CN114656533B

CN114656533B - 西瓜新型糖转运蛋白及其编码基因ClVST1和应用

Info

Publication number: CN114656533B
Application number: CN202011525285.2A
Authority: CN
Inventors: 许勇; 李茂营; 任毅; 张海英; 宫国义; 郭绍贵; 张洁
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN114656533A

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及西瓜新型糖转运及其编码基因ClVST1和应用。西瓜新型糖转运蛋白质具有序列表中序列1所示的序列组成，其编码基因ClVST1具有序列表中序列2所示的序列组成。本发明还涉及西瓜新型糖转运蛋白质和西瓜新型糖转运编码核酸序列在西瓜病虫害抗性中的应用。本发明还提供了一种西瓜抗病虫害株系的获得方法。本发明提供的西瓜新型糖转运及其编码基因ClVST1与病虫害抗性密切相关，表达量越高，对病虫害的抗性越强；因此，通过在西瓜植株中敲除西瓜新型糖转运，可以获得稳定的抗细菌性果斑病和蚜虫的西瓜株系，为抗病虫害西瓜育种提供了一种快捷、高效的途径。

Description

西瓜新型糖转运蛋白及其编码基因ClVST1和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种西瓜新型糖转运蛋白及其编码基因ClVST1和应用。

背景技术

西瓜叶片光合作用产生的糖分经过茎韧皮部运送到果实，在果实中需经历代谢、卸载、转运和存储4个环节，即棉籽糖等寡糖水解为蔗糖、果实韧皮部卸载蔗糖、细胞间隙的糖分由糖转运蛋白运输到果肉细胞内、最终在果肉细胞液泡中存储糖分。新型糖转运蛋白ClVST1是调节果实糖分卸载的关键因子，也就是在第二环节卸载中发挥作用的关键基因。”

西瓜(Citullus lanatus(Thunb.)Matsum&Nadai)是世界上重要的园艺作物，我国的西瓜栽培面积、总产量与人均消费量均居世界首位。由于大棚种植长期连作极易引发病虫害，特别是蚜虫为代表的虫害和以细菌性果斑病为代表的细菌病害的大规模爆发已成为制约西瓜生产的重要因素。

细菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch,BFB)近十多年来已成为严重影响全球瓜类产业的种传毁灭性病害。病原菌主要侵染西瓜、甜瓜、西葫芦等葫芦科瓜类作物，一些发病严重的地区损失甚至可达80％以上，BFB的致病菌Acidovorax citrulli(A.citrulli)于2007年被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。

蚜虫(Aphis gossypii Glover)是世界上分布最广、危害最严重的农业害虫之一。蚜虫不仅可以吸食汁液直接危害植物，并分泌蜜露使植物产生煤污病，还可以传播多种植物病毒，严重危害植物生长。据估计，蚜虫每年造成的全球农作物损失高达数亿美元。

多年来，人们采用传统常规选育等方法解决西瓜品种抗病虫害问题，但往往耗资大、工作量大和选择效率不高。因此，如何解决常规育种中的这些问题，快速获得稳定的西瓜病虫害抗性株系，是实践中急需的重要技术问题。

发明内容

本发明提供了一种西瓜新型糖转运蛋白及其编码基因ClVST1和应用。

本发明提供了一种蛋白质，为如下A1)-A4)任意一种：

A1)序列表中序列1所示的蛋白质；

A2)在A1)所述蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

A3)在A1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失、和/或添加得到的具有西瓜新型糖转运活性的蛋白质；

A4)与A1)所述蛋白质具有98％以上同一性且具有西瓜新型糖转运活性的蛋白质。

本发明还提供与所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低所述蛋白质表达量的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

