KR20120101542A - 식물의 심근성을 제어하는 유전자 Ｄｒｏ１과 그의 이용 - Google Patents

식물의 심근성을 제어하는 유전자 Ｄｒｏ１과 그의 이용 Download PDF

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Abstract

식물의 심근성을 제어하는 유전자, 그 유전자가 도입된 형질전환 식물체, 및 그 유전자를 이용한 식물의 심근성을 제어하는 방법 등을 제공하기 위해, 대규모 분리 집단에 의해, 천근형(shallow rooting type)을 나타내는 벼 품종 IR64와 심근형(deep rooting type)을 나타내는 Kinandang Patong 사이에서 검출된 식물의 심근성을 제어하는 유전자좌(Dro1 유전자좌)의 고정밀도 연쇄해석을 시도하였다. 그 결과, Dro1의 유전자영역은 InDel 마커인 Dro1-INDEL09로부터 CAPS 마커인 Dro1-CAPS05 사이에 끼인 6.0 kbp의 영역인 것이 판명되었다. 또한 Kinandang Patong형의 Dro1 유전자의 형질전환 식물체는, 우위하게 심근률이 높은 것을 확인하였다. 또한 Kinandang Patong형의 Dro1 유전자를 갖는 개체는 내건성인 것을 확인하였다.

Description

식물의 심근성을 제어하는 유전자 Ｄｒｏ１과 그의 이용{Gene Dro1 controlling deep-rooted characteristics of plant and utilization of same}
본 발명은, 식물의 뿌리 형태를 제어하는 신규 유전자 및 그 유전자를 이용한 식물의 뿌리 형태의 제어방법에 관한 것이다. 구체적으로는 본 발명은, 식물에 있어서 심근성에 관여하는 신규 유전자 및 그 유전자를 이용한 식물의 심근성을 제어하는 방법에 관한 것이다.
현재, 세계의 인구는 발전도상국을 중심으로 증가 일로를 걷고 있어, 이들 인구를 부양하기 위한 식량 생산은 필수이다. 그러나, 최근 들어서의 지구 온난화나 사막화 등의 기후 변동에 의해, 농경지에 있어서 안정적인 강우를 얻는 것은 어려워지고 있다. 그 결과, 전세계에서, 강우의 감소에 수반되는 가뭄이 농작물 생산에 대해 커다란 피해를 초래하고 있다. 특히, 빗물만으로 재배되는 경우가 많은 벼나 소맥, 옥수수 등의 곡류의 경우는 가뭄에 의한 피해가 보다 커진다. 이에, 작물에 대한 내건성의 부여는 곡류의 육종상 중요한 목표가 되어 있다.
작물에 있어서의 뿌리는, 수분이나 영양소의 흡수 등에 의한 수량성(收量性)이나 지상부 식물체의 내도복성(耐倒伏性), 건조 회피성에 관여하는 중요한 형질이다. 단자엽 식물인 벼는 종자 뿌리의 발생 후에 절간(節間)으로부터 신장하는 다수의 관근(冠根)에 의해 근계를 형성한다. 벼의 근계 분포는, 관근의 길이와 신장방향에 의해 결정된다(모리타 시게노리 뿌리의 디자인 107p, 2003(비특허문헌 1)). 이 중, 관근의 신장방향은, 근계 분포를 형성하는데 있어서 특히 중요하다. 즉, 관근이 가로방향으로 신장하면 천근성(淺根性)이 되고, 세로방향으로 신장하면 심근성(深根性)이 된다. 심근성의 식물은, 천근성의 식물에 비해, 토양 심층에 뿌리가 보다 많이 분포하는 것으로부터, 식물이 건조 조건하에 노출된 경우에 토양 심층으로부터 물을 흡수하여, 건조로부터 회피할 수 있는 유효한 형질이다(Yoshida and Hasegawa Drought resistance in crops with emphasis on rice p. 97-114. 1982(비특허문헌 2); 모리타 시게노리 뿌리의 발육학 132p, 2000(비특허문헌 3)). 즉, 천근형의 작물을 심근화함으로써, 건조 회피성의 향상에 의한 내건성 부여를 기대할 수 있다.
작물에 있어서의 내건성의 타입은, 건조 도피형, 건조 내성형, 건조 회피형의 3종류가 있다. 일반적으로, 작물이 가장 건조에 약한 시기는 유수(幼穗) 형성기부터 출수기(出穗期) 사이이다. 건조 도피형은, 작물을 조만생화(早晩生化)함으로써 강우가 적은 시기가 유수 형성기부터 출수기와 겹치지 않도록 할 수 있다. 가장 일반적인 내건성의 품종개량의 방법으로, 출수기를 조작할 수 있는 유전자는 다수 단리되어 있다(WO 01/032881(특허문헌 1); 일본국 특허공개 제2002-153283(특허문헌 2); 일본국 특허공개 제2003-339382(특허문헌 3); 일본국 특허공개 제2004-089036(특허문헌 4); 일본국 특허공개 제2004-290190(특허문헌 5); 일본국 특허공개 제2005-110579(특허문헌 6)). 다만, 출수기는 품종에 따라 결정되고 있기 때문에, 재배기간의 강우의 변화가 매년 동일하다면 유효하나, 기후의 변화로 유수 형성기부터 출수기에 가뭄이 일어나면, 가뭄의 영향을 받게 되는 것이 문제이다. 건조 내성형은, 식물이 건조에 노출되었을 때에, 세포의 삼투압 조정 등을 통해 건조에 견디는 성질이다. 건조 내성형의 평가는, 식물 개체에 물을 주지 않음으로써 간편하게 평가할 수 있는 것으로부터, 건조 내성형에 관여하는 유전자는, 분자생물학적 실험에 의해 다수 단리되어 왔다(일본국 특허공개 제2007-222129(특허문헌 7); 총설, Tran et al. Methods in Enzymology 428:109-28. 2007(비특허문헌 4)). 그러나, 포장(圃場) 조건하에 있어서의 건조 내성형의 스크리닝은, 토양의 수분 함량의 불균일 등 환경 조건을 조절하는 것이 어려운 것으로부터, 간단하지 않다. 이 때문에, 건조 내성형의 품종 육성은 그다지 진행되어 있지 않다. 또한, 건조 내성형은 건조에 견디는 능력인데, 건조기간이 길면, 토양으로부터의 양수분(養水分)의 흡수가 불가능하기 때문에, 개체로서의 생장이 억제되고, 최종적으로는 고사하게 된다. 자실을 최종 생산물로 하는 곡물 생산에 있어서는, 식물체로서의 개체의 유지뿐 아니라, 어느 만큼 수확량을 확보할 수 있는지가 중요하기 때문에, 이 점은 문제가 된다. 건조 회피형은, 건조 조건하에 있어서, 건조 스트레스를 받지 않도록 함으로써 내건성을 획득하는 성질이다. 전술한 심근성은 그 중 하나이다. 통상, 포장에 있어서의 가뭄은, 토양 표면으로부터 하층을 향하여 진행되는데, 일반적인 농지에서는 토양 심층에는 물이 존재하기 때문에, 심근성의 식물은 토양 심층으로부터의 물을 이용함으로써, 건조 조건하에서의 개체의 건조를 회피할 수 있다. 일본에서는 육도(陸稻) 재배에 있어서의 장마가 끝난 후의 소우(少雨)?다조(多照)에 의한 가뭄 피해를 피하기 위해 심근성의 육종이 행해져, 심근성 품종인「유메노하타모치」가 고도 내건성?극량 식미 육도 품종으로서 육성되었다(히라사와 히데오등 Breeding Science 48: 415-419. 1998(비특허문헌 5)). 그러나, 심근성의 개변을 목적으로 한 유전자의 단리는 지금까지 보고되어 있지 않다.
뿌리의 신장방향을 제어하고 있는 요인 중 하나인 굴성(屈性)에 관여하는 유전자는 돌연변이체 등을 이용한 분자생물학적 수법으로 다수 단리되어 왔다. 굴성은, 외인성의 환경 자극에 반응하여 뿌리가 반응함으로써 일어나는 굴곡 성장이다. 굴성에는, 중력 굴성, 광 굴성, 수분 굴성, 접촉 굴성, 전기 굴성, 자기 굴성, 화학 굴성 등이 있다. 애기장대의 경우는, 많은 중력 굴성 유전자(총설, Morita and Tasaka Current Opinion in Plant Biology 7(6): 712-718. 2004(비특허문헌 6))나 수분 굴성 유전자 MIZ1(Kobayashi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(11): 4724-4729. 2007(비특허문헌 8)), MIZ2(Miyazawa et al. Plant Physiology 149(2): 835-840. 2009(비특허문헌 9))가 발견되고 있다. 벼의 경우는, 뿌리의 굴성에 관여하는 유전자의 보고는 적다. 광 굴성 유전자 CPT1(Haga et al. Plant Cell 17(1):103-115. 2005(비특허문헌 7))이나 관근 형성 유전자 Crl1(Inukai et al. Plant Cell 17(5): 1387-1396. 2005(비특허문헌 10))이 중력 굴성에 관여하고 있는 것이 보고되어 있다. 이들 유전자는 기능 결손을 수반하는 돌연변이체 등으로부터 단리된 것이 많고, 이들 유전자를 개변함으로써 작물에 심근성을 부여할 수 있었다고 하는 보고는 없다.
건조 회피를 목표로 한 심근성의 유전학적 연구는 옥수수나 벼에서 보고되어 있다. 옥수수의 경우는, Tuberosa등이나 Trachsel등이 뿌리 길이에 관여하는 양적 형질유전자좌(QTL)를 발견하고 있다(Tuberosa et al. Plant Molecular Biology 48: 697-712. 2002(비특허문헌 11); Trachsel et al. Theoretical and Applied Genetics DOI 10.1007/s00122-009-1144-9. 2009(비특허문헌 12)). 벼의 경우는, 심근성이나 뿌리 길이, 뿌리의 굵기 등의 형질에 대해서 품종간에 폭넓은 자연 변이가 존재한다(Uga et al. Breeding Science 59: 87-93. 2009(비특허문헌 13)). 분자 마커를 사용한 유전 해석에 의해, 이러한 품종간에 보이는 뿌리의 형태 변이에 관여하는 양적 형질 유전자좌(QTL)가 다수 발견되어 왔다(총설, Price et al. Journal of Experimental Botany 53: 989-1004. 2002(비특허문헌 14)). 심근성은, 뿌리 길이와 뿌리의 신장방향(각도)의 2가지 형질로부터 성립되는데, 심근성에 관한 QTL의 대부분은 뿌리 길이에 관여하는 QTL의 보고이다(총설, Price et al. Journal of Experimental Botany 53: 989-1004. 2002(비특허문헌 14); Courtois et al. Euphytica 134: 335-345. 2003(비특허문헌 15); Zheng et al. Theoretical and Applied Genetics 107: 1505-1515. 2003(비특허문헌 16); Li et al. Theoretical and Applied Genetics 110: 1244-1252. 2005(비특허문헌 17)). 뿌리의 신장각도에 관한 QTL은 옥수수에서 1예만 있는데, 어디까지나 통계적으로 추정된 것으로, 유전자의 단리?동정에는 이르고 있지 않다(Omori F. and Mano Y. Plant Root 1: 57-65. 2007(비특허문헌 18)). 따라서, 자연 변이로부터 발견된 뿌리에 관여하는 QTL의 유전자 단리?동정에 성공했다고 하는 보고는 없다. 이 원인으로서 생각할 수 있는 것은, 근계 형태는 지상부의 형질과 달리 표현형을 정확하게 평가하는 것이 어려워, 재현성을 얻기 어렵다는 점이다. 또한, 포장 조건에서 조사하는데는 노동력이 소요된다는 문제도 있다(Yadav et al. Theoretical and Applied Genetics 95: 619-632. 1997(비특허문헌 19)).
식물의 심근성을 조사하는 공지의 방법에는, 참호법(塹壕法)이나 모노리스법, 코어 샘플링법 등이 존재하여, 포장에 있어서의 심근성을 평가하기에는 적합하다(Nemoto et al. Breeding Science 48: 321-324. 1998(비특허문헌 20); 히라야마 마사카타등 일본 작물학회 기사 76:245-252. 2007(비특허문헌 21)). 참호법은 포장에서 식물을 재배한 후, 흙을 파올리고, 깊이별로 뿌리의 굵기나 수를 조사하는 방법이다. 다만, 참호법은, 흙을 파올리는데 매우 노동력이 소요되어, 대량의 개체를 평가하는데는 부적합하다. 모노리스법은, 재배한 식물의 주원(株元)에 2매의 철프레임을 박아넣고, 직사각형의 모노리스(예를 들면, 폭 30 ㎝×안길이 5 ㎝×깊이 30 ㎝)를 파내고, 깊이별로, 흙을 잘라내거나 하여, 뿌리의 길이나 수를 조사하는 방법이다. 코어 샘플링법은, 직경 5~8 ㎝, 길이 30~50 ㎝의 금속제의 원기둥관을 식물체의 주원(株元)이나 주간(株間)에 박아넣고, 얻어진 토양 샘플로부터 뿌리를 씻어내고, 뿌리의 길이나 수를 조사하는 방법이다. 어느 쪽의 방법도, 참호법보다는 샘플링이 간단하나, 박아넣는 장소에 따라, 샘플에 오차가 생기기 때문에, 흙 속의 뿌리의 정확한 상태를 확인하는 것은 불가능하다. 온실 등의 인공 환경하에서, 대량의 개체를 평가하는 방법으로서, 직경 5~10 ㎝의 원기둥형상의 재배 용기에 배지를 채우고, 식물을 파종?재배하여, 건조 스트레스 조건하에서의 심근성을 평가하는 방법이 개발되어 있다(WO2006/123392(특허문헌 8)). 이 방법에서는, 재배기간 중에 단계적으로 물의 수위를 낮춰 식물에 건조 스트레스를 가하고, 심근성의 품종은 천근성의 품종보다도 잎의 시듦 정도가 작다는 관계를 얻고 있다. 이 결과로부터, 심근성은 직접 평가하지 않고, 지상부의 시듦에 의해 심근성을 평가하는 방법이다. 이점으로서는, 흙에서 뿌리를 씻어내는 수고가 없어, 심근성을 간편하게 평가할 수 있다. 다만, 뿌리 길이는 길지만, 뿌리가 가로로 신장하는 품종의 경우, 원기둥에 뿌리가 닿은 시점에서 원기둥을 따라 뿌리는 아래로 신장하기 때문에, 심근성으로서 잘못 평가되는 경우가 있다. 이 방법의 경우는, 심근성을 구성하는 형질 중 뿌리 길이는 평가할 수 있으나, 뿌리의 신장방향을 평가하는 것이 어렵다.
뿌리의 신장방향만을 간편하게 정량화하는 방법으로서, 바스켓법이 소맥에 있어서 개발되었다(Oyanagi et al. 일본 작물학회 기사 62: 565-570. 1993(비특허문헌 22)). 또한, 벼에 있어서도 바스켓법에 의해 심근성을 조사한 보고가 있다(Kato et al. Plant Soil 287: 117-129. 2006(비특허문헌 23)). 이 방법은, 망목형상의 바스켓에 흙을 채우고, 포장 또는 포트에 설치하여, 일정 기간 재배한 후, 지표면에 대해 바스켓으로부터 신장되어 오는 뿌리의 신장각도를 측정함으로써 심근성을 평가한다. 간편하게 신장각도를 평가할 수 있으나, 유전자 단리를 위해 한번에 대량의 검체를 평가하기 위해서는 스페이스와 물 관리가 몹시 힘이 든다.
이러한 배경하에서, 자연 변이를 사용한 심근성 유전자의 단리와 심근성 유전자의 건조 회피에 대한 효과를 명확하게 하는 것은, 건조 회피능력의 개량에 맞는 품종 육성을 효율화하기 위해서라도 불가결해져 있다.
Dro1(Deeper Rooting 1)은 indica의 수도(手稻) 품종 IR64를 반복친(反復親)으로 한 열대 japonica의 육도 품종인 Kinandang Patong의 여교잡(backcross) 후대 계통(BC2F2)을 사용한 QTL 해석에 의해, 제9 염색체 장완에 통계적으로 존재가 추정된 심근성에 관여하는 QTL이다(Uga et al. The 2nd International Conference on Plant Molecular Breeding. 2007(비특허문헌 24); 우가등 일본 육종학회 제112회 강연회 요지집 188p. 2007(비특허문헌 25); 우가등 제27회 뿌리 연구집회. 2007(비특허문헌 26); Uga et al. The 5th International Crop Science Congress Abstracts 243p. 2008(비특허문헌 27)). IR64는, 아그로박테리움 형질전환법으로 유전자 도입을 행하는 것이 곤란한 품종이다. 현재, 벼의 경우는, 탈분화한 배양조직(예를 들면, 캘러스)을 식물 시료로서 행하는 아그로박테리움 형질전환법이 일반적이다(일본국 특허 제2649287호(특허문헌 9)). 그러나, IR64의 경우는, 캘러스를 사용한 방법으로는 형질전환효율이 매우 낮아, 캘러스를 사용한 아그로박테리움 형질전환법은 확립되어 있지 않다(Hiei and Komari Nature Protocols 3: 824-834. 2008(비특허문헌 28)). Hiei and Komari는, IR64의 형질전환의 식물 시료로서 캘러스 대신에 미숙 배(胚)를 사용한 방법을 보고하고 있다. 그러나, 미숙 배법은, 개화 후의 미성숙한 배를 사용하기 때문에, 필요할 때 미숙 배를 바로 입수할 수 있도록 하기 위해 연중 논이나 온실 등에서 식물을 준비할 필요가 있다. 예를 들면, 항상 미숙 배를 이용할 수 있도록 하기 위해서는, 2주간 간격으로 종자를 뿌리고, 식물을 관리하기 위한 다대한 재배 스페이스와 노동력이 필요하다. IR64의 경우도 캘러스를 사용한 아그로박테리움 형질전환법으로 유전자의 도입이 가능한 것은, 분자 육종의 실용화에 있어서도 매우 중요하다.
WO 01/032881　식물의 감광성 유전자 Hd1 및 그의 이용 일본국 특허공개 제2002-153283　식물의 개화를 유도하는 유전자 Hd3a 및 그의 이용 일본국 특허공개 제2003-339382　식물의 개화시기를 촉진하는 Ehd1 유전자 및 그의 이용 일본국 특허공개 제2004-089036　식물의 개화 촉진 유전자 RFT1 및 식물의 개화시기를 예측하는 방법 일본국 특허공개 제2004-290190　식물의 개화를 제어하는 유전자 Lhd4와 그의 이용 일본국 특허공개 제2005-110579　식물의 감광성 유전자 Hd5 및 그의 이용 일본국 특허공개 제2007-222129　환경 스트레스 내성 식물의 작출방법 WO2006/123392 식물의 심근성 평가방법 일본국 특허 제2649287호
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본 발명은 이러한 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은, 식물에 건조 회피성의 향상에 의한 내건성을 부여하기 위한, 식물의 뿌리 형태의 개변방법의 제공에 있다. 보다 구체적으로는 본 발명은, 식물에 있어서 심근성에 관여하는 신규 유전자, 심근성의 형질을 갖는 형질전환 식물체, 그 식물체의 제조방법, 및 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 방법 등을 제공하는 것을 과제로 한다.
Dro1의 후보가 되는 영역은, insertion-delition(InDel) 마커 ID07_14와 ID07_17 사이에 끼인 1,443 kbp(닛폰바레의 염기서열에 기초한다)의 염색체영역이다. 이 영역에는, RAP-DB에 의해 166개의 유전자가 예측되어 있었다. 이들 유전자 중, 벼를 포함하여 식물에서 심근성(deep rooting)에 관여하는 것으로 보고되어 있는 유전자 또는 그의 호몰로그는 확인되어 있지 않았다. 따라서, 에측 유전자의 기능으로부터 후보가 되는 유전자를 추정하는 것은 불가능하였다. 또한, IR64와 Kinandang Patong의 양 품종은 염기서열이 해독되어 있지 않기 때문에, 유전자 내에 존재하는 염기서열의 차이로부터 유전자를 추측하는 것도 곤란하였다. 이러한 사정하에 본 발명자는, Dro1 유전자의 단리, 동정을 시도하였다.
