CN108707592B - Clals蛋白、其编码基因及它们在预测西瓜除草剂抗性中的应用 - Google Patents

Clals蛋白、其编码基因及它们在预测西瓜除草剂抗性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CLALS蛋白、其编码基因及它们在预测西瓜除草剂抗性中的应用。“CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为非脯氨酸残基”的待测西瓜或“CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类为非脯氨酸残基和脯氨酸残基”的待测西瓜的除草剂抗性强于“CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为脯氨酸残基”的待测西瓜。实验证明，CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类可以作为检测对象，预测待测西瓜除草剂抗性。本发明具有重大的应用价值。

Description

CLALS蛋白、其编码基因及它们在预测西瓜除草剂抗性中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及CLALS蛋白、其编码基因及它们在预测西瓜除草剂抗性中的应用。
背景技术
西瓜田杂草是限制西瓜产量、品质及成本效益的重要因素之一。西瓜由于种植密度低，在其茎蔓展开前，田间裸露地表的面积大，加之西瓜生长环境较为湿热，易于杂草发生，因此相较于其它作物，西瓜的草害尤为严重。西瓜田人工除草费事费力又操作不便，施用化学除草剂常因选择不当、施用剂量不当等原因对西瓜造成药害，导致西瓜减产减收，因杂草造成西瓜减产约20％，占田间人工操作的成本30％以上。因此西瓜田除草成本及安全问题已成为影响西瓜产业发展的重要问题。培育具有除草剂抗性的的西瓜品种，使其在种植期间使用1-2次除草剂杀死杂草，但不影响西瓜本身的生长，不仅可以解决困扰西瓜生产的草害，而且符合西瓜简约化生产的要求。
乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)是植物和微生物支链氨基酸合成中的一个关键酶。ALS抑制剂类除草剂通过抑制植物体内ALS的活性，从而阻止支链氨基酸的合成，进而影响蛋白质合成及植株生长，最后造成植物死亡。ALS抑制剂类除草剂具有活性高、选择性强、杀草谱广、毒性低等优点，成为20世纪90年代商品化除草剂最活跃的一类。
2016年4月，Komor等人采用Cas9变体、胞嘧啶脱氨酶(cytidine deaminase，CD)和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI)相融合的办法，在大鼠体内实现了高效的单碱基定点突变。依据相同原理，利用Cas9变体(nCas9-D10A)融合大鼠胞嘧啶脱氨酶(rAPOBEC1)和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)，构建的高效的植物单碱基编辑系统nCas9-PBE已在水稻、小麦、玉米、拟南芥等作物实现了目标基因的单碱基定点突变。nCas9-PBE可将靶位点DNA的C替换为T，C碱基脱氨化的窗口覆盖靶序列的7个核苷酸(距离PAM远端的第3-9位)，该技术无需在基因组的靶位点产生DNA双链断裂(DSB)，也无需供体DNA的参与，具有简单、广适、高效的特点。nCas9-PBE单碱基编辑系统成功建立和应用，为高效和大规模创制单碱基突变体提供了一个可靠方案，为作物遗传改良和新品种培育提供了重要技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于培育具有除草剂抗性的的西瓜品种。
本发明首先保护CLALS蛋白，CLALS蛋白可为如下W1)或W2)：
W1)自N端至C端依次可包括区段Ⅰ、区段Ⅱ和区段Ⅲ；
所述区段Ⅱ可为一个氨基酸残基；
所述区段Ⅰ可为如下a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2自N末端起第1至189位所示的多肽；
a2)将a1)所示的多肽经过一个或几个氨基酸残基的替换得到的与除草剂抗性相关的多肽；
a3)与a1)或a2)所示的多肽具有80％或80％以上同一性，来源于西瓜且与除草剂抗性相关的多肽；
所述区段Ⅲ可为如下b1)或b2)或b3)：
b1)氨基酸序列是序列表中序列2自N末端起第191至662位所示的多肽；
b2)将b1)所示的多肽经过一个或几个氨基酸残基的替换得到的与除草剂抗性相关的多肽；
b3)与b1)或b2)所示的多肽具有80％或80％以上同一性，来源于西瓜且与除草剂抗性相关的多肽；
W2)在W1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
上述a3)中，使用的术语“同一性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列表中序列2自N末端起第1至189位所示的氨基酸序列具有80％，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的氨基酸序列。
上述b3)中，使用的术语“同一性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列表中序列2自N末端起第191至662位所示的氨基酸序列具有80％，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的氨基酸序列。
所述CLALS蛋白中，所述区段Ⅱ可为脯氨酸残基或非脯氨酸残基。所述非脯氨酸残基具体可为丝氨酸残基或亮氨酸残基。
所述CLALS蛋白自N端至C端依次可由所述区段Ⅰ、所述区段Ⅱ和所述区段Ⅲ组成。
所述CLALS蛋白具体可为如下c1)或c2)或c3)或c4)或c5)：
c1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
c2)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；
c3)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；
c4)将c1)或c2)或c3)所示的蛋白质的区段Ⅰ和/或区段Ⅲ经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加得到的与除草剂抗性相关的蛋白质；
c5)与c1)或c2)或c3)或c4)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性，来源于西瓜且与除草剂抗性相关的蛋白质。
上述c5)中，使用的术语“同一性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列表中序列2、序列4或序列6所示的氨基酸序列具有80％，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的氨基酸序列。
编码所述CLALS蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
编码所述CLALS蛋白的核酸分子可为如下d1)或d2)或d3)或d4)或d5)所示的DNA分子：
d1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
d2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
d3)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；
d4)与d1)或d2)或d3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述CLALS蛋白的DNA分子；
