CN115011629A

CN115011629A - 基因编辑技术打靶OsCSN5基因提高水稻抗盐碱性的方法

Info

Publication number: CN115011629A
Application number: CN202210660630.6A
Authority: CN
Inventors: 郭立泉; 李蕙; 岳伟杰; 马传福
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2022-06-12
Filing date: 2022-06-12
Publication date: 2022-09-06

Abstract

本发明涉及一种基因编辑技术打靶OsCSN5基因提高水稻抗盐碱性的方法，属于基因编辑技术领域。拟改良水稻品种基因的序列分析确定基因突变类型，选择起始密码子前一个基因序列的位置进行基因编辑靶点设计，构建打靶载体，将拟改良水稻品种的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法将打靶载体导入愈伤组织细胞，并移送到含有盐碱土的实验基地，考察抗盐碱的能力变化。本发明快速地获得不同突变类型的OsCSN5突变体，并从中筛选出能提高水稻抗盐碱的弱突变体材料为水稻抗盐碱改良提供丰富的种质资源，该系统成本低廉，操作方便，效率高。

Description

基因编辑技术打靶OsCSN5基因提高水稻抗盐碱性的方法

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术创制OsCSN5基因突变体来提高水稻抗盐碱的方法。

背景技术

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，利用CRISPR-Cas9技术构建重组双元载体，开展转基因植物构建和目的基因的生物学研究，已经越来越成为反向遗传学研究未知基因功能的有效工具。CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法。 CRISPR-Cas9技术凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR-Cas9技术迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手，是继锌指核酸内切酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)之后出现的第三代基因组定点编辑技术。

水稻属于禾本科，稻属，普通栽培稻种是一种常见的谷类作物，其种子经加工后的稻米通常被用作人类的粮食。水稻生产受到越来越多不利因素的限制，诸如病虫害、环境污染和气候变化等逆境的胁迫等因素严重制约了水稻的高产和稳产。要解决这些问题，就必须进行水稻育种和品种改良。

发明内容

本发明提供一种基因编辑技术打靶OsCSN5基因提高水稻抗盐碱性的方法，以基因编辑技术创制基因弱突变体来改良水稻抽穗，适应于所有含有功能型OsCSN5基因的水稻品种，最终获得优质水稻品种，扩大种植面积。

本发明采取的技术方案是，包括下列步骤:

(1)拟改良水稻品种OsCSN5基因的序列分析确定基因突变类型，选择起始密码子前一个基因序列的位置进行基因编辑靶点设计；

(2)构建打靶载体,将拟改良水稻品种的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法将打靶载体导入愈伤组织细胞，并移送到含有盐碱土的实验基地；

(3)对转基因植株的基因型检测及选取移码突变的基因型进行表型考察，考察抗盐碱的能力变化。

1.水稻中OsCSN5基因的检测。

2.水稻中基因敲除表达载体的构建。

3.将吉粳稻88的愈伤组织作为遗传转化的受体材料,鉴定转基因OsCSN5植株基因编辑情况,获得不同突变类型的等位基因,并筛选功能发送改变的弱突变基因型,最终获得抽穗期改良品系。

所述OsCSN5基因编码的蛋白为:

由SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

所述OsCSN5基因编码的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述水稻OsCSN5基因的表达是通过对水稻中OsCSN5基因进行基因编辑实现的。

所述基因编辑是借助CRISPR/Cas9系统实现的。

所述打靶载体的gRNA靶标序列如SEQ ID No.3所述。

所述编辑的OsCSN5基因蛋白功能正常,所编辑的基因没有发生严重突变。

本发明在创制水稻抗盐碱种制资源中的应用。

本发明利用Cas9基因组编辑技术对水稻OsCSN5第一外显子进行定点编辑,利用其定向打靶功能来实现弱突变体的获得，快速地获得不同突变类型的OsCSN5突变体, 并从中筛选出能提高水稻抗盐碱的弱突变体材料,成功获得具有抗盐碱的水稻，为水稻抗盐碱改良提供丰富的种质资源，为培育抗盐碱水稻新种质的创制及优势水稻的育种实践提供了一种高效的可操作方式，该系统成本低廉，操作方便，效率高。

