JP5791049B2 - 植物の深根性を制御する遺伝子Dro1とその利用 - Google Patents
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Description
根の伸長方向のみを簡便に定量化する方法として、バスケット法がコムギにおいて開発された(Oyanagi et al. 日本作物学会紀事 62: 565-570. 1993(非特許文献22))。さらに、イネにおいてもバスケット法によって深根性を調査した報告がある(Kato et al. Plant Soil 287: 117-129. 2006(非特許文献23))。この方法は、網目状のザルに土を詰め、圃場もしくはポットに設置し、一定期間栽培した後、地表面に対してザルから伸長してくる根の伸長角度を測定することで深根性を評価する。簡便に伸長角度を評価できるが、遺伝子単離のために一度に大量の検体を評価するにはスペースと水管理が大変である。
本発明者はまず、約4,500個体からなる大規模分離集団により、浅根型を示すイネ品種IR64と深根型を示すKinandang Patongの間で検出された植物の深根性を制御する遺伝子座(Dro1遺伝子座)の高精度連鎖解析を試みた。一度に数百個体の深根率(各バスケットから出てくる全根数に対してバスケットの底から出てくる根の割合)を調査するために従来のバスケット法を改良し、500個体を1回で調査することができるようにした。ただし、それ以上は一度に大量の植物体を扱うことはできないため、大規模集団から選抜した組換え系統群から数系統を選び、各系統40個体の表現型と遺伝子型データから少しずつ候補領域を絞り込んだ。候補領域を1,443kbpから約100kbpまで絞り込んだ段階で、IR64とKinadang Patongのbacterial artificial chromosome(BAC)ライブラリーを作製し、100kbpの候補領域を含んだBACをスクリーニングした。つぎに、両品種のBACの塩基配列を解析した。塩基配列の比較から候補遺伝子が絞れないか検討するため、両品種についてRAP-DBで予測された遺伝子の塩基配列を比較したところ、エキソン領域内で塩基配列の変異が存在する遺伝子が多数で、候補遺伝子を絞り込むことは不可能であった。そこで、候補領域内の塩基配列の変異を用いてDNAマーカーを作製しながら合計5回の連鎖解析を行った。その結果、Dro1の遺伝子領域をinsertion-delition(InDel)マーカーであるDro1-INDEL09(プライマー5'- GCAGACGCTCGTAACACGTA -3'(配列番号:4)およびプライマー5'- GTGGCAGCTCCATCAACTCT -3'(配列番号:5))からCleaved Amplified Polymorphic Sequences(CAPS)マーカーであるDro1-CAPS05(プライマー5'- GCACAAGATGGGAGGAGAGT -3'(配列番号:6)およびプライマー5'- CATGGGTGAGAATCGTGTTG -3'(配列番号:7)、増幅したDNAはHinfIで制限酵素処理を行う)で挟まれた6.0kbpの領域に絞り込んだ。この領域には、RAP-DBにより予測された遺伝子が1つだけ存在し、この予測遺伝子は全くの機能未知のタンパクをコードしていることが推定されていた。IR64の形質転換は非常に困難なため、形質転換法を用いた相補性試験を行う前に、この予測遺伝子が本当に深根性と関係するのかを検討した。はじめに、以下に示す数種類の機能検索サイトで予測遺伝子のアミノ酸配列から機能予測を行い、深根性に関連する機能を持っているか調べた。
・「SALAD database」植物のタンパク質配列をゲノムワイドに比較するデータベース(salad.dna.affrc.go.jp/salad/)
・「Pfam」タンパク質ドメインのデータベース (pfam.janelia.org/)
・「PSORT」タンパクの疎水性や局在性を予測するサイト (www.psort.org/)
・「InterPro」蛋白質ファミリー、ドメイン、機能部位のデータベース(www.ebi.ac.uk/interpro/)
しかしながら、どの検索サイトでも、1つも保存されたドメインは見出すことができなかった。つぎに、この遺伝子のエキソン内にIR64とKinandang Patongの間で塩基配列の変異がないか調べた。その結果、第4エキソン内にKinandang Patongではアデニンである部分がIR64では1b欠失していた。この1b欠失によりフレームシフトが起こり途中でストップコドンが生じていた。そこで、この欠失によりIR64では候補遺伝子の発現量が低下しているのではないかと考え、発現量を調査した。調査には発芽6日目と12日目IR64およびKinandag Patongの葉身および葉鞘上部、葉鞘基部、冠根を用いた。これらの3つの組織よりトータルRNAを抽出し、リアルタイムPCRにより遺伝子の発現量を調査した。その結果、両品種とも葉身および葉鞘上部と冠根の2か所ではほとんど発現が見られなかったが、葉鞘基部では両品種とも発現が見られた。しかしながら、IR64とKinandang Patongで発現量を比較したところ、6日目および12日目のサンプルともに、両品種間に2倍以上の発現量の差は見られず、発現量の結果からはこの予測遺伝子がDro1遺伝子の本体であるとは判断できなかった。ただし、葉鞘基部には冠根の原基である冠根始原体が存在することや両品種間においてアミノ酸レベルでの機能の相違も考えられたので、候補遺伝子の可能性はあった。
つぎに、第4エキソンの1b欠失と深根率との関連性からこの遺伝子が深根性に関与していないかを検討した。IR64とKinandang Patongを含む栽培品種64系統、IR64と同じ国際稲研究所(International Rice Research Institute、Los Banos、Philippines)で育成されたIR品種22系統、野生種20系統(Oryza nivara7系統、O. rufipogon12系統、O. meridionalis1系統)について1b欠失のあった周辺塩基配列を解析し、塩基配列を比較したところ、第4エキソンの1b欠失はIR64にのみ存在することが分かった。そのため、1b欠失と深根率の関係からこの予測遺伝子がDro1遺伝子の本体であると判断することはできなかった。
Kinandang Patongを含むjaponica14品種のDro1のcomplementary DNA (cDNA)領域内の塩基配列をすべて解析したところ、全品種の塩基配列は同じであった。しかしながら、バスケット法で深根率を調査したところ、深根率が最も高いKinandang Patongの83.1%から最も低いTupa729の15.9%まで深根率に幅広い変異が見られた。この原因として、ほかに深根性関連QTLが存在することが考えられる一方で、プロモーター領域の塩基配列の違いが遺伝子の発現調節に影響を与えているのではないかと考えた。そこで、Kinandang Patong と日本晴の上流約2.2kb(5'側上流の候補領域の端まで)について塩基配列を比較したところ、2か所で変異が見られた。一箇所は、5’側非翻訳領域から1,250bp上流で日本晴の塩基配列チミンがKinandang Patongではグアニンに置換していた。この周辺配列をプロモーター領域のシス配列の検索サイトPLACE(A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements、 www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)で解析すると、「GATA box」と呼ばれるモチーフのチミンがグアニンになっていることが分かった。もう一箇所は、5’側非翻訳領域上流の1,189から1,218bpの30bpがKinandang Patongで欠失があった。このような塩基配列の変異が品種内の深根性の変異の原因の1つである可能性はある。
これら2つの試験から、候補領域6.0kbpに予測された遺伝子がDro1本体であることを見出した。その結果、深根性遺伝子であるDro1遺伝子の単離、同定に初めて成功した。
〔1〕以下(a)から(e)のいずれかに記載のDNA;
(a)配列番号:1に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:1、2、12、14又、16又は17のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(c)配列番号:3、13又は15のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(d)配列番号:1、2、12、14、16又は17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物に深根性の形質を付与する活性を有するDNA、及び
(e)配列番号:3、13又は15のいずれかに記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物に深根性の形質を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
〔2〕植物が単子葉植物である、〔1〕に記載のDNA。
〔3〕単子葉植物がイネ科植物である〔2〕に記載のDNA。
〔4〕イネ科植物がイネ、麦類(コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ハトムギ)、トウモロコシ、キビ、アワ、ヒエ、ソルガム、シコクビエ、トウジンビ、テフ、サトウキビ、チモシー、ケンタッキーブルーグラス、オーチャードグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、バヒアグラスからなる群より選択される、〔3〕に記載のDNA。
〔5〕イネ科植物がイネ、ソルガム、及びトウモロコシからなる群より選択される、〔3〕に記載のDNA。
〔6〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
