CN111826364B

CN111826364B - 一种抗病虫害相关基因及其应用

Info

Publication number: CN111826364B
Application number: CN201910242246.2A
Authority: CN
Inventors: 苗雪霞; 王美玲; 时振英
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2039-03-28
Also published as: CN111826364A

Abstract

本发明涉及一种抗病虫害相关基因及其应用。本发明揭示了来自禾本科植物的一种新型基因，命名为OsRLCK239.1，其具有调整植物的株型性状、提高植物抵抗病虫害的能力的作用。本发明可应用于植物的品种改良。

Description

一种抗病虫害相关基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学及植物学领域，更具体地，本发明涉及一种抗病虫害相关基因及其应用。

背景技术

粮食作物的病虫害一直是威胁粮食生产安全最严重的因素，培育抗病虫害的作物品种意义重大。

胞质内受体激酶(RLCK)是缺少胞外结合配体结构域的受体类激酶，大多数胞质内受体激酶仅含有Ser/Thr激酶结构域，而其他胞质内受体激酶还含有LRR，EGF，WD40或跨膜结构域。拟南芥和水稻中分别有149和379个胞质内受体激酶；在序列同源性的基础上，拟南芥和水稻胞质内受体激酶分为17个亚组。胞质内受体激酶已经成为一类主要的信号蛋白，可以响应生物或者非生物胁迫，也参与到植物生长发育的多个环节中。通过与免疫受体类激酶(Receptor-like Kinases，RLKs)相关联，胞质内受体激酶调节多个下游信号节点以协调植物对微生物病原体复杂的防御反应。在众多胞质内受体激酶成员中VII和XII亚族内的成员被研究的相对较多，主要参与PTI、ETI和油菜素内脂(Brassinolide，BR)信号通路中，水稻中还没有此类酶的研究。

在粮食作物水稻中，预测有120个胞质内受体激酶可以参与到生物与非生物胁迫中，目前胞质内受体激酶VIIa亚族组成员参与防御植物病害的研究较多。水稻胞质内受体激酶VIIa亚族中的OsRLCK57、OsRLCK107、OsRLCK118、OsRLCK176和OsRLCK102都可以负向调节BR信号，正向调节XA21介导的对黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)的抗性，而抗病机制主要是通过正向调节几丁质和肽聚糖(PGN)诱导的PTI免疫应答，包括活性氧生成，防御基因表达。下调OsRLCK55或者OsRLCK185的植株对Xoo更敏感；OsRLCK278(BROAD-SPECTRUM RESISTANCE 1，BSR1)属于RLCK-VIIb成员，可正向调节白叶枯和稻瘟病的抗性，最近被证明是具有酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸双重磷酸化能力的激酶。水稻中还没有RLCK参与ETI免疫途径的报道。

禾本科植物的病虫害一直是威胁粮食生产安全最严重的因素，培育抗病虫害的植物品种意义重大。田间环境复杂，植物同时面临多种病虫的侵害，植物品种最理想的性状应该是抗逆和保证产量，所以在研究中农艺性状与抗逆性状都应该被考虑。本领域中亟待对于植物进行农艺性状与抗逆性状改良有用的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗病虫害相关基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种OsRLCK239.1或其同源物或其上调剂的用途，用于：提高植物抵抗病虫害的能力或制备抵抗病虫害能力提高的植物；或改良植物的株型性状或制备株型改良的植物。

在一个优选例中，所述的病虫害包括：细菌；较佳地，所述的细菌包括：白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)，细菌性条斑病病菌(Xanthomonas oryzaepv.Oryzicola，oc)、水稻细菌性褐斑病病菌(Pseudomonas syringae pv.syringae VanHoll)及水稻细菌性基腐病病菌(Erwinia chrysanthemi pv.zeae(Sabet)Victria)等。

在另一优选例中，所述的病虫害包括：昆虫；较佳地，所述的昆虫为半翅目昆虫；更佳地为飞虱科昆虫，如褐飞虱(Nilaparvata lugens)，白背飞虱(Sogatella furcifera)和灰飞虱(Lalielphax striatellus)；更佳地，OsRLCK239.1或其同源物通过降低昆虫的取食量而提高植物抵抗病虫害的能力。

在另一优选例中，所述的改良植物的株型性状或制备株型改良的植物包括：降低植物的株高或制备株高降低的植物；促进植物叶片直立或制备叶片直立的植物；或提高植物籽粒的长宽比或制备籽粒长宽比提高的植物。

在另一优选例中，所述的OsRLCK239.1是：(a)如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白；或(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且与(a)蛋白功能相同的由(a)衍生的蛋白；或(c)氨基酸序列与(a)限定的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；更佳地98％或99％以上)相同性，且与(a)蛋白功能相同的由(a)衍生的蛋白；或(d)具有(a)蛋白功能的SEQ ID NO:2的蛋白片段。

在另一优选例中，所述的植物包括：禾本科植物；较佳地，所述的禾本科植物包括：水稻、高粱、玉米、大麦、小麦、燕麦、黑麦。

在另一优选例中，所述的OsRLCK239.1的上调剂包括：OsRLCK239.1的表达构建物、表达盒或表达载体；与OsRLCK239.1相互作用从而促进其表达或活性的分子。

在本发明的另一方面，提供一种提高提高植物抵抗病虫害的能力或改良植物的株型，或制备抵抗病虫害能力提高或株型改良的植物的方法，所述方法包括：提高植物中OsRLCK239.1或其同源物的表达或活性。

在一个优选例中，所述的方法包括：将编码OsRLCK239.1或其同源物的多核苷酸或构建物(如表达载体)转入植物中；或给予植物OsRLCK239.1的上调剂，从而提高植物中OsRLCK239.1或其同源物的表达或活性。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：(i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含编码OsRLCK239.1或其同源物的多核苷酸；(ii)利用农杆菌使所述编码OsRLCK239.1或其同源物的多核苷酸转入植物中。