d5)在严格条件下与d1)或d2)或d3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述CLALS蛋白的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述d4)中，使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列、或、本发明的编码序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列、或、本发明的编码序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。
序列表中序列1由1989个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。序列表中序列3由1989个核苷酸组成，序列表中序列3的核苷酸编码序列表中序列4所示的氨基酸序列。序列表中序列5由1989个核苷酸组成，序列表中序列5的核苷酸编码序列表中序列6所示的氨基酸序列。
上文中，同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
本发明还保护Z1)或Z2)：
Z1)所述CLALS蛋白或编码所述CLALS蛋白的核酸分子，在调控西瓜除草剂抗性中的应用；
Z2)所述CLALS蛋白或编码所述CLALS蛋白的核酸分子，在培育除草剂抗性改变的西瓜中的应用。
本发明还保护预测待测西瓜除草剂抗性的方法。
本发明所保护的预测待测西瓜除草剂抗性的方法，具体可为S1)：检测待测西瓜的所述CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类；“CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为非脯氨酸残基”的待测西瓜或“CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类为非脯氨酸残基和脯氨酸残基”的待测西瓜的除草剂抗性强于“CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为脯氨酸残基”的待测西瓜。
所述S1)中，“CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为非脯氨酸残基”中非脯氨酸残基的氨基酸种类可以为一种，也可以为两种。
本发明所保护的预测待测西瓜除草剂抗性的方法，具体可为S2)：检测待测西瓜总RNA的特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列；所述特定转录本为所述CLALS蛋白的编码基因转录得到的RNA，其第1个密码子为起始密码子；“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列仅编码非脯氨酸”的待测西瓜或“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列编码非脯氨酸和脯氨酸”的待测西瓜的除草剂抗性强于“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列仅编码脯氨酸”的待测西瓜。
所述S2)中，“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列仅编码非脯氨酸”中非脯氨酸的氨基酸种类可以为一种，也可以为两种。
本发明所保护的预测待测西瓜除草剂抗性的方法，具体可为S3)：检测待测西瓜总DNA中所述CLALS蛋白的编码基因自5’末端起第568位和第569位的核苷酸种类；“CLALS蛋白的编码基因自5’末端起第568位和第569位的核苷酸种类仅为c”的待测西瓜的除草剂抗性弱于F1或F2或F3；F1为CLALS蛋白的编码基因自5’末端起第568位和第569位的核苷酸种类均不含有c的待测西瓜；F2为CLALS蛋白的编码基因自5’末端起第569位的核苷酸种类含有c且第568位的核苷酸种类不含有c的待测西瓜；F3为CLALS蛋白的编码基因自5’末端起第568位的核苷酸种类含有c且第569位的核苷酸种类不含有c的待测西瓜。
本发明所保护的预测待测西瓜除草剂抗性的方法，具体可包括如下步骤：检测待测西瓜总DNA中是否具有序列表的序列1所示的DNA分子、序列表的序列3所示的DNA分子和序列表的序列5所示的DNA分子；
“待测西瓜总DNA中具有序列表的序列3所示的DNA分子和/或具有序列表的序列5所示的DNA分子”的待测西瓜的除草剂抗性强于“待测西瓜总DNA中仅具有序列表的序列1所示的DNA分子”的待测西瓜。
本发明还保护物质甲、物质乙或物质丙在预测待测西瓜除草剂抗性中的应用。
所述物质甲可为用于检测所述CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类的物质。
所述物质乙可为用于检测特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列的物质；所述特定转录本为所述CLALS蛋白的编码基因转录得到的RNA，其第1个密码子为起始密码子。
所述物质丙可为用于检测所述CLALS蛋白的编码基因自5’末端起第568位和第569位的核苷酸种类的物质。
本发明还保护成套产品甲、成套产品乙或成套产品丙在预测待测西瓜除草剂抗性中的应用。
所述成套产品甲可为所述物质甲和记载有方法甲的载体；所述方法甲可为：“所述CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为非脯氨酸残基”的待测西瓜或“CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类为非脯氨酸残基和脯氨酸残基”的待测西瓜的除草剂抗性强于“CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为脯氨酸残基”的待测西瓜。
所述成套产品乙可为所述物质乙和记载有方法乙的载体；所述方法乙可为：“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列仅编码非脯氨酸”的待测西瓜或“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列编码非脯氨酸和脯氨酸”的待测西瓜的除草剂抗性强于“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列仅编码脯氨酸”的待测西瓜。
所述成套产品丙可为所述物质丙和记载有方法丙的载体。所述方法丙可为：“所述CLALS蛋白CLALS蛋白的编码基因自5’末端起第568位和第569位的核苷酸种类仅为c”的待测西瓜的除草剂抗性弱于F1或F2或F3；F1为CLALS蛋白的编码基因自5’末端起第568位和第569位的核苷酸种类均不含有c的待测西瓜；F2为CLALS蛋白的编码基因自5’末端起第569位的核苷酸种类含有c且第568位的核苷酸种类不含有c的待测西瓜；F3为CLALS蛋白的编码基因自5’末端起第568位的核苷酸种类含有c且第569位的核苷酸种类不含有c的待测西瓜。
上述应用中，“CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为非脯氨酸残基”中非脯氨酸残基的氨基酸种类可以为一种，也可以为两种。
上述应用中，“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列仅编码非脯氨酸”中非脯氨酸的氨基酸种类可以为一种，也可以为两种。
本发明还保护B1)或B2)或B3)。
B1)所述CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类作为检测对象在预测待测西瓜除草剂抗性中的应用。
B2)特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列作为检测对象在预测待测西瓜除草剂抗性中的应用；所述特定转录本为所述CLALS蛋白的编码基因转录得到的RNA，其第1个密码子为起始密码子。