본 발명자는 먼저, 약 4,500 개체로 되는 대규모 분리 집단에 의해, 천근형(shallow rooting type)을 나타내는 벼 품종 IR64와 심근형(deep rooting type)을 나타내는 Kinandang Patong 사이에서 검출된 식물의 심근성을 제어하는 유전자좌(Dro1 유전자좌)의 고정밀도 연쇄해석을 시도하였다. 한번에 수백 개체의 심근률(각 바스켓으로부터 나오는 전체 뿌리 수에 대해 바스켓의 바닥으로부터 나오는 뿌리의 비율)을 조사하기 위해 종래의 바스켓법을 개량하여, 500 개체를 1회에 조사할 수 있도록 하였다. 다만, 그 이상은 한번에 대량의 식물체를 취급할 수는 없기 때문에, 대규모 집단으로부터 선발한 재조합 계통군으로부터 수 계통을 선택하여, 각 계통 40 개체의 표현형과 유전자형 데이터로부터 조금씩 후보영역을 좁혔다. 후보영역을 1,443 kbp에서 약 100 kbp까지 좁힌 단계에서, IR64와 Kinadang Patong의 bacterial artificial chromosome(BAC) 라이브러리를 제작하고, 100 kbp의 후보영역을 포함한 BAC를 스크리닝하였다. 다음으로, 양 품종의 BAC의 염기서열을 해석하였다. 염기서열의 비교로부터 후보 유전자를 좁힐 수 없는지 검토하기 위해, 양 품종에 대해서 RAP-DB로 예측된 유전자의 염기서열을 비교한 바, 엑손영역 내에서 염기서열의 변이가 존재하는 유전자가 다수로, 후보 유전자를 좁히는 것은 불가능하였다. 이에, 후보영역 내의 염기서열의 변이를 사용하여 DNA 마커를 제작하면서 합계 5회의 연쇄해석을 행하였다. 그 결과, Dro1의 유전자영역을 insertion-delition(InDel) 마커인 Dro1-INDEL09(프라이머 5'-GCAGACGCTCGTAACACGTA-3'(서열번호：4) 및 프라이머 5'-GTGGCAGCTCCATCAACTCT-3'(서열번호：5))로부터 Cleaved Amplified Polymorphic Sequences(CAPS) 마커인 Dro1-CAPS05(프라이머 5'-GCACAAGATGGGAGGAGAGT-3'(서열번호：6) 및 프라이머 5'-CATGGGTGAGAATCGTGTTG-3'(서열번호：7), 증폭한 DNA는 HinfI으로 제한효소 처리를 행한다) 사이에 끼인 6.0 kbp의 영역으로 좁혔다. 이 영역에는, RAP-DB에 의해 예측된 유전자가 하나만 존재하여, 이 예측 유전자는 전혀 기능 미지의 단백을 코드하고 있는 것이 추정되고 있었다. IR64의 형질전환은 매우 곤란하기 때문에, 형질전환법을 사용한 상보성 시험을 행하기 전에, 이 예측 유전자가 정말 심근성과 관계하는 것인지를 검토하였다. 먼저, 이하에 나타내는 수 종류의 기능 검색 사이트에서 예측 유전자의 아미노산 서열로부터 기능 예측을 행하여, 심근성에 관련된 기능을 가지고 있는지를 조사하였다.
?「SALAD database」식물의 단백질 서열을 게놈 와이드에 비교하는 데이터 베이스(salad.dna.affrc.go.jp/salad/)
?「Pfam」단백질 도메인의 데이터 베이스(pfam.janelia.org/)
?「PSORT」단백의 소수성이나 국재성을 예측하는 사이트(www.psort.org/)
?「InterPro」단백질 패밀리, 도메인, 기능부위의 데이터 베이스(www.ebi.ac.uk/interpro/)
그러나, 어느 검색 사이트에서도, 보존된 도메인은 하나도 발견할 수 없었다. 다음으로, 이 유전자의 엑손 내에 IR64와 Kinandang Patong 사이에서 염기서열의 변이가 없는지 조사하였다. 그 결과, 제4 엑손 내에 Kinandang Patong에서는 아데닌인 부분이 IR64에서는 1b 결실되어 있었다. 이 1b 결실에 의해 프레임 시프트가 일어나 도중에 스톱 코돈이 생성되어 있었다. 이에, 이 결실에 의해 IR64에서는 후보 유전자의 발현량이 저하되고 있는 것은 아닌지 생각하고, 발현량을 조사하였다. 조사에는 발아 6일째와 12일째 IR64 및 Kinandag Patong의 엽신(leaf blade) 및 엽초 상부(upper portion of leaf sheath), 엽초 기부(basal portion of leaf sheath), 관근(crown root)을 사용하였다. 이들 3개의 조직으로부터 토탈 RNA를 추출하고, 실시간 PCR에 의해 유전자의 발현량을 조사하였다. 그 결과, 양 품종 모두 엽신 및 엽초 상부와 관근의 2개소에서는 거의 발현이 보이지 않았으나, 엽초 기부에서는 양 품종 모두 발현이 보였다. 그러나, IR64와 Kinandang Patong에서 발현량을 비교한 바, 6일째 및 12일째의 샘플 모두에, 양 품종간에 2배 이상의 발현량의 차는 보이지 않아, 발현량의 결과로부터는 이 예측 유전자가 Dro1 유전자의 본체라고는 판단할 수 없었다. 다만, 엽초 기부에는 관근의 원기인 관근 시원체가 존재하는 것과, 양 품종간에 있어서 아미노산 레벨에서의 기능의 상위도 생각되었기 때문에, 후보 유전자의 가능성은 있었다.
다음으로, 제4 엑손의 1b 결실과 심근률의 관련성으로부터 이 유전자가 심근성에 관여하고 있지 않은지를 검토하였다. IR64와 Kinandang Patong을 포함하는 재배 품종 64 계통, IR64와 동일한 국제 벼 연구소(International Rice Research Institute, Los Banos, Philippines)에서 육성된 IR 품종 22 계통, 야생종 20 계통(Oryza nivara 7 계통, O. rufipogon 12 계통, O. meridionalis 1 계통)에 대해서 1b 결실이 있었던 주변 염기서열을 해석하여, 염기서열을 비교한 바, 제4 엑손의 1b 결실은 IR64에만 존재하는 것을 알 수 있었다. 이 때문에, 1b 결실과 심근률의 관계로부터 이 예측 유전자가 Dro1 유전자의 본체라고 판단하는 것은 불가능하였다.
Kinandang Patong을 포함하는 japonica14 품종의 Dro1의 complementary DNA (cDNA)영역 내의 염기서열을 모두 해석한 바, 전 품종의 염기서열은 동일하였다. 그러나, 바스켓법으로 심근률을 조사한 바, 심근률이 가장 높은 Kinandang Patong의 83.1%부터 가장 낮은 Tupa729의 15.9%까지 심근률에 폭넓은 변이가 보였다. 이 원인으로서, 그 밖에 심근성 관련 QTL이 존재하는 것이 생각되는 한편으로, 프로모터영역의 염기서열의 차이가 유전자의 발현 조절에 영향을 미치고 있는 것은 아닌지 생각하였다. 이에, Kinandang Patong과 닛폰바레의 상류 약 2.2 kb(5'측 상류의 후보영역의 끝까지)에 대해서 염기서열을 비교한 바, 2개소에서 변이가 보였다. 1개소는 5'측 비번역영역으로부터 1,250 bp 상류에서 닛폰바레의 염기서열 티민이 Kinandang Patong에서는 구아닌으로 치환되어 있었다. 이 주변 서열을 프로모터영역의 시스서열의 검색 사이트 PLACE(A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements, www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)에서 해석하면, 「GATA box」라 불리는 모티브의 티민이 구아닌으로 되어 있는 것을 알 수 있었다. 다른 한 개소는, 5'측 비번역영역 상류의 1,189~1,218 bp의 30 bp가 Kinandang Patong에서 결실이 있었다. 이러한 염기서열의 변이가 품종 내의 심근성 변이의 원인 중 하나일 가능성은 있다.
6.0 kbp의 영역에 예측된 유전자에 대해서 닛폰바레의 완전장 cDNA가 AK068870으로서 등록되어 있었기 때문에, 닛폰바레의 FOX hunting system(Full-length cDNA Over-eXpressing gene hunting system)에 포함되어 있지 않은지 검색하였다. 그 결과, T1 세대가 2 계통, T2 세대가 2 계통 존재하였다. 이에 이들 4 계통 각 5 개체의 심근률을 측정한 바, 대조인 닛폰바레(야생형)보다도 유의하게 심근률이 높은 개체가 수 개체 있는 것을 알 수 있었다. 이 결과로부터, 이 예측 유전자가 Dro1 유전자 본체일 가능성이 높아졌다. 이에, 이 예측 유전자가 확실히 Dro1 유전자의 본체인지 실증하기 위해, 본 발명자는, 이 예측 유전자(Kinandang Patong형의 Dro1 유전자)를 포함하는 벡터를 IR64의 캘러스에 도입하여, 형질전환체를 제작하기로 하였다. 닛폰바레와 같은 형질전환이 안이한 품종에 비하면 형질전환효율이 1/10 이하이기 때문에, 형질전환에는 10배 이상의 캘러스를 준비하고, 유전자 도입을 행하였다. 얻어진 형질전환 식물의 심근률을 조사한 바, 예측 유전자로 형질전환된 식물체는 높은 심근률을 갖는 것이 확인되었다.
이들 2개의 시험으로부터, 후보영역 6.0 kbp에 예측된 유전자가 Dro1 본체인 것을 발견하였다. 그 결과, 심근성 유전자인 Dro1 유전자의 단리, 동정에 처음으로 성공하였다.
또한 본 발명자는, Dro1에 의한 심근화가 내건성 향상에 관여하고 있는지를 IR64와 IR64를 유전적 배경으로 하고 Dro1 주변영역만을 Kinandang Patong형으로 치환한 준동질 유전자 계통(Dro1-NIL)을 사용해서 조사하였다. 그 결과, Dro1-NIL은 뿌리를 심근화함으로써 내건성을 나타내, IR64에 대해 유의하게 수량(收量)이 증가하는 것을 증명하였다.
본 발명은 이러한 지견(知見)을 토대로 하는 것으로, 이하의 〔1〕~〔28〕을 제공한다.
〔1〕이하 (a)~(e) 중 어느 하나에 기재된 DNA；
(a) 서열번호：1에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호：1, 2, 12, 14, 16 또는 17 중 어느 하나에 기재된 염기서열의 코드영역을 포함하는 DNA,
(c) 서열번호：3, 13 또는 15 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA,
(d) 서열번호：1, 2, 12, 14, 16 또는 17 중 어느 하나에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA로서, 식물에 심근성의 형질을 부여하는 활성을 갖는 DNA, 및
(e) 서열번호：3, 13 또는 15 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA로서, 식물에 심근성의 형질을 부여하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
〔2〕식물이 단자엽 식물인, 〔1〕에 기재된 DNA.
〔3〕단자엽 식물이 벼과 식물인,〔2〕에 기재된 DNA.
〔4〕벼과 식물이 벼, 맥류(소맥, 대맥, 호밀, 귀리, 율무), 옥수수, 기장, 조, 피, 수수, 핑거 밀렛, 펄 밀렛, 테프, 사탕수수, 티모시, 켄터키 블루그래스, 오차드그래스, 이탈리안 라이그래스, 퍼레니얼 라이그래스, 톨 훼스큐, 바이아그래스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 〔3〕에 기재된 DNA.
〔5〕벼과 식물이 벼, 수수 및 옥수수로 이루어진 군으로부터 선택되는, 〔3〕에 기재된 DNA.
〔6〕〔1〕내지〔5〕 중 어느 하나에 기재된 DNA를 포함하는 벡터.
〔7〕〔1〕내지〔5〕 중 어느 하나에 기재된 DNA를 발현 가능하게 보유하는 형질전환 세포.
〔8〕〔1〕내지〔5〕 중 어느 하나에 기재된 DNA로 형질전환된 식물체로서, 심근성의 형질을 갖는 형질전환 식물체.
〔9〕〔1〕내지〔5〕 중 어느 하나에 기재된 DNA 또는 〔6〕에 기재된 벡터를 식물세포에 도입함으로써 제조되는 형질전환 식물체로서, 심근성의 형질을 갖는 형질전환 식물체.
〔10〕이하 (a)~(d)의 공정에 의해 얻어지는 형질전환 식물체로서, 심근성의 형질을 갖는 형질전환 식물체；
(a)〔1〕내지〔5〕 중 어느 하나에 기재된 DNA 또는 〔6〕에 기재된 벡터를 식물세포에 도입하는 공정,
(b) 공정(a)의 식물세포에 있어서의 〔1〕내지〔5〕 중 어느 하나에 기재된 DNA의 카피 수를 측정하는 공정,
(c) 도입된 DNA 또는 벡터의 카피 수가 1인 형질전환 식물세포를 선택하는 공정, 및
(d) 공정(c)에서 선택된 형질전환 식물세포로부터 식물체를 재생시키는 공정.
〔11〕식물이 단자엽 식물인, 〔8〕~〔10〕 중 어느 하나에 기재된 식물체.
〔12〕단자엽 식물이 벼과 식물인, 〔11〕에 기재된 식물체.
〔13〕벼과 식물이 벼, 맥류(소맥, 대맥, 호밀, 귀리, 율무), 옥수수, 기장, 조, 피, 수수, 핑거 밀렛, 펄 밀렛, 테프, 사탕수수, 티모시, 켄터키 블루그래스, 오차드그래스, 이탈리안 라이그래스, 퍼레니얼 라이그래스, 톨 훼스큐, 바이아그래스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 〔12〕에 기재된 식물체.
〔14〕벼과 식물이 벼, 수수 및 옥수수로 이루어진 군으로부터 선택되는, 〔12〕에 기재된 식물체.
〔15〕〔8〕내지〔14〕 중 어느 하나에 기재된 형질전환 식물체의 자손 또는 클론인, 형질전환 식물체.
〔16〕〔8〕내지〔15〕 중 어느 하나에 기재된 형질전환 식물체로부터 단리된 세포.
〔17〕〔8〕내지〔15〕 중 어느 하나에 기재된 형질전환 식물체의 번식재료.
〔18〕〔8〕내지〔15〕 중 어느 하나에 기재된 형질전환 식물체로부터 단리된 기관.
〔19〕〔16〕에 기재된 세포, 〔17〕에 기재된 번식재료, 및 〔18〕에 기재된 기관 중 하나 이상으로부터 얻어지는 가공식품.
〔20〕〔8〕, 〔11〕내지〔13〕 중 어느 하나에 기재된 형질전환 식물체의 제조방법으로서, 〔1〕내지〔5〕 중 어느 하나에 기재된 DNA 또는 〔6〕에 기재된 벡터를 식물세포에 도입하고, 그 식물세포로부터 식물체를 재생시키는 공정을 포함하는 방법.
〔21〕〔1〕내지〔5〕 중 어느 하나에 기재된 DNA의 카피 수가 1인 형질전환 식물세포 또는 형질전환 식물체를 선택하는 공정을 추가로 포함하는, 〔20〕에 기재된 방법.
〔22〕이하 (a)~(c)의 공정을 포함하는 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 분자량 또는 염기서열이 일치할 때, 피검식물이 심근성의 형질을 갖는 것으로 판정하는 방법；
(a) 피검식물로부터 DNA 시료를 조제하는 공정,
(b) 그 DNA 시료로부터〔1〕내지〔5〕 중 어느 하나에 기재된 DNA를 포함하는 영역을 증폭하는 공정, 및
(c) 증폭된 DNA 단편의 분자량 또는 염기서열을, 〔1〕내지〔5〕 중 어느 하나에 기재된 DNA의 그것과 비교하는 공정.
〔23〕 피검식물로부터 조제한 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호：8에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：9에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 PCR(polymerase chain reaction)을 행하는 공정을 포함하는, 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 증폭산물이 얻어진 경우, 피검식물이 심근성의 형질을 갖는 것으로 판정되는 방법.
〔24〕피검식물로부터 조제한 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호：10에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：11에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 PCR을 행하는 공정을 포함하는, 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 증폭산물이 얻어진 경우, 피검식물이 심근성의 형질을 갖지 않는 것으로 판정되는 방법.
〔25〕이하의 (a) 및 (b)에 기재된 공정을 포함하는 심근성의 형질을 갖는 식물을 선발하는 방법；
(a) 심근성의 형질을 갖는 식물과 임의의 식물이 교배된 품종을 제작하는 공정, 및
(b)〔22〕~〔24〕 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해, 공정(a)에서 얻어진 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 공정.
〔26〕〔1〕내지〔5〕 중 어느 하나에 기재된 DNA에 의해 코드되는 단백질.
〔27〕〔26〕에 기재된 단백질에 결합하는 항체.
〔28〕〔1〕내지〔5〕 중 어느 하나에 기재된 DNA 또는 그의 상보서열에 상보적인 15 이상의 연속하는 염기를 포함하는 DNA.
〔29〕 서열번호：4~11 중 어느 하나에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA.
본 발명에 의해 벼 등의 식물의 심근성을 제어하는 Dro1 유전자 및 그 유전자로 형질전환된 식물체가 제공되었다. 본 발명의 유전자는, 천근성에서 심근성으로, 심근성에서 천근성으로 식물의 근계 형태를 조작하는 것에 이용 가능하다. 구체적으로는, 예를 들면 Dro1 유전자의 조작에 의해 천근형의 식물을 심근화함으로써, 건조 회피능의 향상에 의한 내건성 부여를 기대할 수 있다. 세계적으로는 가뭄에 의한 농작물의 감수(減收)가 심각하여, 해외의 대기업에서는 가뭄에 강한 작물의 개발에 주력하고 있다. 또한, Dro1 유전자의 조작에 의해 심근형의 식물을 천근화함으로써, 내습성의 부여를 기대할 수 있다. 일본에서는 농업정책의 전환으로부터 휴경밭에서의 밭작물의 재배가 추천?장려되고 있는데, 논은 배수성이 나쁘기 때문에, 내습성이 없는 대두나 옥수수는 습해가 문제가 되고 있다. 그 때문에, 내습성 향상을 위해, 작물의 천근화가 연구되고 있다. 이러한 국제 및 일본 국내적 정세를 감안하면, 식물의 뿌리 형태를 제어하는 유전자를 이용하여, 가뭄이나 습해에 강한 작물의 품종 개발의 의의는 매우 크다.
도 1은 개량형 바스켓법에 있어서의 각 계통의 심근성의 평가를 나타내는 사진이다. 스테인리스 바스켓에는 고리가 장착되어 있다. 이 고리의 위치는 지표면에 대해 50도보다 깊게 신장하는 뿌리를 심근으로 간주하도록 설치되어 있다. 범례 중의 괄호 안은, 전반의 기호는 계통명을, 후반은 세대를 나타낸다.
도 2는 IR64에 Dro1을 포함하는 벡터를 도입한 형질전환체와 벡터만을 도입한 형질전환체의 T0 세대에 있어서의 심근률의 분포를 나타내는 그래프이다.
도 3은 IR64에 Dro1을 포함하는 벡터를 도입한 형질전환체와 벡터만을 도입한 형질전환체의 T1 세대에 있어서의 심근률과 형질전환 벡터의 카피 수에 대응한 시그날 강도(실시간 PCR)의 관계를 나타내는 그래프이다. 싱글카피란, T0 세대에 있어서 Dro1이 1 카피만 도입된 계통, 멀티카피란 Dro1이 복수 개 도입된 계통을 나타낸다. 싱글카피의 계통에서는, T1 세대에 있어서 null형(0 카피), 헤테로형(1 카피), 호모형(2 카피)으로 분리하고, 그 카피 수에 대응하여 시그날 강도는 3군으로 분리한다. 다만, 서던 해석과 달리, 실시간 PCR에서는, 그 원리로부터 카피 수가 동일하더라도 시그날 강도는 반드시 개체간에서 동일해진다고는 할 수 없다. 그래프 중의 기호는 독립적인 클론의 계통 번호를 나타낸다.
도 4는 Fox 계통과 닛폰바레의 심근률의 분포를 나타내는 그래프이다.
도 5는 수수와 옥수수의 유연체(ortholog)의 해석결과를 나타내는 도면이다. Dro1：벼(Kinandang Patong), SbDro1L1：수수의 Dro1 유연체, ZmDro1L1： 옥수수의 Dro1 유연체.
도 6은 밭 포장에 있어서의 Dro1-NIL의 심근성을 IR64와 Kinandang Patong과 비교한 사진이다. 흰색부분의 숫자는 지표면으로부터의 토양심도를 나타낸다. 백색의 점선은, 각 계통의 대략의 근계의 분포역을 나타낸다.
도 7은 내건성 검정상(experimental field, 檢定床)에 있어서의 토양의 수분 포텐셜의 경시적 변화를 나타내는 그래프이다. Irregated는 관수구를, Drought는 건조 스트레스구를 나타낸다. 괄호 안은 수분 포텐셜을 측정한 토양심도를 나타낸다. 건조 스트레스구의 토양심도 25 ㎝에서는 파종 후 70일째경부터 급속하게 토양의 건조가 진행되고 있는 것을 알 수 있다.
도 8은 IR64와 Dro1-NIL간에 있어서의 건조 스트레스 조건하의 엽권(leaf rolling) 저항성의 차이를 경시적으로 나타낸 사진이다. 사진은, 식물체를 바로 위에서 촬영한 것이다. 도면 상부의 일수는, 건조 스트레스구에 있어서 관수를 정지한 후의 스트레스 처리 일수이다.
도 9는 IR64와 Dro1-NIL간에 있어서의 건조 스트레스 조건하의 엽면 온도, 기공 컨덕턴스, 광합성 속도의 차이를 나타내는 사진 및 그래프이다. A:관수 정지 후 35일째의 벼의 가시화상. 오른쪽부터 1열째와 2열째는 IR64, 3열째와 4열째는 Dro1-NIL. B:관수 정지 후 35일째의 벼의 온도분포 화상(A와 동일한 개체에 대해서 적외선 서모그래피를 사용하여 촬영한 화상). 오른쪽부터 1열째와 2열째는 IR64, 3열째와 4열째는 Dro1-NIL. 색의 차이는, 난색계에 가까운 색일수록 온도가 높고, 한색계에 가까운 색일수록 온도가 낮은 것을 나타낸다. 이 사진으로부터, IR64와 Dro1-NIL은 엽면 온도가 상이한(Dro1-NIL쪽이 IR64보다도 옆면 온도가 평균 0.7℃ 낮은) 것을 알 수 있다. Dro1-NIL쪽이 한색계의 색의 분포가 넓어, 엽면 온도 IR64보다 낮은 것을 알 수 있다. C:건조 스트레스구에 있어서 관수 정지 후의 Dro1-NIL의 엽면 온도의 변화를 나타낸다. 값은, IR64의 엽면 온도를 기준으로 하여, Dro1-NIL의 평균 엽면 온도에서 IR64의 평균 엽면 온도를 뺀 숫자이다. 모든 조사일에서 IR64에 대해 Dro1-NIL의 엽면 온도의 값이 낮은 것을 알 수 있다. D: 건조 스트레스구에 있어서 관수 정지 후의 IR64와 Dro1-NIL의 기공 컨덕턴스의 차이를 나타낸다. *는 Dro1-NIL이 IR64에 대해 5% 수준에서 유의하게 큰 것을 나타낸다. E: 건조 스트레스구에 있어서 관수 정지 후의 IR64와 Dro1-NIL의 광합성 속도의 차이를 나타낸다. *는 Dro1-NIL이 IR64에 대해 5% 수준에서 유의하게 큰 것을 나타낸다.
