CN109467594B

CN109467594B - Bcdmt2蛋白质及其编码基因在调控灰霉菌致病力与分生孢子产生中的应用

Info

Publication number: CN109467594B
Application number: CN201811432903.1A
Authority: CN
Inventors: 田世平; 张占全; 李博强; 何畅
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2038-11-28
Also published as: CN109467594A

Abstract

本发明公开了Bcdmt2蛋白质及其编码基因在调控灰霉菌致病力与分生孢子产生中的应用。本发明提供的基因Bcdmt2来源于灰霉菌(Botrytis cinerea)，在营养生长、分生孢子的产生量和致病过程中起重要作用。通过对野生型灰霉菌中Bcdmt2进行敲除实验发现：敲除Bcdmt2后的灰霉菌的致病力、分生孢子的萌发率以及产孢量均显著降低。说明Bcdmt2不仅是灰霉菌致病力的重要调控基因，而且是灰霉菌分生孢子产生的关键基因，在植物病原真菌病害的防治中具有广阔的应用前景。

Description

Bcdmt2蛋白质及其编码基因在调控灰霉菌致病力与分生孢子产生中的应用

技术领域

本发明涉及植物病理学和微生物基因工程领域，具体涉及来源于灰霉菌(Botrytis cinerea)的Bcdmt2蛋白质及其编码基因在调控灰霉菌营养生长、分生孢子产生量和致病过程中的应用。

背景技术

灰霉病(grey mould)是一种给农业生产造成巨大危害的病害，是很多重要的经济作物，如葡萄、草莓、番茄、玫瑰等在采前生产和采后贮藏过程中的一个重要病害。灰霉病病原菌为Botrytis cinerea，属于子囊菌亚门、葡萄孢属的灰葡萄孢菌。B.cinerea是一种死体营养型病原真菌，其寄主范围极其广泛，可以侵染200多种植物。B.cinerea主要以菌核形式在土壤中或以菌丝及分生孢子在病残体上越冬或越夏，待条件适宜菌核萌发产生菌丝体和分生孢子梗及分生孢子。分生孢子成熟后脱落，借气流、雨水、露珠或农事操作进行传播。萌发时产生芽管，从寄主伤口或衰老的器官及枯死的组织上侵入。发病后，在病部又可以产生大量分生孢子，借气流传播进行再侵染。它可以从寄主的多个器官侵入，包括花、茎、叶和果实等。该病原菌在成熟衰老的组织上表现出很强的致病力，在植物组织发育的早期阶段便可以侵入寄主组织中处于潜伏状态，当寄主的生理状态和环境条件有利于其侵染时便可以导致寄主组织的迅速腐烂。因此该病原菌可以在成熟的果实上造成比较严重的病害，尤其在很多果蔬的采后运输和贮藏阶段造成严重的腐烂，带来巨大的经济损失。同时，由于B.cinerea的侵染可以造成一些鲜花的插花寿命缩短，在2002年荷兰所种植的玫瑰和非洲菊中有10-20％检测到了灰霉菌的侵染，造成了巨大的经济损失。

由于灰霉病在农业生产上的重要性，对其致病机制进行深入研究越来越受到人们的高度重视。最近一项关于植物病原真菌的调查中显示，B.cinerea在所有的植物病原真菌中重要性位列第二。目前针对灰霉病的抗病育种仍然没有成功，因此对灰霉病的防治主要依赖于化学农药。化学农药的长期使用导致病原菌抗药性的出现，从而使药效显著降低。因此，急需寻找针对灰霉病的新的防治靶标，这需要我们更深入的了解其致病机制。鉴定和克隆植物病原真菌的致病或产孢相关基因可为设计和筛选抗真菌药物提供有用的靶标位点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何防治灰霉病。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了来源于灰霉菌(Botrytis cinerea)的Bcdmt2蛋白质的新用途。

本发明提供了Bcdmt2蛋白质在如下1)-7)中任一种应用：1)防治灰霉病；2)调控灰霉菌的致病力；3)调控灰霉菌菌丝的生长；4)调控灰霉菌分生孢子的产生；5)调控灰霉菌分生孢子的产量；6)调控灰霉菌分生孢子的萌发；7)设计和筛选抗真菌药物；

所述Bcdmt2蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

b)在序列3所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列3所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列3所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

为了解决上述技术问题，本发明又提供了与Bcdmt2蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与Bcdmt2蛋白质相关的生物材料在如下1)-7)中任一种应用：1)防治灰霉病；2)调控灰霉菌的致病力；3)调控灰霉菌菌丝的生长；4)调控灰霉菌分生孢子的产生；5)调控灰霉菌分生孢子的产量；6)调控灰霉菌分生孢子的萌发；7)设计和筛选抗真菌药物；

所述生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：A1)编码Bcdmt2蛋白质的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：1)其编码序列是序列1所示的基因组DNA分子或序列2所示的cDNA分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码Bcdmt2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码Bcdmt2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码Bcdmt2蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码Bcdmt2蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码Bcdmt2蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述Bcdmt2蛋白质作为靶点在设计和筛选抗真菌药物中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述调控灰霉菌菌丝的生长体现在调控灰霉菌菌丝的生长速率；所述调控灰霉菌分生孢子的萌发体现在调控灰霉菌分生孢子的萌发率。所述调控具体为降低。

上述应用中，所述真菌具体为灰霉菌Botrytis cinerea。

本发明还提供了上述Bcdmt2蛋白质或上述生物材料在培育致病力降低和/或分生孢子萌发率降低和/或分子孢子产量降低的转基因灰霉菌中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育致病力降低和/或分生孢子萌发率降低和/或分子孢子产量降低的转基因灰霉菌的方法。

