu Arg His Leu Glu Glu

515 520 525

Asn Val Arg Ser Ala Val Lys Gly Cys Val Thr Thr Val Ala Arg Lys

530 535 540

Thr Leu Ser Thr Ser Ala Thr Gly Asp Leu His Lys Ala Arg Phe Cys

545 550 555 560

Glu Lys Asp Leu Leu Gln Ala Ile Asp Arg Glu Ala Val Phe Ala Tyr

565 570 575

Ala Asp Asp Pro Cys Ser Ala Asn Tyr Pro Leu Met Gln Lys Met Arg

580 585 590

Ala Val Leu Ile Glu His Ala Leu Ala Asn Gly Glu Ala Glu Arg Asn

595 600 605

Val Asp Thr Ser Val Phe Ala Lys Val Ala Thr Phe Glu Glu Glu Leu

610 615 620

Arg Val Ala Leu Pro Arg Glu Val Glu Ala Ala Arg Ala Ala Val Glu

625 630 635 640

Asn Gly Thr Ala Ala Lys Ala Asn Arg Ile Thr Glu Cys Arg Ser Tyr

645 650 655

Pro Leu Tyr Arg Phe Val Arg Glu Glu Leu Gly Thr Glu Tyr Leu Thr

660 665 670

Gly Glu Lys Thr Arg Ser Pro Gly Glu Glu Val Asn Lys Val Phe Val

675 680 685

Ala Met Asn Gln Gly Lys His Ile Asp Ala Leu Leu Glu Cys Leu Lys

690 695 700

Glu Trp Asn Gly Glu Pro Leu Pro Ile Cys

705 710

<210> 2

<211> 700

<212> PRT

<213> IR64水稻(Oryza sativa L. indica. cv)

