CN116355911A - 一种新型的调控植物抗虫性的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型的调控植物抗虫性的基因及其应用。基于大规模的研究筛选以及实验工作，克隆获得了一种新型的与调控植物的抗虫性相关的基因MYB22，其功能缺失会导致植物对昆虫的抗性大大降低，表明其本身为一种具有抗虫功能的基因。本发明为植物的抗虫性状改良提供了新途径。

Description

一种新型的调控植物抗虫性的基因及其应用

技术领域

本发明属于植物学和生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种新型的调控植物抗虫性的基因及其应用。

背景技术

植物在生长发育的过程中遭受着各种各样的植食性昆虫的威胁，随着植物的进化，其机体中形成复杂的防御系统以抵抗昆虫的侵害。

禾本科植物，特别是水稻，是世界上最主要的粮食作物之一，全球约有一半以上的人口以稻米为主粮。水稻病虫害是影响水稻品质和产量的重要因素，其中飞虱科昆虫例如褐飞虱作为仅取食水稻和普通野生稻的单食性害虫，对水稻粮食安全造成重大威胁。

现有技术中，植物(如禾本科植物)对昆虫(例如飞虱科昆虫)抗性的分子机制的研究还处于初级阶段，发掘昆虫抗性相关的基因。尽管育种领域中经将一些基因与抗虫性状进行相关性研究，但是进展并不尽如人意。

因此，增强对昆虫抗性分子机制的了解，将有助于田间对于昆虫的防治挖掘抗虫相关基因、为抗性育种提供储备资源具有十分重要的经济和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的调控植物抗虫性的基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种提高植物抗虫性的方法，所述方法包括上调植物中MYB22的表达或活性，包括上调/增加MYB22的稳定性或有效作用时间等。

在一种或多种实施方式中，所述上调植物中MYB22的表达或活性包括：给予植物MYB22的上调剂，从而提高其表达或活性；较佳地，所述上调剂包括(但不限于)：编码MYB22的多核苷酸或构建物，促进MYB22基因启动子驱动能力的上调剂，与所述MYB22蛋白相互作用、从而提高其表达或活性的上调剂，MYB22基因特异性microRNA的下调剂，MYB22的化学上调剂，或其组合。

在一种或多种实施方式中，所述的虫为植食性昆虫。

在一种或多种实施方式中，所述的植食性昆虫为半翅目昆虫。

在一种或多种实施方式中，所述的半翅目昆虫为飞虱科昆虫，包括褐飞虱(Nilaparvata lugens)，白背飞虱(Sogatella furcifera)和灰飞虱(Lalielphaxstriatellus)。

在一种或多种实施方式中，所述的MYB22选自下组：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；(b)将(a)所示的氨基酸序列经过一个或多个(如1～20个，1-10个，1-5个，1-3个或1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有(a)或(b)多肽功能的MYB22衍生物，或其活性片段；(c)序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，同源性≥70％(如同源性≥75％，≥80％，≥85％，≥90％，≥92％，≥94％，≥96％，≥98％或≥99％)的MYB22衍生物，或其活性片段。

在一种或多种实施方式中，所述的MYB22包括其同源物，所述同源物为来自不同物种(稻属以外的物种)的、与稻属来源的SEQ ID NO:1或编码其的多核苷酸具有序列同源性的蛋白或编码基因。

在一种或多种实施方式中，所述的表达构建物(表达载体)包括：植物表达载体。

在一种或多种实施方式中，所述的表达构建物(表达载体)包括：非病毒载体，病毒载体。

在一种或多种实施方式中，所述的上调表达包括过表达。

在一种或多种实施方式中，所述的上调表示显著性的上调，如上调20％、40％、60％、80％、90％或更多。

在一种或多种实施方式中，所述的植物是表达MYB22或其同源物的植物。

在一种或多种实施方式中，所述的植物包括：禾本科植物。

在一种或多种实施方式中，所述的禾本科植物包括(但不限于)：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、二穗短柄草。