本发明提供的培育致病力降低和/或分生孢子萌发率降低和/或分子孢子产量降低的转基因灰霉菌的方法包括降低受体灰霉菌中Bcdmt2蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因灰霉菌的步骤；所述转基因灰霉菌的致病力和/或分生孢子萌发率和/或分子孢子产量低于所述受体灰霉菌。

上述方法中，转基因灰霉菌的致病力低于所述受体灰霉菌具体体现在转基因灰霉菌侵染引发的病斑直径小于受体灰霉菌侵染引发的病斑直径。

上述方法中，所述降低受体灰霉菌中Bcdmt2蛋白质的表达量和/或活性的方法是通过对所述受体灰霉菌中Bcdmt2蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或沉默表达来实现的。

进一步的，可采用同源重组的方法对所述受体灰霉菌中Bcdmt2蛋白质的编码基因进行敲除。

更进一步的，所述采用同源重组的方法对所述受体灰霉菌中Bcdmt2蛋白质的编码基因进行敲除的方法为将用于进行同源重组的同源重组片段导入受体灰霉菌的原生质体中。

在本发明的具体实施例中，所述用于进行同源重组的同源重组片段的核苷酸序列可为序列4。其中序列4第1-820位为同源重组臂Flank L的核苷酸序列，第821-3161位为潮霉素B抗性片段HPH的核苷酸序列，第3162-4520位为同源重组臂Flank R的核苷酸序列。

上述同源重组片段也属于本发明的保护范围。

上述方法及上述同源重组片段在防治灰霉病中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供了来源于灰霉菌(Botrytis cinerea)的Bcdmt2蛋白质及其编码基因在调控植物病原真菌灰霉菌致病力及分生孢子产生中的应用。通过对野生型灰霉菌中Bcdmt2进行敲除实验发现：敲除Bcdmt2后的灰霉菌的致病力、分生孢子的萌发率以及产孢量均显著降低。说明Bcdmt2不仅是灰霉菌致病力的重要调控基因，而且是灰霉菌分生孢子产生的关键基因，在植物病原真菌病害的防治中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为Bcdmt2的基因结构(A)和蛋白质结构域(B)示意图。A中红色空心框为UTR序列，红色实心框为蛋白编码序列。

图2为Bcdmt2基因敲除策略。

图3为Bcdmt2敲除突变株的检测。A为转化株PCR检测；B为单孢分离后PCR检测；C为Southern blot检测。

图4为Bcdmt2敲除突变株的菌落形态和生长速率检测。

图5为Bcdmt2敲除突变株致病力检测。

图6为Bcdmt2敲除突变株产孢量(A)和孢子萌发率检测(B)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的pLOB7载体记载于文献“Zhang LS,Thiewes H,van Kan JAL.TheD-galacturonic acid catabolic pathway in Botrytis cinerea.Fungal Genetics andBiology,2011,48:990-997.”中，公众可从中国科学院植物研究所获得。

下述实施例中的Bcdmt2基因全长为9735bp，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。Bcdmt2基因的cDNA序列长度为9030bp，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。

Bcdmt2基因编码的Bcdmt2蛋白质长度为2478个氨基酸，其氨基酸序列如序列表中序列3所示，分子量为277.9kDa。Bcdmt2基因结构和Bcdmt2蛋白质结构如图1所示。

实施例1、Bcdmt2敲除突变株的构建及表型分析

一、Bcdmt2敲除突变株的构建

利用基因侧翼序列同源重组的原理，将灰霉菌基因组上的Bcdmt2基因替换为潮霉素B的抗性基因，从而实现将Bcdmt2目的基因敲除的目的，敲除策略如图2所示。具体步骤如下：

1、敲除载体的构建

以Bcdmt2目的基因上下游序列为模板设计引物，扩增出上下游重组臂(500-1000bp为宜)，以pLOB7载体为模板，扩增出潮霉素抗性片段，通过融合PCR方法将上下游重组臂连接在潮霉素抗性片段两端。具体步骤如下：

(1)引物的设计：分别设计融合片段的扩增引物：P1/P2、P3/P4、P5/P6。其中，引物P2和P3，P4和P5分别有20bp的重叠序列。引物序列如下(下划线部分为重叠序列)：

P1：ATTGATAGGTGGACGAGACT；

P2：AATCGGAATGCGGCTCCACAGAGATGGAATGATTGAGAAA；

P3：TTTCTCAATCATTCCATCTCTGTGGAGCCGCATTCCGATT；

P4：ACAACATGAGCCTAACAGCTAGGCAACCATGCATGGTTAC；

P5：GTAACCATGCATGGTTGCCTAGCTGTTAGGCTCATGTTGT；

P6：CATATTTGAGTTCGCTGGAT。

(2)待融合片段的扩增：以灰霉菌基因组DNA为模板，使用引物P1和P2，扩增FlankL；以pLOB7载体为模板，使用引物P3和P4，扩增潮霉素抗性片段HPH；以灰霉菌基因组DNA为模板，使用引物P5和P6，扩增Flank R。电泳检测条带，然后切胶回收。

(3)融合后片段的获得：分别取5μL的待融合片段Flank L、HPH和Flank R，重新加入高保真酶和dNTPs，buffer等(此步骤不加引物)，延伸12轮，每轮延伸时间为10min左右。