进一步，B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)或b15)：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；

b13)序列表中序列1的所示的DNA分子；

b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。

所述蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质或所述生物材料的下述任一应用：

D1)调控植物抗病性；

D2)制备调控植物抗病性产品；

D3)培育抗病植物；

D4)制备培育抗病植物产品；

D5)培育抗病性降低植物；

D6)制备培育抗病性降低植物产品；

D7)调控植物抗虫性；

D8)制备调控植物抗虫性产品；

D9)培育抗虫植物；

D10)制备培育抗虫植物产品；

D11)培育抗虫性降低植物；

D12)制备培育抗虫性降低植物产品。

下述任一方法也应在本发明的保护范围之内：

X1)培育抗病性或抗虫性降低植物的方法，包括使受体植物中表达所述蛋白质，或提高受体植物中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比抗病性降低的目的植物；

X2)培育抗病性或抗虫性增强植物的方法，包括降低受体植物中所述蛋白质的含量，或降低受体植物中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比抗病性增强的目的植物；

X3)降低植物抗病性或抗虫性的方法，包括使受体植物中表达权利要求1所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比抗病性降低的目的植物实现植物抗病性的降低；

X4)提高植物抗病性或抗虫性的方法，包括降低受体植物中权利要求1所述蛋白质的含量，或降低受体植物中权利要求1所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比抗病性增强的目的植物实现植物抗病性的降低提高。

进一步，X2)和X4)所述方法通过向所述受体植物中导入所述蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现；

X1)和X3)所述方法通过敲除所述受体植物中所述蛋白质的编码基因实现。

所述的应用或者所述的方法中，所述抗病为抗白叶枯病，所述抗虫为抗蚜虫。

本发明还提供一种调控植物抗病性或抗虫性的产品，含有所述蛋白质或所述生物材料。

所述植物为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物；

M2)葫芦科植物；

M3)西瓜。

本发明的有益效果在于：本发明克隆了西瓜新型糖转运基因ClVST1，构建了ClVST1的转基因敲除载体转化西瓜获得转基因西瓜材料，明确了ClVST1在病虫害抗性中的作用。

附图说明

图1为实施例3中ClVST1基因敲除西瓜株系(VST1-CRISPR和对照)对细菌性果斑病的抗病性鉴定示意图。

图2为实施例4中ClVST1基因敲除西瓜株系(VST1-CRISPR和对照)对蚜虫的抗病性鉴定示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

pBSE401质粒记载在如下文献中：A CRISPR/Cas9 toolkit for mμ Ltiplexgenome editing in plants.Xing HL,Dong L,Wang ZP,Zhang HY,Han CY,Liu B,WangXC,Chen QJ.BMC Plant Biol.2014Nov 29；14(1):327.10.1186/s12870-014-0327-y。

BM培养基：将0.44g MS培养基、3g蔗糖和0.8g琼脂溶于100mL去离子水，调节pH值为5.8，高温高压灭菌15min。MS培养基为PhytoTech公司的产品。

共培养培养基：含1.5mg/L 6-BA的BM培养基。

选择培养基1：含100mg/L Timentin和1.5mg/L Basta的共培养培养基。

选择培养基2：含100mg/L Timentin和2.0mg/L Basta的共培养培养基。

芽伸长培养基：含0.1mg/L 6-BA、0.01mg/L NAA、100mg/L Timentin和1.5mg/LBasta的BM培养基。

生根培养基：含1mg/L IBA的BM培养基。

实施例1

本实施例用来说明西瓜新型糖转运蛋白及其编码基因ClVST1的发现、克隆及定位。

一、西瓜新型糖转运蛋白及其编码基因ClVST1的发现

“通过利用超高密度SNP遗传图谱、326份自然群体材料，完成了西瓜果实含糖量的精细定位和关联分析，利用西瓜数据库检索并比较其它物种的相关基因序列，从西瓜品种97103中获得一个新蛋白，将其命名为西瓜新型糖转运蛋白，其序列如序列表中的序列1所示(由470个氨基酸残基组成)。将编码西瓜新型糖转运的基因命名为ClVST1基因，其cDNA的开放阅读框如序列表中的序列2所示(由1413个核苷酸组成)。

二、ClVST1基因的克隆

使用华越洋试剂盒抽提西瓜叶片RNA(试剂盒购自华越洋生物(北京)科技有限公司，抽提按照提供的说明书操作)，用M-MLV反转录试剂盒合成第一链cDNA(购自Promega公司，按照试剂盒说明书操作)，所得的第一链cDNA用于扩增ClVST1基因全长。