本发明通过模拟东北地区碱地环境中苏打土的特点，对水稻CSN5突变体进行了抗碱性分析。实验结果表明水稻CSN5突变体在碱性盐胁迫下在相对生长率、含水量和叶绿素含量这些生理指标均优于野生型水稻。水稻CSN5突变体的是一种耐碱性作物，同时揭示了碱胁迫对野生型水稻叶绿素的破坏是导致其生长受阻的一个重要原因。

附图说明

图1是水稻OsCSN5基因的序列分析及基因编辑靶点设计图；

图2是吉粳88材料野生型和突变体植株在东北地区的表型考察图。

具体实施方式

实施例1：水稻OsCSN5基因的序列分析及基因编辑靶点设计

水稻OsCSN5基因的序列分析显示,该基因含有三个外显子，本发明所设靶点均在第一外显子上，如图1所示。

实施例2：打靶载体构建及水稻遗传转化

本实验采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，所使用的载体为pP1C.3，设计23bp gRNA由引物合成公司合成后，进行片段扩增，获得sgRNA克隆框。使用DNA重组酶将上述载体和扩增片段构建重组载体，其中，gRNA序列如SEQ ID No.3所示。

本发明中,将所述载体pCAMBIA1305.1，转化粳稻的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法实现遗传转化,并经抗性愈伤的筛选、分化和生根创制新的水稻品种，以转基因植株为例进行介绍,具体步骤如下：

1.以水稻成熟胚为试材，将其脱壳并消毒之后，置于诱导培养基(含8ml 2,4-D)中，28℃光照培养箱培养，粳稻诱导培养3～4周，然后用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织(淡黄色，致密呈球状)，置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养7d，继代三次之后自然分散、颜色鲜黄、直径约为2～3mm的颗粒状愈伤可用于农杆菌转化；

2.在发根农杆菌培养基(含25μg/mL利福平)上，划线培养，取活化平板上的单克隆菌落于28℃暗培养两天,用AAM(含200μmol/L As)培养基洗菌及重悬菌体,调整菌液OD600达到约0.5左右，静置1h，得到农杆菌悬浮液；

3.将步骤1得到的愈伤组织后浸泡于步骤2的农杆菌悬浮液中，静置30～40min 后于无菌滤纸上晾干愈伤，并接种于共培养基(含As 200mmol/L),25℃暗培养3d；

4.将愈伤组织取出，用无菌水清洗5～6次，其间需不停的振荡。再用含300mg/L 羧苄青霉素钠(Carb)的无菌水清洗2遍，每次在水平摇床上摇晃30min。最后置于无菌滤纸上沥干2h；将晾干的愈伤转入含300mg/L羧苄青霉素钠(Carb)的筛选培养基上进行第一轮选择，28℃，光照培养14天。将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含300mg/L Carb的筛选培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出(约14天)；

5.将步骤4获得的愈伤组织3～7颗转移至装有分化培养基的分化罐中，1罐1个株系为佳，放入25℃恒温培养室中，等待分化成苗，20～50天，待苗长至顶到分化罐盖子时，再将生根的植株用无菌的剪刀去掉根，小心不要伤了根茎结合部，放入生根培养基中生根壮苗，7天之后，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水，防止培养长菌，炼苗3天左右至苗挺立，然后洗去琼脂，溶液培养7～14天，移栽到含有盐碱土的实验基地。

实施例3OsCSN5基因突变体的获得和弱突变体的筛选

提取突变体植株基因组DNA，用引物CSN5-JD-F CTATTTCTTTGCCCTCGGAC 和CSN5-JD-R TTTCGGCTCC AACAATGTCC PCR扩增上述鉴定的突变体植株基因组 DNA，获得带有靶序列的OsCSN5基因片段，送至公司测序。对测序结果进行分析，获得多少个OsCSN5基因发生编辑的克隆。进一步观察上述突变体植株的表型，结果如图2显示，在盐碱土里的转基因植株的抗盐碱能力更强。