(4)融合后片段的扩增：取10μL上述(3)获得的PCR反应液，加入引物P1和P6进行第3轮PCR。

电泳检测，切胶回收融合后片段。

(5)同源重组片段的扩增：将融合后的片段与T载体连接，得到重组载体，并将其转化感受态细胞，培养后提取质粒，在-20℃保存备用。用高保真DNA聚合酶从构建好的重组载体上扩增转化用的同源重组片段。同源重组片段用高保真酶扩增4管(50μL)作为一次转化的用量，之后将PCR产物合入一管。同源重组片段的核苷酸序列如序列表中序列4所示。其中序列4第1-820位为同源重组臂Flank L的核苷酸序列，第821-3161位为潮霉素B抗性片段HPH的核苷酸序列，第3162-4520位为同源重组臂Flank R的核苷酸序列。

(6)同源重组片段的回收：无水乙醇沉淀法回收PCR产物：向200μL PCR产物中加入2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M醋酸钠；-20℃放置20min后，13000g离心15min，收集沉淀；最后用75％的乙醇洗涤沉淀一遍，用100μL的dd H₂O溶解备用。

2、原生质体的转化

通过PEG介导的原生质体转化的方法将步骤1回收的同源重组片段导入野生型灰霉菌株B05.10原生质体中，在含有潮霉素B的抗性平板上筛选具有潮霉素抗性的转化株。

3、敲除突变株的获得

提取转化株的基因组DNA，通过PCR方法筛选阳性敲除突变株，通过单孢分离排除异核体转化株。具体步骤如下：分别在重组序列外侧的灰霉基因组区域和抗潮霉素B抗性基因HPH内部区域设计正反向引物(正向引物：TTTGCCGTTCGTGTTATTGT；反向引物：TTGTTTGCTGGTTACGCTTT)，PCR扩增转化子基因组。只有在目的基因位置发生了同源重组后才可以扩增出预计大小的目的条带(1301bp)，野生型菌株中由于不存在潮霉素B抗性基因HPH，因此不能扩增出目的条带(图3A)。通过在潮霉素B抗性平板上进行单孢分离后，挑取若干单个孢子生成的菌落，提取各个单孢菌株的基因组DNA。之后用引物对D-F/D-R(D-F：GAACAACAAGGCGTAAGTCA；D-R：TAGTCTAGTTAGCGGTCC AAG)扩增单孢菌株基因组DNA。野生型菌株扩增出大小为8752bp的条带，纯合的敲除突变株扩增出大小为3419bp的条带，杂合的敲除突变株扩增出大小为8752bp和3419bp的两条条带。

结果显示本发明所获得的突变株为纯合突变株(图3B)，并将其命名为△Bcdmt2。

4、Southern blot杂交方法验证突变位点

通过Southern blot杂交方法验证突变株△Bcdmt2突变位点的正确性。具体步骤如下：(1)基因组DNA提取：用CTAB法提取基因组DNA，基因组的质量要求没有降解，并且有足够多的量，Southern blot需用10μg左右。(2)地高辛标记杂交探针：用地高辛标记的Dig-dUTP扩增探针(L重组臂)，同时用普通dNTP扩增做对照，用琼脂糖电泳检测标记效果，由于探针上标有了地高辛，所以与同样大小的用普通dNTP扩增的片段要跑的慢。(3)基因组DNA的酶切：用限制性内切酶XbaI酶切10μg基因组DNA过夜(50μL体系)，切后取出4μL电泳检测，若酶切完全会出现均匀的弥散现象。(4)电泳：用较低的电压(1V/cm)在不含EB的1％琼脂糖凝胶(用长胶，跑到大约2/3处)中跑大约5小时。(5)转膜：电泳结束后用碱性转移液将凝胶变性15min，室温下轻轻震荡，换一次液继续浸泡凝胶20min，并轻轻震荡，之后准备转膜。将凝胶的左上角切去一个小角作为标记，将点样孔向下放置，采用毛细管作用法转膜过夜。(6)固定DNA于膜上：将膜浸于适量的中和缓冲液中，室温15min，之后将膜取出并使多余的液体流净，夹在滤纸中间(不含DNA的一面先接触滤纸)置于80℃烘箱中烘烤1h。(7)预杂交：将固定后的膜放入杂交袋中，在封口机上将杂交袋三面封口，加入65℃预热的Hyb高效杂交液5mL，排尽气泡，封口。放在65℃水浴震荡杂交2小时。(8)探针的变性：将探针在100℃变性10min，之后迅速置于冰上冷却备用。(9)杂交：将杂交袋从水浴中取出，剪去一角并尽可能的排尽袋中的预杂交液，取Hyb高效杂交液5mL，加入变性的探针(5-20ng/mL，一般加过量)，混匀。加入杂交袋中，小心排尽气泡，封口，65℃水浴震荡杂交过夜。(10)洗膜：剪开杂交袋，用镊子取出膜，放入装有20mL的2×SSC，0.1％SDS溶液的平皿中，在室温下震荡洗涤两次，每次5min。之后用镊子将膜转入0.1×SSC，0.1％SDS溶液(先放入50℃水浴中预热)中，50℃水浴震荡洗涤两次，每次15min。之后用镊子将膜取出转入装有20mL洗涤缓冲液的平皿中震荡洗涤5min。(11)信号检测(所有孵育过程应在15-25℃下搅动进行)：A，在杂交和严谨洗涤后，在洗涤缓冲液中浸润5min。B，在20mL阻断液中孵育30min。C，在10mL抗体液中孵育30min。D，在20mL洗涤液中洗涤2×15min。E，在15mL检测缓冲液中平衡5min。F，在避光条件下，与10mL新鲜制备的显色底物液中反应显色。在显色过程中勿摇动。G，当达到所需的带强度后用50mL双蒸水或TE缓冲液将膜漂洗5min终止反应，结果照相保存。(12)检测结果：突变株△Bcdmt2杂交条带大小为4855bp，野生型菌株杂交条带大小为10188bp(图3C)。说明本发明所获得的突变株△Bcdmt2在目的基因Bcdmt2处发生了同源重组，使潮霉素抗性基因HPH替换掉了目的基因Bcdmt2，并不存在异位重组的现象。