〔7〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のDNAを発現可能に保持する形質転換細胞。
〔8〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のDNAで形質転換された植物体であって、深根性の形質を有する形質転換植物体。
〔9〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のDNA又は〔6〕に記載のベクターを植物細胞に導入することによって製造される形質転換植物体であって、深根性の形質を有する形質転換植物体。
〔10〕以下(a)から(d)の工程によって得られる形質転換植物体であって、深根性の形質を有する形質転換植物体;
(a)〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のDNA又は〔6〕に記載のベクターを植物細胞に導入する工程、
(b)工程(a)の植物細胞における〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のDNAのコピー数を測定する工程、
(c)導入されたDNA又はベクターのコピー数が1である形質転換植物細胞を選択する工程、および
(d)工程(c)で選択された形質転換植物細胞から植物体を再生させる工程。
〔11〕植物が単子葉植物である、〔8〕から〔10〕のいずれかに記載の植物体。
〔12〕単子葉植物がイネ科植物である、〔11〕に記載の植物体。
〔13〕イネ科植物がイネ、麦類(コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ハトムギ)、トウモロコシ、キビ、アワ、ヒエ、ソルガム、シコクビエ、トウジンビ、テフ、サトウキビ、チモシー、ケンタッキーブルーグラス、オーチャードグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、バヒアグラスからなる群より選択される、〔12〕に記載の植物体。
〔14〕イネ科植物がイネ、ソルガム、及びトウモロコシからなる群より選択される、〔12〕に記載の植物体。
〔15〕〔8〕から〔14〕のいずれかに記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔16〕〔8〕から〔15〕のいずれかに記載の形質転換植物体から単離された細胞。
〔17〕〔8〕から〔15〕のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔18〕〔8〕から〔15〕のいずれかに記載の形質転換植物体から単離された器官。
〔19〕〔16〕に記載の細胞、〔17〕に記載の繁殖材料、および〔18〕に記載の器官の少なくとも1つから得られる加工食品。
〔20〕〔8〕、〔11〕から〔13〕のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のDNA又は〔6〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
〔21〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のDNAのコピー数が1である形質転換植物細胞または形質転換植物体を選択する工程をさらに含む、〔20〕に記載の方法。
〔22〕以下(a)から(c)の工程を含む植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、被検植物が深根性の形質を有すると判定する方法;
(a)被検植物からDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のDNAを含む領域を増幅する工程、及び
(c)増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のDNAのそれと比較する工程。
〔23〕被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号:8に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号:9に記載の塩基配列を含むプライマーでPCR(polymerase chain reaction)を行う工程を含む、植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が深根性の形質を有すると判定される方法。
〔24〕被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号:10に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号:11に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が深根性の形質を有さないと判定される方法。
〔25〕以下の(a)および(b)に記載の工程を含む深根性の形質を有する植物を選抜する方法;
(a)深根性の形質を有する植物と任意の植物とが交配された品種を作製する工程、及び
(b)〔22〕から〔24〕のいずれかに記載の方法により、工程(a)で得られた植物が深根性の形質を有するか否かを判定する工程。
〔26〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のDNAによりコードされるタンパク質。
〔27〕〔26〕に記載のタンパク質に結合する抗体。
〔28〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のDNAまたはその相補配列に相補的な少なくとも15の連続する塩基を含むDNA。
〔29〕配列番号:4から11のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA。
(a)配列番号:1に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:1、2、12、14、16又は17のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(c)配列番号:3、13又は15のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(d)配列番号:1、2、12、14、16又は17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物に導入された場合に当該植物に深根性の形質を付与する活性を有するDNA、及び
(e)配列番号:3、13又は15のいずれかに記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物に深根性の形質を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
以下本明細書において、これらのDNAを「本発明のDNA」又は「Dro1遺伝子」と称する場合がある。また本発明のDNAによりコードされるタンパク質を「本発明のタンパク質」又は「Dro1タンパク質」と称する場合がある。
本発明において「含む」は「含む」及び「からなる」の両方を意味する。
また上の(e)のDNAは次のように表現することも出来る。
(e)配列番号:3、13又は15のいずれかに記載のアミノ酸配列において、1または複数のアミノ酸に置換、欠失、付加、挿入の少なくとも1つから選択される変異を有するタンパク質をコードするDNAであって、植物に深根性の形質を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
また本発明のDNAは「単離されたDNA」と表現することも出来る。
配列番号:1に記載の塩基配列におけるタンパク質のコード領域は、264番目の塩基から2685番目の塩基である。
また配列番号:2に記載の塩基配列におけるタンパク質のコード領域は、264番目の塩基から1019番目の塩基である。
またKinandang PatongのDro1遺伝子およびプロモーター領域を含むその上流の塩基配列を配列番号:17に示す。日本晴における対応する領域の配列(配列番号:18)と比較し、Kinandang Patong(配列番号:17)では、Dro1遺伝子の上流約1.2kbに1塩基の塩基置換と30塩基の欠失が存在する。具体的には、日本晴における「GATA」モチーフの「T」(配列番号:18に記載の塩基配列において6番目の塩基)が、Kinandang Patongでは「G」となっている(配列番号:17に記載の塩基配列において6番目の塩基)。また配列番号:18の7から36番目における30塩基が、Kinandang Patongの対応する領域では欠損している。
配列番号:12(CDS配列)に記載の塩基配列におけるタンパク質のコード領域は、1番目の塩基から789番目の塩基である。
配列番号:14(CDS配列)に記載の塩基配列におけるタンパク質のコード領域は、1番目の塩基から768番目の塩基である。
また化学合成DNAは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。
また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合(縮重変異)もあり、このような縮重変異体も本発明のDNAに含まれる。
これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、Dro1タンパク質のアミノ酸配列(配列番号:3、13又は15)と高い相同性を有すると考えられる。また塩基配列レベルにおいて、Dro1タンパク質をコードするDNAの塩基配列(配列番号:1、2、12、14、16又は17)と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体あるいは塩基配列全体で、少なくとも50%以上、さらに好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上)の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993)を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990)。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=100、wordlength=12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