在另一优选例中，所述的植物包括：禾本科植物；较佳地，所述的禾本科植物包括：水稻，小麦，大麦，玉米，高粱。

在本发明的另一方面，提供一种OsRLCK239.1或其同源物或编码其的多核苷酸的用途，用作鉴定植物的株型性状或抵抗病虫害的能力的分子标记物。

在本发明的另一方面，提供一种植物细胞，其表达外源的OsRLCK239.1或其同源物，或其包含外源的OsRLCK239.1或其同源物的表达盒；较佳地，该表达盒包括：启动子，OsRLCK239.1或其同源物的编码基因，终止子；较佳地，该表达盒被包含在构建物或表达载体中。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、OsRLCK239.1的表达谱及激酶特性。a OsRLCK239.1的表达谱，n＝3；bOsRLCK239.1同源蛋白的进化分析结果，使用MEGA6.06软件，采用临近法(Neighbor-jioning)进行进化分析，使用Bootstrap Method(replications＝500)；c酵母双杂验证OsRLCK239.1自身的互作关系，-LT表示Leu和Trp缺陷型的SD酵母培养基，-LTHA表示Leu，Trp，His和Ade缺陷型的SD酵母培养基；d BiLC验证OsRLCK239.1自身互作关系，OsRLCK239.1-nLUC+cLUC-OsRLCK239.1是验证组，其他组合为对照组；e液相质谱分析OsRLCK239.1的自磷酸化位点分布。

图2、OsRLCK239.1转基因植株发育表型统计结果。a OsRLCK239.1OE阳性植株的鉴定，n＝3；b，c大田中OsRLCK239.1OE植株成熟期株高表型及统计结果，n＝10；dOsRLCK239.1OE节间统计结果，n＝10；e，f穗长照片及穗长统计结果，n＝15；gOsRLCK239.1OE分蘖数统计结果，n＝10；h OsRLCK239.1OE有效分蘖数的统计结果，n＝10；iOsRLCK239.1OE单穗籽粒重量；j OsRLCK239.1OE单穗籽粒数；k OsRLCK239.1OE千粒重统计结果。i、j和k统计了不同品系的15个稻穗，籽粒统计数分别为n_wt＝1451，n_oe1＝1340，n_oe6＝1110，n_oe22＝1375。计算显著性差异时使用t检验统计分析，显著性差异依据*P<0.05，**P<0.01区分。

图3、OsRLCK239.1cas9植株的农艺性状。a OsRLCK239.1OE1和WT开花时期的田间照片；b OsRLCK239.1cas9敲除品系的敲除位点，绿色表示的是向导序列，黄色的虚线表示缺失，红色的表示多出的碱基，67和86表示的是OsRLCK239.1编码基因中对应的碱基位置序号；c，dOsRLCK239.1cas9敲除品系的田间照片；e田间统计分析OsRLCK239.1cas9和野生型水稻的株高，n＝10；f统计分析OsRLCK239.1cas9-2(cas2)和野生型水稻品系的节间长度，n＝15；g，h，i分别统计野生型、对照和OsRLCK239.1cas9敲除品系的有效分蘖数，n＝10、稻穗长度，n＝15和分蘖数，cCON代表空质粒转基因植株，n＝10。计算显著性差异时使用t检验统计分析，显著性差异依据*P<0.05，**P<0.01区分，无星号表示差异不显著。

图4、OsRLCK239.1OE植株的抗虫表型和机制。a褐飞虱处理野生型水稻后OsRLCK239.1基因的表达情况，使用t检验进行显著性分析(*P<0.05，**P<0.01，n＝3)；bOsRLCK239.1OE不同品系的的抗褐飞虱表型；c单株抗褐飞虱实验中水稻苗死亡率统计结果，抗虫实验中每个品系选择8株水稻，三次重复，n＝3；d，e褐飞虱对OsRLCK239.1OE品系和野生型品种的选择性实验，每个品系重复8次，n＝8；f褐飞虱取食不同水稻品系后增重实验结果，n＝15；g褐飞虱在不同品系上的取食量，使用蜜露量作为分析对象，n＝15；h褐飞虱在不同品系上存活率统计结果，时间跨度为两周，n＝10。数据使用t检验显示显著性差异(*P<0.05，**P<0.01)。

图5、OsRLCK239.1cas9植株的感褐飞虱表型。a OsRLCK239.1cas9植株的感褐飞虱表型；b单株抗虫实验中不同水稻品系的存活率，每次实验每个品系含有8株水稻，抗虫实验重复3次，n＝3；c褐飞虱在OsRLCK239.1cas9和野生型植株上的存活率，时间跨度两周，n＝10，d，e分别表示褐飞虱在OsRLCK239.1cas9和野生型植株上的蜜露量和褐飞虱增重，n＝15。数据使用t检验显示显著性差异(*P<0.05，**P<0.01)。

图6、OsRLCK239.1OE抗白叶枯表型。a接白叶枯14天后OsRLCK239.1OE抗白叶枯的照片，比例尺＝2cm；b OsRLCK239.1OE和WT的病斑长度的数理统计，n＝40；cOsRLCK239.1OE和WT抗病级别的统计结果；d白叶枯99A病菌在OsRLCK239.1OE和WT植株中的生长曲线，n＝3。t检验显示显著性差异(*P<0.05，**P<0.01)。

图7、OsRLCK239.1cas9植株对白叶枯的表现。a，b OsRLCK239.1cas9植株接白叶枯病6天后的表型(比例尺＝2cm)和病斑长度统计结果，n＝20；c，d，e分别表示OsRLCK239.1cas9植株接白叶枯病14天后的表型(比例尺＝2cm)、病斑长度统计和抗性级别统计结果，n＝40。t检验显示显著性差异(*P<0.05，**P<0.01)。

图8、OsRLCK239.1参与的信号通路。a，b分别外源施加500uM SA和400uM JA后野生型水稻中OsRLCK239.1的表达变化，使用两周大中花11，分别在激素处理后的0，1，2和4小时进行RNA抽提和检测，n＝3；c，d JA合成通路中的基因Hi-LOX和AOS2在OsRLCK239.1OE和WT植株中的表达量，n＝3；e，f SA合成通路中的基因PAL和EDS1在OsRLCK239.1OE植株中的表达量，n＝3；g SA信号通路中的NPR1在OsRLCK239.1OE和WT植株中的表达量，n＝3；h，i，jMAPK信号通路中的MEK4，MPK3和MPK6在OsRLCK239.1OE和WT植株中的表达量，n＝3.t检验显示显著性差异(*P<0.05，**P<0.01)。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了来自禾本科植物的一种新型基因，命名为OsRLCK239.1，其具有调整植物的株型性状、提高植物抵抗病虫害的能力的作用。本发明可应用于植物的品种改良。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(例如，本发明中的OsRLCK239.1)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。

在研究前期，本发明人从RNA-seq数据中发现一个功能未明确的蛋白，命名为OsRLCK239.1；并且证明了OsRLCK239.1可以形成同源二聚体发生自磷酸化；超表达植株的抗褐飞虱和白叶枯的能力是极显著的，使用Crisper/cas9方法构建的敲除品系呈现相反的感褐飞虱和白叶枯的表型；并且确定OsRLCK239.1可能是参与MAPK级联反应、SA和JA的信号通路调控植株的抗生能力。