二、Bcdmt2敲除突变株关键表型分析

1、Bcdmt2敲除突变株生长速率检测

将Bcdmt2敲除突变株(△Bcdmt2)和野生型灰霉菌株(B05.10)接种于PDA培养基中在22℃恒温培养箱中静置培养，培养过程中观察Bcdmt2敲除突变株(△Bcdmt2)和野生型灰霉菌株(B05.10)的生长情况，并分别于培养1、2和3天后测定菌落直径大小。

结果如图4所示。与野生型灰霉菌株(B05.10)相比，Bcdmt2敲除突变株(△Bcdmt2)在PDA培养基上的气生菌丝较为稀疏(图4A)，生长速率显著降低(图4B)。在接种培养2天和3天后，Bcdmt2敲除突变株(△Bcdmt2)菌落直径比野生型灰霉菌株分别小了52％和56％(图4B)。说明Bcdmt2是调控灰霉菌菌丝生长的关键基因。

2、Bcdmt2敲除突变株致病力检测

通过接种番茄叶片的方法检测Bcdmt2敲除突变株的致病力。具体步骤如下：

将Bcdmt2敲除突变株(△Bcdmt2)和野生型灰霉菌株(B05.10)分别接种到PDA平板上置于22℃恒温培养箱中培养10天。然后分别用PDB液体培养基将Bcdmt2敲除突变株(△Bcdmt2)和野生型灰霉菌株(B05.10)的孢子配成浓度为1×10⁵个/mL的孢悬液。剪取培养4周左右的健康番茄叶片，铺在用灭菌蒸馏水浸湿的滤纸上，置于培养皿中。不同菌株的孢悬液各取5μL，接种到番茄叶片上，然后在25℃条件下培养。每隔24h统计发病率和病斑直径，并拍照记录。

结果如图5所示。结果显示Bcdmt2基因敲除后导致其致病力的显著降低。在番茄叶片上接种孢悬液培养48小时后，野生型灰霉菌株侵染引发的病斑直径为12mm，而Bcdmt2敲除突变株(△Bcdmt2)侵染引发的病斑直径为8mm，Bcdmt2敲除突变株(△Bcdmt2)的病斑扩展速率比野生型灰霉菌株低33％。说明Bcdmt2是调控灰霉菌致病力的关键基因。

3、Bcdmt2敲除突变株产孢量及孢子萌发率检测

灰霉菌所产生的无性分生孢子是其最重要的传播和侵染形态。因此，灰霉菌分生孢子的产量是影响病害流行程度的重要因素。为了探究Bcdmt2对灰霉菌产孢情况的影响，进行如下实验：将Bcdmt2敲除突变株(△Bcdmt2)和野生型灰霉菌株(B05.10)接种于PDA培养基上在22℃恒温培养箱中静置培养，分别于培养2h、4h、6h和8h后检测分生孢子的萌发率，并于培养2周后检测分生孢子的产量(产孢量)。

结果如图6所示。结果表明Bcdmt2敲除突变株(△Bcdmt2)的产孢量与野生型灰霉菌株相比受到显著的抑制。野生型灰霉菌株平均每板的孢子产量达到了22.6×10⁶个，而Bcdmt2敲除突变株(△Bcdmt2)平均每板的孢子产量仅为3.0×10⁶个，比野生型灰霉菌株降低了87％(图6A)。同时，Bcdmt2敲除突变株(△Bcdmt2)所产生的分生孢子的萌发率较野生型灰霉菌株也有显著下降(图6B)。说明Bcdmt2基因是调控灰霉菌分生孢子产生的关键基因。

序列表

<110>中国科学院植物研究所

<120>Bcdmt2蛋白质及其编码基因在调控灰霉菌致病力与分生孢子产生中的应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>9735