도 10은 건조 스트레스 조건하에서 재배한 IR64와 Dro1-NIL의 수량 조사의 결과를 나타내는 도면과 사진이다. A:건조 스트레스구로부터 수확한 IR64와 Dro1-NIL의 모든 형질의 차를 나타낸다. 세로막대는 표준편차를 나타낸다. *, **, ***는, Dro1-NIL이 IR64에 대해 각각 5%, 1%, 0.1% 수준에서 유의하게 큰 것을 나타낸다. B:건조 스트레스구에 있어서 수확한 IR64와 Dro1-NIL의 평균적인 이삭의 사진이다.
도 11은 건조 스트레스구의 내건성 검정상을 해체한 후, 측면에서 IR64와 Dro1-NIL간에 있어서의 근계 분포의 차이를 나타낸 사진이다. 각 계통의 위쪽 도면은, 검정상의 단면 전체를, 아래쪽 도면은 상층의 객토를 씻어, 자갈층에 뿌리가 관통하고 있는지 확대하여 관찰한 결과이다. Dro1-NIL에 있어서의 화살표 머리는 자갈층을 관통하고 있는 뿌리를 나타내고 있다. IR64에서는 자갈층을 관통하여 하층으로 신장한 뿌리가 전혀 보이지 않으나, Dro1-NIL에서는 많은 뿌리가 자갈층을 관통하여 하층에 도달해 있는 것을 알 수 있다.
도 12는 밭에 있어서의 토양의 수분 포텐셜의 경시적 변화를 나타내는 그래프이다.
도 13은 밭에 있어서의 무시비 및 시비구의 파종 후 120일째의 식물체의 모습을 나타낸 사진이다. 위쪽 도면은, 각 구의 전체도이다. 아래쪽 도면은 각 구를 위에서 확대 촬영한 도면이다. 무시비 및 시비구 모두 IR64에서는 엽권을 확인할 수 있으나, Dro1-NIL에서는 엽권은 일어나고 있지 않다.
도 14는 Dro1 유전자의 결실 유무를 판별하는 PCR 마커의 결과를 나타내는 사진이다. 각 어닐링 온도 모두, 왼쪽 레인이 IR64, 오른쪽 레인이 Kinandang Patong을 나타낸다.
본 발명은, 이하 (a)~(e) 중 어느 하나에 기재된 DNA를 제공한다.
(a) 서열번호：1에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호：1, 2, 12, 14, 16 또는 17 중 어느 하나에 기재된 염기서열의 코드영역을 포함하는 DNA,
(c) 서열번호：3, 13 또는 15 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA,
(d) 서열번호：1, 2, 12, 14, 16 또는 17 중 어느 하나에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA로서, 식물에 도입된 경우에 당해 식물에 심근성의 형질을 부여하는 활성을 갖는 DNA, 및
(e) 서열번호：3, 13 또는 15 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA로서, 식물에 심근성의 형질을 부여하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
이하 본 명세서에 있어서, 이들 DNA를 「본 발명의 DNA」 또는 「Dro1 유전자」라 칭하는 경우가 있다. 또한 본 발명의 DNA에 의해 코드되는 단백질을 「본 발명의 단백질」 또는 「Dro1 단백질」이라 칭하는 경우가 있다.
본 발명에 있어서「포함한다」는 「포함한다」 및 「~로 된다」 양쪽을 의미한다.
또한 상기 (e)의 DNA는 다음과 같이 표현하는 것도 가능하다.
(e) 서열번호：3, 13 또는 15 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산으로 치환, 결실, 부가, 삽입 중 하나 이상으로부터 선택되는 변이를 갖는 단백질을 코드하는 DNA로서, 식물에 심근성의 형질을 부여하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
또한 본 발명의 DNA는 「단리된 DNA」로 표현하는 것도 가능하다.
벼 품종 Kinandang Patong의 Dro1 유전자의 게놈 DNA의 염기서열을 서열번호：1에, cDNA의 염기서열을 서열번호：2에, 이들 염기서열의 코드영역에 의해 코드되는 단백질(Dro1 단백질)의 아미노산 서열을 서열번호：3에 나타낸다.
서열번호：1에 기재된 염기서열에 있어서의 단백질의 코드영역은, 264번째의 염기부터 2685번째의 염기이다.
또한 서열번호：2에 기재된 염기서열에 있어서의 단백질의 코드영역은, 264번째의 염기부터 1019번째의 염기이다.
또한 Kinandang Patong의 Dro1 유전자 및 프로모터영역을 포함하는 그 상류의 염기서열을 서열번호：17에 나타낸다. 닛폰바레에 있어서의 대응하는 영역의 서열(서열번호：18)과 비교하여, Kinandang Patong(서열번호：17)에서는, Dro1 유전자의 상류 약 1.2 kb에 1염기의 염기 치환과 30염기의 결실이 존재한다. 구체적으로는, 닛폰바레에 있어서의 「GATA」 모티브의 「T」(서열번호：18에 기재된 염기서열에 있어서 6번째의 염기)가, Kinandang Patong에서는 「G」로 되어 있다(서열번호：17에 기재된 염기서열에 있어서 6번째의 염기). 또한 서열번호：18의 7~36번째에 있어서의 30염기가, Kinandang Patong의 대응하는 영역에서는 결손되어 있다.
수수 유래의 Dro1 유전자의 CDS(coding sequence)의 염기서열을 서열번호：12에, 이들 염기서열의 코드영역에 의해 코드되는 단백질의 아미노산 서열을 서열번호：13에 나타낸다.
서열번호：12(CDS 서열)에 기재된 염기서열에 있어서의 단백질의 코드영역은, 1번째의 염기부터 789번째의 염기이다.
옥수수 유래의 Dro1 유전자의 CDS의 염기서열을 서열번호：14에, 이들 염기서열의 코드영역에 의해 코드되는 단백질의 아미노산 서열을 서열번호：15에 나타낸다.
서열번호：14(CDS 서열)에 기재된 염기서열에 있어서의 단백질의 코드영역은, 1번째의 염기부터 768번째의 염기이다.
본 발명의 Dro1 유전자는, 식물에 심근성의 형질을 부여하는 활성을 갖는다. 본 발명에 있어서「심근성의 형질」이란, 식물체의 지하부 기관인 뿌리가 지표면에 대해 깊은 각도로 땅 속으로 신장하는 성질을 의미한다. 본 발명에 있어서「깊은 각도」란, 뿌리의 지표면에 대한 각도가 적어도 50도, 바람직하게는 60도, 보다 바람직하게는 70도, 더욱 바람직하게는 80도 이상인 것을 의미한다.
DNA가 식물에 심근성의 형질을 부여하는 활성을 갖는지 여부는, Dro1 유전자로 형질전환된 식물체를 조제하고, 그 식물체의 지표면에 대한 각도를 측정함으로써 확인할 수 있다. 식물체의 지표면에 대한 각도의 측정은, 예를 들면 실시예에 기재된 바스켓법, 개량형 바스켓법 외에, 참호법이나 모노리스법, 코어 샘플링법에 의해 판정할 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 Dro1 단백질을 코드하는 DNA에는, 게놈 DNA, cDNA, 및 화학 합성 DNA가 포함된다. 게놈 DNA 및 cDNA의 조제는, 당업자에게 있어 상투수단을 이용하여 행하는 것이 가능하다. 게놈 DNA는, 예를 들면, 심근성의 형질을 갖는 벼 품종(예를 들면, Kinandang Patong), 수수 또는 옥수수로부터 게놈 DNA를 추출하고, 게노믹 라이브러리(벡터로서는, 플라스미드, 파지, 코스미드, BAC, P1 artificial chromosome(PAC) 등을 이용할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다)를 제작하고, 이것을 전개하여, Dro1 단백질을 코드하는 DNA(예를 들면, 서열번호：1, 2, 12, 14, 16 또는 17에 기재된 염기서열을 갖는 DNA)를 토대로 조제한 프로브를 사용하여 콜로니 하이브리다이제이션 또는 플라크 하이브리다이제이션을 행함으로써 조제하는 것이 가능하다. 또한, Dro1 단백질을 코드하는 DNA(예를 들면, 서열번호：1, 2, 12, 14, 16 또는 17에 기재된 염기서열을 갖는 DNA)에 특이적인 프라이머를 제작하고, 이를 이용한 PCR을 행함으로써 조제하는 것도 가능하다. 또한, cDNA는, 예를 들면, 심근성의 형질을 갖는 벼 품종(예를 들면, Kinandang Patong)으로부터 추출한 mRNA를 토대로 cDNA를 합성하고, 이를 λZAP 등의 벡터에 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 이를 전개하여, 상기와 동일하게 콜로니 하이브리다이제이션 또는 플라크 하이브리다이제이션을 행함으로써, 또한, PCR을 행함으로써 조제하는 것이 가능하다.
또한 화학 합성 DNA는, 예를 들면 시판의 올리고뉴클레오티드 합성기에 의해 제작할 수 있다.
또한 본 발명의 Dro1 단백질을 코드하는 DNA는, 심근성의 형질을 갖는 수수(예를 들면, 엽신, 엽초), 옥수수(예를 들면 엽신, 엽초)로부터 게놈 DNA, mRNA를 추출함으로써 조제하는 것도 가능하다.
본 발명은, 서열번호：3, 13 또는 15 중 어느 하나에 기재된 Dro1 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 DNA를 포함한다. 여기서, 「Dro1 단백질과 동등한 기능을 갖는다」는 것은, 대상이 되는 단백질이 식물에 심근성의 형질을 부여시키는 기능을 갖는 것을 가리킨다. 이러한 DNA는, 바람직하게는 단자엽 식물 유래이고, 보다 바람직하게는 벼과, 백합과, 파인애플과, 야자과, 토란과, 생강과, 난과 식물 유래이며, 더욱 바람직하게는 벼, 맥류(소맥, 대맥, 호밀, 귀리, 율무), 옥수수, 기장, 조, 피, 수수, 핑거 밀렛, 펄 밀렛, 테프, 사탕수수, 티모시, 켄터키 블루그래스, 오차드그래스, 이탈리안 라이그래스, 퍼레니얼 라이그래스, 톨 훼스큐, 바이아그래스 유래이고, 특히 바람직하게는 벼, 수수 및 옥수수이다.
이러한 DNA에는, 예를 들면, 서열번호：3, 13 또는 15 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수(예를 들면 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개)의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 되고, 식물에 심근성의 형질을 부여시키는 기능을 갖는 단백질을 코드하는 변이체, 유도체, 대립유전자(allele), 배어리언트(variant) 및 호몰로그(homolog)가 포함된다.
아미노산 서열이 개변된 단백질을 코드하는 DNA를 조제하기 위한 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는, 예를 들면, site-directed mutagenesis법(Kramer, W. and Fritz,H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154: 350-367)을 들 수 있다. 또한, 염기서열의 변이에 의해 코드하는 단백질의 아미노산 서열이 변이되는 것은, 자연계에 있어서도 발생할 수 있다. 이와 같이 천연형의 Dro1 단백질을 코드하는 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 DNA이더라도, 천연형의 Dro1 단백질(서열번호：3, 13 또는 15 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열)과 동등한 기능을 갖는 단백질을 코드하는 한, 본 발명의 DNA에 포함된다. 이러한 DNA의 예로서, 예를 들면 서열번호：16에 기재된 염기서열을 갖는 DNA를 들 수 있다. 서열번호：16에 기재된 염기서열을 갖는 DNA는, 서열번호：2에 기재된 염기서열을 갖는 DNA에 있어서, 5'말단과 3'말단서열이 각각 1 bp 부가된 염기서열을 갖는다. 또한 5'말단측으로부터 373 bp째(서열번호：2에 있어서의 5'말단측으로부터 372 bp째)의 A가 G로 치환되어 있다. 이 염기 치환에 의해, 서열번호：16에 기재된 염기서열을 갖는 DNA에 의해 코드되는 아미노산 서열은, 서열번호：3에 기재된 아미노산 서열에 있어서 37번째의 리신이 글루타민산으로 비동의(非同義) 치환되어 있다. 본 발명은 이러한, 서열번호：3에 기재된 아미노산 서열에 있어서 37번째의 리신이 글루타민산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 제공한다. 또한 그 단백질을 코드하는 DNA(예를 들면 서열번호：16에 기재된 염기서열을 갖는 DNA)도 제공한다.
또한, 설령, 염기서열이 변이된 경우이더라도, 그것이 단백질 중의 아미노산의 변이를 수반하지 않는 경우(축중 변이)도 있어, 이러한 축중 변이체도 본 발명의 DNA에 포함된다.
서열번호：3, 13 또는 15 중 어느 하나에 기재된 Dro1 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 DNA를 조제하기 위해, 당업자에게 잘 알려진 다른 방법으로서는, 하이브리다이제이션 기술(Southern, E.M. (1975) Journal of Molecular Biology, 98, 503)이나 PCR 기술(Saiki, R. K. et al. (1985) Science, 230, 1350-1354, Saiki, R. K. et al. (1988) Science, 239, 487-491)을 이용하는 방법을 들 수 있다. 즉, 당업자에게 있어서는, Dro1 유전자의 염기서열(서열번호：1, 2, 12, 14, 16 또는 17 중 어느 하나에 기재된 염기서열) 또는 그의 일부를 프로브로 하고, 또한 Dro1 유전자(서열번호：1, 2, 12, 14, 16 또는 17 중 어느 하나에 기재된 염기서열)에 특이적으로 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여, 벼나 다른 식물로부터 Dro1 유전자와 높은 상동성을 갖는 DNA를 단리하는 것은 통상 행할 수 있는 것이다. 이와 같이 하이브리다이즈 기술이나 PCR 기술에 의해 단리 가능한 Dro1 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 코드하는 DNA도 또한 본 발명의 DNA에 포함된다.
이러한 DNA를 단리하기 위해서는, 바람직하게는 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이제이션 반응을 행한다. 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은, 당업자라면, 적절히 선택할 수 있다. 일례를 나타내자면, 25% 포름아미드, 보다 엄격한 조건에서는 50% 포름아미드, 4×SSC, 50 mM Hepes pH 7.0, 10×덴하르트용액, 20 ㎍/㎖ 변성 연어 정자 DNA를 포함하는 하이브리다이제이션용액 중, 42℃에서 하룻밤 예비 하이브리다이제이션을 행한 후, 표지한 프로브를 첨가하고, 42℃에서 하룻밤 보온함으로써 하이브리다이제이션을 행한다. 그 후의 세정에 있어서의 세정액 및 온도 조건은, 예를 들면 「2×SSC, 0.1% SDS, 50℃」, 「2×SSC, 0.1% SDS, 42℃」, 「1×SSC, 0.1% SDS, 37℃」 정도이고, 보다 엄격한 조건으로서는 「2×SSC, 0.1% SDS, 65℃」, 「0.5×SSC, 0.1% SDS, 42℃」 정도이며, 더욱 엄격한 조건으로서는 「0.2×SSC, 0.1% SDS, 65℃」 정도에서 실시할 수 있다. 이와 같이 하이브리다이제이션의 조건이 엄격해질수록 프로브 서열과 높은 상동성을 갖는 DNA의 단리를 기대할 수 있다. 단, 상기 SSC, SDS 및 온도 조건의 조합은 예시이며, 당업자라면, 하이브리다이제이션의 스트린젠시를 결정하는 상기 또는 다른 요소(예를 들면, 프로브 농도, 프로브의 길이, 하이브리다이제이션 반응시간 등)를 적절히 조합함으로써, 상기와 동일한 스트린젠시를 실현하는 것이 가능하다.
이것에 의해 단리된 DNA는, 아미노산 레벨에 있어서, Dro1 단백질의 아미노산 서열(서열번호：3, 13 또는 15)과 높은 상동성을 갖는 것으로 생각된다. 또한 염기서열 레벨에 있어서, Dro1 단백질을 코드하는 DNA의 염기서열(서열번호：1, 2, 12, 14, 16 또는 17)과 높은 상동성을 갖는 것으로 생각된다. 높은 상동성이란, 아미노산 서열 전체 또는 염기서열 전체에서, 적어도 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상(예를 들면, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 서열의 동일성을 가리킨다. 아미노산 서열이나 염기서열의 동일성은, 카린 및 알츄얼에 의한 알고리즘 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990, Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993)을 사용하여 결정할 수 있다. BLAST의 알고리즘에 기초한 BLASTN이나 BLASTX로 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990). BLASTN을 사용하여 염기서열을 해석하는 경우는, 파라미터는, 예를 들면 score＝100, wordlength＝12로 한다. 또한, BLASTX를 사용하여 아미노산 서열을 해석하는 경우는, 파라미터는, 예를 들면 score＝50, wordlength＝3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다. 이들 해석방법의 구체적은 수법은 공지이다.
본 발명의 DNA는, 예를 들면, 재조합 단백질의 조제나 심근성의 형질을 갖는 형질전환 식물체의 작출 등에 이용하는 것이 가능하다.
재조합 단백질을 조제하는 경우에는, 통상, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA를 적당한 발현 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 적당한 세포에 도입하여, 형질전환 세포를 배양하고 발현시킨 단백질을 정제한다. 재조합 단백질은, 정제를 용이하게 하는 등의 목적으로, 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현시키는 것도 가능하다. 예를 들면, 대장균을 숙주로서 말토오스 결합 단백질과의 융합 단백질로서 조제하는 방법(미국 New England BioLabs사 발매의 벡터 pMAL 시리즈), 글루타티온-S-트랜스페라아제(GST)와의 융합 단백질로서 조제하는 방법(Amersham Pharmacia Biotech사 발매의 벡터 pGEX 시리즈), 히스티딘 태그를 부가하여 조제하는 방법(Novagen사의 pET 시리즈) 등을 이용하는 것이 가능하다. 숙주세포로서는, 재조합 단백질의 발현에 적합한 세포라면 특별히 제한은 없고, 상기 대장균 외에, 예를 들면, 효모, 각종의 동식물세포, 곤충세포 등을 사용하는 것이 가능하다. 숙주세포로의 벡터의 도입에는, 당업자에게 공지의 각종의 방법을 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 대장균으로의 도입에는, 칼슘 이온을 이용한 도입방법(Mandel, M. & Higa, A. (1970) Journal of Molecular Biology, 53, 158-162, Hanahan, D. (1983) Journal of Molecular Biology, 166, 557-580)을 사용할 수 있다. 숙주세포 내에서 발현시킨 재조합 단백질은, 그 숙주세포 또는 그의 배양상청으로부터, 당업자에게 공지의 방법에 의해 정제하고, 회수하는 것이 가능하다. 재조합 단백질을 상기 말토오스 결합 단백질 등과의 융합 단백질로서 발현시킨 경우에는, 용이하게 친화성 정제를 행하는 것이 가능하다. 또한, 후술하는 수법으로, 본 발명의 DNA가 도입된 형질전환 식물체를 제작하여, 그 식물체로부터 본 발명의 단백질을 조제하는 것도 가능하다. 따라서 본 발명의 형질전환 식물체에는, 후술하는, 식물에 심근성의 형질을 부여하기 위해 본 발명의 DNA가 도입된 식물체뿐 아니라, 본 발명의 단백질의 조제를 위해 본 발명의 DNA가 도입된 식물체도 포함된다.
얻어진 재조합 단백질을 사용하면, 이것에 결합하는 항체를 조제할 수 있다. 예를 들면, 다중클론항체는, 정제한 본 발명의 단백질 또는 그의 일부의 펩티드를 토끼 등의 면역동물에 면역하고, 일정 기간 후에 혈액을 채취하여, 응고된 피를 제거함으로써 조제하는 것이 가능하다. 또한, 단일클론항체는, 상기 단백질 또는 펩티드로 면역한 동물의 항체생산세포와 골종양세포를 융합시켜, 목적으로 하는 항체를 생산하는 단일클론의 세포(하이브리도마)를 단리하고, 그 세포로부터 항체를 얻음으로써 조제할 수 있다. 이것에 의해 얻어진 항체는, 본 발명의 단백질의 정제나 검출 등에 이용하는 것이 가능하다. 본 발명에는, 본 발명의 단백질에 결합하는 항체가 포함된다. 이들 항체를 사용함으로써, 식물체에 있어서의 Dro1 단백질의 발현부위의 판별, 또는 식물종이 Dro1 단백질을 발현하는지 여부의 판별을 행할 수 있다. 예를 들면, Kinandang Patong형 Dro1 단백질의 227번째부터 251번째의 아미노산 서열은, 심근성의 형질을 갖는 품종에 특징적인 서열이다. 따라서 이 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 특이적으로 인식하는 항체는, 식물종이 Kinandang Patong형 Dro1 단백질을 발현하는지 여부(심근성의 형질을 갖는지 여부)를 판별할 때 사용할 수 있다.