如本文所用，所述的“植物(作物)”是包含OsRLCK239.1或其同源物的植物；较佳地，所述的植物包括但不限于：禾本科植物、十字花科植物、茄科植物、大戟科植物等。更佳的，所述的植物是禾本科植物。比如，所述的“植物”包括但不限于：水稻、高粱、玉米、大麦、小麦、燕麦、黑麦等。

本发明还包括OsRLCK239.1的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的OsRLCK239.1相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种OsRLCK239.1的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，OsRLCK239.1的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的OsRLCK239.1的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长OsRLCK239.1的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长OsRLCK239.1的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，术语“OsRLCK239.1”指具有OsRLCK239.1活性的SEQ ID NO:2序列的多肽。该术语还包括具有与OsRLCK239.1相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端(特别是N末端)添加或缺失一个或数个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端(特别是N末端)添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括OsRLCK239.1的活性片段和活性衍生物。

任何与所述的OsRLCK239.1同源性高(比如与SEQ ID NO:2所示的序列的同源性为50％或更高；优选的，同源性为60％或更高；优选的，同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有OsRLCK239.1相同功能的蛋白也包括在本发明内。

在本发明中，“OsRLCK239.1保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

应理解，虽然本发明的OsRLCK239.1优选获自水稻，但是获自其它植物的与水稻中OsRLCK239.1高度同源(如具有60％以上，如70％、75％、80％、85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它多肽也在本发明考虑的范围之内，这些多肽也称为OsRLCK239.1的“同源物”。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明还涉及编码本发明OsRLCK239.1或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或OsRLCK239.1编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。

本发明还提供了一种改良植物的方法，该方法包括提高植物中OsRLCK239.1的表达。所述的改良植物包括：提高植物抵抗病虫害的能力，改良植物的株型性状。在得知了所述的OsRLCK239.1的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来提高所述的OsRLCK239.1的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带OsRLCK239.1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的OsRLCK239.1。

优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源的OsRLCK239.1的编码多核苷酸转入植物组织、器官或组织，获得转化入OsRLCK239.1的编码多核苷酸的植物组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了外源OsRLCK239.1的编码多核苷酸的植物组织、器官或种子再生成植物植株。

其它增加OsRLCK239.1基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强OsRLCK239.1基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该OsRLCK239.1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

基于本发明人的上述新发现，本发明还提供了一种OsRLCK239.1的上调剂的用途，用于提高植物抵抗病虫害的能力或制备抵抗病虫害能力提高的植物；或改良植物的株型性状或制备株型改良的植物。

如本文所用，所述的OsRLCK239.1的上调剂包括了促进剂、激动剂等。任何可提高OsRLCK239.1蛋白的活性、维持OsRLCK239.1蛋白的稳定性、促进OsRLCK239.1蛋白的表达、促进OsRLCK239.1蛋白的分泌、延长OsRLCK239.1蛋白有效作用时间、或促进OsRLCK239.1的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于进行植物改良的有效物质。

作为本发明的优选方式，所述的OsRLCK239.1蛋白的上调剂包括(但不限于)：在转入细胞后可表达(优选过表达)OsRLCK239.1的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码OsRLCK239.1的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

此外，本发明还涉及利用OsRLCK239.1或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用OsRLCK239.1或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中OsRLCK239.1的表达情况，鉴定植物的株型性状以及抵抗病虫害的能力。在对待测植物进行评估时，可通过测定OsRLCK239.1的表达量或mRNA量，了解待测植物中的表达或mRNA量是否高于此类植物的平均值，若是显著高，则其具有更高的抵抗病虫害的能力，或其在株型上呈现半矮秆的株型，或其叶片相对更直立。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

水稻、褐飞虱和白叶枯

水稻(Oryza sativa)转基因背景材料品种为中花11(Zhonghua11)，由中科院植物分子遗传重点实验室提供。水稻感虫品种TN1(Taichung Native 1)，种子由中国水稻研究所提供；植物材料在人工气候室培养。水稻生长条件为12h光照，12h黑暗，28±2℃。田间试验材料种植在松江五厍农场，转基因水稻材料按照相关部门的规定种植，专门种植于供试转基因水稻的围墙内。

水稻褐飞虱BPH，Nilaparvata lugens

原始虫源采自上海松江五厍农场；室内(温度26±2℃；光照12h；湿度70-80％)以TN1水稻苗进行饲养、繁殖。

黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)：PXO99A。在PSA培养基中，28±2℃培养箱中生长。

质粒

本发明涉及的质粒如表1所示。

表1

进化树构建

以OsRLCK239.1蛋白序列在水稻数据库(Rice Genome Annotation Project，RGAP)中进行BLAST，以得分数最高的三个同源序列以及已经有功能报道RLCK基因下载蛋白序列进行进化分析。