B3)所述CLALS蛋白的编码基因自5’末端起第568位和第569位的核苷酸种类作为检测对象在预测待测西瓜除草剂抗性中的应用。
上述任一所述除草剂可为以所述CLALS蛋白作为靶标的除草剂(即ALS抑制剂类除草剂)。上述任一所述除草剂具体可为K1)-K7)中的至少一种：K1)苯磺隆；K2)烟嘧磺隆；K3)噻吩磺隆；K4)吡嘧磺隆；K5)苄嘧磺隆；K6)砜嘧磺隆；K7)唑嘧磺草胺。
上述任一所述非脯氨酸具体可为丝氨酸或亮氨酸。
CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基的突变与CLALS蛋白中其它氨基酸残基的突变形成的双位点或多位点突变基因也属于本发明的保护范围。
CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基的突变与CLALS蛋白中其它氨基酸残基的突变形成的双位点或多位点突变基因在调控西瓜除草剂抗性中的应用也属于本发明的保护范围。
在本发明的实施例中，发明人通过植物单碱基编辑系统nCas9-PBE获得了P190L突变杂合和P190S突变杂合，进一步获得了P190L纯合突变株(CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为亮氨酸残基)、P190S纯合突变株(CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为丝氨酸残基)、P190L杂合突变株(CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类为脯氨酸残基和亮氨酸残基)和P190S杂合突变株(CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类为脯氨酸残基和丝氨酸残基)。用苯磺隆喷施上述突变株的幼苗和未转基因西瓜(CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为脯氨酸残基)的幼苗，结果表明，未转基因西瓜的幼苗很快死亡(苯磺隆喷施后3-7天)，P190L杂合突变株的幼苗、P190S杂合突变株的幼苗、P190L纯合突变株的幼苗和P190S纯合突变株的幼苗均正常生长，且P190L纯合突变株的幼苗和P190S纯合突变株的幼苗的生长状态优于P190L杂合突变株的幼苗和P190S杂合突变株的幼苗。
实验证明，CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类可以作为检测对象，预测待测西瓜除草剂抗性。本发明具有重大的应用价值。
附图说明
图1为除草剂抗性鉴定结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pBSE901质粒记载与如下文献中：Chen Y，Wang Z，Ni H，et al.CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutationsin Arabidopsis[J].Science China Life Sciences，2017，60(5):520-523.
BM培养基：将0.44g MS培养基、3g蔗糖和0.8g琼脂溶于100mL去离子水，调节pH值为5.8，高温高压灭菌15min。MS培养基为PhytoTech公司的产品。
共培养基：含1.5mg/L 6-BA的BM培养基。
选择培养基1：含100mg/L Timentin和1.5mg/L Basta的共培养基。
选择培养基2：含100mg/L Timentin和2.0mg/L Basta的共培养基。
芽伸长培养基：含0.1mg/L 6-BA、0.01mg/L NAA、100mg/L Timentin和1.5mg/LBasta的BM培养基。
生根培养基：含1mg/L IBA的BM培养基。
实施例1、抗除草剂西瓜突变株的获得及其验证
CLALS蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。编码CLALS蛋白的基因(即CLALS基因)如序列表中序列1所示。根据CLALS基因的核苷酸序列选择靶序列，靶序列的核苷酸序列为：5’-AAGTTCCGAGAAGAATGAT-3’。
一、重组质粒pBSE901-ALS的构建
1、用限制性内切酶BsaⅠ酶切pBSE901质粒，回收约15Kb的载体骨架。
2、人工合成引物ALS-190F：
Figure BDA0001670096480000061
(双下划线为靶序列)和引物ALS-190R：
Figure BDA0001670096480000062
(双下划线为靶序列的反向互补序列)，用去离子水分别将引物ALS-190F和引物ALS-190R稀释至100μM，得到引物ALS-190F稀释液和引物ALS-190R稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅰ。
退火程序：95℃水浴10min，自然冷却至室温。
3、将载体骨架和DNA分子Ⅰ连接，得到重组质粒pBSE901-ALS。
将重组质粒pBSE901-ALS进行测序。根据测序结果，对重组质粒pBSE901-ALS进行结构描述如下：向pBSE901质粒的限制性内切酶BsaⅠ识别序列插入DNA分子Ⅱ。DNA分子Ⅱ为5’-GAAGTTCCGAGAAGAATGAT-3’。
二、农杆菌侵染液的制备
1、将步骤一构建的重组质粒pBSE901-ALS转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，得到重组农杆菌，命名为EHA105-pBSE901-ALS。
2、将EHA105-pBSE901-ALS单克隆接种于20mL含卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB液体培养基，28℃、220rpm震荡培养至OD600nm值达到0.8-1.0，得到农杆菌侵染液。
三、T0代拟转基因植株的获得
1、取饱满的西瓜种子，小心剥去种皮(尽量避免伤及种仁)，先用10％(m/v)的次氯酸钠水溶液消毒15min，然后用无菌水洗涤3次，轻轻置于盛有BM培养基(经高压灭菌)的培养皿，28℃暗培养3天。
2、完成步骤1后，取健康萌动的种仁，自子叶近轴端切片(大小为1.5mm×1.5mm)，获得外植体，将外植体放入盛有10mL MS液体培养基的培养皿(规格为9cm)中。
3、取所述培养皿，加入50μL农杆菌侵染液，浸泡10min。
4、完成步骤3后，取所述培养皿，弃菌液，用无菌滤纸吸干多余的菌液，然后置于共培养基，28℃黑暗条件下共培养4天。
5、完成步骤4后，将外植体转移至选择培养基1，25℃光暗交替培养(14h光照/10h黑暗；光照强度约为2000lx)2-4周(每周继代1次)。
6、完成步骤5后，将外植体转移至选择培养基2，25℃光暗交替培养(14h光照/10h黑暗；光照强度约为2000lx)2-4周(每周继代1次)，得到绿色幼芽。
7、完成步骤6后，将绿色幼芽转移至芽伸长培养基，25℃光暗交替培养(14h光照/10h黑暗；光照强度约为2000lx)4周，得到抗性幼苗。期间，每周继代1次。
8、完成步骤7后，将抗性幼苗转移至生根培养基，25℃光暗交替培养(14h光照/10h黑暗；光照强度约为2000lx)7天，得到再生植株，即T0代拟转基因植株。
四、T0代拟转基因植株的鉴定
1、分子鉴定
以步骤三获得的T0代拟转基因植株叶片的基因组DNA为模板，以BE3-IDF：5’-CATACCTCCCAGAACACAAATAAGC-3’和BE3-IDR：5’-ACTGAAGGGCAATAGTGAAGAATGT-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,能得到约500bp的目的条带的T0代拟转基因植株即为T0代阳性转基因植株。