<400> 2

Met Glu Cys Glu Thr Gly Val Asn Gly Ser Gly Pro Arg Gly Ser Asp

1 5 10 15

Pro Leu Tyr Trp Gly Lys Ala Ala Glu Gly Val Ala Gly Ser His Leu

20 25 30

Glu Glu Val Lys Arg Met Val Val Glu Tyr Arg Ala Pro Leu Val Lys

35 40 45

Ile Asp Gly Ala Met Leu Ser Val Ala Lys Val Ala Ala Val Ala Gly

50 55 60

Glu Ala Ala Arg Val Gln Val Val Leu Asp Glu Ser Ala Arg Pro Arg

65 70 75 80

Leu Glu Ala Ser Arg Glu Trp Val Phe Glu Ser Thr Met Asn Gly Thr

85 90 95

Asp Thr Tyr Gly Val Thr Thr Gly Phe Gly Gly Ala Ala His Arg Arg

100 105 110

Thr Lys Glu Phe Ala Ala Leu Gln Lys Glu Leu Ile Arg Tyr Leu Asn

115 120 125

Ala Gly Val Phe Gly Ala Ser Arg Ser Asp Gly Tyr Thr Leu Pro Thr

130 135 140

Glu Val Thr Arg Ala Ala Met Leu Val Arg Ile Asn Thr Leu Thr Gln

145 150 155 160

Gly Tyr Ser Gly Ile Arg Phe Glu Ile Leu Glu Ala Ile Ala Lys Leu

165 170 175

Leu Asn Ala Asn Val Thr Pro Cys Leu Pro Leu Arg Gly Thr Ile Thr

180 185 190

Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr Ile Ala Gly Leu Ile Thr

195 200 205

Gly Arg His Asn Ser Ala Ala Val Ala Pro Asp Gly Thr Lys Val Asp

210 215 220

Ala Ala Glu Ala Phe Arg Met Ala Gly Ile Glu His Gly Phe Phe Ala

225 230 235 240

Leu Gln Pro Lys Glu Gly Leu Ala Ile Val Asn Gly Thr Ala Val Gly

245 250 255

Ser Gly Leu Ala Ala Ile Val Leu Phe Glu Ala Asn Val Leu Ala Val

260 265 270

Leu Ala Glu Val Leu Ser Ala Val Tyr Cys Glu Val Met Ala Gly Asn

275 280 285

Pro Glu Tyr Thr Asp His Leu Ile His Ala Leu Lys His His Pro Gly

290 295 300

Gln Ile Glu Ala Ala Ala Ile Met Glu His Ile Leu Glu Gly Ser Ser

305 310 315 320

Tyr Met Lys Lys Leu Ala Lys Asp Lys Glu Gln Gly Gln Gly Glu Leu

325 330 335

Asp Arg Leu Thr Lys Leu Lys Gln Asp Arg Tyr Ala Ile Arg Thr Ala

340 345 350

Pro Gln Trp Leu Gly Pro Gln Val Glu Val Ile Arg Phe Ala Thr Lys

355 360 365

Ser Ile Glu Arg Glu Ile Asn Ser Val Asn Asp Asn Pro Val Ile Asp

370 375 380

Val Ala Arg Arg Lys Ala Leu His Gly Gly Asn Phe Gln Gly Thr Pro

385 390 395 400

Val Gly Val Ser Met Asp Asn Thr Arg Leu Ala Ile Ala Ala Ile Gly

405 410 415

Arg Leu Met Phe Ser Gln Phe Ser Glu Leu Val Ser Ser Phe Tyr Ser

420 425 430

Asn Gly Leu Pro Ser Asn Leu Ser Gly Gly Arg Asn Pro Ser Leu Asp

435 440 445

Tyr Gly Phe Asn Gly Ala Glu Val Ala Met Ala Ser Tyr Cys Ser Glu

450 455 460

Leu Gln Phe Leu Ala Asn Pro Val Thr Asn His Val Gln Thr Ala Glu

465 470 475 480

Gln His Asn Gln Ser Val Asn Ser Leu Gly Leu Ile Ser Ser Arg Met

485 490 495

Thr Ala Glu Ala Val Thr Ile Leu Lys Leu Met Ser Ser Thr Phe Leu

500 505 510

Ile Ala Leu Cys Gln Ala Val Asp Leu Arg Gln Leu Glu Glu Ser Ile

515 520 525

Lys Ala Ala Val Asn Lys Cys Val Thr Asn Val Ala Lys Lys Ser Leu

530 535 540

Thr Leu Ala Met Asp Asp Asp Asp His Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ala

545 550 555 560

Ala Ile Asp Arg Val Ala Val Phe Thr Tyr Ala Glu Asp Pro Cys Arg

565 570 575

Ser Ser Leu Pro Leu Met Gln Lys Leu Arg Ala Val Leu Met Glu His

580 585 590

Ala Leu Ala Asn Asn Gly Asp Ile Leu Leu Ala Lys Val Ala Glu Phe

595 600 605

Glu Gln Gln Leu Arg Ala Val Leu Pro Asp Glu Val Glu Ala Ala Arg

610 615 620

Ala Ala Val Glu Ser Gly Thr Ala Pro Asn Arg Ile Ser Asp Cys Arg

625 630 635 640

Ser Tyr Pro Leu Tyr Arg Phe Val Arg Lys Glu Leu Gly Ala Glu Tyr

645 650 655

Leu Thr Gly Glu Lys Thr Arg Ser Pro Gly Glu Glu Val Asp Lys Val

660 665 670

Val Ile Ala Met Asn Gln His Lys His Ile His Pro Leu Leu Glu Cys

675 680 685

Leu Ser Glu Trp Lys Gly Ala Pro Leu Pro Leu Ser

690 695 700

<210> 3

<211> 2145

<212> DNA

<213> IR64水稻(Oryza sativa L. indica. cv)