또한 본 발명은, Dro1 유전자를 포함하는 벡터 및 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명의 벡터로서는, 예를 들면, 대장균을 숙주로 하는 경우에는, 벡터를 대장균(예를 들면, JM109, DH5α, HB101, XL1Blue) 등에서 대량으로 증폭시켜 대량 조제하기 위해, 대장균에서 증폭되기 위한 「ori」를 가지며, 또한 형질전환된 대장균의 선발 유전자(예를 들면, 약제(암피실린이나 테트라사이클린, 카나마이신, 클로람페니콜 등)에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자)를 갖는 벡터를 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다. 이러한 벡터의 예로서는, M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한, cDNA의 서브클로닝, 잘라내기를 목적으로 한 경우, 상기 벡터 외에, 예를 들면, pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 들 수 있다. Dro1 단백질을 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히, 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는, 예를 들면, 대장균에서의 발현을 목적으로 한 경우는, 벡터가 대장균에서 증폭되는 상기 특징을 갖는 것 외에, 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서는, 대장균에서 효율적으로 발현 가능한 프로모터, 예를 들면, lacZ 프로모터(Ward등, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터(Better등, Science (1988) 240, 1041-1043), 또는 T7 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하다. 이러한 벡터로서는, 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1(파마시아사 제조), 「QIAexpress system」(퀴아겐사 제조), pEGFP, 또는 pET 등을 들 수 있다.
또한, 벡터에는, 폴리펩티드 분비를 위한 시그날 서열이 포함되어 있어도 된다. 폴리펩티드 분비를 위한 시그날 서열로서는, 대장균의 페리플라즘으로 생산시키는 경우, pelB 시그날 서열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)을 사용하면 된다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들면 염화칼슘법, 전기천공법을 사용해서 행할 수 있다. 또한 식물체 내에서 발현하는 벡터로서 pMH1, pMH2, pCAMBIA 등의 벡터를 들 수 있다.
대장균 이외에도, 예를 들면, Dro1 단백질을 제조하기 위한 벡터로서는, 포유동물 유래의 발현 벡터(예를 들면, pcDNA3(인비트로겐사 제조)나, pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322), pEF, pCDM8), 곤충세포 유래의 발현 벡터(예를 들면 「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(기브코 BRL사 제조), pBacPAK8), 식물 유래의 발현 벡터(예를 들면 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면, pZIPneo), 효모 유래의 발현 벡터(예를 들면, 「Pichia Expression Kit」(인비트로겐사 제조), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현 벡터(예를 들면, pPL608, pKTH50) 등을 들 수 있다.
CHO 세포, COS 세포, NIH3T3 세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포 내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터(Mulligan등, Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터(Mizushima등, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하여, 세포로의 형질전환을 선발하기 위한 유전자(예를 들면, 약제(네오마이신, G418 등)에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자)를 가지면 더욱 바람직하다. 이러한 특성을 갖는 벡터로서는, 예를 들면, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다.
본 발명의 형질전환 세포는, 예를 들면, 본 발명의 단백질의 제조나 발현을 위한 생산계로서 사용할 수 있다. 단백질의 제조를 위한 생산계는, 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo)의 생산계가 있다.
진핵세포를 사용하는 경우, 예를 들면, 동물세포, 식물세포, 진균세포를 숙주에 사용할 수 있다. 동물세포로서는, 포유류세포(예를 들면, 전술한 CHO 세포, COS세포, NIH3T3 세포에 더하여, 3T3, 골수종 세포, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero 등의 세포), 양서류 세포(예를 들면 아프리카발톱개구리 난모세포(Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340)), 또는 곤충세포(예를 들면, sf9, sf21, Tn5 등의 세포)가 알려져 있다. CHO 세포로서는, 특히, DHFR 유전자를 결손한 CHO 세포인 dhfr-CHO(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)나 CHO K-1(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275)을 매우 적합하게 사용할 수 있다. 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO 세포가 바람직하다.
식물세포로서는, 후술하는 식물 유래의 세포 외에, 예를 들면, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 단백질 생산계로서 알려져 있어, 이를 캘러스 배양하면 된다.
또한 진균세포로서는, 효모, 예를 들면, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예를 들면, 아스페르길루스(Aspergillus)속, 예를 들면, 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger)가 알려져 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명은, 본 발명의 DNA나 벡터가 도입된 이들 세포를 제공한다.
또한 본 발명은, Dro1 유전자로 형질전환된 식물체로서, 심근성의 형질을 갖는 형질전환 식물체에 관한 것이다.
식물체가 심근성의 형질을 갖는지 여부는, 대조와 비교함으로써 판단하는 것도 가능하다. 본 발명에 있어서는, 대조와 비교하여, 형질전환 식물체의 뿌리가 약간이라도 지표면에 대해 보다 깊은 각도로 땅 속으로 신장하는 한, 「심근성의 형질을 갖는」의 의미에 포함된다. 형질전환 식물체의 뿌리가 지표면에 대해 보다 깊은 각도로 땅 속으로 신장하고 있는지 여부의 판정은 전술한 방법에 의해 행할 수 있다.
본 발명에 있어서 대조란, 본 발명의 형질전환 식물체와 동일한 종의 식물체로서, 본 발명의 DNA를 갖지 않거나, 또는 본 발명의 DNA가 인위적으로 도입되어 있지 않은 물체를 의미한다. 본 발명에 있어서의 대조는, 형질전환 식물체와 동일한 종의 식물체로서 본 발명의 DNA를 갖지 않거나, 또는 본 발명의 DNA가 인위적으로 도입된 것이 아닌 한 조금도 한정되지 않는다. 따라서 본 발명의 대조에는, 본 발명의 DNA 이외의 DNA가 인위적으로 도입된 식물체도 포함된다. 이러한 식물체의 예로서는, 예를 들면, 본 발명의 형질전환 식물체와 동일한 종의 식물체로서, 본 발명의 DNA 이외의 DNA로 형질전환된 식물체, 본 발명의 DNA의 기능 결실 변이 도입의 DNA로 형질전환된 식물체, 본 발명의 DNA의 기능 억제형으로 변환된 DNA로 형질전환된 식물체, 본 발명의 DNA의 기능 발현에 불충분한 영역의 DNA 단편으로 형질전환된 식물체 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
본 발명의 DNA로 형질전환된 식물체는, 심근성의 형질을 갖는 한 조금도 제한되지 않고, 식물의 다른 부위가 개변되어 있어도 된다. 다른 부위의 개변으로서는, 예를 들면, 이삭의 형태 변화 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 DNA를 이용하여 형질전환 식물체를 제작하기 위해서는, 그 DNA 또는 그 DNA가 삽입된 벡터를 식물세포에 도입하고, 이것에 의해 얻어진 형질전환 식물세포로부터 식물체를 재생시키면 된다.
본 발명에 있어서의 벡터로서는, 식물세포 내에서 삽입 유전자를 발현시키는 것이 가능한 것이 바람직하고, 전술한 벡터(예를 들면 pMH1, pMH2, pCAMBIA 벡터 등의 벡터)를 들 수 있으나, 특별히 제한은 없다. 본 발명의 벡터는, 예를 들면, 식물세포 내에서의 항상적인 유전자 발현을 행하기 위한 프로모터(예를 들면, 칼리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 등)를 가지고 있어도 된다. 이러한 프로모터를 사용하는 경우, 프로모터의 하류에, 본 발명의 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 설계한다. 그리고 설계된 DNA를 포함하는 벡터를 식물세포에 도입한다. 이것에 의해 얻어진 형질전환 식물세포를 재생시킴으로써, 본 발명의 DNA가 발현된 형질전환 식물체를 얻을 수 있다. 본 발명은 이와 같이, 프로모터의 하류에, 본 발명의 DNA가 기능적으로 결합한 DNA도 제공한다. 여기서 「기능적으로 결합」이란, 프로모터 서열에 전사인자가 결합함으로써, 본 발명의 DNA의 발현이 유도되도록, 프로모터 서열과 그 DNA가 결합하고 있는 것을 말한다.
또한, 이들 이외에도, 외적인 자극에 의해 유도적으로 활성화되는 프로모터를 갖는 벡터를 사용하는 것도 가능하다.
상기 DNA나 벡터를 도입하는 식물세포의 종류로서는, 예를 들면 단자엽 식물을 들 수 있다. 단자엽 식물로서는, 벼과, 백합과, 파인애플과, 야자과, 토란과, 생강과, 란과 등의 식물을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 또한 벼과의 식물로서는, 벼나 맥류(소맥, 대맥, 호밀, 귀리, 율무), 옥수수, 기장, 조, 피, 수수, 핑거 밀렛, 펄 밀렛, 테프, 사탕수수, 티모시, 켄터키 블루그래스, 오차드그래스, 이탈리안 라이그래스, 퍼레니얼 라이그래스, 톨 훼스큐, 바이아그래스 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
상기 DNA나 벡터가 도입되는 식물세포의 형태는, 식물체를 재생할 수 있는 것이라면, 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 현탁 배양세포, 프로토블라스트, 잎의 절편, 캘러스, 발아 종자 등이 포함된다.
상기 DNA나 벡터의 식물세포로의 도입은, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜법, 전기천공법(일렉트로포레이션), 아그로박테리움을 매개로 하는 방법, 파티클 건법 등의 당업자에게 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 아그로박테리움을 매개로 하는 방법에 있어서는, 예를 들면 Nagel등의 방법(Nagel, R. et al. FEMS Microbiol Lett. 67, 1990, 325-328.)에 따라서, 상기 DNA가 삽입된 발현 벡터를 아그로박테리움에 도입하고, 이 아그로박테리움을 직접 감엽법이나 리프 디스크법으로 식물세포에 감염시킴으로써, 상기 DNA를 식물세포에 도입할 수 있다. 상기 벡터는, 예를 들면 식물체에 도입한 후, 본 발명의 DNA가 식물체 중에서 발현하도록, 발현 프로모터를 포함한다. 일반적으로, 그 프로모터의 하류에는 본 발명의 DNA가 위치하고, 또한 그 DNA의 하류에는 터미네이터가 위치한다. 이 목적에 사용되는 재조합 벡터는, 식물으로의 도입방법, 또는 식물의 종류에 따라, 당업자에 의해 적절히 선택된다.
상기 프로모터로서, 예를 들면 칼리플라워 모자이크 바이러스 유래의 CaMV35S, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터(일본국 특허공개 평2-79983호 공보) 등을 들 수 있다.
또한, 상기 터미네이터는, 칼리플라워 모자이크 바이러스 유래의 터미네이터, 또는 노팔린 합성효소 유전자 유래의 터미네이터 등을 예시할 수 있으나, 식물체 중에서 기능하는 프로모터나 터미네이터라면, 이들에 한정되지 않는다.
식물세포로부터의 식물체의 재생은, 식물의 종류에 따라 당업자에게 공지의 방법으로 행하는 것이 가능하다. 예를 들면 이하의 방법을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
벼의 경우는 Fujimura등(Fujimura. et al. Tissue Culture Lett. 2, 1995, 74.)의 방법
소맥이라면 Harris등(Harris, R. et al. Plant Cell Reports. 7, 1988, 337-340)의 방법이나 Ozgen등(Ozgen, M. et al. Plant Cell Reports. 18, 1998, 331-335)의 방법
대맥이라면 Kihara와 Funatsuki(Kihara, M. and Funatsuki, H. Breeding Sci. 44, 1994, 157-160.)의 방법이나 Lurs와 Lorz(Lurs, R. and Lorz, H. Theor. Appl. Genet. 75, 1987, 16-25.)의 방법
옥수수라면 Shillito등(Shillito, R.D., et al. Bio/Technology, 7, 1989, 581-587.)의 방법이나 Gordon-Kamm등(Gordon-Kamm, W.J. et al. Plant Cell. 2(7), 1990, 603-618.)의 방법
수수라면 Wen등(Wen, F.S., et al. Euphytica. 52, 1991, 177-181.)의 방법이나 Hagio(Hagio, T. Breeding Sci. 44, 1994, 121-126.)의 방법
호밀이라면 Castillo등(Castillo A. M., Vasil V., Vasil I. K. (1994) Nature Biotechnology 12: 1366-1371.)의 방법
귀리라면 Cho등(Cho M. J., WEN J., LEMAUX P. G., (1999) Plant science 148: 9-17.)의 방법
펄 밀렛이라면 O'Kennedy등(O'Kennedy M. M., Burger J. T., Botha F. C. (2004) Plant Cell Reports 22: 684-690.)의 방법
켄터키 블루그래스라면 Ha등(Ha C. D., Lemaux P. G., Cho M. J. (2001) In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 37: 6-11.)의 방법
오차드그래스라면 CHO등(CHO M.J., CHOI H. W., LEMAUX P. G. (2001) Plant cell reports 20: 318-324.)의 방법
이탈리안 라이그래스라면 Ye등(Ye X., Wang Z. Y., Wu X., Potrykus I., Spangenberg G. (1997) Plant Cell Reports 16: 379-384.)의 방법
퍼레니얼 라이그래스라면 Spangenberg등(Spangenberg G., Wang Z. Y., Wu X., Nagel J., Potrykus I. (1995) Plant science 108: 209-217.)의 방법
톨 훼스큐라면 Wang등(Wang Z. Y., Takamizo T., Iglesias V. A., Osusky M., Nagel J., Potrykus I., Spangenberg G. (1992) Nature Biotechnology 10: 691-696.)의 방법
바이아그래스라면 Smith등(Smith R. L., Grando M. F., Li Y. Y., Seib J. C., Shatters R. G. (2002) Plant Cell Reports 20: 1017-1021.)의 방법
또한, 본 발명의 DNA를 도입하는 식물은, 외식편(外植片)이어도 되고, 이들 식물로부터 배양세포를 조제하여, 얻어진 배양세포에 도입해도 된다. 본 발명의 「식물세포」는, 예를 들면 잎, 뿌리, 줄기, 꽃 및 종자 중의 배반(胚盤), 미숙 배 등의 식물의 세포, 캘러스, 현탁 배양세포, 발아 종자 등을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 DNA의 도입에 의해 형질전환한 세포를 효율적으로 선택하기 위해, 재조합 벡터는, 적당한 선발 마커 유전자, 또는 선발 마커 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터와 함께 식물세포로 도입하는 것이 바람직하다. 이 목적으로 사용하는 선발 마커 유전자는, 예를 들면, 항생물질 하이그로마이신에 내성인 하이그로마이신 포스포트랜스페라아제 유전자, 카나마이신 또는 겐타마이신에 내성인 네오마이신 포스포트랜스페라아제 유전자, 및 제초제 포스피노트리신에 내성인 아세틸트랜스페라아제 유전자 등을 들 수 있다.
재조합 벡터를 도입한 세포는, 도입된 선발 마커 유전자의 종류에 따라 적당한 선발용 약제를 포함하는 공지의 선발용 배지로 치상(置床)하여 배양한다. 이것에 의해 형질전환된 식물 배양세포를 얻을 수 있다.
형질전환 세포로부터 재생시킨 식물체는, 이어서 순화용(順化用) 배지에서 배양한다. 그 후, 순화된 재생 식물체를, 통상의 재배조건에서 재배하면, 심근성의 형질을 갖는 식물체가 얻어지고, 성숙해서 결실하여 종자를 얻을 수 있다. 즉 본 발명은, 하기 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다. 또한 본 발명은, 하기 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 식물체에 심근성의 형질을 부여하는 방법을 제공한다.
(a) 본 발명의 DNA(Dro1 유전자) 또는 그 DNA(Dro1 유전자)를 포함하는 벡터를 식물세포에 도입하는 공정, 및
(b) 공정(a)에 있어서 DNA 또는 벡터가 도입된 식물세포로부터 식물체를 재생하는 공정.
상기 형질전환체의 제조방법은,
(c) 심근성의 형질을 부여하는 식물체를 선택하는 공정,
을 추가로 포함해도 된다.
이와 같이 재생되고, 또한 재배한 형질전환 식물체 중의 도입된 외래 DNA의 존재는, 공지의 PCR법이나 서던 하이브리다이제이션법에 의해, 또는 식물체 중의 DNA의 염기서열을 해석함으로써 확인할 수 있다. 이 경우, 형질전환 식물체로부터의 DNA의 추출은, 공지의 J.Sambrook등의 방법(Molecular Cloning, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 준하여 실시할 수 있다. 재생시킨 식물체 중에 존재하는 본 발명의 DNA로 되는 외래 유전자를, PCR법을 사용하여 해석하는 경우에는, 재생한 식물체로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 증폭반응을 행한다. 또한, 본 발명의 DNA의 염기서열에 따라 적당하게 선택된 염기서열을 갖는 합성한 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여, 이들을 혼합시킨 반응액 중에 있어서 증폭반응을 행하는 것도 가능하다. 증폭반응에 있어서는, DNA의 변성, 어닐링, 신장반응을 수십회 반복하면, 본 발명의 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편의 증폭 생성물을 얻을 수 있다. 증폭 생성물을 포함하는 반응액을 예를 들면 아가로오스 전기영동에 걸면, 증폭된 각종의 DNA 단편이 분획되어, 그 DNA 단편이 본 발명의 DNA에 대응하는 것을 확인하는 것이 가능하다.
또한 본 발명은, Dro1 유전자 또는 Dro1 유전자를 포함하는 벡터를 식물세포에 도입함으로써 제조되는 형질전환 식물체로서, 심근성의 형질을 갖는 형질전환 식물체에 관한 것이다. 또한 본 발명은, Dro1 유전자 또는 Dro1 유전자를 포함하는 벡터를 식물세포에 도입하는 공정을 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.
또한 본 발명의 형질전환 식물체의 바람직한 태양으로서, 이하 (a)~(d)의 공정에 의해 얻어지는 형질전환 식물체로서, 심근성의 형질을 갖는 형질전환 식물체를 들 수 있다. 또한 본 발명의 형질전환 식물체의 제조방법의 바람직한 태양으로서, 이하 (a)~(d)의 공정을 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법을 들 수 있다.
(a) Dro1 유전자 또는 Dro1 유전자를 포함하는 벡터를 식물세포에 도입하는 공정,
(b) 공정(a)의 식물세포에 있어서의 인위적으로 도입된 Dro1 유전자 또는 Dro1 유전자를 포함하는 벡터의 카피 수를 측정하는 공정,
(c) 인위적으로 도입된 Dro1 유전자 또는 Dro1 유전자를 포함하는 벡터의 카피 수가 1(싱글카피)인 형질전환 식물세포를 선택하는 공정, 및
(d) 공정(c)에서 선택된 형질전환 식물세포로부터 식물체를 재생시키는 공정.
상기 방법에 있어서는, Dro1 유전자를 포함하는 형질전환 식물세포로부터 식물체를 재생한 후, 그 식물체에 있어서의 인위적으로 도입된 Dro1 유전자 또는 Dro1 유전자를 포함하는 벡터의 카피 수를 측정하여, 카피 수가 1인 식물체를 선택해도 된다. 따라서 본 발명은, 이하 (a)~(c)의 공정에 의해 얻어지는 형질전환 식물체로서, 심근성의 형질을 갖는 형질전환 식물체에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 이하 (a)~(c)의 공정을 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.
(a) Dro1 유전자 또는 Dro1 유전자를 포함하는 벡터를 식물세포에 도입하고, 그 식물세포로부터 식물체를 재생하는 공정,
(b) 공정(a)의 식물체에 있어서의 인위적으로 도입된 Dro1 유전자 또는 Dro1 유전자를 포함하는 벡터의 카피 수를 측정하는 공정,
(c) 인위적으로 도입된 Dro1 유전자 또는 Dro1 유전자를 포함하는 벡터의 카피 수가 1인 형질전환 식물체를 선택하는 공정.
Dro1 유전자 또는 Dro1 유전자를 포함하는 벡터의 식물세포로의 도입, 그 식물세포로부터 식물체로의 재생은 전술한 방법으로 행할 수 있다. 또한, 형질전환 식물세포 또는 형질전환 식물체에 있어서의 Dro1 유전자 또는 Dro1 유전자를 포함하는 벡터의 카피 수의 측정은, 예를 들면 서던 블롯 해석, 실시간 PCR법, 염기서열의 해석 등에 의해 행할 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
또한 본 발명에 있어서「카피 수」란, 형질전환에 의해 식물체에 도입된 Dro1 유전자 또는 당해 유전자를 포함하는 벡터의 수를 의미한다. 즉, 본 발명의 「카피 수」에는, 식물에 내재하는 Dro1 유전자(내재성 유전자)의 수는 포함되지 않는다.
또한 본 발명자는, 실시예에 기재된 바와 같이, 인위적으로 도입된 Dro1 유전자의 카피 수가 1인 형질전환 식물체(T0 세대)로부터 T1 세대를 제작하고, T1 세대에 있어서의 Dro1 유전자의 추정 카피 수와 심근률의 관계를 조사하였다. 그 결과, T1 세대에 있어서, 호모형(인위적으로 도입된 Dro1 유전자의 수가 2 카피)의 식물체가, null형(인위적으로 도입된 Dro1 유전자의 수가 0 카피)이나 헤테로형(인위적으로 도입된 Dro1 유전자의 수가 1 카피)의 식물체와 비교하여, 심근률이 큰 것을 발견하였다. 따라서 본 발명에 있어서는, 인위적으로 도입된 Dro1 유전자의 카피 수가 1인 T0 세대의 형질전환 식물체로부터 제작되는 T1 세대의 형질전환 식물체로서, T1 세대의 형질전환 식물체에 있어서의 인위적으로 도입된 Dro1 유전자의 카피 수가 2(호모형)인 형질전환 식물체를, 특히 바람직한 식물체로서 들 수 있다.
즉 본 발명의 특히 바람직한 태양으로서, 위에 기재된 공정(a)~(d) 또는 공정(a)~(c)에 더하여, 추가로 이하의 공정을 포함하는 방법으로 얻어지는 형질전환 식물체를 들 수 있다. 또한 본 발명의 특히 바람직한 태양으로서, 위에 기재된 공정(a)~(d) 또는 공정(a)~(c)에 더하여, 추가로 이하의 공정을 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법을 들 수 있다.