按照上述方法，将T0代拟转基因植株叶片的基因组DNA分别替换为水、重组质粒pBSE901-ALS和未转基因西瓜植株叶片的基因组DNA，其它步骤均相同。
结果表明，以水和未转基因西瓜植株叶片的基因组DNA为模板进行PCR扩增后，无目的条带；而以重组质粒pBSE901-ALS为模板进行PCR扩增有约500bp的目的条带。
2、Bar免疫检测试纸鉴定
(1)检测样品处理
取步骤三获得的T0代拟转基因植株叶片0.1g，放入2mL离心管中，加蒸馏水研磨，得到样品液。
(2)样本检测
完成步骤(1)后，将Bar免疫检测试纸(北京奥创金标生物技术有限公司的产品)垂直插入所述离心管，试纸端淹没入样品液的深度约为0.5cm，1min后取出放平阅读检测结果。
(3)结果判断
检测线及对照线一般可在1-2min内出现，检测标准为：在检测条上仅出现一条紫红色质控线为阴性结果；在检测条上出现两条紫红色条带，一条为紫红色检测线，一条为紫红色质控线，此为阳性结果。
凡能得到两条紫红色条带的T0代拟转基因植株叶片即为T0代阳性转基因植株。
经鉴定，共获得199棵T0代阳性转基因植株。
五、突变类型的分子检测
1、分别以T0代阳性转基因植株叶片的基因组DNA为模板，以ALS-190-IDF：5’-CGTCACCAATGTCTTCGCTTA-3’和ALS-190-IDR：5’-CAGGCTTCTTAGATTCAGATACCA-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物并测序。
测序结果表明，199棵T0代阳性转基因植株中，154株的基因型与野生型(即未转基因西瓜)的基因型完全一致、靶点区并未发生编辑，45株靶点区域的全部或部分C突变成T且均为杂合突变，突变率为22.61％；杂合突变株中CLALS基因有两种突变形式：一种是突变基因1(序列表中序列3所示)，为序列表中序列1(即CLALS基因)自5’末端起第568位的C突变为T得到；另一种是突变基因2(序列表中序列5所示)，为序列表中序列1(即CLALS基因)自5’末端起第568位和第569位的C突变为T得到。突变基因1编码序列表中序列4所示的突变蛋白1，突变基因2编码序列表中序列6所示的突变蛋白2。与CLALS蛋白相比，突变蛋白1是将第190位的脯氨酸突变为丝氨酸，突变蛋白2是将第190位的脯氨酸突变为亮氨酸。
将具有突变基因1的杂合突变命名为P190L突变杂合。将具有突变基因2的杂合突变株命名为P190S突变杂合。
六、P190L纯合突变株、P190S纯合突变株、P190L杂合突变株和P190S杂合突变株的获得
1、将含有P190L杂和突变的植株(作为父本)和未转基因西瓜植株(作为母本)进行杂交，收获杂交种。
2、完成步骤1后，将杂交种种植得到植株。
鉴定植株是否转基因和含有P190L突变。未转基因且含有P190L突变的植株约占25％。
3、完成步骤2后，将未转基因且含有P190L突变的植株自交，收获种子。将该种子种植得到植株，分析植株的基因型。
未转基因且含有P190L纯合突变的植株(即P190L纯合突变株)约占25％。
4、完成步骤3后，将P190L纯合突变株自交，即可繁育大量具有P190L纯合突变的后代。
5、完成步骤4后，将P190L纯合突变株和未转基因西瓜植株进行杂交，杂交种即为P190L杂合突变株。
按照上述步骤，将“含有P190L杂和突变的植株”替换为“含有P190S杂和突变的植株”，其它步骤均不变，得到P190S纯合突变株和P190S杂合突变株。
七、除草剂抗性鉴定
待测西瓜种子为未转基因西瓜种子、P190L纯合突变株的种子、P190S纯合突变株的种子、P190L杂合突变株的种子或P190S杂合突变株的种子。
实验重复三次，每次重复的步骤如下：
1、在大田中种植20粒待测西瓜种子，常规培养，得到处于两叶一心时期的待测西瓜幼苗。
2、完成步骤1后，取待测西瓜幼苗，使用苯磺隆喷施叶片(喷施剂量为17g ai/ha；g为克，ai为有效成分，ha为公顷)，然后常规培养7天，观察待测西瓜幼苗的生长状态。
部分实验结果见图1(WT为未转基因西瓜种子，P190L为P190L纯合突变株的种子，P190S为P190S纯合突变株的种子)。结果表明，苯磺隆喷施后，未转基因西瓜种子的幼苗很快死亡(苯磺隆喷施后3-7天)，P190L杂合突变株的种子的幼苗、P190S杂合突变株的种子的幼苗、P190L纯合突变株的种子的幼苗和P190S纯合突变株的种子的幼苗均正常生长，且P190L纯合突变株的种子的幼苗和P190S纯合突变株的种子的幼苗的生长状态优于P190L杂合突变株的种子的幼苗和P190S杂合突变株的种子的幼苗。
上述结果表明，含有突变基因1和/或突变基因2的西瓜对苯磺隆具有明显的抗性。
<110> 北京市农林科学院
<120> CLALS蛋白、其编码基因及它们在预测西瓜除草剂抗性中的应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1989
<212> DNA
<213> 西瓜 Citrullus lanatus
<400> 1
atggcggcgg ctgcttcccc atgcgcctcc aaatccttct ccaaaccctc ctccttctcc 60
cttcctaaac ccttctccag atttgatctt tcattttccc ctcttcctca caatccctcc 120
ttccgccgtc ctcttcgcat ctgcagctcc tctctctcca atccttcccc caaaccctct 180
tccaccgccg cctccgccgc tgccgtcgac acttccacca tcgccagccc tgagattttc 240
gtctcccgat ttgccgctga tgaaccgaga aaaggcgccg atatcctcgt cgaggctctc 300
gagcgccaag gcgtcaccaa tgtcttcgct taccccggcg gcgcgtccat ggagatccat 360
caggccctca cccgctcttc aattatccgt aacgttctcc ctcgccacga gcagggcggc 420
gtattcgccg ccgagggtta cgctcgctcc tctggccttc ccggcgtttg cattgcaact 480
tccggccccg gtgccactaa tctggtcagc ggccttgccg acgccctcct cgacagcgtt 540
ccattggtgg ccattacagg gcaagttccg agaagaatga tcggtaccga tgcgtttcag 600
gaaactccca ttgttgaggt aactcgctct attacaaagc acaactatct ggttcttgat 660
gtagatgaca ttcctaggat tgtgagcgag gcatttttcc tcgcaatttc tggtcgacct 720
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aatcagccca tgaaattacc tggttacttg tctaggttac ctaagcctcc aattgactct 840
catttggaac aaattgtgcg attggtatct gaatctaaga agcctgttct ttacgtgggt 900
ggagggtgtt tgaattcctc ggaggagctg cggcgttttg tcaagctcac cgggattccg 960
gtggccagca ctctaatggg tctcggggct tatccttgct ccggtgaatt gtctctgcaa 1020
atgctgggaa tgcatgggac tgtctatgcc aactatgctg tggataaatc tgatctgttg 1080
cttgcatttg gagtgagatt tgatgaccgt gtgacaggga agctcgaggc ctttgcaagc 1140