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

ggttaccaca tcacttacag taaagtgggg gaagggagag gggaggggat tatcctgaag 60

tatatttacc aggtacacta aaagtgagga gattgaaagg ctctcacagg agctaaccca 120

cctgtatagc aagccatagg aatagggatg cttcgaacat caccgttgta agatcgtggt 180

ctacaggtat agctgcctcg aaggctgata gtgtaatgcc aaatatcggt agggcccatc 240

tgcatatcaa gctagagcct agatcgttga tctcaaccga gaccgtggct tcggctctag 300

tgctgtggtg aaggcagaag ctaggcaact cgacgaaaac ttggagatga gatgggttgc 360

tcacagatac agatagtgtc tttctccctt tgccgttcgt gttattgttt ttcatattgg 420

gtgttggctt aaacttcaac ctacttcaat ttttcgaaac atcagcccag ggaactgtcg 480

gggtatacac ttacatgtga taatacttca tcgatcaatg ctttgctatt ttgaggtctg 540

attcacctca aattattgtc tgcataccag tggctgtctt tggatgaagc taagcaatga 600

gaacataagc aatatcaaat gaagggcaat aatttcaacc aattgatagg tggacgagac 660

tgtttggcta aaggcggtca atgcaaatcg ctgctgagcg ggtgcgatcg ggcaaacggc 720

tcacttcagt tactgcaaat tcttccactc gcgactttga acacacaacc acaaacaaat 780

tcccactttc gacgttttca ccaagaactt ctcctagaat tcaaaaattt ccgcagcatc 840

atccttgatt ttttccgatc cttggcaaag ctacgagaga cgtggaaggt aattatcctt 900

tgcttatggg tttctgcgac tcttccgcat atcacagtgt actccactta tccattttgc 960

aaatatttca agcagccact gactgagttt catcaatagt atcacaaaat taccaagctt 1020

tataacttac gaaatatcat ccatcaggtc tagttccttc ctctaacaac tggagaacaa 1080

caaggcgtaa gtcatttctg tctttataca tttttctcat catgtctagt tccgtctcta 1140

ctctcttgct tcggcatcag ccaatacctc tttactacat tctttttagc catgtattac 1200

ccctcacatt accaggaaca tcgttttact atactgtttg cattttcttt gcttgttcgc 1260

atttccaaaa tgttgcacta attttgagct ctccctcttc cttttcttca ccatcctcat 1320

tcagcaccat caatacctgc agtgcagttg acaggttcta gctgcttggt ataaagatag 1380

accttgttta ctaaatcctc aacccgcaaa agatttcttt ggaaaagtta accattcacc 1440

atttctcaat cattccatct cttatcgggt gtggtatact tctttgggga agcaaaactt 1500

tatctacgtt aactaaccag ctttttatca gacgatttgc tcaacatggc gaagaaacgc 1560

cagaagactt cgcgtccagc accatgtgtt gaagatggat ccgatttaga ggatgaagat 1620

ggcaatggtg gtattgattc agacgatcaa gcaccaggtc ttcatgatca aaagaggaga 1680

accgatgaga gtaaacagtg gaacaccctc agcttcgcgg agggaatcga ctcaagtctt 1740

cctccactta ctactgccac ggaatttatg gagatcttgc ttgaaagatt gttgaatggg 1800

ggattcaaag acgttataaa gcacctcaat ggtcggcctt tgcgcgtcgc caccgcatgt 1860

tccggcactg aagcacccat cctgtttctg aattcttttt ccgaaggtag tatctcaaaa 1920

gatctttttc aattaaagtc taacaatgaa atctaggatt aaggaaaaga ggtcatgact 1980

tcagaattga gcatgtcttc tcatgtgaaa ttgatccggc taaacaatct tacattcgtc 2040

gaaactttca taatgttcct attctacgtg atatcacaga agtcttcgag tgggagggta 2100

accctgaaaa gataggtttt atgtaggttg aagtgtccga aagttttgtt cttggttaac 2160

atgttatagg actaccgctt ttggtagaac ttatgcgctt ccagcaccgg gtacagttga 2220

cgttatcatc gttggtactt cttgcaccag ctattccaat ttgaacaacc aaaagagtac 2280

ggacttggag agagaccaaa ctgagtcatc gcgcactttc cgcgcatatg ttttgcttgt 2340

taagtatcta aaagcaaaga tcgctatcag cgaaaatgtc ctgagtggcc ctttcgaggc 2400

tatgattaaa atgctgggcg atcacggtta catcggtggc tcagcaaacc tcgacagcaa 2460

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ttctaagcct attaccgatt ggcgcagtgc gggcaactat tgtcatcctg ataattggcc 2820

ccgtaatctt aaaggctttg tagaacgtgt tcacgacgtt actgatgtca gccatttgcg 2880

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tgttgcaaat tactgatatc atgtccagtc gaaacatcga tttgtcacaa aacgtttatg 3000

ttcagcacga taacgtgaag tgcggtctat tgccttgctt gacaccaaac ggtgtcatgt 3060

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cacaaactga tatatcacga tcgtcaattg tcaaatgcaa gaactgtggg catgtttcat 3480

gtactaactg tgggattaag ccgcgtcatg cctatgagcc tttggatctc tacattggcc 3540

ctcgaggtac caagggtatt actcctcgta tttcgccttc gtccatcgag ttcaatattg 3600

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gtaattcttt tttaaattgc ctacaatcca tagtcaagtt tcagaagccg gtccgatctt 3780

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acagctcaag aaccatattc gattgcacat ggcagatatg gcagccaaag attcgcaccg 4020

ctcaggcgac tatcagctat ggaggcgacc tcatttcgac ttacgaaagc tcaatcgatc 4080

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tcgatcatga aggaggcaca ggggactgga acaagcatgg gtttgtcttc acttacgatc 4320

aaacacgcaa agaatttgga gtatgcagac aaatcattgc ttcgctttgc acctcgtggg 4380

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gggaaccaga tcattggatc aacgtcacta agcaaaatgg tacccaattt tttaagggct 4740

gttaccatct gttagctcgt ggcttggtta ctccaggaat cgatgaggcc gatccgcctt 4800

ggattccatg caacaaacaa ggcgactctt catgtcggtg cgacgattgt gcaccaccca 4860

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ctgcgccaat tgcaacacaa accccttact caactcatct tgtgccaaat ataacaatac 8400

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aagcccgcat acgtaatgct ctcgcagacg atgtgcctgt agattggact cgcgttggca 8760

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ttctcgacat tgccgacgag tctgctgccg gatccaattt aactgtcgct cagcacatca 8880

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tgggtcgtgc aattcgtcaa ggtcaagcac caggtagcac tgtgactgtt catcatctac 9000

ttgttcagga ttctgtcgag actgatattg cttttcaact tatggatgat caatttccag 9060

gaaggatcaa tgcaacgcat ttactttcta aacataaatc taacattgaa cctgcctttt 9120

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accatgttca aactgcaaat ctgctataca ataccggcta gtgtatgctc taacatatgt 9240

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ctttggtcaa gctacataag ggatacatgg atttagatcg agtagatcat tcaaaattac 9360