本発明のベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌(例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue)等で大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子(例えば、薬剤(アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等)により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有するベクターが挙げられるがこれに限定されない。このようなベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script等が挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7等が挙げられる。Dro1タンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等の大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター(Wardら, Nature (1989) 341, 544-546;FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)、araBプロモーター(Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 )、またはT7プロモーター等を持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1(ファルマシア社製)、「QIAexpress system」(キアゲン社製)、pEGFP、またはpET等が挙げられる。
また真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、糸状菌、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属、例えば、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)が知られているがこれらに限定されない。
本発明は、本発明のDNAやベクターが導入されたこれらの細胞を提供する。
本発明におけるベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものが好ましく、上述のベクター(例えばpMH1、pMH2、pCAMBIAベクターなどのベクター)が挙げられるが、特に制限はない。本発明のベクターは、例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター(例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター等)を有していてもよい。このようなプロモーターを使用する場合、プロモーターの下流に、本発明のDNAが機能的に結合したDNAを設計する。そして設計されたDNAを含むベクターを植物細胞に導入する。これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることによって、本発明のDNAが発現された形質転換植物体を得ることが出来る。本発明はこのように、プロモーターの下流に、本発明のDNAが機能的に結合したDNAも提供する。ここで「機能的に結合」とは、プロモーター配列に転写因子が結合することにより、本発明のDNAの発現が誘導されるように、プロモーター配列と該DNAとが結合していることを言う。
なおこれら以外にも、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。
上記DNAやベクターが導入される植物細胞の形態は、植物体を再生しうるものであれば、特に制限はなく、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、発芽種子などが含まれる。
上記プロモーターとして、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のCaMV35S、トウモロコシのユビキチンプロモーター(特開平2-79983号公報)等を挙げることができる。
また、上記ターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、植物体中で機能するプロモーターやターミネーターであれば、これらに限定されない。
イネであればFujimuraら(Fujimura. et al. Tissue Culture Lett. 2, 1995, 74.)の方法
小麦であればHarrisら(Harris, R. et al. Plant Cell Reports. 7, 1988, 337-340)の方法やOzgenら(Ozgen, M. et al. Plant Cell Reports. 18, 1998, 331-335)の方法
大麦であればKiharaとFunatsuki(Kihara, M. and Funatsuki, H. Breeding Sci. 44, 1994, 157-160.)の方法やLursとLorz(Lurs, R. and Lorz, H. Theor. Appl. Genet. 75, 1987, 16-25.)の方法
トウモロコシであればShillitoら(Shillito, R.D., et al. Bio/Technology, 7, 1989, 581-587.)の方法やGordon-Kammら(Gordon-Kamm, W.J. et al. Plant Cell. 2(7), 1990, 603-618.)の方法
ソルガムであればWenら(Wen, F.S., et al. Euphytica. 52, 1991, 177-181.)の方法やHagio(Hagio, T. Breeding Sci. 44, 1994, 121-126.)の方法
ライムギであればCastilloら(Castillo A. M., Vasil V., Vasil I. K. (1994) Nature Biotechnology 12: 1366-1371.)の方法
エンバクであればChoら(Cho M. J., WEN J., LEMAUX P. G., (1999) Plant science 148: 9-17.)の方法
トウジンビであればO’Kennedyら(O’Kennedy M. M., Burger J. T., Botha F. C. (2004) Plant Cell Reports 22: 684-690.)の方法
ケンタッキーブルーグラスであればHaら(Ha C. D., Lemaux P. G., Cho M. J. (2001) In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 37: 6-11.)らの方法
オーチャードグラスであればCHOら(CHO M.J., CHOI H. W., LEMAUX P. G. (2001) Plant cell reports 20: 318-324.)の方法
イタリアンライグラスであればYeら(Ye X., Wang Z. Y., Wu X., Potrykus I., Spangenberg G. (1997) Plant Cell Reports 16: 379-384.)の方法
ペレニアルライグラスであればSpangenbergら(Spangenberg G., Wang Z. Y., Wu X., Nagel J., Potrykus I. (1995) Plant science 108: 209-217.)らの方法
トールフェスクであればWangら(Wang Z. Y., Takamizo T., Iglesias V. A., Osusky M., Nagel J., Potrykus I., Spangenberg G. (1992) Nature Biotechnology 10: 691-696.)の方法
バヒアグラスであればSmithら(Smith R. L., Grando M. F., Li Y. Y., Seib J. C., Shatters R. G. (2002) Plant Cell Reports 20: 1017-1021.)の方法
(a)本発明のDNA(Dro1遺伝子)又は該DNA(Dro1遺伝子)を含むベクターを植物細胞に導入する工程、及び
(b)工程(a)においてDNA又はベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程。
上記形質転換体の製造方法は、
(c)深根性の形質を付与する植物体を選択する工程、
をさらに含んでもよい。
また本発明の形質転換植物体の好ましい態様として、以下(a)から(d)の工程によって得られる形質転換植物体であって、深根性の形質を有する形質転換植物体が挙げられる。また本発明の形質転換植物体の製造方法の好ましい態様として、、以下(a)から(d)の工程を含む形質転換植物体の製造方法が挙げられる。
(a)Dro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入する工程、
(b)工程(a)の植物細胞における人為的に導入されたDro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターのコピー数を測定する工程、