cgtgcaaaaa tcgttcatat cgatattgat tcggctgaga ttggaaagaa caagcagccc 1200
catgtgtcgg tctgtggtga tgtaaagttg gccttacagg gaatgaatcg tttacttgag 1260
aaaactgaga agcttcactt tgatttctct gcgtggagag aggagctgaa tgagcagaaa 1320
tcaaagtatc cattgacttt caaaacattt gatgaggcca ttcctccaca gtatgcaatt 1380
caacttcttg atgagctaac caacggcgag gccatcgtaa gcacaggggt ggggcagcat 1440
cagatgtggg cagctcagtt ctacaagtac aagaagccac gtcagtggtt aacctctgga 1500
gggttaggtg caatgggctt tggactgcca gcagccatgg gggcagcagt agcaaatccc 1560
gatgcggtgg tcgtagacat cgacggggac gggagtttca tcatgaatgt ccaagaactg 1620
gcaacaatca gtgttgagaa acttccagtg aagatcctgc tgctgaacaa ccagcatcta 1680
ggcatggttg tgcagtggga ggatcggttc tataaagcca acagagctca cacttacctg 1740
ggagatccat caaacgagac cgagatattc cccaacatgt tgaagttcgc agaggcctgc 1800
gggatcccag ctgcccgtgt gacgaagaga gctgagttaa gagcagcaat gaagaagatg 1860
ctggaaacag aagggcctta cttgttggat gtgattgtac cgcatcagga acatgtcctg 1920
ccgatgattc ccagtggcgg tgctttcaaa gatgtgatca cagagggaga tggaagatcc 1980
gtatactaa 1989
<210> 2
<211> 662
<212> PRT
<213> 西瓜 Citrullus lanatus
<400> 2
Met Ala Ala Ala Ala Ser Pro Cys Ala Ser Lys Ser Phe Ser Lys Pro
1 5 10 15
Ser Ser Phe Ser Leu Pro Lys Pro Phe Ser Arg Phe Asp Leu Ser Phe
20 25 30
Ser Pro Leu Pro His Asn Pro Ser Phe Arg Arg Pro Leu Arg Ile Cys
35 40 45
Ser Ser Ser Leu Ser Asn Pro Ser Pro Lys Pro Ser Ser Thr Ala Ala
50 55 60
Ser Ala Ala Ala Val Asp Thr Ser Thr Ile Ala Ser Pro Glu Ile Phe
65 70 75 80
Val Ser Arg Phe Ala Ala Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu
85 90 95
Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val Thr Asn Val Phe Ala Tyr Pro
100 105 110
Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Ser Ile
115 120 125
Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala
130 135 140
Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Leu Pro Gly Val Cys Ile Ala Thr
145 150 155 160
Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu
165 170 175
Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg
180 185 190
Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr
195 200 205
Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Asp Asp Ile
210 215 220
Pro Arg Ile Val Ser Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ile Ser Gly Arg Pro
225 230 235 240
Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Gln Gln Leu Ala
245 250 255
Val Pro Asn Trp Asn Gln Pro Met Lys Leu Pro Gly Tyr Leu Ser Arg
260 265 270
Leu Pro Lys Pro Pro Ile Asp Ser His Leu Glu Gln Ile Val Arg Leu
275 280 285
Val Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Leu
290 295 300
Asn Ser Ser Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Lys Leu Thr Gly Ile Pro
305 310 315 320
Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ala Tyr Pro Cys Ser Gly Glu
325 330 335
Leu Ser Leu Gln Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr
340 345 350
Ala Val Asp Lys Ser Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp
355 360 365
Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile
370 375 380
Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro
385 390 395 400
His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn
405 410 415
Arg Leu Leu Glu Lys Thr Glu Lys Leu His Phe Asp Phe Ser Ala Trp
420 425 430
Arg Glu Glu Leu Asn Glu Gln Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Thr Phe Lys
435 440 445
Thr Phe Asp Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Leu Leu Asp
450 455 460
Glu Leu Thr Asn Gly Glu Ala Ile Val Ser Thr Gly Val Gly Gln His