<400> 3

atggagtgcg agaacgggca cgtcgccgcc gccgccaacg gcagcagcct gtgcgtggct 60

aagccgcgtg ccgacccgct caactggggg aaggcggcgg aggagctgtc cgggagccat 120

ctggacgcgg tgaagcgcat ggtggaggag taccgcaggc ccgtggtgac gatcgagggc 180

gccagcctga ccatcgcgca ggtcgcggcg gtggcctccg ccggcgccgc cagggtggag 240

ctcgacgagt ccgcccgcgg ccgcgtcaag gccagcagcg actgggtcat gaacagcatg 300

atgaacggca ccgacagcta cggcgtcacc accggcttcg gcgccacctc ccaccggagg 360

accaaggagg gcggcgcgct ccagcgagag cttatccggt ttcttaatgc cggggcgttc 420

ggcaacggcg acgacggcca cgtgctgccg gccgcggcga cgcgggcagc catgctcgtc 480

cgcatcaaca ctctgctcca ggggtactct ggcatccggt tcgagatcct cgagacgatc 540

gccacgctgc ttaacgccaa cgtgacgccg tgcttgccgc tccggggcac gatcaccgcg 600

tccggcgacc tcgtcccgct ctcctacatc gcgggactcg tcaccggccg accaaactct 660

gtggcggtga cgcccgatgg caggaaggtg gatgccgcgg aggcgttcaa gatcgccggc 720

atccagcacg gcttcttcga gctccagccc aaggaaggcc tcgccatggt gaacggcacg 780

gccgtcggct ccgggctcgc ctcgatggtg ctctttgagg cgaacgtcct tggcgtgctc 840

gcggaggtcc tctccgcggt gttctgcgag gtcatgaacg gcaagccgga gtacaccgac 900

cacctgacgc acaagcttaa gcaccacccg ggacagattg aggcagccgc cattatggag 960

cacatcttgg aggggagctc ctacatgatg ctggcgaaga agctcggcga gctcgacccg 1020

ctgatgaagc ccaagcaaga caggtacgcg ctccgcacgt cgccgcaatg gctcggcccc 1080

cagattgagg tcatccgtgc cgccaccaag tcgatcgagc gcgagatcaa ctccgtcaac 1140

gacaacccgc tcattgacgt ctcccgtggc aaggcgctcc acggcggcaa cttccagggc 1200

acacccatcg gcgtgtccat ggacaacacc aggctcgcca ttgccgcgat cggtaagctc 1260

atgttcgcgc agttctctga gctcgtgaac gatttctaca acaacggcct gccgtccaac 1320

ctgtccggtg ggcgcaaccc gagcttggac tacggcttca agggtgccga gatcgccatg 1380

gcatcgtact gctctgagct ccagttcttg gccaaccctg tgaccaacca tgtccagagc 1440

gcggagcagc acaaccaaga cgtcaactct ctcggcctca tctcgtccag gaagacggcc 1500

gaggccatcg acgtgctcaa gctcatgtcc tcgacgttct tgatcgcgct atgccaggcc 1560

atcgacctgc gccacctcga agagaacgtc aggagcgccg tcaagggctg cgtgacgacg 1620

gtggcgagga agaccctgag caccagcgcc accggcgacc tccacaaggc ccggttctgc 1680

gagaaggacc tgctccaggc gatcgaccgc gaggccgtgt tcgcgtacgc ggacgacccc 1740

tgcagcgcca actacccgct gatgcagaag atgcgcgccg tcctcatcga gcacgcgctg 1800

gccaacggcg aggcggagcg caacgtcgac acctcggtgt tcgccaaggt cgcgacgttc 1860

gaggaggagc tccgcgtggc gctgcccagg gaggtggagg ctgcccgtgc ggccgtggag 1920

aacggcaccg ccgcaaaggc gaacaggatc accgagtgca ggtcgtaccc gctctaccgg 1980

ttcgtccgcg aggagctcgg gacagagtac ttgaccgggg agaagacgcg gtcgcccggc 2040

gaggaggtga acaaggtgtt cgtcgccatg aaccagggca agcacatcga cgcactgctc 2100

gagtgcctca aggagtggaa cggcgagcct ctgcccatct gctga 2145

<210> 4

<211> 2103

<212> DNA

<213> IR64水稻(Oryza sativa L. indica. cv)