本发明中利用系统基因编辑技术获得OsCSN5基因突变体，与其它技术相比，操作过程简单方便、快捷且高效，是一种快速获得突变体的分子育种方法。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的使用范围不仅局限于此，任何熟悉此项技术的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构想加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 吉林农业大学

<120> 一种基因编辑技术打靶OsCSN5基因提高水稻抗盐碱性的方法

<130> jauguolq202201

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1541

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 1

gagagatccc cgaaatcaaa cccctcctct tctcttcccc ttcctcctgc gttctagggt 60

tttgcctccc agcggcgact cggcgagcga gaccaccggc aagctcgtcg gcgatggagc 120

ccacctcgtc ggcggcgatg gcgaggcaga cgtgggagct ggagaacaac atcccggcgg 180

cggcctccga cccggacgcc ctggacgcga tctaccgcta cgacgaggcg gcgcaggcgc 240

gggtgcagca ggagaagccc tgggcgaacg acccccaccc cttccgccgc gccaagatct 300

ccgccctcgc gctcctcaag atggtcgtcc acgcccgcgc cggcggcact atcgaggtca 360

tgggcctcat gcagggcaag tgcgagggcg acgccatcgt cgtcatggac gccttcgcgc 420

tccccgtcga gggcaccgag accagggtca acgcccaggc cgacgcctac gagtatatgg 480

tcgagtactc caccatcaac aagcaggctg gaaggttgga gaatgtggtt ggctggtatc 540

actcacaccc tggttatgga tgctggttat caggcattga tgtgtctact cagatgctta 600

atcagcaatt tcaagagcca ttcttggctg ttgtgataga ccctacaagg actgtttctg 660

ctggtaaagt ggaaattgga gcttttagga catatccaaa agattacaag ccaccagatg 720

aacctgtgtc agagtatcag acgataccac tcaacaagat agaagatttt ggtgtccact 780

gcaaacagta ctatgctctg gatataactt atttcaaatc atccctggat tctcatctcc 840

ttgatctact ttggaataag tactgggtca atacgttatc ttcatcacct ctcctgggca 900

acagggatta tgttgctggc cagatatttg atttagctga taaactagag caagctgagg 960

gtcaactggc acacagtcga tatggcatgc ttatgccatc gcaacgaaag aaagagcaag 1020

aggagtctcc actggctaag gtaactcggg atagctcaaa aattactgct gaacaggtcc 1080

atggtctcat gtcacaggtc attaaggata tcctcttcaa ctctgtgcac ccgtcaaaca 1140

aggcaagcac aagcgcacca gattcatccg ggcctgagcc tatggttgaa gcatgagtgt 1200

tctacagaat tccttcatta gttagccttt tgttgatgct ggattcacat acactgggtg 1260

cctagttgtt tcatgactaa aagctgtgtc cagcataact acccgattca aaatgcgtta 1320

gctgcgtttt atcgtcaaat cataactgat atgtaattat gagttgcctt ctgaatcttt 1380

cggctgccat tgtgaaggtg cgtggtctac gttaagataa ccaattacct tggcccaact 1440

taccatgttc tctcaacaat gaatggtccc aacgtcgcta ggcacagtgt atgttgattt 1500

ggatgatctt tctggtattt atcctccgat tttggtttct a 1541

<210> 2

<211> 360

<212> PRT

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 2

Met Glu Pro Thr Ser Ser Ala Ala Met Ala Arg Gln Thr Trp Glu Leu

1 5 10 15