(c)人為的に導入されたDro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターのコピー数が1(シングルコピー)である形質転換植物細胞を選択する工程、および
(d)工程(c)で選択された形質転換植物細胞から植物体を再生させる工程。
上記方法においては、Dro1遺伝子を含む形質転換植物細胞から植物体を再生した後、該植物体における人為的に導入されたDro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターのコピー数を測定し、コピー数が1である植物体を選択してもよい。従って本発明は、以下(a)から(c)の工程によって得られる形質転換植物体であって、深根性の形質を有する形質転換植物体に関する。また本発明は、以下(a)から(c)の工程を含む形質転換植物体の製造方法に関する。
(a)Dro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生する工程、
(b)工程(a)の植物体における人為的に導入されたDro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターのコピー数を測定する工程、
(c)人為的に導入されたDro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターのコピー数が1である形質転換植物体を選択する工程。
なお本発明において「コピー数」とは、形質転換によって植物体に導入されたDro1遺伝子あるいは当該遺伝子を含むベクターの数を意味する。すなわち本発明の「コピー数」には、植物に内在するDro1遺伝子(内在性遺伝子)の数は含まれない。
すなわち本発明の特に好ましい態様として、上に記載の工程(a)から(d)あるいは工程(a)から(c)に加え、さらに以下の工程を含む方法によって得られる形質転換植物体にが挙げられる。また本発明の特に好ましい態様として、上に記載の工程(a)から(d)あるいは工程(a)から(c)に加え、さらに以下の工程を含む形質転換植物体の製造方法が挙げられる。
・工程(d)あるいは(c)で得られた形質転換体同士を交配させ、植物体を取得する工程
・上の工程によって得られた植物体からDro1遺伝子をホモに有する植物体を選択する工程
交配によりT0世代の植物体からT1世代の植物体を作製する方法は当業者に周知である。また交配によって得られた植物体におけるDro1遺伝子のコピー数(null型、ヘテロ型、ホモ型)の測定も、サザンブロッド解析やリアルタイムPCR法など当業者に周知の方法によって行うことが出来る。
本発明の加工食品の商品形態は特に限定されない。一例として、常温または低温にて流通販売され、飲食時に電子レンジ等の加温調理器具にて常温もしくは高温に加熱される形態が挙げられる。具体的には、コンビニエンスストア、スーパーマーケットやテイクアウト惣菜店等で販売される弁当、おにぎり、調理麺等が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の加工食品は容器包装した形態であってもよい。例えばプラスチック成型容器などの容器に封入された形態、あるいはレトルトパウチなどの容器に封入され密封後に殺菌された形態とすることも出来る。
本発明の「細胞、繁殖材料、器官の少なくとも1つから得られる加工食品」は、「細胞、繁殖材料、器官の少なくとも1つを原料として製造される加工食品」、「細胞、繁殖材料、器官の少なくとも1つを含む加工食品」、「細胞、繁殖材料、器官の少なくとも1つを加工することによって得られる加工食品」などとも表現することが出来る。
(a)被検植物からDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から本発明のDNA(Dro1遺伝子)の全部又は一部を含む領域を増幅する工程、及び
(c)増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、本発明のDNA(Dro1遺伝子)のそれと比較する工程。
Dro1遺伝子の一部としては、好ましくはDro1遺伝子の第4エキソン、より好ましくはDro1遺伝子の第4エキソンの5’端から116bpの配列(配列番号:2の塩基配列において943番目の塩基)を含む領域(例えば、配列番号:2の塩基配列において943番目の塩基を含む、少なくとも100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1の塩基を含む領域)が挙げられるがこれらに限定されない。本発明者は、Kinandang PatongではDro1遺伝子の第4エキソンの5’端から116bpの配列(配列番号:2の塩基配列において943番目の塩基)がアデニンにあるのに対し、IR64ではこの塩基が欠失していることを見出した。従って、この塩基の欠失の有無を調べることにより、被検植物が深根性の形質を有するか否かの判定が可能である。すなわち本発明は、配列番号:2の塩基配列における943番目の塩基の有無を検出する工程を含む、植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法であって、塩基の欠失が検出された場合に被検植物が深根性の形質を有しないと判定する方法を提供する。1塩基の欠失の有無は、Dro1遺伝子の全部又は一部を含む領域の塩基配列や分子量を比較することによって検出することが可能である。
また、本発明の判定方法に供されるDNA試料は特に制限されるものではないが、通常、被検植物から抽出されるゲノムDNAを用いる。また、ゲノムDNAの採取源は特に限定されるものではなく、植物のいずれの組織からも抽出できる。例えば、穂、葉、根、茎、種子、胚乳部、フスマ、胚等から抽出することができるがこれらに限定されない。
また塩基配列の決定は、例えば市販の自動DNAシーケンサーを用いて行うことが出来る。
すなわち本発明は、以下の(a)および(b)に記載の工程を含む深根性の形質を有する植物を選抜する方法を提供する。
(a)深根性の形質を有する植物と任意の植物とが交配された品種を作製する工程、及び
(b)本明細書に記載された被検植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法により、工程(a)で得られた植物が深根性の形質を有するか否かを判定する工程。
本発明の選抜方法は、以下の工程をさらに含むことが出来る。
(c)工程(b)において深根性の形質を有すると判定された植物を選択する工程。
本発明の選抜方法を利用すれば、深根性の形質を有すると識別される植物を早期に選抜することが可能となる。本発明はこのような深根性の形質を有すると識別される植物を早期に選抜する方法も提供する。ここでいう「早期」とは、例えばイネの出穂より前の状態を指し、好ましくは発芽直後の状態を指す。本発明の選抜方法を利用すれば、深根性の形質を有する品種の育成を従来よりも短期間で成し遂げることが可能となる。
プライマーとしては、以下のプライマーセットが挙げられるがこれらに限定されない。
IR64とKinandang Patong 間で多型を示すInDelマーカーであるDro1-INDEL09の増幅に用いられる、配列番号:4に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号:5に記載の塩基配列を含むプライマーからなるプライマーセット
IR64とKinandang Patong 間で多型を示すCAPSマーカーであるDro1-CAPS05の増幅に用いられる、配列番号:6に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号:7に記載の塩基配列を含むプライマーからなるプライマーセット
Kinandang PatongのゲノムDNA特異的マーカーであるSNP02-KPの増幅に用いられる、配列番号:8に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号:9に記載の塩基配列を含むプライマーからなるプライマーセット
IR64由来のゲノムDNA特異的マーカーであるSNP02-IR64の増幅に用いられる、配列番号:10に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号:11に記載の塩基配列を含むプライマーからなるプライマーセット
また本発明は、植物(例えばイネ)由来のゲノムDNAを鋳型とし上のプライマーセットによって増幅されるDNA断片の全部又は一部を含むヌクレオチドであって、Dro1遺伝子の20〜100の連続したヌクレオチドに関する。このようなDNAは被検植物が深根性であるか浅根性であるかの判定に有用である。
本発明の薬剤に含まれるDNAは、ベクターに挿入された形態であってもよい。ベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター(例えば、ジャガイモ・キチナーゼ遺伝子SK2のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター等)を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。
本発明の薬剤は、上記DNAや該DNAが挿入されたベクター自体であってもよく、また、これらが植物細胞への導入のための他の成分と混合されているものであってもよい。例えば、上記DNA、上記DNAを挿入したベクター、上記DNAが導入されたアグロバクテリウム、これらを含む生化学的試薬や溶液は、本発明における薬剤に含まれる。
また本発明は、上記植物体から単離された細胞、繁殖材料、器官に関する。
また本発明は、上記細胞、繁殖材料、器官の少なくとも1つから得られる加工食品に関する。
また本発明は、本発明のDNA又はベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、耐乾性を有する形質転換植物体の製造方法に関する。
また本発明は、以下(a)から(c)の工程を含む植物が耐乾性を有するか否かを判定する方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、被検植物が耐乾性を有すると判定する方法に関する。