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caagggattg gttgattgtt tcacaggttg cagtagtgag ggcggtagta atcacttcag 9480

tgttcttcaa aaagaggagt ttgtctttca aatgtagtag atagtatgaa ttctcagatt 9540

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tagacgatga gaaaggatac tcatttcatt tgtttttagc tattacgaga cttcttccag 9660

tcgcataaat gcttccaaca gaaatagaat aagaatcatg gatttttata ttaaatagaa 9720

ccgactaact ttaca 9735

<210>2

<211>9030

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

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tatatttacc aggtacacta aaagtgagga gattgaaagg ctctcacagg agctaaccca 120

cctgtatagc aagccatagg aatagggatg cttcgaacat caccgttgta agatcgtggt 180

ctacaggtat agctgcctcg aaggctgata gtgtaatgcc aaatatcggt agggcccatc 240

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tgctgtggtg aaggcagaag ctaggcaact cgacgaaaac ttggagatga gatgggttgc 360

tcacagatac agatagtgtc tttctccctt tgccgttcgt gttattgttt ttcatattgg 420

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attcacctca aattattgtc tgcataccag tggctgtctt tggatgaagc taagcaatga 600

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actatgctaa catgaaagtc atgtgttcgc gccctgctag cagtgacgct gagcagtgga 1980

tggagccatc tgattcaaag gcactccggt ctcaggtcga atttcaagtt gaatcacgtg 2040

cggtcgcaaa gtgggatacg tgctgtgcga ggcattttga ttatcgccat gcacagggct 2100

tcggtacttc taagcctatt accgattggc gcagtgcggg caactattgt catcctgata 2160

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atttgcgtgg catatgccga ggttatgatg accgttacct cagtcgaaac atcgatttgt 2280

cacaaaacgt ttatgttcag cacgataacg tgaagtgcgg tctattgcct tgcttgacac 2340

caaacggtgt catgtttaat actgcacgtg gtagcaagct tactggtgaa gaatatcttc 2400

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aaagctcaat cgatcttcct gcctggaaag gagattttat attctcaaag aaaaccatcc 3420

aggtcctaga tgatcatccc gcgttcgggg aaatcaatgg tgtttatata gcgcatccgg 3480

aatgtcaaca ggcttttaat agctaccatt ccaagaatgg cactgccgga ggagataatc 3540

aaatacattt tttcttcgat catgaaggag gcacagggga ctggaacaag catgggtttg 3600

tcttcactta cgatcaaaca cgcaaagaat ttggagtatg cagacaaatc attgcttcgc 3660

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gagataccgt gtacaaaagt cttcccttgc taaaagaagg aatgagtgaa gttgtcgaga 3780

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ttatacctcc ttattgggaa ccagatcatt ggatcaacgt cactaagcaa aatggtaccc 4020

aattttttaa gggctgttac catctgttag ctcgtggctt ggttactcca ggaatcgatg 4080

aggccgatcc gccttggatt ccatgcaaca aacaaggcga ctcttcatgt cggtgcgacg 4140

attgtgcacc acccaagcca gatatgctat ggcatttgaa gagaagcggg caaagaattc 4200

agcaaacccc attcgaaaat ccaccagcag ctgcgatctt tgagacttta acaaagaatg 4260

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agtatcaatt ccttatctgt cccgcggttt tgtgtcatca agcagctgcg cttcttaatt 4380

tgtttccacg cccagagatt cctgtgcacc tctcgtggcg tttccttcct ggagcttggg 4440

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ctcagaaaga gagacgggag ctcttggcgt atcttttgga aaggctccca atggaagtag 5160

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agacttttca gaaatacaag aaaaatgttg cggatgctgg ggttaatgag ccacatattc 5280

cttcaatgcg gcgtaagggc gcagaacttg ttaaatatct catggaggaa gccaagaagg 5340

atttcaaggg caagggcaaa cccagaacta atgtcttgat tgatgaggca gatgctgaga 5400

agacgttcga gttccactac tttgaagatg attgtgttga tggccttact ggggtatgtt 5460

tgtcagattt tgcctggtct cggtgcgtca tagatgaagt tggctacata acccgcagga 5520

atatgcaggt ggctatatat tcactgacag ctcaatcccg gtgggccttg tcagcaacac 5580

ctgatattgt tgatttcaaa tcgacttcaa gaattgcccg gtgccttggt attaatctcg 5640

gtgtcgacga ccaggagaca ctccgcaatg ataagaattt gactagcgcg gaaaggtttt 5700

tatcctatgg acctgacgca tcggcaacct ggcattctca aagactccaa gttgctcaag 5760

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agactatcaa agacttgaaa gcagccgcgc tcaatgaaat caatgcttcg aaaaactatt 6120

tgcgccaaca gatggagcta ctcgattatt tggtgacaga gaaattagtc ttcaaggatg 6180

cccaactggt tcttagatat aggaactggg aaactcaagt tttagccgga tatcgttacc 6240

ccgaccccga cgctcttctt gatatcctcc aagttgtcaa aggcgttcga aggacaaagt 6300

ctagtaagac caaagatgac ttttactatg aaaatcctgg tcctgcttat ggtcgccgtc 6360

tctggccttc tcaaactgag acaatcatgc acaacggtcg caaaacgctt ggtctaattg 6420

ccgaatttaa gatagggctc atcgaattaa acaaaactgc tatggacctt atgcaattta 6480

gagcggatta tcgctattat aggtctgtgg ggcagattga ccaagctggt agcgtaacac 6540

ctgcaggaag tctcacttgt aactgttgca acaagagtac acctttgtac gaagcagtca 6600

ttcaaggtag ctgtggccat atcctatgta ggaaatgcaa cgaaacctca tcggaaggca 6660

attgcccaat tgaacactgt gctgcgcaat cactagatga ccaaaagtac ttggcgtcat 6720

ccttatattc ttcggctgga aaatttcccg agcgcaaaga accaggaact aaacccgacg 6780

agctttcact attctggaat aacccaagtg ttcgagtcga caagctgaca gctatgcggt 6840

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agtacttgct cattgctcag caaatgatgg aagctgatgg tgttccttgt atcaacctga 6960