在本发明的另一方面，提供一种MYB22或其上调剂的应用，用于：提高植物抗虫性；制备提高植物抗虫性的制剂；或，作为鉴定植物的抗虫性的分子标记物。

在一种或多种实施方式中，所述上调剂包括(但不限于)：编码MYB22的多核苷酸或构建物，促进MYB22基因启动子驱动能力的上调剂，与所述MYB22蛋白相互作用、从而提高其表达或活性的上调剂，MYB22基因特异性microRNA的下调剂，MYB22的化学上调剂，或其组合。

在一种或多种实施方式中，所述的虫为植食性昆虫；较佳地为半翅目昆虫；更佳地为飞虱科昆虫，包括褐飞虱(Nilaparvata lugens)，白背飞虱(Sogatella furcifera)和灰飞虱(Lalielphax striatellus)。

在一种或多种实施方式中，所述的植物是表达MYB22或其同源物的植物；较佳地，所述的植物包括：禾本科植物；较佳地，所述的禾本科植物包括(但不限于)：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、二穗短柄草等。

在本发明的另一方面，提供一种植物细胞、组织或器官，所述的植物是表达MYB22或其同源物的植物，其中含有外源的MYB22或其同源物的上调剂，所述上调剂包括：编码MYB22的多核苷酸或构建物(包括表达载体)，促进MYB22基因启动子驱动能力的上调剂，与所述MYB22蛋白相互作用、从而提高其表达或活性的上调剂，MYB22基因特异性microRNA的下调剂，MYB22的化学上调剂，或其组合。

在一种或多种实施方式中，所述的植物细胞、组织或器官不直接生成活体的植物，或不作为植物繁殖材料。

在一种或多种实施方式中，所述高表达或高活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。

在本发明的另一方面，提供一种选择或鉴定具有抗虫性的植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中的MYB22的表达或活性，若该测试植物MYB22表达或活性高(如，高于该种植物的平均值)，则其为具有抗虫性的植物。

在本发明的另一方面，提供一种筛选提高植物抗虫性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达MYB22；和

(2)检测所述体系中MYB22的表达或活性；若所述候选物质在统计学上提高(如提高5％、10％、15％、20％、30％或更高，较佳地提高50％或更高；更佳地提高80％以上)MYB22的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物抗虫性的潜在物质。

在一种或多种实施方式中，所述的筛选方法还包括设置对照组，从而明确分辨MYB22的表达或活性。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对MYB22蛋白或其编码基因、或其上游或下游蛋白或基因的调控分子(如上调剂、干扰分子(例如其可干扰“抑制MYB22表达”的上游基因)、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体))，CRISPR构建物，小分子化合物等。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、OsMYB22基因过表达和基因编辑植株的检测；

A：OsMYB22基因的Cas9植株中碱基突变位点示意图；

B：OE-11植株中OsMYB22基因的表达检测。

图2、褐飞虱取食后OsMYB22基因的表达变化。

图3、过表达植株抗褐飞虱的表型鉴定；

A：OE-11植株和ZH11植株单株抗褐飞虱鉴定；

B：OE-11植株和ZH11小群体抗褐飞虱鉴定。

图4、Cas9植株抗褐飞虱的表型鉴定；

A：Cas9植株单株抗褐飞虱鉴定；

B：Cas9植株小群体抗褐飞虱鉴定。

具体实施方式

本发明人经过大规模的研究筛选以及实验工作，克隆获得了一种新型的与调控植物的抗虫性相关的基因MYB22，其功能缺失会导致植物对昆虫的抗性大大降低，表明其本身为一种具有抗虫功能的基因。本发明为植物的抗虫性状改良提供了新途径。

术语

如本文所用，所述的虫为植食性昆虫；较佳地包括半翅目昆虫、同翅目昆虫、双翅目昆虫鳞翅目昆虫(如二化螟)等；较佳地为飞虱科昆虫。所述的“飞虱科昆虫”包括但不限于：褐飞虱(Brown planthopper，BPH)，白背飞虱(white back planthopper，WBPH)及灰飞虱(small brown planthopper，SBPH)。“飞虱科”是属于同翅目的1个科，“飞虱科昆虫”具有较多共性如下：通称飞虱，全部植食性，很多种生活于禾本科植物，为刺吸式农业害虫。有迁飞习性，是中国和许多亚洲国家当前水稻上的首要害虫。其中褐飞虱为单食性害虫，在水稻和普通野生稻上取食和繁殖后代。白背飞虱和灰飞虱食性广，可危害水稻、小麦、玉米等禾本科植物。