(a)被検植物からDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から本発明のDNAを含む領域を増幅する工程、及び
(c)増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、本発明のDNAのそれと比較する工程。
また本発明は、被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号:8に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号:9に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が耐乾性を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が耐乾性を有すると判定される方法に関する。
また本発明は、被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号:10に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号:11に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が耐乾性を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が耐乾性を有さないと判定される方法に関する。
また本発明は、以下の(a)および(b)に記載の工程を含む耐乾性を有する植物を選抜する方法に関する。
(a)耐乾性を有する植物と任意の植物とが交配された品種を作製する工程、及び
(b)上記耐乾性を有するか否かを判定する方法により、工程(a)で得られた植物が耐乾性を有するか否かを判定する工程。
植物が耐乾性を有するか否かは、葉面温度を測定することによって行うことが出来る。
本発明では、形質転換植物が対照と比較して、人工的に作製した乾燥ストレス下(乾燥環境下)において、わずかでも葉面温度が下降する限り、「耐乾性を有する」の意に含まれる。
すなわち本発明は、本発明のDNAで形質転換された植物体であって、乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有する植物体に関する。
また本発明は、上記植物体から単離された細胞、繁殖材料、器官に関する。
また本発明は、上記細胞、繁殖材料、器官の少なくとも1つから得られる加工食品に関する。
また本発明は、本発明のDNA又はベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有する形質転換植物体の製造方法に関する。
また本発明は、以下(a)から(c)の工程を含む植物が乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有するか否かを判定する方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、被検植物が乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有すると判定する方法に関する。
(a)被検植物からDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から本発明のDNAを含む領域を増幅する工程、及び
(c)増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、本発明のDNAのそれと比較する工程。
また本発明は、被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号:8に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号:9に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有すると判定される方法に関する。
また本発明は、被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号:10に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号:11に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有さないと判定される方法に関する。
また本発明は、以下の(a)および(b)に記載の工程を含む乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有する植物を選抜する方法に関する。
(a)乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有する植物と任意の植物とが交配された品種を作製する工程、及び
(b)上記乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有するか否かを判定する方法により、工程(a)で得られた植物が乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有するか否かを判定する工程。
本発明では、形質転換植物が対照と比較してわずかでも乾燥ストレス時の葉の巻き込みの程度が少ない限り、「葉巻抵抗性を有する」の意に含まれる。
すなわち本発明は、本発明のDNAで形質転換された植物体であって、対照と比較し、乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは稔実重を有する植物体に関する。このような植物体は、乾燥ストレス下における稔実数もしくは稔実重の減少が抑制された植物体と表現することも出来る。また、対照と比較し、乾燥ストレス下における稔実数もしくは稔実重が増加した植物体と表現することも出来る。
また本発明は、上記植物体から単離された細胞、繁殖材料、器官に関する。
また本発明は、上記細胞、繁殖材料、器官の少なくとも1つから得られる加工食品に関する。
また本発明は、本発明のDNA又はベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、対照と比較し乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有する形質転換植物体の製造方法に関する。
また本発明は、以下(a)から(c)の工程を含む、対照と比較し、植物が乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有するか否かを判定する方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、対照と比較し、被検植物が乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有すると判定する方法に関する。
(a)被検植物からDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から本発明のDNAを含む領域を増幅する工程、及び
(c)増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、本発明のDNAのそれと比較する工程。
また本発明は、被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号:8に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号:9に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、対照と比較し、植物が乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、対照と比較し、被検植物が乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有すると判定される方法に関する。
また本発明は、被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号:10に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号:11に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、対照と比較し、植物が乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、対照と比較し、被検植物が乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有さないと判定される方法に関する。
また本発明は、以下の(a)および(b)に記載の工程を含む、対照と比較し、乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有する植物を選抜する方法に関する。
(a)対照と比較し乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有する植物と任意の植物とが交配された品種を作製する工程、及び
(b)上記対照と比較し乾燥ストレス下において植物が多くの稔実数もしくは重い稔実重を有するか否かを判定する方法により、工程(a)で得られた植物が、対照と比較し、乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有するか否かを判定する工程。
本発明において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有するとは、本発明のDNAを有さない対照と比較し、乾燥ストレス下における稔実数が多いもしくは稔実重が重いことを意味する。本発明においては、対照と比較しわずかでも多くの稔実数もしくは重い稔実重を有する限り、「多くの稔実数もしくは重い稔実重を有する植物体」を意味する。