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Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr Lys Tyr Lys Lys Pro Arg Gln Trp
485 490 495
Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala
500 505 510
Met Gly Ala Ala Val Ala Asn Pro Asp Ala Val Val Val Asp Ile Asp
515 520 525
Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Ser
530 535 540
Val Glu Lys Leu Pro Val Lys Ile Leu Leu Leu Asn Asn Gln His Leu
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Gly Met Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala
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His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ser Asn Glu Thr Glu Ile Phe Pro Asn
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Met Leu Lys Phe Ala Glu Ala Cys Gly Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr
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Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Val Ile Thr Glu Gly
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Asp Gly Arg Ser Val Tyr
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<213> 西瓜 Citrullus lanatus
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Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Asp Asp Ile
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Pro Arg Ile Val Ser Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ile Ser Gly Arg Pro
225 230 235 240
Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Gln Gln Leu Ala
245 250 255
Val Pro Asn Trp Asn Gln Pro Met Lys Leu Pro Gly Tyr Leu Ser Arg
260 265 270
Leu Pro Lys Pro Pro Ile Asp Ser His Leu Glu Gln Ile Val Arg Leu
275 280 285
Val Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Leu
290 295 300
Asn Ser Ser Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Lys Leu Thr Gly Ile Pro
305 310 315 320
Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ala Tyr Pro Cys Ser Gly Glu
325 330 335
Leu Ser Leu Gln Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr
340 345 350
Ala Val Asp Lys Ser Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp
355 360 365
Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile
370 375 380
Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro
385 390 395 400
His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn
405 410 415
Arg Leu Leu Glu Lys Thr Glu Lys Leu His Phe Asp Phe Ser Ala Trp
420 425 430
Arg Glu Glu Leu Asn Glu Gln Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Thr Phe Lys
435 440 445
Thr Phe Asp Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Leu Leu Asp
450 455 460
Glu Leu Thr Asn Gly Glu Ala Ile Val Ser Thr Gly Val Gly Gln His
465 470 475 480
Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr Lys Tyr Lys Lys Pro Arg Gln Trp
485 490 495
Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala
500 505 510
Met Gly Ala Ala Val Ala Asn Pro Asp Ala Val Val Val Asp Ile Asp
515 520 525
Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Ser
530 535 540
Val Glu Lys Leu Pro Val Lys Ile Leu Leu Leu Asn Asn Gln His Leu
545 550 555 560
Gly Met Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala
565 570 575
His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ser Asn Glu Thr Glu Ile Phe Pro Asn
580 585 590
Met Leu Lys Phe Ala Glu Ala Cys Gly Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr
595 600 605
Lys Arg Ala Glu Leu Arg Ala Ala Met Lys Lys Met Leu Glu Thr Glu
610 615 620
Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu
625 630 635 640
Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Val Ile Thr Glu Gly
645 650 655