超表达载体构建

扩增OsRLCK239.1的编码区序列，使用酶切链接的方法连入pCambia1301::35s载体的SpeI，KpnI位点。

OsRLCK239.1的编码序列(核苷酸序列)如下：

ATGAGGTCATCCAGCGATTGCAAGGTTGTGGCGGCGGCGGCGAGGAAGAAGGAGAAGGAGGCGGCGGCGTGGCCGTGGTCGCTGTGGGGGTTCCTCCTGACCGGCTGCCTCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGGAAGAAGAAGAGCGGGGGGAAGAAGGTGCGTCCCCGCGGCGGCGGCGGCGGCCTGCGGCGGCTGTCGTTCACGGACCTGACGGGGGCGGCGGACCAGGACCTGTCGGTGTCGCTGGTGGGGTCCAACCTCCACGTCTTCACCGTCGCCGAGCTCCGCGACGCCACCCGCGGGTTCGTCTCCGGCAACTTCCTCGGCGAGGGCGGCTTCGGGCCGGTCTACAAGGGCCTCGTCGGCGACGGCGTCAAGCCGGGCCTCCGCCCGCAGGCCATCGCCGTCAAGCTCTGGGATCCCGAGGGCGCCCAGGGCCACAAGGAATGGCTGGCAGAGGTGATCTTCCTTGGCCAGCTTCGGCATCCCAACCTGGTGAAGCTGGTCGGCTACTGCTGCGAGGACGAGAACCGCCTCCTCGTCTACGAGTACATGGAGCATGGCAGCCTCGAGAACCACCTCTTCAAACAGATTCCTGCCGTGCTGCCGTGGTCGACCCGATTAAACATCGCGGTTGGCGCCGCGAAGGGTTTGGCGTTCCTCCACGACGCAGAGAAGCCGGTCATCTACCGTGACTTCAAGGCTTCCAACATCCTGCTCGATTCGGATTACAAGGCGAAGCTGTCGGACTTCGGGCTGGCCAAGGACGGGCCGGAGGGGGACGACACCCACGTGTCGACGCGCGTGATGGGCACCCATGGCTACGCCGCGCCGGAGTACATCATGACCGGCCACCTGACGGCGAAGAGCGACGTGTACAGCTTCGGCGTGGTGCTCCTGGAGATCCTGACGGGGCGGCGCGCCGTCGACAAGACGCGGCCGAACAGGGAGCAGAGCCTCGTGGAGTACGCGCGGCCGTGCCTGCGCGACCCGCTCCGGCTCATCCGGATCATGGACCCGGCGCTGGAGGGGCGCTACTCGCCGGCGGCGGCGAGGGAGGCGGCCGCCGTCGCCTACCGGTGCCTCAGCGGGAGCCCCAAGAACCGCCCCGACATGTCCGCCGTCGTCGACGCGCTCGAGCCGCTGCTCGTCGCCACCGACGACGTCCCCCTCGGCCCCGTCGTGCTGTTCGTCGCGCCGGATCAGGAGGCCGACGCCGCCGCCGCCGCCGACGACGACGAGGACGACAAGGCCCGGCGGCGGCAGCGGCGGACGCGGAAGGACGAGCAGCACCGCCGCCGCAGCCGCCTCCGGACGTCGCCCAAGGGCAGCCCGAGGAAGCCCGCCGTCGCCGCCGCTTGCCGGAACGAGGAGTTCTGGGTGTGGCACGTCCCCGCCGACCACAAGGCGTGA

OsRLCK239.1的氨基酸序列如下：

MRSSSDCKVVAAAARKKEKEAAAWPWSLWGFLLTGCLGGGGGGGKKKSGGKKVRPRGGGGGLRRLSFTDLTGAADQDLSVSLVGSNLHVFTVAELRDATRGFVSGNFLGEGGFGPVYKGLVGDGVKPGLRPQAIAVKLWDPEGAQGHKEWLAEVIFLGQLRHPNLVKLVGYCCEDENRLLVYEYMEHGSLENHLFKQIPAVLPWSTRLNIAVGAAKGLAFLHDAEKPVIYRDFKASNILLDSDYKAKLSDFGLAKDGPEGDDTHVSTRVMGTHGYAAPEYIMTGHLTAKSDVYSFGVVLLEILTGRRAVDKTRPNREQSLVEYARPCLRDPLRLIRIMDPALEGRYSPAAAREAAAVAYRCLSGSPKNRPDMSAVVDALEPLLVATDDVPLGPVVLFVAPDQEADAAAAADDDEDDKARRRQRRTRKDEQHRRRSRLRTSPKGSPRKPAVAAACRNEEFWVWHVPADHKA*

BiLC载体构建

将pCambia1300-nLUC，pCambia1300-cLUC载体使用KpnI和SalI切成单链，使用同源重组的方式将OsRLCK239.1的编码序列分别连入载体pCambia1300-nLUC和载体pCambia1300-cLUC中。

酵母双杂载体构建

将OsRLCK239.1编码序列使用同源重组的方法分别连入pADT7，pBKT7的EcoRI和BamHI的位点上，分别选用EcoRI和BamHI酶切位点的5’，3’端的20bp为同源臂。

原核表达载体构建

将OsRLCK239.1编码序列的全长和去掉信号肽的编码序列(193-1413bp)使用同源重组的方法连入pGEX4T1-1的EcoRI和BamHI酶切位点中。

CRISPR-Cas9技术

设计Spacer：在文本库中找到基因号对应的可用识别序列，与cds和基因组序列对比，选在靠近5’端编码区的，并且以NGG为结尾，去掉NGG在5’端加上8个前段序列，F端加GGCA，R端加AAAC，引物共20bp。将选择的引物输入到靶点脱靶预测网站CRISPER-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)，进行脱靶预测，将sgRNA输入引物结构预测网站OligoEvaluater(http://www.oligoevaluator.com)，点击Calcute，得到基因分析。综合考虑Tm(56～62)、GC content(45～60％)、secondary structure及试验结果来最终确定适宜的sgRNA序列，高score的序列不一定是最佳序列。根据最终结果，确定的sgRNA引物如下：

sgRNA-OsRLCK239.1F：GGCAGCGTGGCCGTGGTCGCTGTG

sgRNA-OsRLCK239.1R：AAACCACAGCGACCACGGCCACGC

合成Spacers双链片段，链接到pOS-sgRNA的BsaI位点，构建pOS-sgRNA-OsRLCK239.1。之后，连入pOS-Cas9载体中，得到pOS-Cas9-OsRLCK239.1。进行转基因植株的组培实验。

水稻单株抗虫实验

分别进行苗期和分蘖期的单株抗虫鉴定。选择大小均一的两周大水稻苗，单株定植于5x5cm小盒内，每株苗接入8头2～3龄褐飞虱，在一个品系接近全部死亡时进行拍照和统计死亡率，每次实验单株品系8个重复，共重复3次实验。对于分蘖期抗虫鉴定，需要剪掉分蘖后两天，再进行抗虫鉴定，接入20头2-3龄褐飞虱。接虫后需要每天观测水稻状态，大约5～8天可以进行拍照和水稻死亡率统计。

褐飞虱对水稻的选择性实验

选取1个月大小水稻苗，放在9×9×9cm装满泥土的盒子里，每个转基因品系植株两株，位于盒子对角处，另外两个对角处移植野生型ZH11，每个转基因品系种植8盒，对OsRLCK239.1OE1和OE6进行选择性试验。吸取15头雌性成虫，置于盒子中部，按照0，1，3，6，12，24，48小时时间点记录每株水稻上褐飞虱的数目。记录同一个盒子内的同品系植株上褐飞虱总数，计算8个重复的平均值进行比较。

褐飞虱蜜露量和虫增重实验

5头三龄的褐飞虱若虫，分别放入称过重量的蜡袋，再次称重可以得到褐飞虱的初始重量，挂在植株上，两天后再次称量蜡袋总重和移除若虫的总重。可以算出褐飞虱的增重以及褐飞虱取食后分泌出的蜜露量。