植物の稔実数は、例えば収穫した穂から不稔を除いた稔実を数えることによって簡単に測定することが出来るがこの方法に限定されない。また、植物の稔実重は、例えば収穫した穂から不稔を除いた稔実の重さを計ることによって簡単に測定することが出来るがこの方法に限定されない。
配列番号1:Kinandang PatongのDro1遺伝子のゲノムDNAの塩基配列
配列番号2:Kinandang PatongのDro1遺伝子のcDNAの塩基配列
配列番号3:Kinandang PatongのDro1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号4、5:IR64とKinandang Patong 間で多型を示すInDelマーカーであるDro1-INDEL09の増幅に用いられるプライマーセット
配列番号6、7:IR64とKinandang Patong 間で多型を示すCAPSマーカーであるDro1-CAPS05の増幅に用いられるプライマーセット
配列番号8、9:Kinandang PatongのゲノムDNA特異的マーカーであるSNP02-KPの増幅に用いられるプライマーセット
配列番号10、11:IR64のゲノムDNA特異的マーカーであるSNP02-IR64の増幅に用いられるプライマーセット
配列番号12:ソルガムのDro1遺伝子のCDSの塩基配列
配列番号13:ソルガムのDro1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号14:トウモロコシのDro1遺伝子のCDSの塩基配列
配列番号15:トウモロコシのDro1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号16:日本晴のFOX hunting systemに用いられているcDNAの塩基配列。ゲノムDNAの塩基配列から決定されたcDNA配列(配列番号:2の塩基配列)に対し、5'末端と3'末端配列がそれぞれ1bp付加されている。また、本cDNA塩基配列ベースで5'末端側から373bp目(配列番号:2における5'末端側から372bp目)のAがGに塩基置換されている。
配列番号17:Kinandang PatongのDro1遺伝子およびプロモーター領域を含むその上流の塩基配列
配列番号18:日本晴において、配列番号:17に対応する領域の塩基配列
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例1〕Dro1遺伝子座の同定
フィリピンの陸稲品種Kinandang Patongと国際稲研究所が育成した水稲品種IR64の2品種を国際稲研究所より分譲していただき、両品種を交配することで遺伝子単離の材料を育成した。両品種の交配に由来するBC2F2集団のうち、第9染色体は分離するが、それ以外の染色体領域はできるだけIR64ホモ型に固定した集団において、浅根型と深根型の個体が分離することを発見した。IR64は浅根型を、Kinandang Patongは深根型を示すことから、この分離はKinandang Patongが持つ深根性の遺伝子が関与していると考え、集団内の個体を達観により浅根型と深根型に分けて、遺伝子型を調査した。その結果、深根性に関与するQTLが、第9染色体に存在することが分かった(Uga et al. The 2nd International Conference on Plant Molecular Breeding. 2007)。詳細な遺伝解析を行うために、深根性を定量的に評価できるバスケット法を利用した。すなわち、土を充填した直径15cmのプラスチックザルをポットに埋設し、播種した後、イネが8葉齢前後になるまで栽培した。各バスケットから出てくる全根数に対してバスケットの底から出てくる根の割合を深根率として深根性を求めた。バスケットの底は平らになっており、地表面に対して53度より下に向かって伸長する根がバスケットの底より伸長することになる。IR64の深根率は平均1.6%であったのに対し、Kinandang Patongの深根率は平均72.6%であった。深根性に関与するQTLを単一遺伝子座としてマッピングするために、BC2F2集団からQTLの近傍領域で組換えが生じた8個体を選抜し、その自殖後代(BC2F3)からさらに組換え自殖固定系統(BC2F4)を選抜した。各固定系統について、20〜23個体をポット栽培し、バスケット法によって求めた深根率から遺伝子型を推定した。BC2F4系統のうち、QTLの周辺領域がIR64型に固定した系統の深根率は平均2.6%とIR64とほぼ同じ割合を示したのに対し、QTLの周辺領域がKinandang Patong型に固定した系統の深根率は平均40.4%であった。この結果から、各系統のQTLの遺伝子型は明確に決定され、QTLはInDelマーカーであるID07_14とID07_17の間に単一遺伝子座として位置づけられた。そこで、このQTLは深根性関連遺伝子座Dro1(Deeper Rooting 1)と命名された(宇賀ら 日本育種学会第112回講演会要旨集188p. 2007; 宇賀ら 第27回根研究集会. 2007; Uga et al. The 5th International Crop Science Congress Abstracts 243p. 2008)。さらに、公開されているsimple sequence repeat(SSR)マーカー情報(International Rice Genome Sequencing Project 2005)をもとに、両InDelマーカー間に存在するすべてのSSRマーカーの多型解析を行い、Dro1の候補領域をSSRマーカーであるRM24393とRM7424間の608kbpに絞り込んだ。
Dro1遺伝子をマップベースクローニング法で単離するため、4,560個体からなるBC3F2集団から候補領域内で組換えのあった359個体を選抜した。選抜した個体の後代を用いて候補領域を絞り込むためには、一度に多数の個体の深根率を調査する必要があった。そこで、バスケットをポットに埋設しないで水耕栽培で調査できる方法を考案した。考案した改良型バスケット法は、ポットにザルを埋設することなく、土を充填した直径7.5cmのステンレス製の特注ザルを水耕液中に設置することで、これまでの方法よりも1/4のスペースでイネの深根率を調査することが可能となった。改良型バスケット法での深根率は、地表面に対して50度より下に向かって伸長する根を深根として求めた(図1)。改良型バスケット法を用いて、各系統あたり約40個体の深根率を調査し、深根率の頻度分布から各系統のDro1遺伝子の遺伝子型を推定した。遺伝子領域を狭めるために、DNAマーカーのスクリーニングを行った。OryzaSNP Consortium(http://irfgc.irri.org/index.php?option=com_content&task=view&id=14&Itemid=106)のホームページからIR64とKinandang Patongに近い品種AzucenaのDro1周辺のSNP情報を抽出し、CAPSマーカーをデザインした。これらのCAPSマーカーの多型をIR64とKinandang Patongで調べ、多型のあった6マーカーをマッピングに用いた。また、IR64とKinandang PatongのBACライブラリーを作製し、候補領域を含むクローンの選抜を行い、選抜したクローンの塩基配列を解析した。これらの配列情報を用いてIR64とKinandang Patong 間で多型を示すInDelマーカーやCAPSマーカーを11個作製した。これらのマーカーを用いて359系統から組換え系統を選抜し、連鎖解析を行った結果、Dro1の遺伝子領域はInDelマーカーであるDro1-INDEL09(プライマー5'- GCAGACGCTCGTAACACGTA -3'(配列番号:4)およびプライマー5'- GTGGCAGCTCCATCAACTCT -3'(配列番号:5))からCAPSマーカーであるDro1-CAPS05(プライマー5'- GCACAAGATGGGAGGAGAGT -3'(配列番号:6)およびプライマー5'- CATGGGTGAGAATCGTGTTG -3'(配列番号:7)、増幅したDNAはHinfIで制限酵素処理を行う)で挟まれた6.0kbpの領域に絞り込まれた。この候補領域を含むゲノム塩基配列をRAP-DBにより解析した結果、1つの予測遺伝子が存在した。この予測遺伝子は、IR64の配列で第4エキソンに1bの欠失が存在し、フレームシフトによってストップコドンが生じていることが分かった。
3.1 Dro1遺伝子特定のための相補試験
RAP-DB で予測された遺伝子をDro1本体であると仮定し、Dro1候補領域6.0kbpとその前後を含むKinandang Patong由来のKpnI-NotI断片8.7kbpをpPZP2H-lac(Fuse et al. Plant Biotechnology 18:219-222, 2001)に組込み、アグロバクテリウムEHA101菌を介してIR64のカルスに導入した。具体的なIR64の形質転換は以下のとおりである。
(アグロバクテリウムを感染させるカルスの誘導)
滅菌したIR64の種子を2,4-Dを含むカルス誘導培地に置床し、30から33℃の24時間照明下で1週間培養後、新しいカルス誘導培地にカルスを分割し移植した。この操作を3回繰り返し、カルスを形成させた。カルス誘導培地の組成は、Hiei and Komariらが未熟胚法を用いた形質転換法で形質転換カルスを選抜した後に形質転換植物を再分化させる前培養として用いたNBPRCH40(Hiei and Komari Nature Protocols 3: 824-834. 2008)を改変し、カルス誘導培地として用いた。カルス誘導培地の組成は、以下のとおりである。
:100mL 10x N6 major salts、10mL 100x FeEDTA、1mL 1000x B5 minor salts、1mL 1000x B5 vitamins、30g/Lマルトース、0.5g/Lカザミノ酸、0.5g/Lプロリン、2mg/L 2,4-D、5g/Lゲルライト、pH5.8。
(アグロバクテリウムの感染)
カルスを感染前に新しい培地に移植し、3日間前培養したカルスをアグロバクテリウム菌液に浸せきした後、2N6-AS培地(Hiei and Komari Nature Protocols 3: 824-834. 2008)に移植し、暗黒下23℃で共存培養を行った。