根据西瓜基因组(http://cucurbitgenomics.org/,V1)数据库得到的ClVST1基因序列，设计两条特异性引物，用于PCR反应扩增ClVST1基因序列，所述两条引物如下：

上游引物：5’-ATGAACCTCTCCCAGCTC-3’；

下游引物：5’-TTATCCCTTTAGACCCCTC-3’。

20μL的PCR反应体系为：10×Buffer 2μL、10mmol/L dNTPs 2μL、MgSO₄1.4μL、模板cDNA 1.2μL、KOD-Plus酶0.4μL、上游引物0.3μL、下游引物0.3μL、ddH₂O 12.4μL。

PCR扩增程序为：阶段1：94℃，2min；阶段2：94℃、15s，56℃、30s，68℃、3min，共30个循环；阶段3：68℃延伸10min。

取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳。电泳完毕在紫外灯下切下目的条带(即1413bp的序列2，位于琼脂糖凝胶上的1500bp附近)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)纯化，操作步骤参照该试剂盒的使用说明书。

回收完的片段末端需要加A，加A的10μL反应体系为：10×Buffer 1μL、dATP 1μL、Taq酶0.5μL、回收片段7.5μL，72℃反应半小时。将加A后的回收片段与PMD18-T载体(购自TaKaRa公司)连接，操作按照TaKaRa公司的说明书进行。连接的反应体系为：加A后的片段4.5μL、PMD18-T 0.5μL、Solution I 5μL，总体积为10μL；于16℃连接过夜。

取5μL的连接产物，采用热击法(参照J.萨姆布鲁克，等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序验证(测序工作由北京擎科新业生物技术有限公司完成)，测序结果表明，该序列全长1413bp，正是编码序列1的490个氨基酸的完整的ORF阅读框。

实施例2

本实施例用来说明CRISPR敲除ClVST1植株的获得。

一、CRISPR-ClVST1敲除载体的构建

1、以终浓度为10ng/μL的pCBC-DT1T2(Xing,H.L.#,Dong,L.#,Wang,Z.P.,Zhang,H.Y.,Han,C.Y.,Liu,B.,Wang,X.C.,and Chen,Q.J.*(2014).ACRISPR/Cas9 toolkit formultiplex genome editing in plants.BMC Plant Biol 14,327.)为模板进行PCR扩增。四引物的序列组成如下。

DT1-BsF-ClVST1的序列组成：

5’-ATATATGGTCTCGATTGAAATCAAACCACTCCCTTACTGGGTT-3’；

DT1-F0-ClVST1的序列组成：

5’-TGAAATCAAACCACTCCCTTACTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；

DT2-R0--ClVST1的序列组成：5’-AACGGTCGGAGGCGAGGCCGGCGCAATCTCTTAGTCGACTCTAC-3’；

DT2-BsR--ClVST1的序列组成：

5’-ATTATTGGTCTCGAAAC GGTCGGAGGCGAGGCCGGCGCAA-3’。

20μL PCR反应体系为：pCBC-DT1T2模板、10×Buffer 2μL、10mmol/L dNTPs 2μL、MgSO₄1.4μL、cDNA 1.2μL、KOD-Plus酶0.4μL、四引物分别为0.3μL、ddH₂O 11.8μL。

引物中，DT1-BsF-ClVST1和DT1-F0-ClVST1的浓度均为100μmol/L；

PCR扩增程序为：

阶段1：94℃，2min；阶段2：94℃，15s；56℃，30s；68℃，3min；共30个循环；阶段3：68℃延伸10min。

取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳。电泳完毕后在紫外灯下切下目的条带(626bp)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)纯化，操作步骤参照该试剂盒的使用说明书。