如本文所用，所述的“植物”包括表达MYB22或包含MYB22及其所参与的信号通路的植物。根据本领域的知识，表达MYB22的植物，其内在存在如本发明所主张的作用机制，可以实现如本发明所主张的技术效果。在一些优选方式中，所述的植物为作物，较佳地为禾谷类作物，较佳地所述禾谷类作物为具有籽粒(穗粒)的作物。所述的“禾谷类作物”可以是禾本科植物。较佳地，所述的禾本科植物包括：禾本科稻属植物如水稻，禾本科小麦属植物如小麦，禾本科玉米属植物如玉米等。更具体地例如水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、二穗短柄草等。

关于“对照植物”，选择合适的对照植物是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应转基因植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同或属于同一类的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。

如本文所用，术语“提高”、“改良”或“增强”是相互可以交换的并且在应用含义上应当意指与本文中定义的对照植物相比较，至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选的至少15％或20％、更优选25％、30％更高的调节。

MYB22基因及其所编码的蛋白

MYB22基因为本发明人筛选获得并赋予其新功能的基因。MYB22基因的功能在以往未被研究，本发明人通过深入研究后发现其在调控植物抗虫性中发挥重要作用。

在本发明中，除非特别说明，所述MYB22蛋白包括了其同源物(同源蛋白)。所述MYB22为具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽(蛋白)。本发明还包括具有与MYB22蛋白相同的抗虫功能的序列变异形式。

所述的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的MYB22蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO:1所示的多肽序列的同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有所述MYB22蛋白相同的抗虫功能的蛋白也包括在本发明内。

本发明中，所述的“MYB22蛋白”也包括它们的同源物。应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种的MYB22蛋白，但是获自其它物种、特别是禾本科植物的与所述MYB22蛋白高度同源(如具有70％以上，更特别80％，85％、90％、95％、甚至98％以上序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内。

来源于水稻以外其它物种的与SEQ ID NO:1所示序列的多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近的抗虫作用的多肽也包括在本发明中。

本发明还提供了分离的蛋白，其是MYB22蛋白的片段或在两端添加其它蛋白或标签等形成的。

本发明还涉及编码本发明的MYB22蛋白或其序列变异形式的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1序列的多肽，但与SEQ ID NO:3所示的基因组序列或SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体(变体)，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或多肽编码核酸经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，编码本发明的多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。较佳地，所述表达载体还可选择性地加入抗性元件、筛选(选择)元件或报告基因元件，如Bar、GUS。

所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。

植物的抗虫性改造

本发明通过大量的系统性研究、大规模的研究筛选，鉴定到了MYB22基因，此基因调控植物抗虫性。通过CRISPR/cas9技术对此基因进行编辑，得到了抗虫性改变的材料。

具体的实施例中，本发明人通过靶向编辑MYB22基因使之缺失，之后观测性状变化。结果显示，MYB22基因缺失植株与野生型植株的相比，抗虫性能大大下降，因此，MYB22基因本身为一种促进植物抗虫能力的正调控基因。

基于本发明人的新发现，提供了一种MYB22蛋白或其调节分子的用途，用于：提高植物抗虫性。在得知了所述MYB22的功能后，可以应用本领域人员熟知的多种方法来过表达MYB22，从而提高植物抗虫性。比如可通过本领域人员已知的途径将携带MYB22基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的MYB22。

作为一种优选的方式，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：(1)将外源的MYB22的编码核酸转入植物组织、器官或组织，获得转化入MYB22的编码多核苷酸的植物组织、器官或种子；和(2)将步骤(1)获得的转入了外源的编码核酸的植物组织、器官或种子再生成植物植株。

其它增加MYB22基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强MYB22基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该MYB22的表达。适用于的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。

本发明中，所述MYB22的多肽或其编码基因的上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了多肽活性的“上调”、“促进”或多肽表达的“上调”、“促进”。任何可提高MYB22的活性、提高MYB22的稳定性、上调MYB22的表达、增加MYB22有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调MYB22有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。所述的MYB22或其上调剂特别适合应用于一类植物，其MYB22的表达低于该类植物的平均值或其MYB22不表达；从而，所述的MYB22蛋白或其上调剂的运用可以使该类植物回复为野生型表型或更优的表型。