(除菌及び形質転換カルスの選抜)
共存培養の完了後、アグロバクテリウムを除菌し、次いで形質転換した細胞を選抜するために形質転換処理カルスを薬剤として25mg/Lハイグロマイシン及び400mg/Lカルベニシリンを含有するカルス誘導培地(選抜培地)に置床した。30から33℃の24時間照明下で1週間培養後、新しい選抜培地にカルスを分割し移植した。この操作を3回繰り返し、形質転換細胞を選抜した。
(形質転換体の再分化)
選抜培地上で増殖の見られたカルスを再分化培地に移植した。28℃の24時間照明下で1週間から10日間培養後、新しい再分化培地に芽が形成され始めたカルスについて移植した。この操作を2回繰り返し、形質転換植物を選抜した。再分化培地の組成は、以下のとおりである:100mL 10x N6 major salts、10mL 100x FeEDTA、1mL 1000x B5 minor salts、1mL 1000x B5 vitamins、30g/Lマルトース、30g/L ソルビトール、2g/Lカザミノ酸、0.5g/Lプロリン、0.02mg/L NAA、5g/L、2mg/L カイネチン、5g/L ゲルライト、pH5.8に調整した培地に25mg/Lハイグロマイシン及び300mg/Lカルベニシリンを添加した。
(鉢上げ)
再分化した形質転換体を、発根培地(25mg/Lハイグロマイシン及び200mg/Lカルベニシリンを添加したMS培地(4g/L ゲルライト、pH5.8))に移して、28℃の24時間照明下で培養した。形質転換植物は根の発育を確認した後に、鉢上げした。
ハイグロマイシンで選抜し得られた異なるカルス由来の形質転換体17クローンの当代(T0)の深根率を改良バスケット法で調査した。ベクターコントロールでは深根率は、IR64と同じであったが、8.7kbpのKinandang Patong断片を導入した系統のうち、深根率の高い系統が多数観察された(図1、図2)。T0世代でサザン解析と形質転換ベクター中に含まれるハイグロマイシン抵抗性遺伝子の配列を検出できるリアルタイムPCRの系を併用し、各個体に導入された形質転換ベクターのコピー数を調べ、シングルコピーの個体を選び、T1種子を増殖した。T1個体では、リアルタイムPCRの系を用いて得られたシグナル強度から、T0でシングルコピーであった4系統のnull型(0コピー)、ヘテロ型(1コピー)、ホモ型(2コピー)を推定し、深根率との関係を調べた。4系統ともシグナル強度が0の個体の深根率はコントロールベクターと同じであった(図3)。一方、シグナル強度の強い系統は深根率も高かった。例えば、D27-cでは、2系統のシグナル強度は0で深根率も低いことからnull型と考えられる。また、シグナル強度が10から20程度の4系統については深根率も中程度であることからヘテロ型、シグナル強度が40から70程度の4系統は深根率がすべて高いことからホモ型であると判断した。このように、シングルコピーのT1系統では、導入されたDro1の遺伝子型の分離と深根率に正の相関がみられた。
3.2 Dro1遺伝子過剰発現体の深根率の検討
予測遺伝子はRAP-DBで完全長cDNA (AK068870)が登録されており、日本晴のFOX hunting system (Full-length cDNA Over-eXpressing gene hunting system) でT1世代が2系統、T2世代が2系統存在した。FOX系統に用いられた完全長cDNAの配列(配列番号:16)は、ゲノムの塩基配列から決定されたcDNA配列(配列番号:2)に対して、5'末端と3'末端配列がそれぞれ1bp付加されていた。また、本cDNA塩基配列ベースで5'末端側から373bp目(配列番号:2における5'末端側から372bp目)のAがGに塩基置換されていた。この塩基置換により、配列番号:3における37番目のアミノ酸がリジンからグルタミン酸に非同義置換を起こしていた。これら4系統について、各系統5個体の深根率を改良型バスケット法で調査した。その結果、コントロールである日本晴(野生型)10個体の深根率のレンジが12.2%から23.5%であったのに対し、FOX系統は8.1%から50.0%と日本晴よりも有意に深根率の高い個体が存在した(図4)。
これらの試験の結果から、候補領域6.0kbpに予測された遺伝子がDro1本体であることが明らかとなった。また、相補試験の結果から、Kinandang Patong型のDro1が機能型で深根となり、IR64型のDro1は機能が失われているか、低下していることで浅根になると考えられた。
マルチコピーの2系統(T1)でシグナル強度と深根率との関係を調査したところ、D130-cでは、シグナル強度と深根率に正の相関がみられた(図3)。しかし、D91-eは、シグナル強度がシングルコピーのホモ型(10〜350)程度であった4個体ではシグナル強度と深根率に正の相関がみられたが、シグナル強度が強い6系統(500〜2000)ではベクターコントロールと同じ浅根性を示した。Dro1がマルチコピーで植物体に導入されたことにより遺伝子のサイレンシングが起こったことが推測された。このことから、Dro1の遺伝子導入時にはシングルコピーを選抜するなどして発現量の調整が必要と考えられる。
NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)のホームページのblastnを用いて、Dro1のアミノ酸配列をクエリーとしたDro1の類似遺伝子の検索を行った。その結果、相同性の高い類似の遺伝子がソルガムとトウモロコシでそれぞれ1つずつ見出された。ソルガムとトウモロコシともに、Dro1にもっとも類似したORFには遺伝子名が無く、ソルガムはSbDro1L1、トウモロコシはZmDro1L1と命名した。ソルガムのアミノ酸配列はNCBIのホームページから取得した。トウモロコシのアミノ酸配列については、MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)からNCBIで取得したmRNA配列をもとに検索し、取得した。SbDro1L1のCDSの塩基配列を配列番号:12に、アミノ酸配列を配列番号:13に示した。またZmDro1L1のCDSの塩基配列を配列番号:14に、アミノ酸配列を配列番号:15に示した。Dro1に対するSbDro1L1の相同性は64%、ZmDro1L1の相同性は62%であった(図5)。
Dro1が圃場条件下において、深根化しているかを調べた。圃場試験の実験材料として用いた準同質遺伝子系統(Dro1-NIL)は以下の通り作製した。IR64/Kinandang PatongのF1にIR64を4回戻し交雑し、1回の自殖を行ったBC4F2系統の中から 第9染色体16.6〜19.5Mbpの領域のみがホモ型になっている個体を選抜した。この系統の自殖種子を準同質遺伝子系統として用いた。畑圃場にIR64とKinandang Patong、Dro1-NILを播種し、一般的な陸稲の肥培管理を行った。灌水は、特に行わず、天水のみで105日間栽培した。ショベルカーを用いて植物体の株元近くの土壌を深さ約1m掘り起こした後、水スプレーを用いて株から5cm程度の断面を丁寧に洗い流し、根がどこまで伸びているかを観察した。その結果、IR64で約20cm、Kinandang Patongで約80cm、Dro1-NILで約40cmの土壌深度まで根が伸びていた(図6)。Dro1-NILの根の長さは、IR64の根の長さと同じであったが、Dro1-NILはIR64に比べ約2倍も深く根が伸長していた。これは、Dro1の効果によって根の伸長角度が大きくなったことで、IR64の根の長さとほぼ同じ40cm程度まで根が深く伸びたことによる。
Dro1による深根化が耐乾性向上に関与しているか調べた。耐乾性試験の実験材料としてIR64とDro1-NILを用いた。耐乾性試験には茨城県農業総合センター生物工学研究所にて用いられている耐干性検定(平山、須賀 農業研究センター研究資料第30号イネ育種マニュアル. 152-155. 1995)の施設と同じものを、当研究所のビニールハウス内に設けた。施設は、灌水区と乾燥ストレス区からなる。灌水区の検定床は、木枠を用いて床土に30cmの客土を行っている。灌水区は、播種時から収穫までイネに乾燥ストレスがかからないように断続的な灌水を行った。灌水は、栽培期間中土壌深度25cmに設置したテンションメーターで土壌の水ポテンシャルを測定し、約-0.015MPa以下になったときに行った(図7)。この値は、一般的に植物が乾燥ストレスの影響を受けない状態である。乾燥ストレス区の検定床は、地中からの毛細管水を遮断するために、床土の上に三分砂利を厚さ5cmほど敷き、その上に25cmの客土をした。この処理により、灌水を停止すると客土層では徐々に土壌の水分含量が低下し、植物体は乾燥ストレスにさらされることになる。乾燥ストレス区は播種後約2ヶ月目に灌水を停止し、最初の個体が出穂するまで灌水しなかった。その結果、乾燥ストレス区では、灌水停止後10日目で土壌深度25cmの水ポテンシャルが-0.07MPaまで低下し、乾燥ストレス条件下になった(図7)。一方、土壌深度40cmの水ポテンシャルはストレス処理期間を通して-0.03MPa前後で安定し乾燥条件下とはならなかった。乾燥ストレス区では灌水停止後35日目にIR64は葉巻が観察され乾燥ストレスの影響を受けていることが分かったが、Kinandang Patong型のDro1を持ったIR64(Dro1-NIL)は葉巻が見られなかった(図8)。その後、ストレス区のIR64は葉巻の程度が大きくなり、49日目には植物体の生育がかなり抑制されていることが分かった。一方、IR64に比較して、Dro1-NILは49日目も葉巻の程度は小さく、個体の生育状態は良かった。葉面温度については、乾燥ストレス区で灌水停止後35日目のIR64に比べDro1-NILは葉面温度が平均0.7℃低かった(図9)。その後も、すべての調査日においてDro1-NILの葉面温度はIR64に比べ低いことが分かった。また、IR64とDro1-NILに対して気孔コンダクタンスと光合成速度を34日目と41日目の2回測定したところ、両形質ともDro1-NILがIR64と比較して有意に値が大きいことが分かった(図9)。乾燥ストレス区において最初の個体が出穂した後、再灌水を行い、イネを登熟させた。個体ごとに収穫し、各個体のかん長、穂長、地上部乾物重、穂数、穂重、稔実数を調査した。その結果、かん長と穂長についてはIR64とDro1-NIL間に有意な差は見られなかった。一方、地上部乾物重、穂数、穂重、稔実数はIR64とDro1-NIL間に有意な差がみられた(図10)。特に、稔実数はIR64に比較してDro1-NILは約3.8倍も増加していた。これらの結果が、Dro1-NILの深根性によるものかを確認するため、検定床を解体し、根が砂利層を貫通しているか調べた。その結果、IR64は砂利層を貫通することはできなかったが、Dro1-NILは砂利層を貫通し、下の土層に根が伸びていることが確認できた(図11)。これらのことから、Dro1がイネを深根化することで耐乾性を獲得し、光合成能力や収量を増加させることが明らかとなった。