?공정(d) 또는 (c)에서 얻어진 형질전환체끼리를 교배시켜서 식물체를 취득하는 공정
?위의 공정에 의해 얻어진 식물체로부터 Dro1 유전자를 호모에 갖는 식물체를 선택하는 공정
교배에 의해 T0 세대의 식물체로부터 T1 세대의 식물체를 제작하는 방법은 당업자에게 주지이다. 또한 교배에 의해 얻어진 식물체에 있어서의 Dro1 유전자의 카피 수(null형, 헤테로형, 호모형)의 측정도, 서던 블롯 해석이나 실시간 PCR법 등 당업자에게 주지의 방법에 의해 행할 수 있다.
일단, 염색체 내에 본 발명의 DNA가 도입된 형질전환 식물체가 얻어지면, 그 식물체로부터 유성 생식 또는 무성 생식에 의해 자손을 얻는 것이 가능하다. 또한, 그 식물체나 그의 자손 또는 클론으로부터 세포나 기관, 번식재료(예를 들면, 종자, 과실, 절수(絶穗), 괴경(塊莖), 괴근(塊根), 그루터기(株), 캘러스, 프로토블라스트 등)를 단리하고, 그들을 토대로 그 식물체를 양산하는 것도 가능하다. 본 발명에는, 본 발명의 DNA가 인위적으로 도입된 식물세포, 그 세포를 포함하는 식물체, 그 식물체의 기관(예를 들면 꽃, 잎, 뿌리, 줄기 등), 그 식물체의 자손 및 클론, 및 그 식물체, 그의 자손 및 클론의 번식재료가 포함된다. 이들 식물세포, 그 세포를 포함하는 식물체, 그 식물체의 기관, 그 식물체의 자손 및 클론, 및 그 식물체, 그의 자손 및 클론의 번식재료는, 식물에 심근성의 형질을 부여하기 위해 사용하는 것이 가능하다.
또한 본 발명의 형질전환 식물체로서는, 예를 들면 단자엽 식물을 들 수 있다. 단자엽 식물로서는, 벼과, 백합과, 파인애플과, 야자과, 토란과, 생강과, 란과의 식물 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 벼과의 식물로서는, 벼나 맥류(소맥, 대맥, 호밀, 귀리, 율무), 옥수수, 기장, 조, 피, 수수, 핑거 밀렛, 펄 밀렛, 테프, 사탕수수, 티모시, 켄터키 블루그래스, 오차드그래스, 이탈리안 라이그래스, 퍼레니얼 라이그래스, 톨 훼스큐, 바이아그래스 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
또한 본 발명은, 본 발명의 세포, 번식재료, 기관 중 하나 이상으로부터 얻어지는 가공식품에 관한 것이다. 본 발명에 있어서의 가공식품이란, 쌀, 맥류(소맥, 대맥, 호밀, 귀리, 율무), 옥수수, 기장, 조, 피, 수수, 핑거 밀렛, 펄 밀렛, 테프, 사탕수수, 티모시 등의 식물 또는 그의 일부(세포, 번식재료, 기관 등)를 인위적으로 가공함으로써 사람이 먹는 형태로 개변된 것을 말한다. 본 발명에 있어서 가공이란, 밥을 짓는, 삶는, 볶는, 찌는, 튀기는, 분말로 하는 등의 처리를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한 「분말로 하는」에는 탈곡, 정미 등도 포함된다. 본 발명의 가공식품에는, 이들 처리 중 하나 이상의 처리가 행해진 가공식품이 포함된다. 예를 들면, 벼의 종자를 탈곡, 정미하고, 추가로 가열함으로써 얻어지는 가공식품을, 본 발명의 가공식품의 바람직한 예로서 예시할 수 있다. 본 발명의 가공식품으로서, 구체적으로는, 쌀에 취반(炊飯)이라는 가공을 행한 미반류(냉동 미반, 무균 미반을 포함한다), 미분, 떡, 쌀국수, 아라레(정육면체 쌀 크래커), 전병, 쿠키, 된장, 간장, 두부, 빵, 메밀, 우동, 파스타, 중화면 등의 면류(생면, 건면, 삶은 면 등), 시리얼, 콘플레이크 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 가공식품의 상품형태는 특별히 한정되지 않는다. 일례로서, 상온 또는 저온에서 유통 판매되며, 먹을 때 전자레인지 등의 가열 조리기구에서 상온 또는 고온으로 가열되는 형태를 들 수 있다. 구체적으로는, 편의점, 슈퍼마켓이나 테이크아웃 식품점 등에서 판매되는 도시락, 주먹밥, 조리면 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 가공식품은 용기 포장한 형태여도 된다. 예를 들면 플라스틱 성형 용기 등의 용기에 봉입된 형태, 또는 레토르트 파우치 등의 용기에 봉입되어 밀봉 후에 살균된 형태로 하는 것도 가능하다.
본 발명의 「세포, 번식재료, 기관 중 하나 이상으로부터 얻어지는 가공식품」은, 「세포, 번식재료, 기관 중 하나 이상을 원료로서 제조되는 가공식품」, 「세포, 번식재료, 기관 중 하나 이상을 포함하는 가공식품」, 「세포, 번식재료, 기관 중 하나 이상을 가공함으로써 얻어지는 가공식품」 등으로도 표현할 수 있다.
또한 본 발명은, 이하 (a)~(c)의 공정을 포함하는 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 분자량 또는 염기서열이 일치할 때, 피검식물이 심근성의 형질을 갖는, 또는 피검식물이 심근성의 형질을 가질 가능성이 있다고 판정하는 방법을 제공한다.
(a) 피검식물로부터 DNA 시료를 조제하는 공정,
(b) 그 DNA 시료로부터 본 발명의 DNA(Dro1 유전자)의 전부 또는 일부를 포함하는 영역을 증폭하는 공정, 및
(c) 증폭된 DNA 단편의 분자량 또는 염기서열을, 본 발명의 DNA(Dro1 유전자)의 그것과 비교하는 공정.
Dro1 유전자의 일부로서는, 바람직하게는 Dro1 유전자의 제4 엑손, 보다 바람직하게는 Dro1 유전자의 제4 엑손의 5'말단으로부터 116 bp의 서열(서열번호：2의 염기서열에 있어서 943번째의 염기)을 포함하는 영역(예를 들면, 서열번호：2의 염기서열에 있어서 943번째의 염기를 포함하는, 적어도 100, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1의 염기를 포함하는 영역)을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 본 발명자는, Kinandang Patong에서는 Dro1 유전자의 제4 엑손의 5'말단으로부터 116 bp의 서열(서열번호：2의 염기서열에 있어서 943번째의 염기)이 아데닌에 있는 것에 대해, IR64에서는 이 염기가 결실되어 있는 것을 발견하였다. 따라서, 이 염기의 결실 유무를 조사함으로써, 피검식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부의 판정이 가능하다. 즉, 본 발명은, 서열번호：2의 염기서열에 있어서의 943번째의 염기 유무를 검출하는 공정을 포함하는, 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 염기의 결실이 검출된 경우에 피검식물이 심근성의 형질을 갖지 않는 것으로 판정하는 방법을 제공한다. 1염기의 결실의 유무는, Dro1 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 영역의 염기서열이나 분자량을 비교함으로써 검출하는 것이 가능하다.
또한 본 발명은, 피검식물로부터 조제한 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호：8에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：9에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 PCR을 행하는 공정을 포함하는, 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 방법에 관한 것이다. 본 방법에서는, 증폭산물이 얻어진 경우, 피검식물이 심근성의 형질을 갖는 것으로 판정된다.
또한 본 발명은, 피검식물로부터 조제한 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호：10에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：11에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 PCR을 행하는 공정을 포함하는, 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 방법에 관한 것이다. 본 방법에서는, 증폭산물이 얻어진 경우, 피검식물이 심근성 형질을 갖지 않는 것으로 판정된다.
또한 본 발명은, 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하기 위해 사용되는 프라이머를 제공한다. 이러한 프라이머로서 서열번호：8~11 중 어느 하나에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서「식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정한다」는 것은, 지금까지 재배되고 있던 품종이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 것뿐 아니라, 교배나 유전자 재조합기술에 의해 얻어지는 새로운 품종이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 것도 포함된다.
본 발명의 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부의 판정방법은, 식물이 기능적인 Kinandang Patong형의 Dro1 단백질을 코드하는 DNA를 보유하고 있는지 여부를 검출하는 것을 특징으로 한다. 식물이 기능적인 Dro1 단백질(Kinandang Patong형)을 코드하는 DNA를 보유하고 있는지 여부는, 게놈 DNA의 Dro1에 상당하는 영역의 분자량의 차이, 또는 염기서열의 차이를 검출함으로써 판정하는 것이 가능하다.
본 발명의 판정방법에서는 먼저, DNA 시료를 조제(추출)한다. 이어서, 그 DNA 시료로부터 Dro1 유전자에 상당하는 DNA영역을 증폭한다. 또한, 심근성의 형질을 갖는 품종에 있어서의 Dro1 유전자의 DNA영역을 증폭한 DNA 단편과, 피검식물의 DNA 시료로부터 증폭된 DNA 단편의 분자량을 비교하여, 분자량이 일치하는 경우에, 피검식물이 심근성의 형질을 갖는 것으로 판정된다. 또는, 심근성의 형질을 갖는 품종에 있어서의 Dro1 유전자의 DNA영역을 증폭한 DNA 단편과, 피검식물의 DNA 시료로부터 증폭된 DNA 단편의 염기서열을 비교하여, 염기서열이 일치하는 경우에, 피검식물이 심근성의 형질을 갖는 것으로 판정된다.
DNA 시료의 조제(추출)는, 당업자에게 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 바람직한 조제방법으로서, 예를 들면, CTAB법을 사용하여 DNA를 추출하는 방법을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 판정방법에 제공되는 DNA 시료는 특별히 제한되지는 않지만, 통상, 피검식물로부터 추출되는 게놈 DNA를 사용한다. 또한, 게놈 DNA의 채취원은 특별히 한정되지 않고, 식물의 어느 조직으로부터도 추출할 수 있다. 예를 들면, 이삭, 잎, 뿌리, 줄기, 종자, 배유부(胚乳部), 밀기울, 배 등으로부터 추출할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 판정방법에서는, 다음으로, 본 발명의 Dro1 유전자의 DNA영역을 PCR법 등에 의해 증폭한다. 본 발명에 있어서의 「Dro1 유전자의 DNA영역」이란, Dro1 유전자의 게놈 DNA영역(예를 들면 서열번호：1에 기재된 DNA영역)에 상당하는 부분으로, 증폭되는 범위로서는 게놈 DNA 전장이어도 되고, 게놈 DNA의 일부분(예를 들면 단백질을 코드하는 ORF영역 또는 그 영역의 일부)이어도 된다. PCR은, 당업자에게 있어서는 반응조건 등을 적절히 선택해서 행할 수 있다. PCR을 할 때, 32P 등의 아이소토프, 형광색소, 또는 비오틴 등에 의해 표지한 프라이머를 사용함으로써, 증폭 DNA 산물을 표지할 수 있다. 또는 PCR 반응액에 32P 등의 아이소토프, 형광색소, 또는 비오틴 등에 의해 표지된 기질 염기를 첨가하여 PCR을 행함으로써, 증폭 DNA 산물을 표지하는 것도 가능하다. 또한, PCR 반응 후에 클레노우 효소(Klenow enzyme) 등을 사용하여, 32P 등의 아이소토프, 형광색소, 또는 비오틴 등에 의해 표지된 기질 염기를, 증폭 DNA 단편에 부가하는 것으로도 표지를 행할 수 있다.
이렇게 하여 얻어진 표지된 DNA 단편을, 열을 가하는 것 등에 의해 변성시키고, 요소나 SDS 등의 변성제를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔에 의해 전기영동을 행한다. 변성제로서 SDS를 이용한 SDS-PAGE는, 본 발명에 있어서 유리한 분리수법으로, SDS-PAGE는 Laemmli의 방법(Laemmli (1970) Nature 227, 680-685)에 준하여 행할 수 있다. 전기영동 후, DNA 단편의 이동도를, X선 필름을 사용한 오토라디오그래피나, 형광을 검출하는 스캐너 등으로 검출하여, 해석을 행한다. 표지한 DNA를 사용하지 않는 경우에 있어서도, 전기영동 후의 겔을 에티디움 브로마이드나 은 염색법 등에 의해 염색함으로써, DNA 단편을 검출할 수 있다. 예를 들면, 서열번호：8에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：9에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머를 사용하여, 심근성의 형질을 갖는 품종(예를 들면 Kinandang Patong) 및 피검식물로부터 DNA 단편을 증폭하고, 분자량을 비교함으로써 피검식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정할 수 있다. 분자량이 일치하는 경우에, 그 피검식물은 심근성의 형질을 갖는 것으로 판정된다.
또한, 본 발명의 DNA에 상당하는 피검식물체의 DNA영역의 염기서열을 직접 결정하고, 심근성의 형질을 갖는 품종의 염기서열과 비교함으로써, 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 것도 가능하다. 염기서열이 일치하는 경우에, 그 피검식물은 심근성의 형질을 갖는 것으로 판정된다.
본 발명에 있어서「일치한다」는 것은, 대립 유전자의 양쪽 유전자의 분자량 또는 염기서열이 심근성의 형질을 갖는 식물의 그것과 일치하는 것, 또는 아미노산 서열에 있어서 일치하는 것을 의미한다. 따라서, 대립 유전자의 한쪽 유전자의 분자량, 염기서열 또는 아미노산 서열이 심근성의 형질을 갖는 식물의 그것과 상이하나, 다른 한쪽이 심근성의 형질을 갖는 식물의 그것과 동일한 경우에는, 「일치하는」 것에 포함되지 않는다.
상기 전기영동분석은, 통상의 방법에 따라 행하면 된다. 예를 들면, 아가로오스 또는 폴리아크릴아미드의 겔 중에서 전기를 가하여 전기영동하고, 분리된 DNA 패턴을 분석한다.
또한, 염기서열의 결정은, 예를 들면 시판의 자동 DNA 시퀀서를 사용하여 행할 수 있다.
또한, 본 발명의 판정방법을 이용하면, 심근성의 형질을 갖는 것으로 식별되는 식물을 조기에 선발하는 것이 가능해진다.
즉, 본 발명은, 이하의 (a) 및 (b)에 기재된 공정을 포함하는 심근성의 형질을 갖는 식물을 선발하는 방법을 제공한다.
(a) 심근성의 형질을 갖는 식물과 임의의 식물이 교배된 품종을 제작하는 공정, 및
(b) 본 명세서의 기재에된 피검식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 방법에 의해, 공정(a)에서 얻어진 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 공정.
본 발명의 선발방법은, 이하의 공정을 추가로 포함할 수 있다.
(c) 공정(b)에 있어서 심근성의 형질을 갖는 것으로 판정된 식물을 선택하는 공정.
심근성의 형질을 갖는 식물과 임의의 식물의 교배는 당업자에게 주지의 방법으로 행할 수 있다.
본 발명의 선발방법을 이용하면, 심근성의 형질을 갖는 것으로 식별되는 식물을 조기에 선발하는 것이 가능해진다. 본 발명은 이러한 심근성의 형질을 갖는 것으로 식별되는 식물을 조기에 선발하는 방법도 제공한다. 여기서 말하는 「조기」란, 예를 들면 벼의 출수(出穗)보다 전의 상태를 가리키고, 바람직하게는 발아 직후의 상태를 가리킨다. 본 발명의 선발방법을 이용하면, 심근성의 형질을 갖는 품종의 육성을 종래보다도 단기간에 이루는 것이 가능해진다.
본 발명의 판정방법 및 선발방법에 있어서의 식물로서는, 예를 들면 단자엽 식물을 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다. 단자엽 식물로서는, 벼과, 백합과, 파인애플과, 야자과, 토란과, 생강과, 란과의 식물 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 벼과의 식물로서는, 벼나 맥류(소맥, 대맥, 호밀, 귀리, 율무), 옥수수, 기장, 조, 피, 수수, 핑거 밀렛, 펄 밀렛, 테프, 사탕수수, 티모시, 켄터키 블루그래스, 오차드그래스, 이탈리안 라이그래스, 퍼레니얼 라이그래스, 톨 훼스큐, 바이아그래스 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
또한 본 발명은, 본 발명의 Dro1 유전자의 염기서열 또는 그의 상보서열에 상보적인 15 이상(예를 들면 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25)의 연속하는 염기를 포함하는 DNA(올리고뉴클레오티드)를 제공한다. 여기서 「상보서열」이란, A:T, G:C의 염기쌍으로 되는 이중가닥 DNA의 한쪽 가닥의 서열에 대한 다른쪽 가닥의 서열을 가리킨다. 또한, 「상보적」이란, 15개 이상의 연속한 뉴클레오티드영역에서 완전히 상보서열인 경우에 한정되지 않고, 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상(95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 염기서열의 동일성을 가지면 된다. 이러한 DNA는, 본 발명의 DNA의 검출이나 단리를 행하기 위한 프로브로서, 또한, 증폭을 행하기 위한 프라이머로서 유용하다.
프라이머로서는, 이하의 프라이머 세트를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
IR64와 Kinandang Patong 사이에서 다형(polymorphism)을 나타내는 InDel 마커인 Dro1-INDEL09의 증폭에 사용되는, 서열번호：4에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：5에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 되는 프라이머 세트
IR64와 Kinandang Patong 사이에서 다형을 나타내는 CAPS 마커인 Dro1-CAPS05의 증폭에 사용되는, 서열번호：6에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：7에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 되는 프라이머 세트
Kinandang Patong의 게놈 DNA 특이적 마커인 SNP02-KP의 증폭에 사용되는, 서열번호：8에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：9에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 되는 프라이머 세트
IR64 유래의 게놈 DNA 특이적 마커인 SNP02-IR64의 증폭에 사용되는, 서열번호：10에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：11에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 되는 프라이머 세트
또한 본 발명은, 식물(예를 들면 벼) 유래의 게놈 DNA를 주형으로 하여 위의 프라이머 세트에 의해 증폭되는 DNA 단편의 전부 또는 일부를 포함하는 뉴클레오티드로서, Dro1 유전자의 20~100의 연속한 뉴클레오티드에 관한 것이다. 이러한 DNA는 피검식물이 심근성인지 천근성인지의 판정에 유용하다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드를 프로브로서 사용하는 경우는, 적절히 표지하여 사용하는 것이 바람직하다. 표지하는 방법으로서는, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 올리고뉴클레오티드의 5'말단을 32P로 인산화함으로써 표지하는 방법, 및 클레노우 효소 등의 DNA 폴리머라아제를 사용하여, 랜덤 헥사머 올리고뉴클레오티드 등을 프라이머로서 32P 등의 아이소토프, 형광색소, 또는 비오틴 등에 의해 표지된 기질 염기를 삽입하는 방법(랜덤 프라임법 등)을 예시할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 시판의 올리고뉴클레오티드 합성기에 의해 제작할 수 있다. 프로브는, 제한효소 처리 등에 의해 취득되는 이중가닥 DNA 단편으로서 제작하는 것도 가능하다.
또한 본 발명은, Dro1 유전자 또는 당해 유전자를 발현 가능하게 보유하는 벡터를 포함하는 식물에 심근성의 형질을 부여하는 약제에 관한 것이다. 본 발명의 약제에 사용하는 DNA의 형태에 특별히 제한은 없고, cDNA여도 되고 게놈 DNA여도 된다. 또한, 식물에 도입된 경우에 당해 식물에 심근성의 형질을 부여하는 하는 것이 가능한 한, 벼 유래의 Dro1 단백질을 코드하는 DNA뿐 아니라, 그 단백질과 구조적으로 유사한 단백질을 코드하는 DNA(예를 들면, 변이체, 유도체, 대립유전자, 배어리언트 및 호몰로그)를 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 약제에 포함되는 DNA는, 벡터에 삽입된 형태여도 된다. 벡터로서는, 식물세포 내에서 삽입 유전자를 발현시키는 것이 가능한 것이라면 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 식물세포 내에서의 항상적인 유전자 발현을 행하기 위한 프로모터(예를 들면, 감자 키틴분해효소 유전자 SK2의 프로모터, 칼리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 등)를 갖는 벡터나 외적인 자극에 의해 유도적으로 활성화되는 프로모터를 갖는 벡터를 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 약제는, 상기 DNA나 그 DNA가 삽입된 벡터 자체여도 되고, 또한, 이들이 식물세포로의 도입을 위한 다른 성분과 혼합되어 있는 것이어도 된다. 예를 들면, 상기 DNA, 상기 DNA를 도입한 벡터, 상기 DNA가 도입된 아그로박테리움, 이들을 포함하는 생화학적 시약이나 용액은, 본 발명에 있어서의 약제에 포함된다.
또한 본 발명은, 본 발명의 DNA로 형질전환된 식물체로서, 내건성을 갖는 식물체에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 상기 식물체로부터 단리된 세포, 번식재료, 기관에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 상기 세포, 번식재료, 기관 중 하나 이상으로부터 얻어지는 가공식품에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 본 발명의 DNA 또는 벡터를 식물세포에 도입하고, 그 식물세포로부터 식물체를 재생시키는 공정을 포함하는, 내건성을 갖는 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 이하 (a)~(c)의 공정을 포함하는 식물이 내건성을 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 분자량 또는 염기서열이 일치할 때, 피검식물이 내건성을 갖는 것으로 판정하는 방법에 관한 것이다.