2、利用步骤1纯化回收的PCR产物，建立如下酶切-连接体系如表1所示：

表1

3、取5μL步骤2的酶切-连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。然后用Kan板筛选转化的大肠杆菌感受态细胞，将长出的阳性大肠杆菌克隆用PBSE401载体的引物对U626-IDF和U629-IDR，进行PCR扩增。其中，U626-IDF和U629-IDR的引物序列如下：

U626-IDF:5’-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3’；

U629-IDR:5’-AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC-3’。

PCR扩增的反应体系(13μL)为：

1.3μL含15mM MgCl₂的10×EasyTaq PCR Buffer；0.8μL浓度为2.5mM的dNTPs；0.4U PCR Taq DNA聚合酶；0.5μL 10mM的U626-IDF，0.5μL 10mM的U629-IDR；模板DNA；ddH₂O补足到13μL。

其中，模板DNA为1.0μL的OD值为0.8(OD值至少为0.8，一般为0.8-1.0)的阳性大肠杆菌菌液；Taq DNA聚合酶、反应缓冲液及dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司。

PCR扩增的反应程序为：

阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃15s，55℃20s，72℃20s，共34个循环；阶段3：72℃延伸4min；阶段4：4℃保存。

其中，PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler。

将PCR产物送北京擎科生物科技有限公司用引物U626-IDF和U629-IDF测序，若测序正确后即可进行后续操作。

其中，U626-IDF的引物序列如上所述，U629-IDF的引物序列如下：

U629-IDF:5’-TTAATCCAAACTACTGCAGCCTGAC-3’。

所得序列正确的重组质粒即为CRISPR-ClVST1敲除载体，能表达靶向ClVST1基因的sgRNA，该sgRNA的靶序列为序列2的第176-198位。

4、将步骤3获得的测序正确的阳性大肠杆菌提质粒(该质粒即为CRISPR-ClVST1敲除载体)，并用质粒转化农杆菌GV3101。然后用Kan板筛选并按照步骤3的方法进行PCR鉴定(本步骤中的模板DNA为1.0μL的OD值为0.8(OD值至少为0.8，一般为0.8-1.0)的阳性农杆菌GV3101菌液)，经鉴定能扩增出目的片段的克隆即为阳性农杆菌GV3101克隆，将阳性农杆菌GV3101克隆用于后续的西瓜转化。

二、CRISPR-ClVST1敲除转基因西瓜的遗传转化过程

1、取饱满的97103西瓜种子，小心剥去种皮(尽量避免伤及种仁)，先用10％(m/v，质量百分比浓度)的次氯酸钠水溶液消毒15min，然后用无菌水洗涤3次，轻轻置于盛有无菌BM培养基的培养皿，28℃暗培养3天，使得西瓜种子萌动。

2、取步骤1获得的健康萌动的种仁，自子叶近轴端，切成1.5mm×1.5mm的外植体，将外植体放入盛有10mL的MS液体培养基的培养皿(规格为9cm)中。然后向培养皿中加入OD600在0.8-1.0的经鉴定为阳性的农杆菌GV3101克隆的菌液50μL，混匀，浸泡10min后，滤干菌液，将外植体转入共培养培养基中，28℃黑暗条件下共培养4天，获得共培养后的外植体。

3、将步骤2获得的共培养后的外植体于选择培养基1上，25℃光暗交替培养(14h光照/10h黑暗；光照强度约为2000lx)2-4周，每周继代1次(即更换一次选择培养基1)。然后将外植体转移至选择培养基2，25℃光暗交替培养(14h光照/10h黑暗；光照强度约为2000lx)2-4周，每周继代1次，即得到含有绿色幼芽的植物组织。

4、将步骤3获得的含有绿色幼芽的植物组织上的绿色幼芽转移至芽伸长培养基，25℃光暗交替培养(14h光照/10h黑暗；光照强度约为2000lx)4周，每周继代1次，得到抗性幼苗。