agggcaagaa gaaggatgtc gctgactatc ttgaaaactt caagcaaaat agaggcatgc 7020

gattcaggga tgacaaaaaa caggccaagc ccagaacacc tgcacaaatc aaagcggcag 7080

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agctaagcat tcgggttaat ccaaattctc aaatccccca aaagagaaag aggaaagcta 7260

tggctacaaa aggtaaagct gcagaagttg aagtagaatc tgttggtatt gcaccagtcg 7320

atagtgacac tactccggtc gaattcacgc cagcttctgt cgagacaaac attcaggtca 7380

aaccagcctt tcaagggccc caaaaaagaa aaagaaatga ttctgtcgac aacactctaa 7440

tggatccggt ttccaaagtt cgccgtgtta ccttaccaga ttcagttgat ccaacgccag 7500

ttgcttcaga gtccacactt gtttcagatt ctcaaggtgc ttcggtcggc cacgacgacg 7560

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ttaattccga tcctcctgcg ccaattgcaa cacaaacccc ttactcaact catcttgtgc 7680

caaatataac aatacagccc caattaaacg ctgaggatta tatgattacg actaaattgg 7740

gacatgaggt tgatcatgct ggaaatatta tttacgcgga tcaggataac cctattcaag 7800

ctcgtgaact cattgatgat gaaaatgcag cttatgatgc tcctccgccc tcattccctg 7860

tctcaaatcc tactcgatct gcgaaagaga caaaaagggc tataaaggca tggatagctg 7920

gcaacgagaa gatgattcaa tatccaccac ttaattcttc tgagctcgaa gacattaagg 7980

aagccgctgc tcctgaagcc cgcatacgta atgctctcgc agacgatgtg cctgtagatt 8040

ggactcgcgt tggcaaggag gcgtttgatc ctgaagactt tgctgagaac cctgatccca 8100

ccgctcgtat cttgtttctc gacattgccg acgagtctgc tgccggatcc aatttaactg 8160

tcgctcagca catcatcttc ttgactcctt actttgccga aaagcaaaag tacaattctt 8220

caatgactca ggcaatgggt cgtgcaattc gtcaaggtca agcaccaggt agcactgtga 8280

ctgttcatca tctacttgtt caggattctg tcgagactga tattgctttt caacttatgg 8340

atgatcaatt tccaggaagg atcaatgcaa cgcatttact ttctaaacat aaatctaaca 8400

ttgaacctgc ctttttcaac agataggcta agctgttagg ctcatgttgt ttctgcacgg 8460

tctctctctt cgtcgaccat gttcaaactg caaatctgct atacaatacc ggctagtgta 8520

tgctctaaca tatgtgtacg aacgctattt actcagtctg tatacctcag agttcaagtc 8580

ttactcactc acttcctttg gtcaagctac ataagggata catggattta gatcgagtag 8640

atcattcaaa attacacgag agaatttttc attcgaggtg gctactttcg agattttcat 8700

ttcatttatt actcgcaagg gattggttga ttgtttcaca ggttgcagta gtgagggcgg 8760

tagtaatcac ttcagtgttc ttcaaaaaga ggagtttgtc tttcaaatgt agtagatagt 8820

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cgagacttct tccagtcgca taaatgcttc caacagaaat agaataagaa tcatggattt 9000

ttatattaaa tagaaccgac taactttaca 9030

<210>3

<211>2477

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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Ser Lys Gln Trp Asn Thr Leu Ser Phe Ala Glu Gly Ile Asp Ser Ser

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Leu Pro Pro Leu Thr Thr Ala Thr Glu Phe Met Glu Ile Leu Leu Glu

65 70 75 80

Arg Leu Leu Asn Gly Gly Phe Lys Asp Val Ile Lys His Leu Asn Gly

85 90 95

Arg Pro Leu Arg Val Ala Thr Ala Cys Ser Gly Thr Glu Ala Pro Ile

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Leu Phe Leu Asn Ser Phe Ser Glu Gly Leu Arg Lys Arg Gly His Asp

115 120 125

Phe Arg Ile Glu His Val Phe Ser Cys Glu Ile Asp Pro Ala Lys Gln

130 135 140

Ser Tyr Ile Arg Arg Asn Phe His Asn Val Pro Ile Leu Arg Asp Ile

145 150 155 160

Thr Glu Val Phe Glu Trp Glu Gly Asn Pro Glu Lys Ile Gly Phe Met

165 170 175

Thr Thr Ala Phe Gly Arg Thr Tyr Ala Leu Pro Ala Pro Gly Thr Val

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Asp Val Ile Ile Val Gly Thr Ser Cys Thr Ser Tyr Ser Asn Leu Asn

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Ala Ile Ser Glu Asn Val Leu Ser Gly Pro Phe Glu Ala Met Ile Lys

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Arg Pro Ala Ser Ser Asp Ala Glu Gln Trp Met Glu Pro Ser Asp Ser

325 330 335

Lys Ala Leu Arg Ser Gln Val Glu Phe Gln Val Glu Ser Arg Ala Val

340 345 350

Ala Lys Trp Asp Thr Cys Cys Ala Arg His Phe Asp Tyr Arg His Ala

355 360 365

Gln Gly Phe Gly Thr Ser Lys Pro Ile Thr Asp Trp Arg Ser Ala Gly

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Asn Tyr Cys His Pro Asp Asn Trp Pro Arg Asn Leu Lys Gly Phe Val