(a) 피검식물로부터 DNA 시료를 조제하는 공정,
(b) 그 DNA 시료로부터 본 발명의 DNA를 포함하는 영역을 증폭하는 공정, 및
(c) 증폭된 DNA 단편의 분자량 또는 염기서열을, 본 발명의 DNA의 그것과 비교하는 공정.
또한 본 발명은, 피검식물로부터 조제한 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호：8에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：9에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 PCR을 행하는 공정을 포함하는, 식물이 내건성을 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 증폭산물이 얻어진 경우, 피검식물이 내건성을 갖는 것으로 판정되는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 피검식물로부터 조제한 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호：10에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：11에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 PCR을 행하는 공정을 포함하는, 식물이 내건성을 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 증폭산물이 얻어진 경우, 피검식물이 내건성을 갖지 않는 것으로 판정되는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 이하의 (a) 및 (b)에 기재된 공정을 포함하는 내건성을 갖는 식물을 선발하는 방법에 관한 것이다.
(a) 내건성을 갖는 식물과 임의의 식물이 교배된 품종을 제작하는 공정, 및
(b) 상기 내건성을 갖는지 여부를 판정하는 방법에 의해, 공정(a)에서 얻어진 식물이 내건성을 갖는지 여부를 판정하는 공정.
내건성을 갖는 형질전환 식물체의 제조, 식물이 내건성을 갖는지 여부의 판정, 내건성을 갖는 식물의 선발은 본 명세서의 기재에 따라 행할 수 있다.
식물이 내건성을 갖는지 여부는, 엽면 온도를 측정함으로써 행할 수 있다.
본 발명에서는, 형질전환 식물이 대조와 비교하여, 인공적으로 제작한 건조 스트레스하(건조 환경하)에 있어서, 조금이라도 엽면 온도가 하강하는 한, 「내건성을 갖는」의 의미에 포함된다.
본 발명에 있어서 엽면 온도란, 식물체의 잎의 표면 온도를 의미한다. 식물은, 기공을 통해 이산화탄소를 흡수하여, 광합성을 행한다. 동시에, 기공으로부터 세포 내의 물이 외기로 증발하여, 수분이 상실된다. 이 현상을 증산이라 한다. 이들 관계에 대해서, Takai et al은, 엽면 온도와 광합성 속도 및 기공의 벌어짐 정도(기공 컨덕턴스)에는 마이너스의 상관관계가 있는 것을 보고하고 있다(Takai et al. Field Crops Research doi:10.1016/j.fcr.2009.10.019. 2009). 기공은 벌어지면 벌어질수록 증산이 활발해져, 증산에 의해 잎의 표면으로부터 기화열이 빼앗기기 때문에 엽면 온도는 저하된다. 식물이 광합성을 활발히 행하고 있을 때는 기공이 벌어지고 증산도 활발해져, 잎의 표면 온도는 낮아진다. 한편, 식물이 건조 스트레스를 받으면, 세포의 수분 포텐셜을 유지하기 위해, 기공을 닫아, 증산을 억제한다. 그 결과, 광합성이 저하되는 동시에, 잎의 표면 온도 상승한다. 건조 조건하에 있어서, 기공을 벌리고 광합성할 수 있는 건조에 강한 식물은, 그렇지 않은 식물에 비해 엽면 온도가 보다 낮은 값을 나타낸다. Hirayama et al은, 벼에 있어서 엽면 온도를 지표로 한 내건성의 계통 선발은 내건성 벼 품종의 개발에 효과적이라고 보고하고 있다(Hirayama et al. Breeding Science 56: 47-54. 2006). 식물의 엽면 온도가 낮은지 어떤지는, 실시예에 기재된 바와 같이, 건조 스트레스시에 적외선 서모그래피 등의 장치를 사용함으로써 간단하게 판정할 수 있다. 또한, 광합성이나 기공의 벌어짐 정도는, 실시예에 기재된 바와 같이, 건조 스트레스시에 광합성 증산 측정 시스템 등의 장치를 사용함으로써 간단하게 측정할 수 있다.
또한, 통상 식물은, 건조 스트레스에 노출되면, 잎이 위축되는 것이 알려져 있다. 특히 벼에 있어서는 잎이 침형상으로 말리는 것이 알려져 있다. 그러나 본 발명의 형질전환 식물체는, 건조 스트레스하에 있어서도, 잎이 거의 말리지 않는다.
즉, 본 발명은, 본 발명의 DNA로 형질전환된 식물체로서, 건조 스트레스하에 있어서 엽권 저항성을 갖는 식물체에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 상기 식물체로부터 단리된 세포, 번식재료, 기관에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 상기 세포, 번식재료, 기관 중 하나 이상으로부터 얻어지는 가공식품에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 본 발명의 DNA 또는 벡터를 식물세포에 도입하고, 그 식물세포로부터 식물체를 재생시키는 공정을 포함하는, 건조 스트레스하에 있어서 엽권 저항성을 갖는 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 이하 (a)~(c)의 공정을 포함하는 식물이 건조 스트레스하에 있어서 엽권 저항성을 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 분자량 또는 염기서열이 일치할 때, 피검식물이 건조 스트레스하에 있어서 엽권 저항성을 갖는 것으로 판정하는 방법에 관한 것이다.
(a) 피검식물로부터 DNA 시료를 조제하는 공정,
(b) 그 DNA 시료로부터 본 발명의 DNA를 포함하는 영역을 증폭하는 공정, 및
(c) 증폭된 DNA 단편의 분자량 또는 염기서열을, 본 발명의 DNA의 그것과 비교하는 공정.
또한 본 발명은, 피검식물로부터 조제한 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호：8에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：9에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 PCR을 행하는 공정을 포함하는, 식물이 건조 스트레스하에 있어서 엽권 저항성을 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 증폭산물이 얻어진 경우, 피검식물이 건조 스트레스하에 있어서 엽권 저항성을 갖는 것으로 판정되는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 피검식물로부터 조제한 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호：10에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：11에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 PCR을 행하는 공정을 포함하는, 식물이 건조 스트레스하에 있어서 엽권 저항성을 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 증폭산물이 얻어진 경우, 피검식물이 건조 스트레스하에 있어서 엽권 저항성을 갖지 않는 것으로 판정되는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 이하의 (a) 및 (b)에 기재된 공정을 포함하는 건조 스트레스하에 있어서 엽권 저항성을 갖는 식물을 선발하는 방법에 관한 것이다.
(a) 건조 스트레스하에 있어서 엽권 저항성을 갖는 식물과 임의의 식물이 교배된 품종을 제작하는 공정, 및
(b) 상기 건조 스트레스하에 있어서 엽권 저항성을 갖는지 여부를 판정하는 방법에 의해, 공정(a)에서 얻어진 식물이 건조 스트레스하에 있어서 엽권 저항성을 갖는지 여부를 판정하는 공정.
건조 스트레스하에 있어서 엽권 저항성을 갖는 형질전환 식물체의 제조, 식물이 건조 스트레스하에 있어서 엽권 저항성을 갖는지 여부의 판정, 건조 스트레스하에 있어서 엽권 저항성을 갖는 식물의 선발은 본 명세서의 기재에 따라 행할 수 있다.
본 발명에 있어서 엽권 저항성이란, 건조 스트레스를 원인으로 하는 잎의 말려들어감에 대한 저항성을 의미한다. 벼에 있어서 잎이 건조되면 잎의 내부에서는 상표피의 기동세포가 팽압을 잃어 결과적으로 잎이 상표면측으로 말린다. 식물이 엽권 저항성을 갖는지 여부는 건조 스트레스시에 잎이 말려들어가는지 말려들어가지 않는지로 간단하게 판정할 수 있다.
본 발명에서는, 형질전환 식물이 대조와 비교하여 조금이라도 건조 스트레스시의 잎의 말려들어감의 정도가 적은 한, 「엽권 저항성을 갖는」의 의미에 포함된다.
또한, 통상, 작물은 건조 스트레스 조건하에서는 불임이 다수 발생하여 임실 수(number of ripened grain)나 임실 무게가 감소한다. 이 때문에 최종적인 수량은 감소한다. 그러나 본 발명의 형질전환 식물체는, 본 발명의 DNA를 갖지 않는 식물체(대조)와 비교하여, 건조 스트레스하에 있어서도 많은 임실 수 또는 임실 무게를 갖는다(임실 수 또는 임실 무게의 감소가 억제되어 있다).
즉, 본 발명은, 본 발명의 DNA로 형질전환된 식물체로서, 대조와 비교하여, 건조 스트레스하에 있어서 많은 임실 수 또는 임실 무게를 갖는 식물체에 관한 것이다. 이와 같은 식물체는, 건조 스트레스하에 있어서의 임실 수 또는 임실 무게의 감소가 억제된 식물체로 표현하는 것도 가능하다. 또한, 대조와 비교하여, 건조 스트레스하에 있어서의 임실 수 또는 임실 무게가 증가된 식물체로 표현하는 것도 가능하다.
또한 본 발명은, 상기 식물체로부터 단리된 세포, 번식재료, 기관에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 상기 세포, 번식재료, 기관 중 하나 이상으로부터 얻어지는 가공식품에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 본 발명의 DNA 또는 벡터를 식물세포에 도입하고, 그 식물세포로부터 식물체를 재생시키는 공정을 포함하는, 대조와 비교하여 건조 스트레스하에 있어서 많은 임실 수 또는 무거운 임실 무게를 갖는 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 이하 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 대조와 비교하여, 식물이 건조 스트레스하에 있어서 많은 임실 수 또는 무거운 임실 무게를 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 분자량 또는 염기서열이 일치할 때, 대조와 비교하여, 피검식물이 건조 스트레스하에 있어서 많은 임실 수 또는 무거운 임실 무게를 갖는 것으로 판정하는 방법에 관한 것이다.
(a) 피검식물로부터 DNA 시료를 조제하는 공정,
(b) 그 DNA 시료로부터 본 발명의 DNA를 포함하는 영역을 증폭하는 공정, 및
(c) 증폭된 DNA 단편의 분자량 또는 염기서열을, 본 발명의 DNA의 그것과 비교하는 공정.
또한 본 발명은, 피검식물로부터 조제한 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호：8에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：9에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 PCR을 행하는 공정을 포함하는, 대조와 비교하여, 식물이 건조 스트레스하에 있어서 많은 임실 수 또는 무거운 임실 무게를 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 증폭산물이 얻어진 경우, 대조와 비교하여, 피검식물이 건조 스트레스하에 있어서 많은 임실 수 또는 무거운 임실 무게를 갖는 것으로 판정되는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 피검식물로부터 조제한 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호：10에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：11에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 PCR을 행하는 공정을 포함하는, 대조와 비교하여, 식물이 건조 스트레스하에 있어서 많은 임실 수 또는 무거운 임실 무게를 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 증폭산물이 얻어진 경우, 대조와 비교하여, 피검식물이 건조 스트레스하에 있어서 많은 임실 수 또는 무거운 임실 무게를 갖지 않는 것으로 판정되는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 이하의 (a) 및 (b)에 기재된 공정을 포함하는, 대조와 비교하여, 건조 스트레스하에 있어서 많은 임실 수 또는 무거운 임실 무게를 갖는 식물을 선발하는 방법에 관한 것이다.
(a) 대조와 비교하여 건조 스트레스하에 있어서 많은 임실 수 또는 무거운 임실 무게를 갖는 식물과 임의의 식물이 교배된 품종을 제작하는 공정, 및
(b) 상기 대조와 비교하여 건조 스트레스하에 있어서 식물이 많은 임실 수 또는 무거운 임실 무게를 갖는지 여부를 판정하는 방법에 의해, 공정(a)에서 얻어진 식물이, 대조와 비교하여, 건조 스트레스하에 있어서 많은 임실 수 또는 무거운 임실 무게를 갖는지 여부를 판정하는 공정.
상기 식물체의 제조, 판정 및 선택은, 본 명세서의 기재에 따라 행할 수 있다.
본 발명에 있어서 많은 임실 수 또는 무거운 임실 무게를 갖는다는 것은, 본 발명의 DNA를 갖지 않는 대조와 비교하여, 건조 스트레스하에 있어서의 임실 수가 많거나 또는 임실 무게가 무거운 것을 의미한다. 본 발명에 있어서는, 대조와 비교하여 조금이라도 많은 임실 수 또는 무거운 임실 무게를 갖는 한, 「많은 임실 수 또는 무거운 임실 무게를 갖는 식물체」를 의미한다.
식물의 임실 수는, 예를 들면 수확한 이삭에서 불임을 제외한 임실을 셈으로써 간단하게 측정할 수 있지만 이 방법에 한정되지 않는다. 또한, 식물의 임실 무게는, 예를 들면 수확한 이삭에서 불임을 제외한 임실의 무게를 계측함으로써 간단하게 측정할 수 있지만 이 방법에 한정되지 않는다.
이하에, 서열번호와 서열의 대응관계를 나타낸다.
서열번호 1：Kinandang Patong의 Dro1 유전자의 게놈 DNA의 염기서열
서열번호 2：Kinandang Patong의 Dro1 유전자의 cDNA의 염기서열
서열번호 3：Kinandang Patong의 Dro1 단백질의 아미노산 서열
서열번호 4, 5：IR64와 Kinandang Patong 사이에서 다형을 나타내는 InDel 마커인 Dro1-INDEL09의 증폭에 사용되는 프라이머 세트
서열번호 6, 7：IR64와 Kinandang Patong 사이에서 다형을 나타내는 CAPS 마커인 Dro1-CAPS05의 증폭에 사용되는 프라이머 세트
서열번호 8, 9：Kinandang Patong의 게놈 DNA 특이적 마커인 SNP02-KP의 증폭에 사용되는 프라이머 세트
서열번호 10, 11：IR64의 게놈 DNA 특이적 마커인 SNP02-IR64의 증폭에 사용되는 프라이머 세트
서열번호 12：수수의 Dro1 유전자의 CDS의 염기서열
서열번호 13：수수의 Dro1 단백질의 아미노산 서열
서열번호 14： 옥수수의 Dro1 유전자의 CDS의 염기서열
서열번호 15： 옥수수의 Dro1 단백질의 아미노산 서열
서열번호 16：닛폰바레의 FOX hunting system에 사용되고 있는 cDNA의 염기서열. 게놈 DNA의 염기서열로부터 결정된 cDNA 서열(서열번호：2의 염기서열)에 대해, 5'말단과 3'말단 서열이 각각 1 bp 부가되어 있다. 또한, 본 cDNA 염기서열 베이스로 5'말단측으로부터 373 bp째(서열번호：2에 있어서의 5'말단측으로부터 372 bp째)의 A가 G로 염기 치환되어 있다.
서열번호 17：Kinandang Patong의 Dro1 유전자 및 프로모터영역을 포함하는 그 상류의 염기서열
서열번호 18：닛폰바레에 있어서, 서열번호：17에 대응하는 영역의 염기서열
또한, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로써 본 명세서에 포함된다.
실시예
본 발명에서는, 간편하고, 재현성이 높으며, 공간을 절약하여 심근성을 조사할 수 있도록 바스켓법을 개량하였다. 또한, 후보가 되는 염기서열을 IR64에 도입하기 위해, 캘러스를 사용한 아그로박테리움 형질전환법을 개량하여, IR64에 유전자를 도입하였다. 이들 방법을 사용한 맵 베이스 클로닝법에 의해, 심근성 유전자인 Dro1의 염기서열을 단리, 동정하였다. 이 유전자를 사용하여 벼의 심근성을 용이하게 개변하고, 추가로, 건조 회피성을 부여하는 수법을 개발하였다.
이하 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하나, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
〔실시예 1〕Dro1 유전자좌의 동정
필리핀의 육도 품종 Kinandang Patong과 국제 벼 연구소가 육성한 수도 품종 IR64의 2 품종을 국제 벼 연구소로부터 분양받아, 양 품종을 교배함으로써 유전자 단리의 재료를 육성하였다. 양 품종의 교배에 유래하는 BC2F2 집단 중, 제9 염색체는 분리되나, 그 이외의 염색체영역은 될 수 있는 한 IR64 호모형에 고정한 집단에 있어서, 천근형(shallow rooting type)과 심근형(deep rooting type)의 개체가 분리되는 것을 발견하였다. IR64는 천근형을, Kinandang Patong은 심근형을 나타내는 것으로부터, 이 분리는 Kinandang Patong이 갖는 심근성의 유전자가 관여하고 있는 것으로 생각하고, 집단 내의 개체를 달관에 의해 천근형과 심근형으로 나눠서, 유전자형을 조사하였다. 그 결과, 심근성에 관여하는 QTL이, 제9 염색체에 존재하는 것을 알 수 있었다(Uga et al. The 2nd International Conference on Plant Molecular Breeding. 2007). 상세한 유전 해석을 행하기 위해, 심근성을 정량적으로 평가할 수 있는 바스켓법을 이용하였다. 즉, 흙을 충전한 직경 15 ㎝의 플라스틱 바스켓을 포트에 매설하고, 파종한 후, 벼가 8 엽령 전후가 될 때까지 재배하였다. 각 바스켓으로부터 나오는 전체 뿌리 수에 대해 바스켓의 바닥으로부터 나오는 뿌리의 비율을 심근률로 하여 심근성을 구하였다. 바스켓의 바닥은 평평해져 있어, 지표면에 대해 53도보다 아래를 향하여 신장하는 뿌리가 바스켓의 바닥으로부터 신장하게 된다. IR64의 심근률은 평균 1.6%였던 것에 반하여, Kinandang Patong의 심근률은 평균 72.6%였다. 심근성에 관여하는 QTL을 단일 유전자좌로서 맵핑하기 위해, BC2F2 집단으로부터 QTL의 근방영역에서 재조합이 생긴 8 개체를 선발하여, 그 자식후대(自殖後代)(BC2F3)로부터 추가로 재조합 자식 고정 계통(BC2F4)을 선발하였다. 각 고정 계통에 대해서, 20~23 개체를 포트 재배하고, 바스켓법에 의해 구한 심근률로부터 유전자형을 추정하였다. BC2F4 계통 중, QTL의 주변영역이 IR64형에 고정한 계통의 심근률은 평균 2.6%로 IR64와 거의 동일한 비율을 나타낸 것에 반하여, QTL의 주변영역이 Kinandang Patong형에 고정한 계통의 심근률은 평균 40.4%였다. 이 결과로부터, 각 계통의 QTL의 유전자형은 명확하게 결정되어, QTL은 InDel 마커인 ID07_14와 ID07_17 사이에 단일 유전자좌로서 자리매김되었다. 이에, 이 QTL은 심근성 관련 유전자좌 Dro1(Deeper Rooting 1)으로 명명되었다(우가등 일본 육종학회 제112회 강연회 요지집 188p. 2007; 우가등 제27회 뿌리 연구집회. 2007; Uga et al. The 5th International Crop Science Congress Abstracts 243p. 2008). 또한, 공개되어 있는 simple sequence repeat(SSR) 마커 정보(International Rice Genome Sequencing Project 2005)를 토대로, 양 InDel 마커 사이에 존재하는 모든 SSR 마커의 다형 해석을 행하여, Dro1의 후보영역을 SSR 마커인 RM24393와 RM7424 사이의 608 kbp로 좁혔다.
〔실시예 2〕고정밀도 연쇄 해석
Dro1 유전자를 맵 베이스 클로닝법으로 단리하기 위해, 4,560 개체로 되는 BC3F2 집단으로부터 후보영역 내에서 재조합이 있었던 359 개체를 선발하였다. 선발된 개체의 후대를 사용하여 후보영역을 좁히기 위해서는, 한번에 다수의 개체의 심근률을 조사할 필요가 있었다. 이에, 바스켓을 포트에 매설하지 않고 수경재배로 조사할 수 있는 방법을 고안하였다. 고안한 개량형 바스켓법은, 포트에 바스켓을 매설하지 않고, 흙을 충전한 직경 7.5 ㎝의 스테인리스제의 특별 주문 바스켓을 수경액 중에 설치함으로써, 지금까지의 방법보다도 1/4의 공간으로 벼의 심근률을 조사하는 것이 가능해졌다. 개량형 바스켓법에서의 심근률은, 지표면에 대해 50도보다 아래를 향하여 신장하는 뿌리를 심근으로서 구하였다(도 1). 개량형 바스켓법을 사용하여, 각 계통당 약 40 개체의 심근률을 조사하여, 심근률의 빈도 분포로부터 각 계통의 Dro1 유전자의 유전자형을 추정하였다. 유전자영역을 좁히기 위해, DNA 마커의 스크리닝을 행하였다. OryzaSNP Consortium(http://irfgc.irri.org/index.php?option=com_content&task=view&id=14&Itemid=106)의 홈페이지로부터 IR64와 Kinandang Patong에 가까운 품종 Azucena의 Dro1 주변의 SNP 정보를 추출하여, CAPS 마커를 디자인하였다. 이들 CAPS 마커의 다형을 IR64와 Kinandang Patong에서 조사하여, 다형이 있었던 6 마커를 맵핑에 사용하였다. 또한, IR64와 Kinandang Patong의 BAC 라이브러리를 제작하여, 후보영역을 포함하는 클론의 선발을 행하고, 선발된 클론의 염기서열을 해석하였다. 이들 서열정보를 사용하여 IR64와 Kinandang Patong 사이에서 다형을 나타내는 InDel 마커나 CAPS 마커를 11개 제작하였다. 이들 마커를 사용하여 359 계통에서 재조합 계통을 선발하고, 연쇄 해석을 행한 결과, Dro1의 유전자영역은 InDel 마커인 Dro1-INDEL09(프라이머 5'-GCAGACGCTCGTAACACGTA-3'(서열번호：4) 및 프라이머 5'-GTGGCAGCTCCATCAACTCT-3'(서열번호：5))로부터 CAPS 마커인 Dro1-CAPS05(프라이머 5'-GCACAAGATGGGAGGAGAGT-3'(서열번호：6) 및 프라이머 5'-CATGGGTGAGAATCGTGTTG-3'(서열번호：7), 증폭된 DNA는 HinfI로 제한효소 처리를 행한다) 사이에 끼인 6.0 kbp의 영역으로 좁혀졌다. 이 후보영역을 포함하는 게놈 염기서열을 RAP-DB에 의해 해석한 결과, 하나의 예측 유전자가 존재하였다. 이 예측 유전자는, IR64의 서열에서 제4 엑손에 1 b의 결실이 존재하여, 프레임 시프트에 의해 스톱 코돈이 생성되어 있는 것을 알 수 있었다.