5、将步骤4获得的抗性幼苗转移至生根培养基，25℃光暗交替培养(14h光照/10h黑暗；光照强度约为2000lx)7天，得到再生植株，即T0代转基因植株。

三、T0代转基因植株的鉴定：

1、采用Bar免疫检测试纸条鉴定T0代转基因植株。具体地，取步骤二获得的T0代转基因植株的叶片0.1g，放入2mL离心管中，加蒸馏水研磨，得到样品液。

2、将Bar免疫检测试纸(北京奥创金标生物技术有限公司的产品)垂直插入步骤1的2mL离心管的样品液中，试纸端淹没入样品液的深度约为0.5cm，1min后取出放平阅读检测结果。

3、检测线及对照线一般可在1-2min内出现，检测标准为：在检测条上仅出现一条紫红色质控线，则为阴性结果；在检测条上出现两条紫红色条带(其中一条为紫红色检测线，另一条为紫红色质控线)时，则为阳性结果，也即该样品对应的植株为T0代阳性转基因植株。

经鉴定，共获得68棵T0代阳性转基因植株。

四、突变类型的分子检测及纯合敲除ClVST1植株的获得

1、分别以T0代阳性转基因植株叶片的基因组DNA为模板，以ClVST1-IDF和ClVST1-IDR为引物进行PCR扩增。

ClVST1-IDF和ClVST1-IDR的引物序列组成如下：

ClVST1-IDF：5’-ATGAACCTCTCCCAGCTC-3’；

ClVST1-IDR：5’-GAAGGGGGTGAGGGAA-3’。

20μL的PCR反应体系为：模板(T0代阳性转基因植株叶片的基因组DNA)、10×Buffer 2μL、10mmol/L dNTPs 2μL、MgSO₄1.4μL、cDNA 1.2μL、KOD-Plus酶0.4μL、ClVST1-IDF引物0.3μL、ClVST1-IDR引物0.3μL、ddH₂O 12.4μL。

PCR扩增的程序为：阶段1：94℃，2min；阶段2：94℃、15s，56℃、30s，68℃、3min，共30个循环；阶段3：68℃延伸10min。

将获得的PCR扩增产物测序。测序结果表明，68棵T0代阳性转基因植株中，35株的基因型与野生型(即未转基因西瓜97103株系植株)的基因型完全一致、靶点区并未发生编辑，33株靶点区域的全部或部分118bp删除均为杂合突变，杂合突变株中ClVST1基因的突变形式为在序列表中序列2(即ClVST1基因)自5’末端起第74位核苷酸残基之后删除118bp。

2、将步骤1的33株含有ClVST1基因杂合敲除的转基因植株自交，收种获得T1代种子，采用上述步骤1中的方法鉴定T1代植株是否转基因和含有ClVST1突变。鉴定结果表明，T1代植株中，含有ClVST1突变的纯合植株约占25％。

3、将来自不同株系的上述含有ClVST1突变的T1代纯合植株分别自交，收种获得ClVST1基因敲除的、来自不同株系的T2代转基因种子。将来自T2代转基因种子播种，获得ClVST1基因敲除的纯合株系VST1-CRISPR用于后续抗病虫鉴定实验。

利用westernblot检测纯合株系VST1-CRISPR中ClVST1蛋白的表达情况，所用一抗为ClVST1抗体，内参为Actin9，内参的一抗为Actin9抗体，并利用97103作为对照(Ctrl)，结果表明，所述纯合株系VST1-CRISPR中不表达ClVST1蛋白。

实施例3：

本实施例用来说明基因敲除纯合株系对细菌性果斑病的抗病反应。

1、对西瓜基因敲除纯合株系的抗病性分析

将实施例2中获得的ClVST1基因敲除的纯合株系VST1-CRISPR(三组，每组取平均值)和受体97103(三组，每组取平均值)分别催芽。以经高温灭菌后的蛭石为基质，播种后用蛭石覆盖，并盖上保温保湿的薄膜，白天育苗温度控制在24-28℃，夜间18℃度左右。参照赵廷昌等报道的西瓜细菌性果斑病人工接种鉴定方法，采用喷雾接种测定菌株致病性。用KB液体培养基28℃振荡培养甜瓜果斑病菌突变菌株、野生型菌株和互补菌株菌液(任争光,林敏,姜文君,等.群体感应系统对甜瓜果斑病菌MH21致病力的影响[J].植物病理学报,2012,42(6):608-608.)至对数生长期，4000r·min^-1离心，使用蒸馏水洗去菌株表面抗性后重悬菌体。