褐飞虱存活率统计

一个月大水稻苗，分别种植于小塑料盒内，每株水稻接入15头二龄若虫，两周后，计录存活下来的虫数目。每个品系重复5株。

白叶枯病菌接种及生长曲线制作

1)取-80℃冰箱内保存的PXO99A菌种，在PSA平板上划板子活化1次，置于28℃培养48-72h。

2)长出单克隆菌落后，挑单克隆至PSA液体培养基小摇1-2天。

3)吸取100μl菌液至PSA(15mg/L头孢氨苄)平板，用干净涂棒均匀涂布，置于28℃培养48h。根据菌液浓度和接种需求调整图板数目。长出的白叶枯病菌可用于水稻接种。

4)将PSA培养基上长好的白叶枯菌用无菌水，使用涂布器刮洗下来，稀释至OD值为1.0。

5)用剪刀沾取菌液，斜向下在叶尖2cm左右的位置剪去水稻叶尖，每株选3个分蘖剪2-3片，主要选取倒二叶和倒三叶。蘸取一次菌液剪三片伸展状态的叶片。

6)接种12-14天后，量取叶片病斑的长度及叶片总长度(用于抗性级别鉴定使用)。级别与病斑大小的对应关系如表2。

表2

级别	病斑大小
		0，高抗(HR)	剪口处无明显病斑
1，抗(R)	病斑向下扩展，长度2～3cm
		3，中抗(MS)	病斑长度小于接种叶片长度的1/4
5，中感(MS)	病斑长度大于接种叶片长度的1/4，但小于1/2
		7，感(S)	病斑长度大于接种叶片长度的1/2，但小于3/4
9，高感(HS)	病斑长度大于接种叶片长度的3/4

生长曲线的制作

1)研钵中先加入少量95％工业酒精燃烧，并冷却至室温(作用是灭菌)。

2)取接病不同天数的水稻叶片10cm，每个样品含3张叶片，表面用75％乙醇擦拭干净，剪碎放到研钵中，加入少量灭菌的石英砂和2ml灭菌水，在超净工作台内研磨好后，继续加无菌水至10ml，振荡混匀，充分释放菌体。

3)将振荡混匀后的菌液取出少量做梯度稀释(通常要做100倍，1000倍，10000倍的稀释)，涂含有15mg/L头孢氨苄(cephalexin，BBI公司的PSA平板，待生长2-3天后，统计长出的克隆数目，每个时间点每个材料做三个重复。

4)最后计算每种材料的Bacterial population[Log(c.f.u./leaf)]。

酵母双杂筛库

1)将质粒BD-HLH61转入AH109酵母菌株中并验证其自激活作用。

2)挑取BD-HLH61较大的阳性单克隆放入50ml SD/–Trp培养基中，30℃震荡(250–270rpm)培养(16-20hr)至OD600＝0.8左右，离心收集菌体(1，000g，5min)，倒掉上清，用4–5ml SD/–Trp液体培养基重悬，血球计数板计数每毫升菌液细胞数>1x10⁸。

3)从1ml文库菌液(Y178)中取出10ul菌液制作稀释梯度溶液(1/100，1/1，000，1/10，000)分别涂布在SD/–Leu固体培养基检测文库容量后，与AH109(BD-HLH61)重悬菌液混合后放入2L的烧瓶中，加入45ml 2xYPDA液体培养基(含有50μg/ml卡纳抗生素)，并用1ml2xYPDA培养基清洗两次文库菌液的小瓶加入到大烧瓶中。

4)30℃低速震荡(40–60rpm)培养20-24hr，40x显微镜检测到’三叶草’或’米老鼠’样的Mating菌出现时，停止摇菌。

5)1，000g，10min收集菌体，用50ml 0.5xYPDA(含有50μg/ml卡纳抗生素)液体培养基清洗2次2L的烧瓶并收集菌体，再次离心去上清。

6)最后用10ml 0.5xYPDA/Kan培养基重悬菌体，总体积约是11.5ml。

7)杂化效率测定：取出30ul杂化菌液按照1/10，1/100，1/1，000，和1/10，000的比例稀释，并分别涂在SD/–Trp、SD/–Leu和SD/–Leu/–Trp的100mm的平板上，30℃培养3–5天。

8)将剩下的Mating菌液以每一个150mm平板涂布200ul的量，涂在四缺培养基上(50-55个平板)，30℃培养3–5天。

9)统计平板上菌落的个数，计算杂化效率(2-5％)。

10)将四缺平板上的菌落转移到新的四缺培养基上，去掉假阳性的菌落。

11)使用酵母菌落PCR进行片段扩增，引物使用AD载体的通用引物T7和3’AD，纯化PCR，以T7引物测序。

12)从测序结果中挑选候选基因，并提取对应酵母质粒，重新与诱饵质粒以醋酸锂的方法共转，确定互作关系。

荧光素酶互补实验(BiLC)

将OsRLCK239.1-nLUC，cLUC-OsRLCK239.1，nLUC和cLUC转入农杆菌GV3101，鉴定阳性菌落后，将鉴定后的菌体，转入液体培养基中，离心收集菌体，洗涤后再次离心，与工作液孵育1-2hr，并以单一菌液终浓度OD₆₀₀约1.0，一起注射烟草，对照组与实验组注射入同一片烟草的1/4；三天后，注射荧光素酶底物30mg/ml稀释200倍后进行注射(翊圣公司，货号40901)，将烟草叶片剪下，保证注射面积一致，使用冷的CCD相机在黑暗中收集荧光信号10min，有荧光表达表示蛋白发生互作。

大田农艺性状统计

测量10个单独茎干不同节间的长度，平均值作为节间长度；每株植株的穗头数作为有效分蘖数，每个品系统计10株；在不同品系植株中随机量取15穗的长度进行统计分析；单穗籽粒数，重量，结实率，籽粒长宽，千粒重等籽粒性状使用仪器万深自动考种分析仪进行批量分析，每个实验15个重复。

体外磷酸化

磷酸化实验反应体系(40μl体系)