〔실시예 3〕Dro1 유전자의 특정을 위한 상보시험 및 Dro1 유전자 과잉 발현체의 심근률의 검토
3.1 Dro1 유전자 특정을 위한 상보시험
RAP-DB로 예측된 유전자를 Dro1 본체라고 가정하고, Dro1 후보영역 6.0 kbp와 그의 전후를 포함하는 Kinandang Patong 유래의 KpnI-NotI 단편 8.7 kbp를 pPZP2H-lac(Fuse et al. Plant Biotechnology 18:219-222, 2001)에 삽입하고, 아그로박테리움 EHA101균을 매개로 IR64의 캘러스에 도입하였다. 구체적인 IR64의 형질전환은 이하와 같다.
(아그로박테리움을 감염시키는 캘러스의 유도)
멸균한 IR64의 종자를 2,4-D를 포함하는 캘러스 유도배지로 치상하고, 30~33℃의 24시간 조명하에서 1주일 배양 후, 새로운 캘러스 유도배지에 캘러스를 분할하여 이식하였다. 이 조작을 3회 반복하여, 캘러스를 형성시켰다. 캘러스 유도배지의 조성은, Hiei and Komari등이 미숙 배법을 사용한 형질전환법으로 형질전환 캘러스를 선택한 후에 형질전환 식물을 재분화시키는 전배양으로서 사용한 NBPRCH40(Hiei and Komari Nature Protocols 3: 824-834. 2008)을 개변하여, 캘러스 유도배지로서 사용하였다. 캘러스 유도배지의 조성은, 이하와 같다.
：100 mL 10×N6 major salts, 10 mL 100×FeEDTA, 1 mL 1000×B5 minor salts, 1 mL 1000×B5 vitamins, 30 g/L 말토오스, 0.5 g/L 카사미노산, 0.5 g/L 프롤린, 2 mg/L 2,4-D, 5 g/L 겔라이트, pH 5.8.
(아그로박테리움의 감염)
캘러스를 감염 전에 새로운 배지에 이식하고, 3일간 전배양한 캘러스를 아그로박테리움균액에 침지한 후, 2N6-AS배지(Hiei and Komari Nature Protocols 3: 824-834. 2008)에 이식하고, 암흑하 23℃에서 공존 배양을 행하였다.
(제균 및 형질전환 캘러스의 선발)
공존 배양의 완료 후, 아그로박테리움을 제균하고, 이어서 형질전환한 세포를 선발하기 위해 형질전환 처리 캘러스를 약제로서 25 mg/L 하이그로마이신 및 400 mg/L 카베니실린을 함유하는 캘러스 유도배지(선발배지)로 치상하였다. 30~33℃의 24시간 조명하에서 1주일 배양 후, 새로운 선발배지에 캘러스를 분할하여 이식하였다. 이 조작을 3회 반복하여, 형질전환 세포를 선발하였다.
(형질전환체의 재분화)
선발배지 상에서 증식이 보인 캘러스를 재분화배지에 이식하였다. 28℃의 24시간 조명하에서 1주일~10일간 배양 후, 새로운 재분화배지에 싹이 형성되기 시작한 캘러스에 대해서 이식하였다. 이 조작을 2회 반복하여, 형질전환 식물을 선발하였다. 재분화배지의 조성은, 이하와 같다：100 mL 10×N6 major salts, 10 mL 100×FeEDTA, 1 mL 1000×B5 minor salts, 1 mL 1000×B5 vitamins, 30 g/L 말토오스, 30 g/L 소르비톨, 2 g/L 카사미노산, 0.5 g/L 프롤린, 0.02 mg/L NAA, 5 g/L, 2 mg/L 키네틴, 5 g/L 겔라이트, pH 5.8로 조정한 배지에 25 mg/L 하이그로마이신 및 300 mg/L 카베니실린을 첨가하였다.
(화분에 이식(naturalization))
재분화된 형질전환체를, 발근배지(25 mg/L 하이그로마이신 및 200 mg/L 카베니실린을 첨가한 MS배지(4 g/L 겔라이트, pH 5.8))로 옮기고, 28℃의 24시간 조명하에서 배양하였다. 형질전환 식물은 뿌리의 발육을 확인한 후에, 화분에 이식하였다.
하이그로마이신으로 선발하여 얻어진 상이한 캘러스 유래의 형질전환체 17 클론의 당대(T0)의 심근률을 개량 바스켓법으로 조사하였다. 벡터 대조에서는 심근률은 IR64와 동일하였으나, 8.7 kbp의 Kinandang Patong 단편을 도입한 계통 중, 심근률이 높은 계통이 다수 관찰되었다(도 1, 도 2). T0 세대에서 서던 해석과 형질전환 벡터 중에 포함되는 하이그로마이신 저항성 유전자의 서열을 검출할 수 있는 실시간 PCR의 시스템을 병용하여, 각 개체에 도입된 형질전환 벡터의 카피 수를 조사하여, 싱글카피의 개체를 선택해서, T1 종자를 증식하였다. T1 개체에서는, 실시간 PCR의 시스템을 사용하여 얻어진 시그날 강도로부터, T0에서 싱글카피였던 4 계통의 null형(0 카피), 헤테로형(1 카피), 호모형(2 카피)을 추정하고, 심근률과의 관계를 조사하였다. 4 계통 모두 시그날 강도가 0인 개체의 심근률은 대조 벡터와 동일하였다(도 3). 한편, 시그날 강도가 강한 계통은 심근률도 높았다. 예를 들면, D27-c에서는, 2 계통의 시그날 강도는 0이고 심근률도 낮은 것으로부터 null형으로 생각된다. 또한, 시그날 강도가 10~20 정도인 4 계통에 대해서는 심근률도 중(中)정도인 것으로부터 헤테로형, 시그날 강도가 40~70 정도인 4 계통은 심근률이 모두 높은 것으로부터 호모형으로 판단하였다. 이와 같이, 싱글카피의 T1 계통에서는, 도입된 Dro1의 유전자형의 분리와 심근률에 양의 상관관계가 보였다.
3.2 Dro1 유전자 과잉 발현체의 심근률의 검토
예측 유전자는 RAP-DB에서 완전장 cDNA(AK068870)가 등록되어 있고, 닛폰바레의 FOX hunting system(Full-length cDNA Over-eXpressing gene hunting system)에서 T1 세대가 2 계통, T2 세대가 2 계통 존재하였다. FOX 계통에 사용된 완전장 cDNA의 서열(서열번호：16)은, 게놈의 염기서열로부터 결정된 cDNA 서열(서열번호：2)에 대해, 5'말단과 3'말단 서열이 각각 1 bp 부가되어 있었다. 또한, 본 cDNA 염기서열 베이스로 5'말단측으로부터 373 bp째(서열번호：2에 있어서의 5'말단측으로부터 372 bp째)의 A가 G로 염기 치환되어 있었다. 이 염기 치환에 의해, 서열번호：3에 있어서의 37번째의 아미노산이 리신에서 글루타민산으로 비동의 치환을 일으키고 있었다. 이들 4 계통에 대해서, 각 계통 5 개체의 심근률을 개량형 바스켓법으로 조사하였다. 그 결과, 대조인 닛폰바레(야생형) 10 개체의 심근률의 레진이 12.2%~23.5%였던 것에 반하여, FOX 계통은 8.1%~50.0%로 닛폰바레보다도 유의하게 심근률이 높은 개체가 존재하였다(도 4).
이들 시험의 결과로부터, 후보영역 6.0 kbp에 예측된 유전자가 Dro1 본체인 것이 명확해졌다. 또한, 상보시험의 결과로부터, Kinandang Patong형의 Dro1이 기능형으로 심근이 되고, IR64 Dro1은 기능이 상실되어 있거나, 저하되어 있음으로써 천근이 되는 것으로 생각되었다.
멀티카피의 2 계통(T1)에서 시그날 강도와 심근률의 관계를 조사한 바, D130-c에서는, 시그날 강도와 심근률에 양의 상관관계가 보였다(도 3). 그러나, D91-e는, 시그날 강도가 싱글카피의 호모형(10~350) 정도였던 4 개체에서는 시그날 강도와 심근률에 양의 상관관계가 보였으나, 시그날 강도가 강한 6 계통(500~2000)에서는 벡터 대조와 동일한 천근성을 나타내었다. Dro1이 멀티카피로 식물체에 도입됨으로써 유전자의 사일런싱(silencing)이 일어난 것이 추측되었다. 이 사실로부터, Dro1의 유전자 도입시에는 싱글카피를 선발하거나 하여 발현량의 조정이 필요하다고 생각된다.
〔실시예 4〕벼, 수수, 옥수수의 Dro1의 아미노산 서열의 상동성
NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)의 홈페이지의 blastn을 사용하여, Dro1의 아미노산 서열을 쿼리(query)로 한 Dro1의 유사 유전자의 검색을 행하였다. 그 결과, 상동성이 높은 유사한 유전자가 수수와 옥수수에서 각각 하나씩 발견되었다. 수수와 옥수수 모두, Dro1과 가장 유사한 ORF에는 유전자명이 없고, 수수는 SbDro1L1, 옥수수는 ZmDro1L1으로 명명하였다. 수수의 아미노산 서열은 NCBI의 홈페이지로부터 취득하였다. 옥수수의 아미노산 서열에 대해서는, MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)로부터 NCBI에서 취득한 mRNA 서열을 토대로 검색하여, 취득하였다. SbDro1L1의 CDS의 염기서열을 서열번호：12에, 아미노산 서열을 서열번호：13에 나타내었다. 또한 ZmDro1L1의 CDS의 염기서열을 서열번호：14에, 아미노산 서열을 서열번호：15에 나타내었다. Dro1에 대한 SbDro1L1의 상동성은 64%, ZmDro1L1의 상동성은 62%였다(도 5).
〔실시예 5〕포장 조건에 있어서의 Dro1의 심근성에 대한 효과
Dro1이 포장 조건하에 있어서, 심근화되어 있는지를 조사하였다. 포장 시험의 실험재료로서 사용한 준동질 유전자 계통(Dro1-NIL)은 이하와 같이 제작하였다. IR64/Kinandang Patong의 F1에 IR64를 4회 여교잡하고, 1회의 자식(自殖)을 행한 BC4F2 계통 중에서 제9 염색체 16.6~19.5 Mbp의 영역만이 호모형이 되어 있는 개체를 선발하였다. 이 계통의 자식 종자를 준동질 유전자 계통으로서 사용하였다. 밭 포장에 IR64와 Kinandang Patong, Dro1-NIL을 파종하고, 일반적인 육도의 비배(fertilization)관리를 행하였다. 관수는 특별히 행하지 않고, 빗물만으로 105일간 재배하였다. 로더셔벨(loading shovel)을 사용하여 식물체의 주원(株元) 근처의 토양을 깊이 약 1 m 판 후, 물 스프레이를 사용하여 그루터기로부터 5 ㎝ 정도의 단면을 세심하게 씻어내고, 뿌리가 어디까지 신장되어 있는지를 관찰하였다. 그 결과, IR64에서 약 20 ㎝, Kinandang Patong에서 약 80 ㎝, Dro1-NIL에서 약 40 ㎝의 토양심도까지 뿌리가 신장되어 있었다(도 6). Dro1-NIL의 뿌리의 길이는, IR64의 뿌리의 길이와 동일하였으나, Dro1-NIL은 IR64에 비해 약 2배나 깊게 뿌리가 신장되어 있었다. 이는, Dro1의 효과에 의해 뿌리의 신장각도가 커짐으로써, IR64의 뿌리의 길이와 거의 동일한 40 ㎝ 정도까지 뿌리가 깊게 신장한 것에 기인한다.
〔실시예 6〕내건성 검정상에 있어서의 Dro1의 내건성에 대한 효과
Dro1에 의한 심근화가 내건성 향상에 관여하고 있는지 조사하였다. 내건성 시험의 실험재료로서 IR64와 Dro1-NIL을 사용하였다. 내건성 시험에는 이바라키현 농업종합센터 생물공학연구소에서 사용되고 있는 내간성 검정(히라야마, 스가 농업연구센터 연구자료 제30호 벼 육종 매뉴얼. 152-155. 1995)의 시설과 동일한 것을, 당 연구소의 비닐 하우스에 설치하였다. 시설은, 관수구와 건조 스트레스구로 된다. 관수구의 검정상은, 나무 프레임을 사용하여 상토(床土)에 30 ㎝의 객토(客土)를 행하고 있다. 관수구는, 파종시부터 수확까지 벼에 건조 스트레스가 가해지지 않도록 단속적인 관수를 행하였다. 관수는, 재배기간 중 토양심도 25 ㎝에 설치한 텐션미터로 토양의 수분 포텐셜을 측정하여, 약 -0.015 MPa 이하가 되었을 때에 행하였다(도 7). 이 값은, 일반적으로 식물이 건조 스트레스의 영향을 받지 않는 상태이다. 건조 스트레스구의 검정상은, 땅 속으로부터의 모세관수를 차단하기 위해, 상토 위에 삼분(三分) 자갈을 두께 5 ㎝ 정도 깔고, 그 위에 25 ㎝의 객토를 행하였다. 이 처리에 의해, 관수를 정지하면 객토층에서는 서서히 토양의 수분 함량이 저하되어, 식물체는 건조 스트레스에 노출되게 된다. 건조 스트레스구는 파종 후 약 2개월째에 관수를 정지하고, 최초의 개체가 출수될 때까지 관수하지 않았다. 그 결과, 건조 스트레스구에서는, 관수 정지 후 10일째에서 토양심도 25 ㎝의 수분 포텐셜이 -0.07 MPa까지 저하되어, 건조 스트레스 조건하가 되었다(도 7). 한편, 토양심도 40 ㎝의 수분 포텐셜은 스트레스 처리기간을 통해 -0.03 MPa 전후로 안정하여 건조 조건하로는 되지 않았다. 건조 스트레스구에서는 관수 정지 후 35일째에 IR64는 엽권이 관찰되어 건조 스트레스의 영향을 받고 있는 것을 알 수 있었으나, Kinandang Patong형의 Dro1을 가진 IR64(Dro1-NIL)는 엽권이 보이지 않았다(도 8). 그 후, 스트레스구의 IR64는 엽권의 정도가 커지고, 49일째에는 식물체의 생육이 상당히 억제되어 있는 것을 알 수 있었다. 한편, IR64와 비교하여, Dro1-NIL은 49일째도 엽권의 정도는 작아, 개체의 생육상태는 양호하였다. 엽면 온도에 대해서는, 건조 스트레스구에서 관수 정지 후 35일째의 IR64에 비해 Dro1-NIL은 엽면 온도가 평균 0.7℃ 낮았다(도 9). 그 후에도, 모든 조사일에 있어서 Dro1-NIL의 엽면 온도는 IR64에 비해 낮은 것을 알 수 있었다. 또한, IR64와 Dro1-NIL에 대해 기공 컨덕턴스와 광합성 속도를 34일째와 41일째의 2회 측정한 바, 양 형질 모두 Dro1-NIL이 IR64와 비교하여 유의하게 값이 큰 것을 알 수 있었다(도 9). 건조 스트레스구에 있어서 최초의 개체가 출수된 후, 재관수를 행하여, 벼를 등숙(登熟)시켰다. 개체별로 수확하여, 각 개체의 간 길이(culm length), 이삭 길이, 지상부 건물(乾物) 무게, 이삭 수, 이삭 무게, 임실 수를 조사하였다. 그 결과, 간 길이와 이삭 길이에 대해서는 IR64와 Dro1-NIL 사이에 유의한 차는 보이지 않았다. 한편, 지상부 건물 무게, 이삭 수, 이삭 무게, 임실 수는 IR64와 Dro1-NIL 사이에 유의한 차가 보였다(도 10). 특히, 임실 수는 IR64와 비교하여 Dro1-NIL은 약 3.8배나 증가해 있었다. 이들 결과가, Dro1-NIL의 심근성에 의한 것인지를 확인하기 위해, 검정상을 해체하여, 뿌리가 자갈층을 관통하고 있는지 조사하였다. 그 결과, IR64는 자갈층을 관통할 수는 없었으나, Dro1-NIL은 자갈층을 관통하여, 아래의 토층에 뿌리가 신장되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 11). 이들 사실로부터, Dro1이 벼를 심근화함으로써 내건성을 획득하여, 광합성 능력이나 수량을 증가시키는 것이 명확해졌다.
또한 엽면 온도의 측정은, 대상물로부터 나와 있는 적외선 방사 에너지를 검출하고, 겉보기 온도로 변환하여, 온도 분포를 화상 표시하는 장치(적외선 서모그래피)를 사용하여 행하였다. 구체적으로는, 건조 스트레스 조건하의 벼 식물체에 대해, 일정 거리로부터 적외선 서모그래피를 사용하여 잎의 표면 온도를 촬영하였다. 다음으로, 전용 소프트웨어로 취입한 화상 중의 식물체의 평균적인 엽면 온도를 구하였다. 광합성 속도는, 잎을 둔 용기에 일정 농도의 이산화탄소를 포함한 공기를 통기하고, 용기로부터 나오는 공기의 이산화탄소 농도의 감소를 측정하여 어림잡았다. 기공 컨덕턴스는, 잎을 둔 용기로부터 나오는 공기의 수증기의 증가량을 측정하여 어림잡았다. 구체적으로는, 건조 스트레스 조건하의 벼 식물체에 대해, 완전 전개엽을 광합성 증산 측정 시스템의 챔버에 일정 시간 끼워둠으로써 계측값을 얻었다. 동일한 전개엽을 3회 계측하여, 평균값을 구하였다.
〔실시예 7〕밭 포장의 심한 가뭄하에 있어서의 Dro1의 내건성에 대한 효과
실시예 6에 있어서는, 내건성 검정상을 사용하여 Dro1의 내건성을 실증하였다. 다음으로, 밭의 자연 환경하에서의 심한 가뭄 스트레스에 대해, Dro1이 내건성을 나타내는지 조사하였다. 조사에는 IR64와 Dro1-NIL을 사용하여, 밭 포장에 있어서 시비구(N:P:K=12:12:9 kg/10a)와 무시비구 각각 3반복을 마련하였다. 1구획 3 m×3 m 내에, 그루터기 사이(株間) 15 ㎝, 이랑 사이(畝間) 30 ㎝로, 200 개체를 심었다. 이 중, IR64를 100 개체, Dro1-NIL을 100 개체, 각각 심었다. 재배기간 중 관수는 행하지 않았다. 이 때문에, 파종 후 90일째부터 1개월 이상 비가 내리지 않은 것으로 인해, 토양심도 40 ㎝에 있어서도 토양의 수분 포텐셜이 평균 -0.08 MPa 이하라는 엄격한 건조 스트레스 조건이 되었다(도 12). 건조 스트레스 조건하에 있어서, IR64는 양 처리구 모두 심한 엽권 현상이 관찰되었으나 Dro1-NIL은 거의 관찰되지 않았다(도 13). 특히, 무시비구에서는 Dro1-NIL은 엽권이 거의 관찰되지 않은 한편, IR64는 엽권이 관찰되고, 출수일도 Dro1-NIL에 비해 크게 지연되었다. 수확기에 쿼드라트법(quadrate method)에 의한 수량 조사를 행하였다. 조사한 5항목 중, 이삭 수(panicle number), 지상부 건물 무게(dry matter weight), 전체 낟알 무게(total grain weight), 임실 낟알 무게(filled grain weight)의 4항목에서 IR64보다 Dro1-NIL이 커다란 값을 나타내었다(표 1).
Figure pct00001
특히, 수량에 가장 관여하는 임실 뉘 무게(filled grain weight)는 무시비구에서 4.9배, 시비구에서 7.8배로 대폭의 증가가 보였다. 이 사실로부터, Dro1이 밭이라는 실제의 재배환경하에서, 또한, 가뭄 조건하에서, 내건성을 나타내는 것이 증명되었다.
〔실시예 8〕Dro1 유전자 내의 1염기 결실의 유무를 판별하는 마커
Dro1 유전자는, IR64의 서열에서 제4 엑손에 1 b의 결실이 존재하는 것으로부터, 이 결실을 판별하는 PCR 마커를 설계하였다. 설계한 마커는, Kinandang Patong의 DNA에서만 증폭하는 마커인 SNP02-KP(프라이머 5'-GTCTAGATCACGCAGTGAAT-3'(서열번호：8) 및 프라이머 5'-TCGCATGATGATGACCAAGT-3'(서열번호：9))와 IR64의 DNA에서만 증폭하는 마커인 SNP02-IR64(프라이머 5'-ATCGTCTAGATCACGCAGTGAAC-3'(서열번호：10) 및 프라이머 5'-AGGGTGGCTTTACCTCCGTA-3'(서열번호：11))의 2종류이다.