喷雾接种：调节菌液浓度为3×10⁸CFU·mL^-1，将200mL菌液均匀喷洒在3～4叶龄的健壮西瓜幼苗叶片的两面，每个处理接种每种幼苗3盆(每盆5～6棵)，清水对照。幼苗接种后套袋培养，培养条件同注射接种。接种5 d后开始调查植株发病情况，计算病情指数。实验重复3次，结果如图1和表2所示。病情等级按照病情严重度分为5级，标准如下：

0级——叶片无明显发病症状；1级——叶片大约25％的面积坏死病变；

3级——叶片大约50％的面积坏死病变；5级——叶片大约75％的面积坏死病变；7级——整株幼苗死亡。

病情指数DI＝∑(s_i·n_i)/9N×100，其中DI——病情指数；s_i——发病级别(i＝0，1，3，5，7)；n_i——相应病级级别的株数；N——调查总株数。

病情指数小于等于35时，待测植株为抗病植株，病情指数大于等于55时，待测植株为感病植株。

表2

根据图1和表2中的数据可以看出，结果显示VST1基因敲除转基因株系VST1-CRISPR的细菌性果斑病抗性均强于对照97103，并有极显著性差异。

实施例4：

本实施例用来说明基因敲除纯合株系对蚜虫的抗性反应。

1、对西瓜基因敲除纯合株系的抗虫性分析

将实施例2中获得的ClVST1基因敲除的VST1-CRISPR和受体97103分别催芽。以经高温灭菌后的蛭石为基质，播种后用蛭石覆盖，并盖上保温保湿的薄膜，白天育苗温度控制在24-28℃，夜间18℃度左右。参照孙志娟等报道的瓜蚜(Aphis gossypii Glover)人工接种鉴定方法，收集出生12h的1龄瓜蚜若虫，接到西瓜叶片上，叶片置于防虫网中，待瓜蚜长至3龄(第4d)，统计叶片上蚜虫数量(统计每株植株上蚜虫数量，然后取平均值)，结果如表3和图2所示。

表3

结果显示VST1基因敲除转基因株系VST1-CRISPR的蚜虫抗性均强于对照97103，并有极显著性差异。

本发明在前期遗传定位和图位克隆的基础上，克隆了西瓜ClVST1基因，验证了CRISPR技术在西瓜上的敲除效率，探究了ClVST1基因的生物学功能，发明人目前的工作主要是寻找西瓜新型糖转运的下游蛋白，从分子水平上研究病虫害接种条件下基因的表达与调控，完善抗病虫信号的传递与基因表达调控网络，更深入的研究植物对病虫害侵染的响应机制，为有效提高植物抗病虫性奠定良好的分子基础。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 西瓜新型糖转运蛋白其编码基因ClVST1和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 470

<212> PRT

<213> 西瓜(Citrullus lanatus)