作为一种优选的实施方式，提供一种上调植物中MYB22蛋白的表达的方法，所述的方法包括：将MYB22蛋白或其编码的蛋白的表达构建物或载体转入植物中。

优选地，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源的本发明的多肽的编码核酸转入植物器官或组织，获得转化入所述多肽的编码核酸的植物组织或器官；和

(2)将步骤(1)获得的转入了外源的本发明的多肽的编码核酸的植物组织或器官再生成植物植株。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有本发明的MYB22蛋白的编码核酸；(s2)将植物组织或器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使所述多肽的编码核酸转入并且整合到植物细胞的染色体上；(s3)选择出转入所述MYB22蛋白的编码核酸的植物组织或器官；以及(s4)将步骤(s3)中的植物组织或器官再生成植物。

本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了所述多肽的编码核酸的转基因植物。

植物育种筛选或靶向性筛选调控分子

基于本发明人的新发现，本发明提供了适用于鉴定植物抗虫能力的分子标记，即MYB22基因。本发明还涉及针对所述MYB22基因设计的特异性分子标记，以及鉴定策略。早期确定植物的抗虫性能。

因此，本发明提供了一种特异性鉴定植物的抗虫性的方法，包括：鉴定待测植物的MYB22的表达情况，若是该测试植物的MYB22高表达，则其为具有抗虫性的植物。

因此，本发明提供了一种定向选择或鉴定农艺性状被调节的植物的方法，包括：鉴定测试植物体内MYB22蛋白的表达或活性，若该测试植物中MYB22蛋白的表达或活性高于该类植物(对照植物)中MYB22蛋白的表达或活性的平均值，则其为抗虫能力增加的植物；或，若该测试植物中MYB22蛋白的表达或活性低于该类植物(对照植物)中MYB22蛋白的表达或活性的平均值，则其为抗虫能力下降的植物。

根据本发明的新发现，本领域技术人员可以采用任何本领域公知的或正在发展的多种技术来进行核酸序列的分析，这些技术均可被包含在本发明中。所述的方法例如包括但不限于：测序法，PCR扩增法，探针法，杂交法，限制性酶切分析法，等位基因多态性分析法(如溶解曲线法)进行核酸序列的鉴定，等等。

本发明的鉴定方法，只需进行PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的长度，就可以准确、快速地判断待测样品的表型，成本低廉，适合于大规模鉴定，而且所需的样品量很少。如果需要，本领域技术人员能够设计出鉴定所述分子标记的引物。

获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。

本发明在分子设计育种及利用基因工程技术进行农作物品种改良等方面具有良好的应用前景。

在得知了MYB22基因的功能以后，可以以其为分子标记物，来进行植物的定向筛选。也可基于该新发现来筛选通过调节这一机制，从而定向调控抗虫性的物质或潜在物质。

本发明提供了一种筛选促进植物性状改良的物质(潜在物质)的方法，所述性状改良包括：抗虫能力增强；该方法包括：(1)将候选物质加入到表达MYB22蛋白的体系中；(2)检测所述体系，观测其中MYB22蛋白的表达或活性，若其表达或活性提高，则表明该候选物质为促进增强植物抗虫能力的物质。

本发明提供了一种筛选促进植物性状改良的物质(潜在物质)的方法，所述性状改良包括：抗虫能力增强；该方法包括：(1)将候选物质加入到表达MYB22蛋白的体系中；(2)检测所述体系，观测其中MYB22蛋白的表达或活性，若其表达或活性降低，则表明该候选物质为降低植物抗虫能力的物质。

以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。

检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术(GST-Pull Down)、双分子荧光互补实验、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术等。

经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于MYB22蛋白或其编码基因，对抗虫性状改良有调控作用的物质。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、植物材料

用于本发明的水稻材料为粳稻品种(Oryza sativa L.subsp.Japonica)中花11。

受试水稻材料夏天种植于上海田间，采用标准水稻田间种植管理模式；冬天种植于中科院分子植物科学卓越创新中心人工气候室。温度29℃±1℃，湿度50-70％±5％，光照时间7:00-19:00。