Asp Gly Arg Ser Val Tyr
660
<210> 5
<211> 1989
<212> DNA
<213> 西瓜 Citrullus lanatus
<400> 5
atggcggcgg ctgcttcccc atgcgcctcc aaatccttct ccaaaccctc ctccttctcc 60
cttcctaaac ccttctccag atttgatctt tcattttccc ctcttcctca caatccctcc 120
ttccgccgtc ctcttcgcat ctgcagctcc tctctctcca atccttcccc caaaccctct 180
tccaccgccg cctccgccgc tgccgtcgac acttccacca tcgccagccc tgagattttc 240
gtctcccgat ttgccgctga tgaaccgaga aaaggcgccg atatcctcgt cgaggctctc 300
gagcgccaag gcgtcaccaa tgtcttcgct taccccggcg gcgcgtccat ggagatccat 360
caggccctca cccgctcttc aattatccgt aacgttctcc ctcgccacga gcagggcggc 420
gtattcgccg ccgagggtta cgctcgctcc tctggccttc ccggcgtttg cattgcaact 480
tccggccccg gtgccactaa tctggtcagc ggccttgccg acgccctcct cgacagcgtt 540
ccattggtgg ccattacagg gcaagttttg agaagaatga tcggtaccga tgcgtttcag 600
gaaactccca ttgttgaggt aactcgctct attacaaagc acaactatct ggttcttgat 660
gtagatgaca ttcctaggat tgtgagcgag gcatttttcc tcgcaatttc tggtcgacct 720
ggtcctgttc ttattgatat tcctaaggac gttcagcaac agctcgcggt tcccaattgg 780
aatcagccca tgaaattacc tggttacttg tctaggttac ctaagcctcc aattgactct 840
catttggaac aaattgtgcg attggtatct gaatctaaga agcctgttct ttacgtgggt 900
ggagggtgtt tgaattcctc ggaggagctg cggcgttttg tcaagctcac cgggattccg 960
gtggccagca ctctaatggg tctcggggct tatccttgct ccggtgaatt gtctctgcaa 1020
atgctgggaa tgcatgggac tgtctatgcc aactatgctg tggataaatc tgatctgttg 1080
cttgcatttg gagtgagatt tgatgaccgt gtgacaggga agctcgaggc ctttgcaagc 1140
cgtgcaaaaa tcgttcatat cgatattgat tcggctgaga ttggaaagaa caagcagccc 1200
catgtgtcgg tctgtggtga tgtaaagttg gccttacagg gaatgaatcg tttacttgag 1260
aaaactgaga agcttcactt tgatttctct gcgtggagag aggagctgaa tgagcagaaa 1320
tcaaagtatc cattgacttt caaaacattt gatgaggcca ttcctccaca gtatgcaatt 1380
caacttcttg atgagctaac caacggcgag gccatcgtaa gcacaggggt ggggcagcat 1440
cagatgtggg cagctcagtt ctacaagtac aagaagccac gtcagtggtt aacctctgga 1500
gggttaggtg caatgggctt tggactgcca gcagccatgg gggcagcagt agcaaatccc 1560
gatgcggtgg tcgtagacat cgacggggac gggagtttca tcatgaatgt ccaagaactg 1620
gcaacaatca gtgttgagaa acttccagtg aagatcctgc tgctgaacaa ccagcatcta 1680
ggcatggttg tgcagtggga ggatcggttc tataaagcca acagagctca cacttacctg 1740
ggagatccat caaacgagac cgagatattc cccaacatgt tgaagttcgc agaggcctgc 1800
gggatcccag ctgcccgtgt gacgaagaga gctgagttaa gagcagcaat gaagaagatg 1860
ctggaaacag aagggcctta cttgttggat gtgattgtac cgcatcagga acatgtcctg 1920
ccgatgattc ccagtggcgg tgctttcaaa gatgtgatca cagagggaga tggaagatcc 1980
gtatactaa 1989
<210> 6
<211> 662
<212> PRT
<213> 西瓜 Citrullus lanatus
<400> 6
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1 5 10 15
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Ser Pro Leu Pro His Asn Pro Ser Phe Arg Arg Pro Leu Arg Ile Cys
35 40 45
Ser Ser Ser Leu Ser Asn Pro Ser Pro Lys Pro Ser Ser Thr Ala Ala
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Ser Ala Ala Ala Val Asp Thr Ser Thr Ile Ala Ser Pro Glu Ile Phe
65 70 75 80
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145 150 155 160
Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu
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195 200 205
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Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Gln Gln Leu Ala
245 250 255
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Leu Pro Lys Pro Pro Ile Asp Ser His Leu Glu Gln Ile Val Arg Leu
275 280 285
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Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu
625 630 635 640
Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Val Ile Thr Glu Gly
645 650 655
Asp Gly Arg Ser Val Tyr
660

Claims (7)

1.CLALS蛋白或编码所述CLALS蛋白的核酸分子在调控西瓜除草剂抗性中的应用；
所述除草剂为苯磺隆、吡嘧磺隆、苄嘧磺隆或砜嘧磺隆；
所述CLALS蛋白为如下c2）或c3）：
c2）氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；
c3）氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；
所述编码所述CLALS蛋白的核酸分子为如下d2）或d3）所示的DNA分子：
d2）核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
d3）核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子。
2.CLALS蛋白或编码所述CLALS蛋白的核酸分子在培育除草剂抗性改变的西瓜中的应用；
所述除草剂为苯磺隆、吡嘧磺隆、苄嘧磺隆或砜嘧磺隆；
所述CLALS蛋白为如下c2）或c3）：
c2）氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；
c3）氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；
所述编码所述CLALS蛋白的核酸分子为如下d2）或d3）所示的DNA分子：
d2）核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
d3）核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子。
3.一种预测待测西瓜除草剂抗性的方法，为检测待测西瓜的CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类；所述CLALS蛋白为氨基酸序列是序列表中序列2、序列表中序列4或序列表中序列6所示的蛋白质；
“CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为非脯氨酸残基”的待测西瓜或“CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类为非脯氨酸残基和脯氨酸残基”的待测西瓜的除草剂抗性强于“CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为脯氨酸残基”的待测西瓜；
所述非脯氨酸为丝氨酸或亮氨酸；
所述除草剂为苯磺隆、吡嘧磺隆、苄嘧磺隆或砜嘧磺隆。
4.一种预测待测西瓜除草剂抗性的方法，为检测待测西瓜总RNA的特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列；所述特定转录本为权利要求3中所述CLALS蛋白的编码基因转录得到的RNA，其第1个密码子为起始密码子；
“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列仅编码非脯氨酸”的待测西瓜或“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列编码非脯氨酸和脯氨酸”的待测西瓜的除草剂抗性强于“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列仅编码脯氨酸”的待测西瓜；
所述非脯氨酸为丝氨酸或亮氨酸；
所述除草剂为苯磺隆、吡嘧磺隆、苄嘧磺隆或砜嘧磺隆。
5.一种预测待测西瓜除草剂抗性的方法，包括如下步骤：检测待测西瓜总DNA中是否具有序列表的序列1所示的DNA分子、序列表的序列3所示的DNA分子和序列表的序列5所示的DNA分子；
“待测西瓜总DNA中具有序列表的序列3所示的DNA分子和/或具有序列表的序列5所示的DNA分子”的待测西瓜的除草剂抗性强于“待测西瓜总DNA中仅具有序列表的序列1所示的DNA分子”的待测西瓜；
所述除草剂为苯磺隆、吡嘧磺隆、苄嘧磺隆或砜嘧磺隆。
6.物质甲或物质乙在预测待测西瓜除草剂抗性中的应用；所述除草剂为苯磺隆、吡嘧磺隆、苄嘧磺隆或砜嘧磺隆；
所述物质甲为用于检测权利要求3中所述CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类的物质；所述物质甲预测待测西瓜除草剂抗性的预测判断标准为“权利要求3中所述CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为非脯氨酸残基”的待测西瓜或“权利要求3中所述CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类为非脯氨酸残基和脯氨酸残基”的待测西瓜的除草剂抗性强于“权利要求3中所述CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为脯氨酸残基”的待测西瓜；所述非脯氨酸为丝氨酸或亮氨酸；
所述物质乙为用于检测特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列的物质；所述特定转录本为权利要求3中所述CLALS蛋白的编码基因转录得到的RNA，其第1个密码子为起始密码子；所述物质乙预测待测西瓜除草剂抗性的预测判断标准为“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列仅编码非脯氨酸”的待测西瓜或“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列编码非脯氨酸和脯氨酸”的待测西瓜的除草剂抗性强于“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列仅编码脯氨酸”的待测西瓜；所述非脯氨酸为丝氨酸或亮氨酸。
7.成套产品甲或成套产品乙在预测待测西瓜除草剂抗性中的应用；所述除草剂为苯磺隆、吡嘧磺隆、苄嘧磺隆或砜嘧磺隆；
所述成套产品甲为权利要求6中所述物质甲和记载有方法甲的载体；
所述方法甲为：“权利要求3中所述CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为非脯氨酸残基”的待测西瓜或“CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类为非脯氨酸残基和脯氨酸残基”的待测西瓜的除草剂抗性强于“CLALS蛋白自N末端起第190位的氨基酸残基种类仅为脯氨酸残基”的待测西瓜；
所述成套产品甲的预测判断标准为方法甲；
所述成套产品乙为权利要求6中所述物质乙和记载有方法乙的载体；
所述方法乙为：“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列仅编码非脯氨酸”的待测西瓜或“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列编码非脯氨酸和脯氨酸”的待测西瓜的除草剂抗性强于“特定转录本中第190个密码子的核苷酸序列仅编码脯氨酸”的待测西瓜；所述特定转录本为权利要求3中所述CLALS蛋白的编码基因转录得到的RNA，其第1个密码子为起始密码子；
所述成套产品乙的预测判断标准为方法乙；
所述非脯氨酸为丝氨酸或亮氨酸。
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"The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions";Shaogui Guo等;《NATURE GENETICS》;20121125;第45卷(第1期);摘要、附页、supplementary table 23 *
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