<400> 1

Met Asn Leu Ser Gln Leu Gln Leu Asn Asn Leu Ser Val Ala Lys Asp

1 5 10 15

Leu Gly Lys Ala Phe Gly Leu Leu Ala Gly Leu Ala Ser Asp Arg Phe

20 25 30

Ser Thr Ser Leu Leu Leu Leu Ile Gly Ser Ile Glu Gly Leu Ile Gly

35 40 45

Tyr Gly Ala Gln Trp Leu Val Val Ser Gln Lys Ile Lys Pro Leu Pro

50 55 60

Tyr Trp Gln Met Cys Ile Phe Leu Cys Met Gly Gly Asn Ser Thr Thr

65 70 75 80

Trp Met Asn Thr Gly Val Leu Val Thr Cys Leu Arg Asn Phe Arg Arg

85 90 95

Asn Arg Gly Thr Val Ser Gly Ile Leu Lys Gly Tyr Ile Ala Leu Ser

100 105 110

Thr Ala Ile Phe Thr Asp Leu Cys Thr Ala Leu Phe Ser Asp Asn Pro

115 120 125

Ser Ser Phe Leu Ala Leu Leu Ser Leu Thr Pro Phe Ala Val Cys Leu

130 135 140

Thr Ala Val Leu Phe Leu Arg Glu Ile Pro Cys Ser Ala Asp Asn Glu

145 150 155 160

Thr Glu Asp Ser Arg Tyr Phe Trp Val Leu Asn Ala Val Ser Val Ala

165 170 175

Val Ala Val Ile Leu Leu Ala Phe Asp Ser Ile Pro Asn Pro Thr Ser

180 185 190

Ser Val Ser Arg Ile Phe Ser Met Val Leu Leu Ile Leu Leu Ala Ser

195 200 205

Pro Leu Val Ile Pro Leu His Ser Phe Val Lys Asn Arg Gly Arg Ser

210 215 220

Gly Glu Val Ala Glu Ala Leu Leu Ala Asp Glu Ser Ala Val Glu Gly

225 230 235 240

Ala Glu Glu Gly Lys Pro Val Ile Gly Glu Asp His Thr Ile Val Glu

245 250 255

Ala Met Lys Thr Val Glu Phe Trp Ile Leu Phe Gly Ser Phe Leu Cys

260 265 270

Gly Val Gly Thr Gly Leu Ala Val Met Asn Asn Met Gly Gln Ile Gly

275 280 285

Leu Ala Leu Gly Tyr Asp Glu Val Ser Ile Phe Ile Ser Leu Met Ser

290 295 300

Ile Trp Gly Phe Phe Gly Arg Ile Leu Ser Gly Ser Val Ser Glu His

305 310 315 320

Phe Ile Lys Lys Ala Gly Met Pro Arg Pro Leu Trp Asn Ala Ala Ser

325 330 335

Gln Ile Leu Met Ala Leu Gly Tyr Ile Leu Leu Ala Ile Ala Met Pro

340 345 350

Gly Ser Leu Tyr Ile Gly Ser Val Val Val Gly Ile Cys Tyr Gly Val

355 360 365

Arg Leu Ala Ile Thr Val Pro Met Ala Ser Glu Val Phe Gly Leu Lys

370 375 380

Asn Tyr Gly Met Ile Tyr Asn Val Leu Ile Leu Asn Leu Pro Leu Gly

385 390 395 400

Ser Phe Leu Phe Ser Gly Leu Leu Ala Gly Ile Leu Tyr Asp Trp Glu

405 410 415

Ala Thr Thr Thr Lys Glu Gly Gly Asn Met Cys Val Gly Gly His Cys

420 425 430

Tyr Arg Leu Val Phe Val Val Met Ala Cys Ser Cys Val Val Gly Phe

435 440 445

Ala Met Asp Leu Phe Leu Ala Phe Arg Thr Lys Arg Leu Tyr Ser Lys

450 455 460

Met Arg Gly Leu Lys Gly

465 470

<210> 3

<211> 1413

<212> DNA

<213> 西瓜(Citrullus lanatus)