2、OsMYB22过表达载体的构建

通过表1中的引物PUN1301-OsMYB22F、PUN1301-OsMYB22R从中花11总cDNA中扩增OsMYB22基因片段，利用同源重组将其构建到PUN1301-3×Flag载体上。

表1、OsMYB22转基因材料相关载体构建所用引物序列

3、OsMYB22-Cas9载体的构建

通过表1中的引物OsMYB22-sgRNAF、OsMYB22-sgRNAR，首先形成双链DNA；之后，将双链片段构建到pOs-sgRNA载体上；然后，转移到pH-Ubi-cas9载体上，获得的重组载体称为OsMYB22-Cas9载体。

4、水稻遗传转化

主要参照文献Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro T:Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant journal:for cell andmolecular biology 1994,6(2):271-282中的方法进行。

5、单株抗褐飞虱鉴定法

水稻种子经过催芽后，分单株播种于小的塑料盆钵中，正常生长管理，约1个月后，待苗子将进入分蘖期，进行抗虫鉴定。预先制备高40cm、直径约8cm的透塑料罩子，在罩子一侧留有6*10cm大小的通风口，用纱网遮盖。用罩子将苗子罩住，以纱网罩住顶部。

鉴定时，将每个罩子中接入15头左右3龄若虫。第2天重复数虫一次。正常生长管理条件下，待5-8天，观察苗子的存活状况。

6、小群体抗褐飞虱鉴定法

水稻种子经过催芽后，将实验组和对照组分别对称播种在长方形塑料盒中，正常生长管理20天左右，按每株水稻接入8头2～3龄的褐飞虱若虫，随后每天观察水稻存活情况，进行拍照。

实施例1、OsMYB22过表达和基因编辑植株的获得

OsMYB22基因的序列登录号为LOC_Os01g65370(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，OsMYB22的氨基酸序列以及cDNA序列分别如下：

OsMYB22的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：

说明：Cas9-1由于碱基缺失导致第48个氨基酸R及以后发生移码突变；Cas9-2由于碱基插入导致第49个氨基酸C及以后发生移码突变。

OsMYB22的cDNA序列(SEQ ID NO:2)：

说明：下划线标记位置为sgRNA靶位置，Cas9-1为143bp处的G缺失(粗黑体标记)，Cas9-2为143bp后插入T；导致移码。

本发明人通过从天然水稻品种中花11(Zhonghua11，简为ZH11)的总cDNA中克隆其CDS片段，连接到过表达载体PUN1301-3×Flag上。

同时，采用CRISPR-Cas9的技术对OsMYB22基因进行了编辑。首先设计了OsMYB22基因的特异sg-RNA，并根据该sgRNA的序列设计特异引物(表1)，经退火后形成双链，连入CRISPR(UBI，OsU6)载体；通过农杆菌介导的遗传转化法转入野生型水稻品种中花11中，随后利用分子生物学技术筛选过表达转基因植株和纯合突变植株。

转基因植株经过分子检测分析后得到一系列突变株系。本发明人选取其中两个纯合编辑突变株系Cas9-1、Cas9-2及一个过表达株系OE-11作为列举。

Cas9-1及Cas9-2中OsMYB22基因被编辑的序列信息如图1A所示，与野生型相比较，这两个株系分别在OsMYB22基因的sgRNA位点处造成“G”的缺失和“T”的插入(图1A)。

通过实时荧光定量(real-time PCR)技术对OE-11进行检测。

结果表明，相较于野生型ZH11，OE-11中OsMYB22的表达量上调14倍左右(图1B)。

实施例2、OsMYB22响应褐飞虱取食

为检测OsMYB22基因是否可能在水稻抗褐飞虱中发挥作用，本发明人检测了该基因在褐飞虱取食中花11后0、4、8、12、24、48以及72小时后的表达量变化。

结果表明，在褐飞虱取食后，OsMYB22基因的表达呈显著上调趋势(图2)。

上述结果提示，OsMYB22参与调控水稻对褐飞虱的抗性。

实施例3、OsMYB22基因的过表达植株呈现对褐飞虱的抗性表型

为明确OsMYB22基因在水稻抗褐飞虱过程中的作用，本发明人分别通过单株抗虫鉴定和小群体抗虫鉴定两种方法，对OE-11植株进行了褐飞虱抗性鉴定。

过表达植株的抗褐飞虱的表型鉴定结果的代表性的图如图3A-B所示，其中A为OE-11植株和ZH11植株单株抗褐飞虱鉴定，B为OE-11植株和ZH11小群体抗褐飞虱鉴定。