<400> 4

atggagtgtg agaccggtgt caacggctca gggccgcgcg gcagcgaccc cttgtactgg 60

ggcaaggcgg cagagggtgt tgcggggagc cacctcgagg aggtgaagag gatggtggtt 120

gagtaccgcg cgccgctggt gaagatcgac ggcgccatgc tcagcgtcgc caaggtggca 180

gccgtcgccg gcgaggccgc ccgggtgcag gtggtgctgg acgaatccgc acgaccccgc 240

ctggaggcta gccgcgagtg ggttttcgaa agcaccatga atggcaccga cacgtacggc 300

gtcaccaccg gcttcggggg tgccgcccac cgccgcacca aggagttcgc cgcgctccag 360

aaagagctga tccgatacct caacgccggc gtctttggag ccagccgcag cgacggctac 420

acgctgccga cggaggtcac gcgcgcagcc atgctcgtgc gcatcaacac cctcacccag 480

ggctactcgg gcatccgctt cgagatcctc gaggccatcg ccaagctgct caacgccaac 540

gttacgccgt gcctgccgct ccggggcacc atcaccgcgt ccggcgacct ggtccctctg 600

tcctacatcg ccggcctaat caccggccgc cacaactccg cggcggtggc cccggacggc 660

accaaggtgg acgccgccga ggcattcagg atggccggca tcgagcacgg gttcttcgcg 720

ttgcagccca aggaagggct cgccatcgtc aacggcacgg ccgtgggctc cggcctcgcg 780

gcgatcgtgc tcttcgaggc caacgtcctc gccgtccttg ccgaggtcct ctcggcggtg 840

tactgcgagg taatggccgg caatccggag tacaccgacc acctcatcca cgcgctgaag 900

caccaccctg gacagatcga agctgcggcc atcatggagc acatactgga aggcagctcc 960

tacatgaaga agcttgccaa ggacaaggag cagggccagg gcgagcttga ccggctgacg 1020

aagctgaagc aggacaggta cgccatccgc acggcgccgc agtggctcgg cccgcaggtc 1080

gaggtcatcc gcttcgccac caagtccatc gagcgggaga tcaactccgt caacgacaac 1140

ccggtcatcg acgtcgcccg ccgcaaggcg ctccacggcg gcaacttcca gggcactccc 1200

gtcggggtgt ccatggacaa cactcgtctc gccatcgctg ccatcggcag gctcatgttc 1260

tcgcagttct ccgagctcgt cagtagcttc tacagcaacg gccttccctc caacctgtcc 1320

ggcgggcgca acccgagctt ggactacggt ttcaatggcg ccgaggtcgc catggcgtcc 1380

tactgctctg agctccagtt cctcgccaac ccggtgacca accatgtgca gaccgcggag 1440

cagcacaacc agagcgtcaa ctctctcggc ctcatctcct ccaggatgac tgcagaggcc 1500

gtcaccatcc tgaagctcat gtcctctact ttcctcatcg cactgtgcca ggccgtcgac 1560

ctgcgccaac tcgaggagag catcaaggcc gctgttaaca agtgcgtgac gaatgtcgcc 1620

aagaaatccc tgaccctggc catggacgac gacgaccatc tgctagcgct gctcggcgct 1680

gctatcgacc gcgtggcggt gttcacgtac gcagaagacc catgcagatc cagcttgcca 1740

ctcatgcaga agctccgcgc ggtgctcatg gagcatgcgc tggccaataa cggtgacatc 1800

ctcctggcca aggtggctga gttcgagcag cagctccgcg cggtgctccc cgacgaggtg 1860

gaggccgcac gcgccgctgt agagagcggc acggccccga acaggatctc cgactgccgc 1920

tcgtacccgc tgtacaggtt cgtgcgcaag gagctcggcg ccgagtacct gaccggcgag 1980

aagacgcggt ctcccgggga ggaggtggac aaggtggtga tcgccatgaa ccagcacaag 2040

cacatccatc cactgctgga gtgcctcagc gagtggaaag gcgcgcccct gccacttagc 2100

tga 2103

<210> 5

<211> 2745

<212> DNA

<213> IR64水稻(Oryza sativa L. indica. cv)