<400> 3

atgaacctct cccagctcca actcaacaat ctctccgtcg ccaaagacct cggaaaggcc 60

tttggcctcc tcgccggcct cgcctccgac cgcttctcca cctccctcct gctcctcatc 120

ggctccatcg aaggccttat tggctacggc gctcaatggc tcgtcgtcag tcaaaaaatc 180

aaaccactcc cttactggca gatgtgtata tttttgtgta tgggagggaa tagtaccact 240

tggatgaaca ccggcgtgct tgttacttgc ctgagaaact tccggcgaaa cagaggcact 300

gtttccggca ttctcaaagg ctacatcgct ctcagtaccg ccattttcac cgatctttgt 360

accgctcttt tctccgataa tccctcttct tttctcgccc tcctttccct cacccccttc 420

gccgtttgtc tcactgctgt tctcttcctc cgtgaaatcc cctgttccgc cgataacgaa 480

acagaggact cgagatactt ctgggtactc aacgccgttt ccgtcgctgt cgctgtcatt 540

ctcttagcct tcgattcgat cccaaatccc acctcgtccg tatcgagaat tttctccatg 600

gtgttgctga ttttgctagc ctcacctctg gtaatcccac tccactcgtt tgtcaaaaac 660

aggggtcggt ccggtgaagt tgcagaggcg ttgctggcgg acgagagtgc ggtggagggt 720

gcggaagagg ggaagccggt gatcggagaa gatcatacga ttgttgaggc gatgaagacg 780

gttgaatttt ggattctgtt tgggtcgttt ctgtgtggag tgggaacggg attggcagtg 840

atgaacaata tgggacagat tggattggct cttggatacg acgaggtttc gattttcata 900

tctctgatga gtatttgggg gttttttggc cggattttat cgggatcagt gtcggagcat 960

ttcatcaaga aagcaggaat gccaaggcca ctatggaacg cagcttctca aattctaatg 1020

gcacttggct acattctctt agccattgcc atgcctggat ccttatacat cggctcggtt 1080

gttgtcggga tttgctatgg cgtccgtctt gccatcaccg tcccaatggc ctctgaagtc 1140

ttcggtctca aaaactatgg catgatctac aatgttctaa tcctcaacct cccactcggt 1200

tcgttcctct tctcaggact gcttgccggg atcctctatg attgggaggc gacaacgacg 1260

aaggaaggcg gcaatatgtg tgtgggaggg cattgttata ggcttgtgtt tgttgtaatg 1320

gcttgttcat gtgtggttgg gtttgccatg gacttgtttt tggcctttag aaccaagagg 1380

ttgtattcca aaatgagggg tctaaaggga taa 1413

Claims

1.一种蛋白质，为如下A1）-A2）任意一种：

A1）序列表中序列1所示的蛋白质；

A2）在A1）所述蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B5)含有降低权利要求1所述蛋白质表达量的核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子。

4.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料的下述任一应用：

D1)调控西瓜抗细菌性果斑病性；

D2)制备调控西瓜抗细菌性果斑病性的产品；

D3)培育抗细菌性果斑病西瓜；

D4)制备培育抗细菌性果斑病西瓜的产品；

D5)培育抗细菌性果斑病性能降低西瓜；

D6)制备培育抗细菌性果斑病性能降低西瓜的产品；

D7)调控西瓜抗蚜虫性；

D8)制备调控西瓜抗蚜虫性产品；

D9)培育抗蚜虫西瓜；

D10)制备培育抗蚜虫西瓜产品；

D11)培育抗蚜虫性能降低的西瓜；

D12)制备培育抗蚜虫性能降低西瓜的产品。

5.下述任一方法：

X1)培育抗细菌性果斑病性或抗蚜虫性降低植物的方法，包括使受体植物中表达权利要求1所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比抗细菌性果斑病性或抗蚜虫性降低的目的植物，所述植物为西瓜；

X2)培育抗细菌性果斑病性或抗蚜虫性增强植物的方法，包括降低受体植物中权利要求1所述蛋白质的含量，或降低受体植物中权利要求1所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比抗细菌性果斑病或抗蚜虫性性增强的目的植物，所述植物为西瓜；

X3)降低植物抗细菌性果斑病性或抗蚜虫性的方法，包括使受体植物中表达权利要求1所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比抗细菌性果斑病性或抗蚜虫性降低的目的植物，实现植物抗细菌性果斑病性或抗蚜虫性的降低，所述植物为西瓜；

X4)提高植物抗细菌性果斑病性或抗蚜虫性的方法，包括降低受体植物中权利要求1所述蛋白质的含量，或降低受体植物中权利要求1所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比抗细菌性果斑病性或抗蚜虫性增强的目的植物，实现植物抗细菌性果斑病性或抗蚜虫性的提高，所述植物为西瓜。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：X2)和X4)所述方法通过向所述受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现；

X1)和X3)所述方法通过敲除所述受体植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因实现。

7.调控植物抗病性或抗虫性的产品，含有权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料。