两种方法的结果均表明，过表达OsMYB22基因能够显著提高水稻对褐飞虱的抗性。

实施例4、OsMYB22基因的编辑植株呈现出对褐飞虱敏感的表型

为进一步明确OsMYB22基因在水稻抗褐飞虱中的功能，本发明人进一步对OsMYB22基因的编辑(OsMYB22缺失表达)植株Cas9-1及Cas9-2植株进行了抗褐飞虱抗性鉴定。

实验结果表明，OsMYB22基因的编辑植株Cas9-1及Cas9-2对褐飞虱的抗性显著低于野生型植株(图4A-B)。

该结果进一步表明，OsMYB22基因在调控水稻对褐飞虱的抗性中发挥正调控的作用。

实施例5、筛选方法

细胞：在水稻叶片细胞中，其中表达OsMYB22。

测试组：在该表达OsMYB22的细胞培养体系中，引入候选物质；

对照组：在该表达OsMYB22的细胞培养体系中，不引入候选物质。

分别检测测试组和对照组中OsMYB22的表达或活性情况，并进行比较。如果测试组中OsMYB22的表达或活性在统计学上高于(如高20％或更高)对照组，就表明该候选物是有利于改良植物抗病性的潜在物质。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 一种新型的调控植物抗虫性的基因及其应用

<130> 217656

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 287

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 1

Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Glu Lys Ala His Thr Asn Lys Gly Ala

1 5 10 15

Trp Thr Lys Glu Glu Asp Gln Arg Leu Ile Ala Tyr Ile Lys Ala His

20 25 30

Gly Glu Gly Cys Trp Arg Ser Leu Pro Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Gly Asn Phe Thr Asp Asp Asp Asp Glu Leu Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ala Leu Leu Gly Asn Lys Trp Ser Leu Ile Ala Gly Gln Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Ile

100 105 110

Lys Arg Lys Leu Leu Ser Arg Gly Ile Asp Pro Gln Thr His Arg Pro

115 120 125

Val Ser Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ser Gly Leu Thr Thr Thr

130 135 140

Ala Ser Thr Ala Ala Phe Pro Ser Leu Ala Pro Ala Pro Pro Pro Gln

145 150 155 160

Gln His Arg Leu His Asn Pro Val His Ala Ala Ala Pro Ser Asn Ala

165 170 175

Ser Phe Ala Arg Ser Ala Ala Ser Pro Pro Ser Glu Asp Gly His Ser

180 185 190

Ser Ser Gly Gly Ser Ser Asp Ala Pro Arg Cys Pro Asp Leu Asn Leu

195 200 205

Asp Leu Asp Leu Asp Leu Ser Met Ser Leu Pro Ser Ser Pro Pro Lys

210 215 220

Thr Pro Ala Ala Ala Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His His His

225 230 235 240

Gln Gln Gln Lys Thr Ile Cys Leu Cys Tyr His Leu Gly Val Arg Asn

245 250 255

Gly Asp Val Cys Ser Cys Lys Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ala Gly Pro