PCR의 반응액은, 1 반응 15 ㎕당, 0.2 μM 프라이머, 0.6 U Tag, 0.2 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, 20 ng DNA를 포함한다. PCR의 반응조건은, (1) 95℃ 2분, (2) 94℃ 30초, (3) 어닐링온도는 51.8℃~62.2℃의 범위에서 30초, (4) 72℃ 1분, (5) 7분에 걸쳐, SNP02-KP는 (2)~(4)의 반응을 25 사이클, SNP02-IR64는 (2)~(4)의 반응을 30 사이클 각각 행하였다. PCR 산물을 전기영동한 결과, SNP02-KP는 Kinandang Patong에서, SNP02-IR64는 IR64에서만 각각 증폭이 확인되었다(도 9).
본 발명에 의해 벼 등의 식물의 심근성을 제어하는 Dro1 유전자 및 그 유전자로 형질전환된 식물체가 제공되었다. Dro1 유전자의 조작에 의해 천근형의 식물을 심근화함으로써, 건조 회피능이 향상된 식물의 작출을 기대할 수 있다. 또는, Dro1 유전자의 조작에 의해 심근형의 식물을 천근화함으로써, 식물에 대한 내습성의 부여를 기대할 수 있다.
세계적으로는 가뭄에 의한 농작물의 감수(減收)가 심각하다. 또한 일본에서는, 논의 배수성이 나쁘기 때문에, 내습성이 없는 대두나 옥수수의 습해가 문제가 되고 있다. 본 발명은, 이러한 일본 국내외의 문제의 해결에 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL SCIENCES <120> Gene, Dro1, controlling deep root in plant and utilization thereof <130> MOA-A0904P <150> JP 2009-292524 <151> 2009-12-24 <160> 18 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 3058 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 agatgaagta tagcaagcta tcctacagcc agccacgctg caccgaaccc tccaatcctt 60 ggaacttgaa ccccttcaaa tcacacccag taggctacta gtagtacttc tctgcaccaa 120 ttccatcgcc aatagcagcc actacaagtc ttacatctct cctttcctcc tctctctgcc 180 attgctagga gcttgcattt cttggtagct tcatcagcta gctgctttct ccctccccaa 240 tctctcattc ttcaggccag gatatgaagg taaaggctca aaccatcggt gtgattaatc 300 atttcagaga ggttaataga tttgaagtgt tggtagtgtt gatccatttc ttgatggcat 360 catgaggctt gggttttctc tgcagatttt cagctgggta gccaacaaga tcagtgggaa 420 gcaagaagca aatcggtttc ccgcaaattc ttctgcgcct taccgtgagt gtacctgaac 480 tttcagtttc cttgtaaatt ctttcagaac taaggtgatt gttgttcacc aggcttcatg 540 ctgttcttat gaaatgtttc cctgttcctt gaggggagag ggagagtacg gacagtaatt 600 tggaagccgt 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caccgaaccc tccaatcctt 60 ggaacttgaa ccccttcaaa tcacacccag taggctacta gtagtacttc tctgcaccaa 120 ttccatcgcc aatagcagcc actacaagtc ttacatctct cctttcctcc tctctctgcc 180 attgctagga gcttgcattt cttggtagct tcatcagcta gctgctttct ccctccccaa 240 tctctcattc ttcaggccag gatatgaaga ttttcagctg ggtagccaac aagatcagtg 300 ggaagcaaga agcaaatcgg tttcccgcaa attcttctgc gccttaccgt gctaacgtgt 360 cagattgtcg aaaggatgaa ttcagtgatt ggccccaatc attgcttgct attgggacat 420 ttggaaataa gcagattgag gaggtagctc aggtggagaa ttcatccgac aatgtgcagt 480 cagtgcaaga taccgtcaaa tttacagagg aagaagtaga caagatacgg aaagaattcg 540 aaacgctact agcaatcaaa gatcaagcag aagctcaacg ctcgcatgat gatgaccaag 600 taggtttaca aaagcgtgcc gatggggaag acaatgagaa gcatattaga cagttgatca 660 acaaaaggat cattgtaagt aaatcaaaga attcgttagg aaagaaagga aatacactca 720 agccgagatc agtcgcttcg ttgctcaagt tattcatgtg taagggtggc tttacctccg 780 tagttccaga accaaggaac acatttcctc aatcaagaat ggagaagttg ctcaaggcaa 840 tattgcagaa gaaaatacac ccgcaaaatt cttccacgct agttgctaag aggcatttgg 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cgc agg gag caa ttg atg aac agg gag atg atc ata agc aaa gcg aga 432 Arg Arg Glu Gln Leu Met Asn Arg Glu Met Ile Ile Ser Lys Ala Arg 130 135 140 gaa cta gta ggg aag aaa aag agt gct aag ctc aag cca aga tcg atg 480 Glu Leu Val Gly Lys Lys Lys Ser Ala Lys Leu Lys Pro Arg Ser Met 145 150 155 160 gtt tcg ctc ctt aga tta ctc gcg tgc aag ggc ggt ttt acc acc ccg 528 Val Ser Leu Leu Arg Leu Leu Ala Cys Lys Gly Gly Phe Thr Thr Pro 165 170 175 gtt ctg gaa cca agg aac gct ttc ccc caa tca aga atg gag aag ctg 576 Val Leu Glu Pro Arg Asn Ala Phe Pro Gln Ser Arg Met Glu Lys Leu 180 185 190 ctc aag gca ata cta cag aag aaa ata cac cca cag aat tcc aac acg 624 Leu Lys Ala Ile Leu Gln Lys Lys Ile His Pro Gln Asn Ser Asn Thr 195 200 205 gta gca acc agg agg cac ttg gac tgg aag cta gac gag aaa gag atc 672 Val Ala Thr Arg Arg His Leu Asp Trp Lys Leu Asp Glu Lys Glu Ile 210 215 220 aac gaa tgt ctt gag gat gcg ctg cgt gat ctt gat gac gat gat gat 720 Asn Glu Cys Leu Glu Asp Ala Leu Arg Asp Leu Asp Asp Asp Asp Asp 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tgagccacta gtccagctgg actacagtac attatttatc tctcaagatt 2760 acataaaaag actactattg tacagagaat gcattgttta agtggtaaca actgctgtga 2820 taagttattc ctggtataca gaaaaatggc aggtgaaaac atcagggagt ggagtaagca 2880 tgggcagaca ttgtacttaa agagtgatag gccaatgaga atcactgggt gtttaaggat 2940 taaaaatttg tggtccatgc tctagacatc caatttatgc taatatgaac ttaggaccat 3000 atatttatgt ttgtttactg atcttgcggc ttaatcgagt tctaatgcgc aggtgctaac 3060 gtgtcagatt gtcgaaagga tgaattcagt gattggcccc aatcattgct tgctattggg 3120 acatttggaa ataagcagat tgaggaggta gctcaggtgg agaattcatc cgacaatgtg 3180 cagtcagtgc aagataccgt caaatttaca gaggaagaag tagacaagat acggaaagaa 3240 ttcgaaacgc tactagcaat caaagatcaa gcagaagctc aacgctcgca tgatgatgac 3300 caagtaggtt tacaaaagcg tgccgatggg gaagacaatg agaagcatat tagacagttg 3360 atcaacaaaa ggatcattgt aagtaaatca aagaattcgt taggaaagaa aggaaataca 3420 ctcaagccga gatcagtcgc ttcgttgctc aagttattca tgtgtaaggg tggctttacc 3480 tccgtagttc cagaaccaag gaacacattt cctcaatcaa gaatggagaa ggtacacagt 3540 gaaattcttt ttttcttatg taacatgata agttttacat actttctcgt cctcttatta 3600 tcttatatga tgttcattgc agttgctcaa ggcaatattg cagaagaaaa tacacccgca 3660 aaattcttcc acgctagttg ctaagaggca tttggactgg aagccagatg agacagaaat 3720 caatgagtgc ctggaggatg cactgcgtga tctagacgat gatggtgcaa aatgggtcaa 3780 aactgattca gagtgtaagt agcatacttg cctatcatga attgaacctt ttcttttgcc 3840 acttttgtca atggagcaac tgactgaata tgaacttttc ttgtttccag atattgtgct 3900 tgaaatgtaa agttgggtga atatgttagt tcgttcatgc caggtatata cctttctttg 3960 atccccaaat tttcaactca actcaaatgt gaattatcct tgatctagca tgtctctctg 4020 ttttgatctg attagtgtga ttccaatctg caggttccaa aggtcctggc aagcttgggg 4080 tttatggtgt tactacgtaa tgatataaat atgggatata gttagcaatg aagctctatg 4140 atcatgtaat gctcctccat tatttctgac atgaaccatc tgtaatttga atcatgataa 4200 ggaggttctg ggacaaaggc ctattccatg tgtctactct cttctgccct gaaactgtaa 4260 agaacgcatt caattttttc aac 4283 <210> 18 <211> 4313 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 18 gcagatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 60 atatatagca ctatcatgtc atgttagctt gttggtccag gtgcatccac ggtctagtac 120 cattattgcg tagttaatgg acggaatagc tgctagtgga gatgggggtg tacttcagca 180 gttaaccccc agaaacgtga ttagcatcgg tgcaggcgcc cctcgtgctg gttaaccaag 240 gcgggcgccc cgtacttacc cgcgctaatg ccgggtttaa ggaagttaac acgtgattct 300 ggcacacgcg tcgggcccga ccaagtgcga tgggatccgt tgcggcgcgg tcgtgacact 360 tggtgcccca acttgccgtc gatctcgccg cgctgtactt tatcttagct aataactctt 420 cttctccccc tggaaaaaaa aattaacaac cgggtttctt cctttgaggc attgattttt 480 ggatactctc tcgctggctg cagtgcaagc gaaccagtgc acggtattca aacagtctgc 540 aatacctggg taaatctgag tcctttgatt ttgatctggc gaacataata tgactgttta 600 aaactacagt caccctactt attgcagctg aaccgtcaaa ttatagcttc ttctagggat 660 ggattgggaa ttttcttaca tgttgagttt ttgaacacct gactagacga tctcacgata 720 tactaccttc gtcctaaaat atagtaattt ttagctatga atttggacac acaaaaattg 780 ctatattttg ggacagagag agtagtcaga tagttttatc attcttaaga aggtatatcg 840 agatgatggt tttttatcgt aaaacttaat atctctagta ggtgtctcga aatatcgtac 900 aagtcctgca tgtactttct taagtaccat aaacttctct acaatttaag tagggtagaa 960 gcacccccgt tgaggtgtag ctaccacaat tttgggttcc tcaaaagtgt gaggtcgatc 1020 acaagtttac actatctata tctagaaaca tcaattcaat atttacaatc cgtatggcgc 1080 atatgggcgt acggtagctg gagttgcaaa taccgaattt tctcttccga agaaagtgca 1140 aattccattg tttatatata tagctgtgtc ctgttatcat tccatggctc acctgttgag 1200 ctggtaaccc ggtttggagt catctataaa aggaaggtaa aggaagtgac atgccagatg 1260 aagtatagca agctatccta cagccagcca cgctgcaccg aaccctccaa tccttggaac 1320 ttgaacccct tcaaatcaca cccagtaggc tactagtagt acttctctgc accaattcca 1380 tcgccaatag cagccactac aagtcttaca tctctccttt cctcctctct ctgccattgc 1440 taggagcttg catttcttgg tagcttcatc agctagctgc tttctccctc cccaatctct 1500 cattcttcag gccaggatat gaaggtaaag gctcaaacca tcggtgtgat taatcatttc 1560 agagaggtta atagatttga agtgttggta gtgttgatcc atttcttgat ggcatcatga 1620 ggcttgggtt ttctctgcag attttcagct gggtagccaa caagatcagt gggaagcaag 1680 aagcaaatcg gtttcccgca aattcttctg cgccttaccg tgagtgtacc tgaactttca 1740 gtttccttgt aaattctttc agaactaagg tgattgttgt tcaccaggct tcatgctgtt 1800 cttatgaaat gtttccctgt tccttgaggg gagagggaga gtacggacag taatttggaa 1860 gccgtttcct aatttgatat tttctttctg tcattctgct gcagttataa tgtctttacc 1920 tcttagcagt ttctgcttag gcatcatttg ccttattcat ttctggatac gatgatactt 1980 tattgctttg tcctaattta atcttttcct gctgtcattc tgctccattt atggtgtctt 2040 tacctcttag cagtttccgc ttaggcatca tttgccatgt tcatttctga atatgctgat 2100 atactttgtt gtcttggtag ccatatacaa gagtgaacga tttaaaggtt tctcctaatt 2160 gctagtaaca gaacgctttt cgctctgcga ttttctggat taccatcccc tgattcctga 2220 gtaacctatc acaacgccaa tgtgatggag caaacattga tgtattatga caatgttgtt 2280 tctgatcctt tgagaaaatt ttcttatatg cacttgggtg ttgtttggaa cgcaggaatt 2340 tcactggaaa cagttcaatt atcgcacttc cggaaaaaaa attcctgcat tttaaacggc 2400 gctttaagtt cagtaggagt tttcaatttt attttcctct tccctagcac gaaaagtgag 2460 agatttttgt gcatatgtta tacccccaaa ggactatttc atggcctgat gcccgccacg 2520 ccaatatctc tgtaaagcac tgcttccaac tagtcagtat gggtcaaagt cttgactaag 2580 tgcaaccctg caagcaagtg tttccaacta gtcagtatgg cttcaattat ttagttgatt 2640 tataacccca accctccact tgtgaccaag aagaatttga tttgagcaga caatatcctg 2700 acctcggatg gtttcgtaaa tcgtactaag gaatcagatc tgagccacta gtccagctgg 2760 actacagtac attatttatc tctcaagatt acataaaaag actactattg tacagagaat 2820 gcattgttta agtggtaaca actgctgtga taagttattc ctggtataca gaaaaatggc 2880 aggtgaaaac atcagggagt ggagtaagca tgggcagaca ttgtacttaa agagtgatag 2940 gccaatgaga atcactgggt gtttaaggat taaaaatttg tggtccatgc tctagacatc 3000 caatttatgc taatatgaac ttaggaccat atatttatgt ttgtttactg atcttgcggc 3060 ttaatcgagt tctaatgcgc aggtgctaac gtgtcagatt gtcgaaagga tgaattcagt 3120 gattggcccc aatcattgct tgctattggg acatttggaa ataagcagat tgaggaggta 3180 gctcaggtgg agaattcatc cgacaatgtg cagtcagtgc aagataccgt caaatttaca 3240 gaggaagaag tagacaagat acggaaagaa ttcgaaacgc tactagcaat caaagatcaa 3300 gcagaagctc aacgctcgca tgatgatgac caagtaggtt tacaaaagcg tgccgatggg 3360 gaagacaatg agaagcatat tagacagttg atcaacaaaa ggatcattgt aagtaaatca 3420 aagaattcgt taggaaagaa aggaaataca ctcaagccga gatcagtcgc ttcgttgctc 3480 aagttattca tgtgtaaggg tggctttacc tccgtagttc cagaaccaag gaacacattt 3540 cctcaatcaa gaatggagaa ggtacacagt gaaattcttt ttttcttatg taacatgata 3600 agttttacat actttctcgt cctcttatta tcttatatga tgttcattgc agttgctcaa 3660 ggcaatattg cagaagaaaa tacacccgca aaattcttcc acgctagttg ctaagaggca 3720 tttggactgg aagccagatg agacagaaat caatgagtgc ctggaggatg cactgcgtga 3780 tctagacgat gatggtgcaa aatgggtcaa aactgattca gagtgtaagt agcatacttg 3840 cctatcatga attgaacctt ttcttttgcc acttttgtca atggagcaac tgactgaata 3900 tgaacttttc ttgtttccag atattgtgct tgaaatgtaa agttgggtga atatgttagt 3960 tcgttcatgc caggtatata cctttctttg atccccaaat tttcaactca actcaaatgt 4020 gaattatcct tgatctagca tgtctctctg ttttgatctg attagtgtga ttccaatctg 4080 caggttccaa aggtcctggc aagcttgggg tttatggtgt tactacgtaa tgatataaat 4140 atgggatata gttagcaatg aagctctatg atcatgtaat gctcctccat tatttctgac 4200 atgaaccatc tgtaatttga atcatgataa ggaggttctg ggacaaaggc ctattccatg 4260 tgtctactct cttctgccct gaaactgtaa agaacgcatt caattttttc aac 4313

Claims (29)

  1. 이하 (a)~(e) 중 어느 하나에 기재된 DNA；
    (a) 서열번호：1에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA,
    (b) 서열번호：1, 2, 12, 14, 16 또는 17 중 어느 하나에 기재된 염기서열의 코드영역을 포함하는 DNA,
    (c) 서열번호：3, 13 또는 15 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA,
    (d) 서열번호：1, 2, 12, 14, 16 또는 17 중 어느 하나에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA로서, 식물에 심근성(deep rooting)의 형질을 부여하는 활성을 갖는 DNA, 및
    (e) 서열번호：3, 13 또는 15 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA로서, 식물에 심근성의 형질을 부여하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
  2. 제1항에 있어서,
    식물이 단자엽 식물인 DNA.
  3. 제2항에 있어서,
    단자엽 식물이 벼과 식물인 DNA.
  4. 제3항에 있어서,
    벼과 식물이 벼, 맥류(소맥, 대맥, 호밀, 귀리, 율무), 옥수수, 기장, 조, 피, 수수, 핑거 밀렛, 펄 밀렛, 테프, 사탕수수, 티모시, 켄터키 블루그래스, 오차드그래스, 이탈리안 라이그래스, 퍼레니얼 라이그래스, 톨 훼스큐, 바이아그래스로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA.
  5. 제3항에 있어서,
    벼과 식물이 벼, 수수 및 옥수수로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 DNA를 포함하는 벡터.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 DNA를 발현 가능하게 보유하는 형질전환 세포.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 DNA로 형질전환된 식물체로서, 심근성의 형질을 갖는 형질전환 식물체.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 또는 제6항에 기재된 벡터를 식물세포에 도입함으로써 제조되는 형질전환 식물체로서, 심근성의 형질을 갖는 형질전환 식물체.
  10. 이하 (a)~(d)의 공정에 의해 얻어지는 형질전환 식물체로서, 심근성의 형질을 갖는 형질전환 식물체；
    (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 또는 제6항에 기재된 벡터를 식물세포에 도입하는 공정,
    (b) 공정(a)의 식물세포에 있어서의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 DNA의 카피 수를 측정하는 공정,
    (c) 도입된 DNA 또는 벡터의 카피 수가 1인 형질전환 식물세포를 선택하는 공정, 및
    (d) 공정(c)에서 선택된 형질전환 식물세포로부터 식물체를 재생시키는 공정.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    식물이 단자엽 식물인 식물체.
  12. 제11항에 있어서,
    단자엽 식물이 벼과 식물인 식물체.
  13. 제12항에 있어서,
    벼과 식물이 벼, 맥류(소맥, 대맥, 호밀, 귀리, 율무), 옥수수, 기장, 조, 피, 수수, 핑거 밀렛, 펄 밀렛, 테프, 사탕수수, 티모시, 켄터키 블루그래스, 오차드그래스, 이탈리안 라이그래스, 퍼레니얼 라이그래스, 톨 훼스큐, 바이아그래스로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물체.
  14. 제12항에 있어서,
    벼과 식물이 벼, 수수 및 옥수수로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물체.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환 식물체의 자손 또는 클론인 형질전환 식물체.
  16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환 식물체로부터 단리된 세포.
  17. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환 식물체의 번식재료.
  18. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환 식물체로부터 단리된 기관.
  19. 제16항에 기재된 세포, 제17항에 기재된 번식재료, 및 제18항에 기재된 기관 중 하나 이상으로부터 얻어지는 가공식품.
  20. 제8항, 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환 식물체의 제조방법으로서, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 또는 제6항에 기재된 벡터를 식물세포에 도입하고, 그 식물세포로부터 식물체를 재생시키는 공정을 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 DNA의 카피 수가 1인 형질전환 식물세포 또는 형질전환 식물체를 선택하는 공정을 추가로 포함하는 방법.
  22. 이하 (a)~(c)의 공정을 포함하는 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 분자량 또는 염기서열이 일치할 때, 피검식물이 심근성의 형질을 갖는 것으로 판정하는 방법；
    (a) 피검식물로부터 DNA 시료를 조제하는 공정,
    (b) 그 DNA 시료로부터 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 DNA를 포함하는 영역을 증폭하는 공정, 및
    (c) 증폭된 DNA 단편의 분자량 또는 염기서열을, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 DNA의 그것과 비교하는 공정.
  23. 피검식물로부터 조제한 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호：8에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：9에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 PCR을 행하는 공정을 포함하는, 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 증폭산물이 얻어진 경우, 피검식물이 심근성의 형질을 갖는 것으로 판정되는 방법.
  24. 피검식물로부터 조제한 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호：10에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호：11에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 PCR을 행하는 공정을 포함하는, 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 방법으로서, 증폭산물이 얻어진 경우, 피검식물이 심근성의 형질을 갖지 않는 것으로 판정되는 방법.
  25. 이하의 (a) 및 (b)에 기재된 공정을 포함하는 심근성의 형질을 갖는 식물을 선발하는 방법；
    (a) 심근성의 형질을 갖는 식물과 임의의 식물이 교배된 품종을 제작하는 공정, 및
    (b) 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해, 공정(a)에서 얻어진 식물이 심근성의 형질을 갖는지 여부를 판정하는 공정.
  26. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 DNA에 의해 코드되는 단백질.
  27. 제26항에 기재된 단백질에 결합하는 항체.
  28. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 또는 그의 상보서열에 상보적인 15 이상의 연속하는 염기를 포함하는 DNA.
  29. 서열번호：4 내지 11 중 어느 하나에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA.
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