<400> 5

aagagcaaag ccactgcagc ttccatatcc ccggctcttc cgcacacaca actcctccac 60

ctccatcggg agcaaaccgc tcgagcaacc accactcgtt acagctacac atcgatctcc 120

cctctgcttc gccgttccga tggagtgcga gaacgggcac gtcgccgccg ccgccaacgg 180

cagcagcctg tgcgtggcta agccgcgtgc cgacccgctc aactggggga aggcggcgga 240

ggagctgtcc gggagccatc tggacgcggt gaagcgcatg gtggaggagt accgcaggcc 300

cgtggtgacg atcgagggcg ccagcctgac catcgcgcag gtcgcggcgg tggcctccgc 360

cggcgccgcc agggtggagc tcgacgagtc cgcccgcggc cgcgtcaagg ccagcagcga 420

ctgggtcatg aacagcatga tgaacggcac cgacagctac ggcgtcacca ccggcttcgg 480

cgccacctcc caccggagga ccaaggaggg cggcgcgctc cagcgagagc ttatccggta 540

agaagccgca agagtttgct gttcgtctgg tgagagcttg tgtggatcag aggcctaacg 600

tgtgttcctg taatggttgc catgacaggt ttcttaatgc cggggcgttc ggcaacggcg 660

acgacggcca cgtgctgccg gccgcggcga cgcgggcagc catgctcgtc cgcatcaaca 720

ctctgctcca ggggtactct ggcatccggt tcgagatcct cgagacgatc gccacgctgc 780

ttaacgccaa cgtgacgccg tgcttgccgc tccggggcac gatcaccgcg tccggcgacc 840

tcgtcccgct ctcctacatc gcgggactcg tcaccggccg accaaactct gtggcggtga 900

cgcccgatgg caggaaggtg gatgccgcgg aggcgttcaa gatcgccggc atccagcacg 960

gcttcttcga gctccagccc aaggaaggcc tcgccatggt gaacggcacg gccgtcggct 1020

ccgggctcgc ctcgatggtg ctctttgagg cgaacgtcct tggcgtgctc gcggaggtcc 1080

tctccgcggt gttctgcgag gtcatgaacg gcaagccgga gtacaccgac cacctgacgc 1140

acaagcttaa gcaccacccg ggacagattg aggcagccgc cattatggag cacatcttgg 1200

aggggagctc ctacatgatg ctggcgaaga agctcggcga gctcgacccg ctgatgaagc 1260

ccaagcaaga caggtacgcg ctccgcacgt cgccgcaatg gctcggcccc cagattgagg 1320

tcatccgtgc cgccaccaag tcgatcgagc gcgagatcaa ctccgtcaac gacaacccgc 1380

tcattgacgt ctcccgtggc aaggcgctcc acggcggcaa cttccagggc acacccatcg 1440

gcgtgtccat ggacaacacc aggctcgcca ttgccgcgat cggtaagctc atgttcgcgc 1500

agttctctga gctcgtgaac gatttctaca acaacggcct gccgtccaac ctgtccggtg 1560

ggcgcaaccc gagcttggac tacggcttca agggtgccga gatcgccatg gcatcgtact 1620

gctctgagct ccagttcttg gccaaccctg tgaccaacca tgtccagagc gcggagcagc 1680

acaaccaaga cgtcaactct ctcggcctca tctcgtccag gaagacggcc gaggccatcg 1740

acgtgctcaa gctcatgtcc tcgacgttct tgatcgcgct atgccaggcc atcgacctgc 1800

gccacctcga agagaacgtc aggagcgccg tcaagggctg cgtgacgacg gtggcgagga 1860

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aggcggagcg caacgtcgac acctcggtgt tcgccaaggt cgcgacgttc gaggaggagc 2100

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ccgcaaaggc gaacaggatc accgagtgca ggtcgtaccc gctctaccgg ttcgtccgcg 2220

aggagctcgg gacagagtac ttgaccgggg agaagacgcg gtcgcccggc gaggaggtga 2280

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aggagtggaa cggcgagcct ctgcccatct gctgattgct gaacagagga ccgacgagaa 2400

gatagcaaaa tattagcgtg tttcagaaat tcagaagttc acagatgtgc ttagctgatg 2460

ctgtaataag tatgcctttt ctttcatttt tttttaagtt cttgtttgca acgttctttg 2520

gaagttacga tgccatagcc aaatttagca atttgcatag aggcaggcag ctactaaaac 2580

tgctgttgat gtaagttaaa gggtgtaatt tgtgatactt ttccatggtc aattcgtgag 2640

agaactccaa acagtcagaa gaagttcatc tgttactgtc agagtgtcat gccatttggt 2700

ttatgaacat gattatacta aaataggacg cagtttataa acgtt 2745

<210> 6

<211> 2255

<212> DNA

<213> IR64水稻(Oryza sativa L. indica. cv)