用ddH₂O补齐至40ul。30℃反应45min。

加入15ul 4X蛋白loading Buffer，95℃煮10min。

跑蛋白胶，100V，80min。

然后考马斯亮蓝染色，脱色后切取目的条带，进行质谱样品制备。

实施例1、OsRLCK239.1的表达谱及同源基因分析

本发明人从下调HLH61植株的RNA-seq数据中发现未知功能基因OsRLCK239.1。经分析，其蛋白含有激酶结构域，属于胞质内受体类蛋白激酶(receptor-like cytoplasmickinase，RLCK)VIIa亚族成员(Liu等，2011)。OsRLCK239.1的时空表达分析后还发现OsRLCK239.1在白叶枯危害部位叶片和褐飞虱取食部位叶鞘中大量积累(图1a)。OsRLCK239.1同源蛋白的进化分析结果如图1b。已有文献报道激酶倾向形成同源二聚体发生自磷酸化的现象(Han等，2014)，通过酵母双杂(图1c)和BiLC实验(图1d)验证OsRLCK239.1可以自身形成同源二聚体；将OsRLCK239.1基因连入带有GST标签的原核表达载体中进行蛋白纯化，进行体外磷酸化实验之后，使用液相质谱的方法鉴定OsRLCK239.1的自磷酸化位点，部分Ser(S)和Thr(T)氨基酸上可以发生磷酸化(表1)并统计主要磷酸化区域(图1e)，自磷酸化区域只要集中在激酶结构域，在甘氨酸聚集区段的下游也存在少数的自磷酸化位点(图1d)。这些特点证明OsRLCK239.1是可以自身形成二聚体发生自磷酸化具有功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。

实施例2、OsRLCK239.1OE植株株高降低

确定了OsRLCK239.1蛋白是具有功能的激酶后，进行转基因植株的构建。将OsRLCK239.1的编码序列连入到pCambia1301::35s超表达载体中，用农杆菌转染的方法培育转基因水稻。

通过荧光定量检测选取3个超表达阳性品系(OsRLCK239.1OE)，简写为OE1，OE6和OE22(图2a)；OsRLCK239.1OE植株发育表型有显著的变化，其中株高变化最为显著，在田间试验时取单株进行拍照(图2b)并统计株高(图2c)和以OE1为代表进行了节间长度的统计(图2b，d)，图中OE1的叶片较为直立，这个现象在花期更为显著(图3a)。

除此之外，对产量相关性状进行统计，发现除了OsRLCK239.1OE植株的穗长变短(图2e，f)外，分蘖数(图2g)和有效分蘖数(图2h)与野生型无差异，单穗的籽粒重量(图2i)，籽粒数(图2g)和千粒重(图2k)都没有显著差异，除了OE6品系存在差异，可能是因为OE6中OsRLCK239.1的表达量是最高的，OsRLCK239.1这个基因有剂量效应导致的(图2a)；而OsRLCK239.1OE籽粒的长宽比是显著高于野生型的，而籽粒的面积小于野生型(表3)，说明籽粒的性状发生了变化，但是仍然没有改变籽粒的质量(图2k)。

表3、OsRLCK239.1OE籽粒性状

表1中，籽粒性状使用万深自动考种分析仪进行籽粒指标考察，每个品系选择15个稻穗的籽粒进行统计。

从上面的结果，本发明人认为，OsRLCK239.1OE植株是具有半矮秆的株型，又不影响产量的转基因植株。

本发明人使用Crisper/cas9的技术构建了OsRLCK239.1的敲除植株，敲除使用的引导序列位于OsRLCK239.1编码序列的67-86的位置，并且获得两种突变品系(OsRLCK239.1cas9)，分别简单命名为cas2，cas7和cas18，其中cas2缺失了14bp，而cas7和cas18都是在83碱基的位置后多出一个T碱基(图3b)，这两种突变都可以彻底改变OsRLCK239.1蛋白序列。

在发育性状上，敲除OsRLCK239.1并没有在株高(图3c，d，e)、节间长度(图3f)、有效分蘖数(图3g)、穗长(图3h)和分蘖数(图3i)上发生变化，这部分功能可能被OsRLCK239.1冗余的同源基因补充了。OsRLCK239.1cas9植株农艺性状没有发生改变。

实施例3、OsRLCK239.1可以正向调节水稻对褐飞虱虫害的抗性

根据前述实施例2的结果，OsRLCK239.1OE植株可以使水稻株高变矮，本发明人进一步分析OsRLCK239.1对褐飞虱的作用。

首先使用qRT-PCR检测处理的野生型水稻中OsRLCK239.1的表达变化，结果显示OsRLCK239.1可以响应褐飞虱取食活动，并在诱导后的第3、7和12小时的表达量显著提高(图4a)。

然后，通过单株抗虫实验(图4b)及实验中水稻死亡率统计结果(图4c)确定超表达OsRLCK239.1植株呈现极显著的抗褐飞虱的能力。

为了明确基因的抗虫机制，又进行了褐飞虱对水稻品系的选择性实验，结果显示，OE1在接虫第6个小时(图4d)和OE6在接虫的第12个小时(图4e)有显著差异。

在OsRLCK239.1OE和WT的不同品系上分别进行褐飞虱取食的蜜露量测定实验(图2f)、褐飞虱生长状态增重实验(图2g)和褐飞虱存活率实验(图2h)。结果证明，褐飞虱取食OsRLCK239.1OE植株时取食量是显著降低的(图2f)，进而影响了褐飞虱的生长，但是对褐飞虱的存活影响并不显著。说明OsRLCK239.1OE植株主要通过减少褐飞虱的取食，影响褐飞虱的生长但并不完全致死的抗生机制达到极其显著的抗虫目的的。

与OsRLCK239.1OE植株的抗虫表型相反，OsRLCK239.1cas9植株呈现感虫的表型(图5a)，单株抗虫实验中OsRLCK239.1cas9植株的死亡率显著高于野生型(图5b)，褐飞虱在OsRLCK239.1cas9和野生型植株上的存活数目(图5c)，蜜露量(图5d)和虫增重(图5e)有所增加，但是没有显著性差异。

以上结果可以证明，OsRLCK239.1可以正向调节水稻对褐飞虱的抗性。

实施例4、OsRLCK239.1可以正向调节水稻对白叶枯病害的抗性

本实施例中，考察OsRLCK239.1可能存在抗病的能力。

选择水稻三大病害之一的白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)中致病性最强的菌种99A进行大田抗病实验，接病14天后，每个品系量取40片叶片长度和病斑长度，抗病结果如图6a-b，OsRLCK239.1OE植株的病斑长度极显著地低于对照。