Glu Asn Asn Ile Pro Ala Ala Ala Ser Asp Pro Asp Ala Leu Asp Ala

20 25 30

Ile Tyr Arg Tyr Asp Glu Ala Ala Gln Ala Arg Val Gln Gln Glu Lys

35 40 45

Pro Trp Ala Asn Asp Pro His Pro Phe Arg Arg Ala Lys Ile Ser Ala

50 55 60

Leu Ala Leu Leu Lys Met Val Val His Ala Arg Ala Gly Gly Thr Ile

65 70 75 80

Glu Val Met Gly Leu Met Gln Gly Lys Cys Glu Gly Asp Ala Ile Val

85 90 95

Val Met Asp Ala Phe Ala Leu Pro Val Glu Gly Thr Glu Thr Arg Val

100 105 110

Asn Ala Gln Ala Asp Ala Tyr Glu Tyr Met Val Glu Tyr Ser Thr Ile

115 120 125

Asn Lys Gln Ala Gly Arg Leu Glu Asn Val Val Gly Trp Tyr His Ser

130 135 140

His Pro Gly Tyr Gly Cys Trp Leu Ser Gly Ile Asp Val Ser Thr Gln

145 150 155 160

Met Leu Asn Gln Gln Phe Gln Glu Pro Phe Leu Ala Val Val Ile Asp

165 170 175

Pro Thr Arg Thr Val Ser Ala Gly Lys Val Glu Ile Gly Ala Phe Arg

180 185 190

Thr Tyr Pro Lys Asp Tyr Lys Pro Pro Asp Glu Pro Val Ser Glu Tyr

195 200 205

Gln Thr Ile Pro Leu Asn Lys Ile Glu Asp Phe Gly Val His Cys Lys

210 215 220

Gln Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Thr Tyr Phe Lys Ser Ser Leu Asp Ser

225 230 235 240

His Leu Leu Asp Leu Leu Trp Asn Lys Tyr Trp Val Asn Thr Leu Ser

245 250 255

Ser Ser Pro Leu Leu Gly Asn Arg Asp Tyr Val Ala Gly Gln Ile Phe

260 265 270

Asp Leu Ala Asp Lys Leu Glu Gln Ala Glu Gly Gln Leu Ala His Ser

275 280 285

Arg Tyr Gly Met Leu Met Pro Ser Gln Arg Lys Lys Glu Gln Glu Glu

290 295 300

Ser Pro Leu Ala Lys Val Thr Arg Asp Ser Ser Lys Ile Thr Ala Glu

305 310 315 320

Gln Val His Gly Leu Met Ser Gln Val Ile Lys Asp Ile Leu Phe Asn

325 330 335

Ser Val His Pro Ser Asn Lys Ala Ser Thr Ser Ala Pro Asp Ser Ser

340 345 350

Gly Pro Glu Pro Met Val Glu Ala

355 360

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 3

cgcgatctac cgctacgacg agg 23

Claims

1.基因编辑技术打靶OsCSN5基因提高水稻抗盐碱性的方法，其特征在于，包括下列步骤：

2.根据权利要求1所述的基因编辑技术打靶OsCSN5基因提高水稻抗盐碱性的方法，其特征在于，所述OsCSN5基因编码的蛋白为：

由SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.根据权利要求1所述的基因编辑技术打靶OsCSN5基因提高水稻抗盐碱性的方法，其特征在于，所述OsCSN5基因编码的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.根据权利要求1所述的基因编辑技术打靶OsCSN5基因提高水稻抗盐碱性的方法，其特征在于，所述水稻OsCSN5基因的表达是通过对水稻中OsCSN5基因进行基因编辑实现的。

5.根据权利要求1所述的基因编辑技术打靶OsCSN5基因提高水稻抗盐碱性的方法，其特征在于，所述基因编辑是借助CRISPR/Cas9系统实现的。

6.根据权利要求1所述的基因编辑技术打靶OsCSN5基因提高水稻抗盐碱性的方法，其特征在于，所述打靶载体的gRNA靶标序列如SEQ ID No.3所述。

7.根据权利要求1所述的基因编辑技术打靶OsCSN5基因提高水稻抗盐碱性的方法，其特征在于，所述编辑的OsCSN5基因蛋白功能正常,所编辑的基因没有发生严重突变。

8.如权利要求1所述的基因编辑技术打靶OsCSN5基因提高水稻抗盐碱性的方法，在创制水稻抗盐碱种制资源中的应用。