<400> 6

atggagtgtg agaccggtgt caacggctca gggccgcgcg gcagcgaccc cttgtactgg 60

ggcaaggcgg cagagggtgt tgcggggagc cacctcgagg aggtgaagag gatggtggtt 120

gagtaccgcg cgccgctggt gaagatcgac ggcgccatgc tcagcgtcgc caaggtggca 180

gccgtcgccg gcgaggccgc ccgggtgcag gtggtgctgg acgaatccgc acgaccccgc 240

ctggaggcta gccgcgagtg ggttttcgaa agcaccatga atggcaccga cacgtacggc 300

gtcaccaccg gcttcggggg tgccgcccac cgccgcacca aggagttcgc cgcgctccag 360

aaagagctga tccggtacga ctttaattag ctgtacacta ctagtatact tgagtatttt 420

attttatact actaattgct cactgtcaca agctatatat aatgctagta attaattcgt 480

tcattgggtg ggtggttctg aatgaaaatc aaatacttca ttaaagatac ctcaacgccg 540

gcgtctttgg agccagccgc agcgacggct acacgctgcc gacggaggtc acgcgcgcag 600

ccatgctcgt gcgcatcaac accctcaccc agggctactc gggcatccgc ttcgagatcc 660

tcgaggccat cgccaagctg ctcaacgcca acgttacgcc gtgcctgccg ctccggggca 720

ccatcaccgc gtccggcgac ctggtccctc tgtcctacat cgccggccta atcaccggcc 780

gccacaactc cgcggcggtg gccccggacg gcaccaaggt ggacgccgcc gaggcattca 840

ggatggccgg catcgagcac gggttcttcg cgttgcagcc caaggaaggg ctcgccatcg 900

tcaacggcac ggccgtgggc tccggcctcg cggcgatcgt gctcttcgag gccaacgtcc 960

tcgccgtcct tgccgaggtc ctctcggcgg tgtactgcga ggtaatggcc ggcaatccgg 1020

agtacaccga ccacctcatc cacgcgctga agcaccaccc tggacagatc gaagctgcgg 1080

ccatcatgga gcacatactg gaaggcagct cctacatgaa gaagcttgcc aaggacaagg 1140

agcagggcca gggcgagctt gaccggctga cgaagctgaa gcaggacagg tacgccatcc 1200

gcacggcgcc gcagtggctc ggcccgcagg tcgaggtcat ccgcttcgcc accaagtcca 1260

tcgagcggga gatcaactcc gtcaacgaca acccggtcat cgacgtcgcc cgccgcaagg 1320

cgctccacgg cggcaacttc cagggcactc ccgtcggggt gtccatggac aacactcgtc 1380

tcgccatcgc tgccatcggc aggctcatgt tctcgcagtt ctccgagctc gtcagtagct 1440

tctacagcaa cggccttccc tccaacctgt ccggcgggcg caacccgagc ttggactacg 1500

gtttcaatgg cgccgaggtc gccatggcgt cctactgctc tgagctccag ttcctcgcca 1560

acccggtgac caaccatgtg cagaccgcgg agcagcacaa ccagagcgtc aactctctcg 1620

gcctcatctc ctccaggatg actgcagagg ccgtcaccat cctgaagctc atgtcctcta 1680

ctttcctcat cgcactgtgc caggccgtcg acctgcgcca actcgaggag agcatcaagg 1740

ccgctgttaa caagtgcgtg acgaatgtcg ccaagaaatc cctgaccctg gccatggacg 1800

acgacgacca tctgctagcg ctgctcggcg ctgctatcga ccgcgtggcg gtgttcacgt 1860

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tggagcatgc gctggccaat aacggtgaca tcctcctggc caaggtggct gagttcgagc 1980

agcagctccg cgcggtgctc cccgacgagg tggaggccgc acgcgccgct gtagagagcg 2040

gcacggcccc gaacaggatc tccgactgcc gctcgtaccc gctgtacagg ttcgtgcgca 2100

aggagctcgg cgccgagtac ctgaccggcg agaagacgcg gtctcccggg gaggaggtgg 2160

acaaggtggt gatcgccatg aaccagcaca agcacatcca tccactgctg gagtgcctca 2220

gcgagtggaa aggcgcgccc ctgccactta gctga 2255

Claims

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)或(C)的蛋白质：

(a)SEQ ID NO.1氨基酸序列所示的蛋白质；

(b)SEQ ID NO.2氨基酸序列所示的蛋白质；

(C)将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗虫相关的由序列1和序列2的衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1～6)任一项的DNA分子：

1)SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

2)SEQ ID NO.4所示的DNA分子；

3)SEQ ID NO.5所示的DNA分子；

4)SEQ ID NO.6所示的DNA分子；

5)在严格条件下与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5限定的DNA序列杂交且编码植物抗病毒相关蛋白的DNA分子；

6)与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5限定的DNA序列具有80％以上同源性且编码植物抗病毒相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，其特征在于：所述重组表达载体是在pCUbi1390载体的重组位点KpnⅠ和BamHⅠ之间插入权利要求2或3所述基因得到的重组质粒。

6.扩增权利要求2或3所述基因的全长及其任意片段的引物对。

7.权利要求1所述蛋白，权利要求2或3所述基因，权利要求4或5所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用，优选的在培育抗虫性特高的植物育种中的应用；进一步优选的，是在培育抗虫性特高的水稻育种中的应用；最优选的，在培育抗褐飞虱的水稻育种中的应用。

8.一种培育抗虫转基因植物的方法，其特征在于，是将权利要求2或3所述基因导入感虫植物中，得到抗虫的转基因植物；所述感虫植物为死苗率高于80％的植物；所述抗虫的转基因植物为发病率低于30％的转基因植物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述感虫植物中。