按照国家白叶枯抗病级别进行统计分级，结果显示超表达OsRLCK239.1植株对白叶枯的抗性属于高抗级别(图6c)，OE6品系接近免疫级别。

本发明人制作了病菌生长曲线，这更好地显示了病菌的生长繁殖速度，在OsRLCK239.1超表达植株中病菌的生长能力极显著地低于野生型中病菌的生长能力(图6d)。

与过表达的植株相反的是，在接病6天时量取病斑长度，统计发现OsRLCK239.1cas9植株呈现感白叶枯病的表型(图7a)，统计结果如图7b；而在接病14天后，OsRLCK239.1cas9植株病斑长度与野生型没有显著差异(图7c-e)。

以上结果说明，OsRLCK239.1可以正向调节水稻对白叶枯的抗性。

实施例5、OsRLCK239.1负向调节SA，JA和MAPK信号通路

明确OsRLCK239.1在生物抗性中正向调节作用后，本发明人进一步研究OsRLCK239.1的抗性作用机制。

首先，选择植物中与抗逆密切相关的激素SA(水杨酸)和JA(茉莉酸)，使用500uMSA和400uM JA外源施加，处理两周大野生型水稻后，在处理后的0，1，2，和4h时间点取样，抽提RNA后，使用qRT-PCR检测OsRLCK239.1的表达量，发现SA处理后OsRLCK239.1可以在1和4h表达量显著升高(图8a)，而JA处理后OsRLCK239.1的表达量在2h的时候被显著抑制(图8b)。表明外源施加SA和JA在OsRLCK239.1的表达上具有拮抗的作用；在OsRLCK239.1OE植株中JA合成通路基因Hi-LOX和AOS2的表达量是显著低于野生型的(图8c，d)；SA合成通路的基因PAL和EDS1及信号通路中的SA受体NPR1的表达量也是显著低于野生型的(图8e，f，g)；又因为RLCK多与MAPK信号通路相关，检测发现OsRLCK239.1OE植株中的MEK4(图8h)和MAPK3(图8i)的表达量也是显著降低的，而MAPK6的表达变化不显著(图8j)。

以上结果说明，外源施加的SA和JA可以拮抗调节OsRLCK239.1的表达，而超表达OsRLCK239.1可以减弱SA，JA和MAPK信号通路。说明OsRLCK239.1OE的极显著抗虫抗病的表型是源于对多重抗性信号通路的能力。

结论

本发明人从实验室原有的RNA-seq数据中发现OsRLCK239.1这个新基因，其结构特点属于受体类胞质内激酶VIIa亚族成员，自身可以形成二聚体并具有体外自磷酸化的能力。超表达OsRLCK239.1植株可以形成叶片直立的半矮株型，对单穗的籽粒数量和千粒重没有显著的影响，除此之外还具有极其显著的抗褐飞虱和白叶枯病的能力，褐飞虱和白叶枯分别是水稻最主要虫害和病害之一。使用Crisper/cas9技术构建OsRLCK239.1敲除植株(OsRLCK239.1cas9)，发现OsRLCK239.1cas9植株的农艺性状没有发生变化，但是对褐飞虱和白叶枯的抗性是显著降低的；外源施加SA可以诱导OsRLCK239.1的表达，外源施加JA可以抑制OsRLCK239.1的表达，在OsRLCK239.1OE植株中JA、SA和MAPK信号通路都被显著抑制了。本发明发现一个胞质内受体激酶，OsRLCK239.1，可以通过影响SA、JA和MAPK信号通路影响水稻的抗生性能。超表达OsRLCK239.1的植株不仅株型优良不影响产量，还具有同时抗病虫害的能力，可以用于以后的分子育种，培育高抗高产的新品种。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 一种抗病虫害相关基因及其应用

<130> 190640

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1413

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa )

<400> 1

atgaggtcat ccagcgattg caaggttgtg gcggcggcgg cgaggaagaa ggagaaggag 60

gcggcggcgt ggccgtggtc gctgtggggg ttcctcctga ccggctgcct cggcggcggc 120

ggcggcggag ggaagaagaa gagcgggggg aagaaggtgc gtccccgcgg cggcggcggc 180

ggcctgcggc ggctgtcgtt cacggacctg acgggggcgg cggaccagga cctgtcggtg 240

tcgctggtgg ggtccaacct ccacgtcttc accgtcgccg agctccgcga cgccacccgc 300

gggttcgtct ccggcaactt cctcggcgag ggcggcttcg ggccggtcta caagggcctc 360

gtcggcgacg gcgtcaagcc gggcctccgc ccgcaggcca tcgccgtcaa gctctgggat 420

cccgagggcg cccagggcca caaggaatgg ctggcagagg tgatcttcct tggccagctt 480

cggcatccca acctggtgaa gctggtcggc tactgctgcg aggacgagaa ccgcctcctc 540

gtctacgagt acatggagca tggcagcctc gagaaccacc tcttcaaaca gattcctgcc 600

gtgctgccgt ggtcgacccg attaaacatc gcggttggcg ccgcgaaggg tttggcgttc 660

ctccacgacg cagagaagcc ggtcatctac cgtgacttca aggcttccaa catcctgctc 720

gattcggatt acaaggcgaa gctgtcggac ttcgggctgg ccaaggacgg gccggagggg 780

gacgacaccc acgtgtcgac gcgcgtgatg ggcacccatg gctacgccgc gccggagtac 840

atcatgaccg gccacctgac ggcgaagagc gacgtgtaca gcttcggcgt ggtgctcctg 900

gagatcctga cggggcggcg cgccgtcgac aagacgcggc cgaacaggga gcagagcctc 960

gtggagtacg cgcggccgtg cctgcgcgac ccgctccggc tcatccggat catggacccg 1020

gcgctggagg ggcgctactc gccggcggcg gcgagggagg cggccgccgt cgcctaccgg 1080

tgcctcagcg ggagccccaa gaaccgcccc gacatgtccg ccgtcgtcga cgcgctcgag 1140

ccgctgctcg tcgccaccga cgacgtcccc ctcggccccg tcgtgctgtt cgtcgcgccg 1200

gatcaggagg ccgacgccgc cgccgccgcc gacgacgacg aggacgacaa ggcccggcgg 1260

cggcagcggc ggacgcggaa ggacgagcag caccgccgcc gcagccgcct ccggacgtcg 1320

cccaagggca gcccgaggaa gcccgccgtc gccgccgctt gccggaacga ggagttctgg 1380

gtgtggcacg tccccgccga ccacaaggcg tga 1413

<210> 2

<211> 470

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa )

<400> 2

Met Arg Ser Ser Ser Asp Cys Lys Val Val Ala Ala Ala Ala Arg Lys

1 5 10 15

Lys Glu Lys Glu Ala Ala Ala Trp Pro Trp Ser Leu Trp Gly Phe Leu

20 25 30

Leu Thr Gly Cys Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys Lys Ser

35 40 45

Gly Gly Lys Lys Val Arg Pro Arg Gly Gly Gly Gly Gly Leu Arg Arg

50 55 60

Leu Ser Phe Thr Asp Leu Thr Gly Ala Ala Asp Gln Asp Leu Ser Val

65 70 75 80

Ser Leu Val Gly Ser Asn Leu His Val Phe Thr Val Ala Glu Leu Arg

85 90 95

Asp Ala Thr Arg Gly Phe Val Ser Gly Asn Phe Leu Gly Glu Gly Gly

100 105 110

Phe Gly Pro Val Tyr Lys Gly Leu Val Gly Asp Gly Val Lys Pro Gly

115 120 125

Leu Arg Pro Gln Ala Ile Ala Val Lys Leu Trp Asp Pro Glu Gly Ala

130 135 140

Gln Gly His Lys Glu Trp Leu Ala Glu Val Ile Phe Leu Gly Gln Leu

145 150 155 160

Arg His Pro Asn Leu Val Lys Leu Val Gly Tyr Cys Cys Glu Asp Glu

165 170 175

Asn Arg Leu Leu Val Tyr Glu Tyr Met Glu His Gly Ser Leu Glu Asn

180 185 190

His Leu Phe Lys Gln Ile Pro Ala Val Leu Pro Trp Ser Thr Arg Leu

195 200 205

Asn Ile Ala Val Gly Ala Ala Lys Gly Leu Ala Phe Leu His Asp Ala

210 215 220

Glu Lys Pro Val Ile Tyr Arg Asp Phe Lys Ala Ser Asn Ile Leu Leu

225 230 235 240

Asp Ser Asp Tyr Lys Ala Lys Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Asp

245 250 255

Gly Pro Glu Gly Asp Asp Thr His Val Ser Thr Arg Val Met Gly Thr

260 265 270

His Gly Tyr Ala Ala Pro Glu Tyr Ile Met Thr Gly His Leu Thr Ala

275 280 285

Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Leu Glu Ile Leu Thr

290 295 300

Gly Arg Arg Ala Val Asp Lys Thr Arg Pro Asn Arg Glu Gln Ser Leu

305 310 315 320

Val Glu Tyr Ala Arg Pro Cys Leu Arg Asp Pro Leu Arg Leu Ile Arg

325 330 335

Ile Met Asp Pro Ala Leu Glu Gly Arg Tyr Ser Pro Ala Ala Ala Arg

340 345 350

Glu Ala Ala Ala Val Ala Tyr Arg Cys Leu Ser Gly Ser Pro Lys Asn

355 360 365

Arg Pro Asp Met Ser Ala Val Val Asp Ala Leu Glu Pro Leu Leu Val

370 375 380

Ala Thr Asp Asp Val Pro Leu Gly Pro Val Val Leu Phe Val Ala Pro

385 390 395 400

Asp Gln Glu Ala Asp Ala Ala Ala Ala Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp

405 410 415

Lys Ala Arg Arg Arg Gln Arg Arg Thr Arg Lys Asp Glu Gln His Arg

420 425 430

Arg Arg Ser Arg Leu Arg Thr Ser Pro Lys Gly Ser Pro Arg Lys Pro

435 440 445

Ala Val Ala Ala Ala Cys Arg Asn Glu Glu Phe Trp Val Trp His Val

450 455 460

Pro Ala Asp His Lys Ala

465 470

Claims

1.一种OsRLCK239.1或其上调剂的用途，用于：

提高植物抵抗病虫害的能力或制备抵抗病虫害能力提高的植物；或

改良植物的株型性状或制备株型改良的植物；包括：降低植物的株高或制备株高降低的植物；促进植物叶片直立或制备叶片直立的植物；或提高植物籽粒的长宽比或制备籽粒长宽比提高的植物；

所述的OsRLCK239.1是SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的蛋白；

所述的植物为水稻；

所述的病虫害为细菌，所述的细菌为白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)；或，所述的病虫害为昆虫，所述的昆虫为半翅目飞虱科昆虫褐飞虱(Nilaparvata lugens)。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述OsRLCK239.1通过降低昆虫的取食量而提高植物抵抗病虫害的能力。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的OsRLCK239.1的上调剂包括：OsRLCK239.1的表达构建物、表达盒或表达载体。

4.一种提高植物抵抗病虫害的能力或改良植物的株型，或制备抵抗病虫害能力提高或株型改良的植物的方法，所述方法包括：提高植物中OsRLCK239.1的表达或活性；所述的OsRLCK239.1是SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的蛋白；

所述的病虫害为细菌，所述的细菌为白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)；或，所述的病虫害为昆虫，所述的昆虫为半翅目飞虱科昆虫褐飞虱(Nilaparvata lugens)；

所述的植物为水稻；

所述的改良植物的株型性状或制备株型改良的植物为：降低植物的株高或制备株高降低的植物；促进植物叶片直立或制备叶片直立的植物；或提高植物籽粒的长宽比或制备籽粒长宽比提高的植物。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：将编码OsRLCK239.1的多核苷酸或构建物转入植物中；或

给予植物OsRLCK239.1的上调剂，从而提高植物中OsRLCK239.1的表达或活性。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(i) 提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含编码OsRLCK239.1的多核苷酸；

(ii) 利用农杆菌使所述编码OsRLCK239.1的多核苷酸转入植物中。

7.一种OsRLCK239.1或编码其的多核苷酸的用途，用作鉴定植物的株型性状或抵抗病虫害的能力的分子标记物；所述的OsRLCK239.1是SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的蛋白；所述株型性状是株高、叶片直立或籽粒的长宽比；所述鉴定包括：测定OsRLCK239.1的表达量或mRNA量，若是显著高于此类植物的平均值，则其具有高的抵抗病虫害的能力，或其在株型上呈现半矮秆的株型，或其叶片相对直立；

所述的植物为水稻。

8.一种水稻细胞的用途，所述细胞表达外源的OsRLCK239.1，或其包含外源的OsRLCK239.1的表达盒；所述细胞用于抵抗病虫害，所述的病虫害为细菌，所述的细菌为白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)；或，所述的病虫害为昆虫，所述的昆虫为半翅目飞虱科昆虫褐飞虱(Nilaparvata lugens)；所述的OsRLCK239.1是SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的蛋白。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，该表达盒包括：启动子，OsRLCK239.1的编码基因，终止子。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，该表达盒被包含在构建物或表达载体中。