260 265 270

Arg Ala Phe Arg Phe Leu Arg Pro Leu Glu Glu Gly Gln Tyr Ile

275 280 285

<210> 2

<211> 864

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 2

atggggaggt cgccatgctg cgagaaggcg cacacgaaca agggggcgtg gacgaaggag 60

gaggaccagc ggctgatcgc ctacatcaag gcgcacggcg agggttgctg gcggtcgctg 120

cccaaggcgg cggggctcct ccgctgcggc aagagctgcc gcctccgctg gatgaactac 180

ctccgccccg acctcaagcg cggcaacttc accgacgacg acgacgagct catcatcaag 240

ctccacgccc ttctcggcaa caagtggtcg ttgattgcgg ggcagctgcc ggggaggacg 300

gacaacgaga tcaagaacta ctggaacacg cacatcaagc gcaagctcct gagccggggc 360

atcgacccgc agacgcaccg gccggtcagc gccgggagca gcgccgccgc ggcgagcggg 420

ctgaccacga cggccagcac cgccgccttt ccgtcccttg cgccggcgcc gccgccgcag 480

cagcacaggc tacacaaccc ggtgcacgcc gcggcgccga gcaatgcgag cttcgccagg 540

tccgcggcgt ccccgccgtc ggaggacggc cacagcagca gcggcggcag ctcggacgcg 600

ccgcggtgcc ccgacctcaa cctcgacctc gacctcgacc tgtccatgag cctgccgagc 660

tcgccgccca agacgccggc cgccgcgtcg tccacgaccg cgtcgcgcca ccatcaccac 720

cagcagcaga agaccatctg cctctgctac cacctcggcg tccgcaacgg cgacgtctgc 780

agctgcaagg cggccgcgcc atcgccggcc ggcccacgcg cgttccggtt tctcaggcca 840

ctggaggagg gccagtacat atag 864

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

caggtcgact ctagaggatc catggggagg tcgccatgct gcgagaag 48

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atggtctttg tagtcggtac ctatgtactg gccctcctcc agtggc 46

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ggcagccagg gagccgagca gcag 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aaacctgctg ctcggctccc tggc 24

Claims (10)

1.一种提高植物抗虫性的方法，其特征在于，包括上调植物中MYB22的表达或活性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上调植物中MYB22的表达或活性包括：给予植物MYB22的上调剂，从而提高其表达或活性；较佳地，所述上调剂包括：编码MYB22的多核苷酸或构建物，促进MYB22基因启动子驱动能力的上调剂，与所述MYB22蛋白相互作用、从而提高其表达或活性的上调剂，MYB22基因特异性microRNA的下调剂，MYB22的化学上调剂，或其组合。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的虫为植食性昆虫；较佳地为半翅目昆虫；更佳地为飞虱科昆虫，包括褐飞虱(Nilaparvata lugens)，白背飞虱(Sogatellafurcifera)和灰飞虱(Lalielphax striatellus)。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物是表达MYB22或其同源物的植物；较佳地，所述的植物包括：禾本科植物；较佳地，所述的禾本科植物包括：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、二穗短柄草。

5.一种MYB22或其上调剂的应用，用于：

提高植物抗虫性；

制备提高植物抗虫性的制剂；或，

作为鉴定植物的抗虫性的分子标记物。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述上调剂包括：编码MYB22的多核苷酸或构建物，促进MYB22基因启动子驱动能力的上调剂，与所述MYB22蛋白相互作用、从而提高其表达或活性的上调剂，MYB22基因特异性microRNA的下调剂，MYB22的化学上调剂，或其组合。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的虫为植食性昆虫；较佳地为半翅目昆虫；更佳地为飞虱科昆虫，包括褐飞虱(Nilaparvata lugens)，白背飞虱(Sogatellafurcifera)和灰飞虱(Lalielphax striatellus)；和/或

所述的植物是表达MYB22或其同源物的植物；较佳地，所述的植物包括：禾本科植物；较佳地，所述的禾本科植物包括：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、二穗短柄草。

8.一种植物细胞、组织或器官，其特征在于，所述的植物是表达MYB22或其同源物的植物，其中含有外源的MYB22或其同源物的上调剂，所述上调剂包括：编码MYB22的多核苷酸或构建物，促进MYB22基因启动子驱动能力的上调剂，与所述MYB22蛋白相互作用、从而提高其表达或活性的上调剂，MYB22基因特异性microRNA的下调剂，MYB22的化学上调剂，或其组合。

9.一种选择或鉴定具有抗虫性的植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中的MYB22的表达或活性，若该测试植物MYB22表达或活性高，则其为具有抗虫性的植物。

10.一种筛选提高植物抗虫性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达MYB22；和

(2)检测所述体系中MYB22的表达或活性；若所述候选物质在统计学上提高MYB22的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物抗虫性的潜在物质；

较佳地，所述的候选物质包括：针对MYB22蛋白或其编码基因、或其上游或下游蛋白或基因的调控分子、激动剂、核酸抑制物、结合分子、CRISPR构建、小分子化合物。

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