なお葉面温度の測定は、対象物から出ている赤外線放射エネルギーを検出し、見かけの温度に変換して、温度分布を画像表示する装置(赤外線サーモグラフィ)を用いて行った。具体的には、乾燥ストレス条件下のイネ植物体に対して、一定の距離から赤外線サーモグラフィを用いて葉の表面温度を撮影した。つぎに、専用のソフトウェアで取り込んだ画像中の植物体の平均的な葉面温度を求めた。光合成速度は、葉をおいた容器に一定濃度の二酸化炭素を含んだ空気を通気し、容器から出てくる空気の二酸化炭素濃度の減少を測定し見積もった。気孔コンダクタンスは、葉をおいた容器から出てくる空気の水蒸気の増加量を測定し見積もった。具体的には、乾燥ストレス条件下のイネ植物体に対して、完全展開葉を光合成蒸散測定システムのチャンバーに一定の時間挟むことで計測値を得た。同じ展開葉を3回計測し、平均値を求めた。
実施例6においては、耐乾性検定床を用いてDro1の耐乾性を実証した。つぎに、畑の自然環境下での強干ばつストレスに対し、Dro1が耐乾性を示すか調査した。調査にはIR64とDro1-NILを用いて、畑圃場において施肥区(N:P:K=12:12:9 kg/10a)と無施肥区それぞれ3反復を設けた。1区画3mx3m内に、株間15cm、畝間30cmで、200個体植えた。このうち、IR64を100個体、Dro1-NILを100個体、それぞれ植えた。栽培期間中灌水は行わなかった。そのため、播種後90日目から1カ月以上雨が降らなかったことにより、土壌深度40cmにおいても土壌の水ポテンシャルが平均-0.08MPa以下という厳しい乾燥ストレス条件となった(図12)。乾燥ストレス条件下において、IR64は両処理区とも激しい葉巻現象が観察されたがDro1-NILはほとんど観察されなかった(図13)。とくに、無施肥区では、Dro1-NILは葉巻がほとんど観察されなかった一方で、IR64は葉巻が観察され、出穂日もDro1-NILに比べ大きく遅延した。収穫期に坪刈りによる収量調査を行った。調査した5項目のうち、穂数、地上部乾物重、全籾重、稔実籾重の4項目でIR64よりDro1-NILが大きな値と示した(表1)。
Dro1遺伝子は、IR64の配列で第4エキソンに1bの欠失が存在することから、この欠失を判別するPCRマーカーを設計した。設計したマーカーは、Kinandang PatongのDNAでのみ増幅するマーカーのSNP02-KP(プライマー5'- GTCTAGATCACGCAGTGAAT -3'(配列番号:8)およびプライマー5'- TCGCATGATGATGACCAAGT -3'(配列番号:9))とIR64のDNAでのみ増幅するマーカーのSNP02-IR64(プライマー5'- ATCGTCTAGATCACGCAGTGAAC -3'(配列番号:10)およびプライマー5'- AGGGTGGCTTTACCTCCGTA -3'(配列番号:11))の2種類である。
PCRの反応液は、1反応15μlあたり、0.2μM プライマー、0.6U Tag、0.2mM dNTPs、2mM MgCl2、20ng DNAを含む。PCRの反応条件は、(1) 95℃ 2分、(2) 94℃ 30秒、(3) アニーリング温度は51.8℃から62.2℃の範囲で30秒、(4) 72℃ 1分、(5) 7分で、SNP02-KPは(2)から(4)の反応を25サイクル、SNP02-IR64は(2)から(4)の反応を30サイクルそれぞれおこなった。PCR産物を電気泳動した結果、SNP02-KPはKinandang Patongで、SNP02-IR64はIR64でのみそれぞれ増幅が確認された(図9)。
世界的には干ばつによる農作物の減収が深刻である。また日本では、水田の排水性が悪いため、耐湿性のない大豆やトウモロコシの湿害が問題となっている。本発明は、このような国内外の問題の解決に有用である。
Claims (7)
- 以下(a)及び(b)の工程を含む、植物体に深根性の形質を付与する方法;
(a)以下(i)から(v)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターを含む植物に深根性の形質を付与する薬剤を植物細胞に導入する工程、及び
(b)工程(a)においてDNA又はベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程、
(i)配列番号:1に記載の塩基配列を含むDNA、
(ii)配列番号:1、2、16又は17のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(iv)配列番号:1、2、16又は17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、配列番号:1、2、16又は17に記載の塩基配列に対し90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、植物に深根性の形質を付与する活性を有するDNA、及び
(v)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物に深根性の形質を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 以下(i)から(v)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターを含む、植物に深根性の形質を付与するための薬剤;
(i)配列番号:1に記載の塩基配列を含むDNA、
(ii)配列番号:1、2、16又は17のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(iv)配列番号:1、2、16又は17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、配列番号:1、2、16又は17に記載の塩基配列に対し90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、植物に深根性の形質を付与する活性を有するDNA、及び
(v)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物に深根性の形質を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 以下(a)から(c)の工程を含む植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、被検植物が深根性の形質を有すると判定する方法;
(a)被検植物からDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から以下(i)から(v)からなる群より選択されるDNAを含む領域を増幅する工程、及び
(c)増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、以下(i)から(v)からなる群より選択されるDNAのそれと比較する工程;
(i)配列番号:1に記載の塩基配列を含むDNA、
(ii)配列番号:1、2、16又は17のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(iv)配列番号:1、2、16又は17のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、配列番号:1、2、16又は17に記載の塩基配列に対し90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、植物に深根性の形質を付与する活性を有するDNA、及び
(v)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物に深根性の形質を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号:8に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号:9に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が深根性の形質を有すると判定される方法。
- 被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号:10に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号:11に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が深根性の形質を有さないと判定される方法。
- 以下の(a)および(b)に記載の工程を含む深根性の形質を有する植物を選抜する方法;
(a)深根性の形質を有する植物と任意の植物とが交配された品種を作製する工程、及び
(b)請求項3から5のいずれかに記載の方法により、工程(a)で得られた植物が深根性の形質を有するか否かを判定する工程。 - 配列番号:4から11のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA。
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