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Glu Arg Val His Asp Val Thr Asp Val Ser His Leu Arg Gly Ile Cys

405 410 415

Arg Gly Tyr Asp Asp Arg Tyr Leu Ser Arg Asn Ile Asp Leu Ser Gln

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Asn Val Tyr Val Gln His Asp Asn Val Lys Cys Gly Leu Leu Pro Cys

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Glu Leu Gly Gly Ile Ser Gln Gln Asp Leu Arg Asn Leu Ala Gly Asn

485 490 495

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Ser Tyr Glu Asp Ile Thr Val Val Arg Arg Pro Leu Thr Phe Gly Glu

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Cys Val His Leu Val Glu Ser Ser Ala Lys Tyr Cys Tyr Cys Glu Ala

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Gln Thr Asp Ile Ser Arg Ser Ser Ile Val Lys Cys Lys Asn Cys Gly

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Phe Gly Val Cys Arg Gln Ile Ile Ala Ser Leu Cys Thr Ser Trp Glu

885 890 895

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Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Ser Ala Gly Lys Phe Pro Glu Arg Lys

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Pro Ser Val Arg Val Asp Lys Leu Thr Ala Met Arg Ser Ile Phe

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Trp Lys His Asp Asp Gly Lys Asn Lys Phe Ile Val Phe Ser Pro

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Leu Pro Glu Tyr Leu Leu Ile Ala Gln Gln Met Met Glu Ala Asp

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Gly Val Pro Cys Ile Asn Leu Lys Gly Lys Lys Lys Asp Val Ala

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2015 2020 2025

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Lys Ala Thr Lys Ala Ala Glu Val Thr Gly Val Pro Val Asp Ala

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Phe Gln Gly Pro Gln Lys Arg Lys Arg Asn Asp Ser Val Asp Asn

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Ser Thr His Ala Asp Leu Glu Thr Glu Arg Arg Ala Glu Leu Asp

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His Leu Leu Val Gln Asp Ser Val Glu Thr Asp Ile Ala Phe Gln

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<210>4

<211>4520

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

attgataggt ggacgagact gtttggctaa aggcggtcaa tgcaaatcgc tgctgagcgg 60

gtgcgatcgg gcaaacggct cacttcagtt actgcaaatt cttccactcg cgactttgaa 120

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tctaacaact ggagaacaac aaggcgtaag tcatttctgt ctttatacat ttttctcatc 480

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ctttttagcc atgtattacc cctcacatta ccaggaacat cgttttacta tactgtttgc 600

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ccttttgtaa agcgtaacca gcaaacaaat tgcaattggc ccgtagcaag gtagtcaggg 1080

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cccccatctc aactccatca catcacaatc gatccatggc tgaactcacc gcgacgtctg 1680

tcgagaagtt tctgatcgaa aagttcgaca gcgtctccga cctgatgcag ctctcggagg 1740

gcgaagaatc tcgtgctttc agcttcgatg taggagggcg tggatatgtc ctgcgggtaa 1800

atagctgcgc cgatggtttc tacaaagatc gttatgttta tcggcacttt gcatcggccg 1860

cgctcccgat tccggaagtg cttgacattg gggagttcag cgagagcctg acctattgca 1920

tctcccgccg tgcacagggt gtcacgttgc aagacctgcc tgaaaccgaa ctgcccgctg 1980

ttctgcagcc ggtcgcggag gctatggatg cgatcgctgc ggccgatctt agccagacga 2040

gcgggttcgg cccattcgga ccgcaaggaa tcggtcaata cactacatgg cgtgatttca 2100

tatgcgcgat tgctgatccc catgtgtatc actggcaaac tgtgatggac gacaccgtca 2160

gtgcgtccgt cgcgcaggct ctcgatgagc tgatgctttg ggccgaggac tgccccgaag 2220

tccggcacct cgtgcacgcg gatttcggct ccaacaatgt cctgacggac aatggccgca 2280

taacagcggt cattgactgg agcgaggcga tgttcgggga ttcccaatac gaggtcgcca 2340

acatcttctt ctggaggccg tggttggctt gtatggagca gcagacgcgc tacttcgagc 2400

ggaggcatcc ggagcttgca ggatcgccgc ggctccgggc gtatatgctc cgcattggtc 2460

ttgaccaact ctatcagagc ttggttgacg gcaatttcga tgatgcagct tgggcgcagg 2520

gtcgatgcga cgcaatcgtc cgatccggag ccgggactgt cgggcgtaca caaatcgccc 2580

gcagaagcgc ggccgtctgg accgatggct gtgtagaagt actcgccgat agtggaaacc 2640

gacgccccag cactcgtccg agggcaaagg aatagagtag atgccgaccg ggatcttagt 2700

gatttaatag ctccatgtca acaagaataa aacgcgtttc gggtttacct cttccagata 2760

cagctcatct gcaatgcatt aatgcattgg acctcgcaac cctagtacgc ccttcaggct 2820

ccggcgaagc agaagaatag cttagcagag tctattttca ttttcgggag acgagatcaa 2880

gcagatcaac ggtcgtcaag agacctacga gactgaggaa tccgctcttg gctccacgcg 2940

actatatatt tgtctctaat tgtactttga catgctcctc ttctttactc tgatagcttg 3000

actatgaaaa ttccgtcacc agcccctggg ttcgcaaaga taattgcact gtttcttcct 3060

tgaactctca agcctacagg acacacattc atcgtaggta taaacctcga aaatcattcc 3120

tactaagatg ggtatacaat agtaaccatg catggttgcc tagctgttag gctcatgttg 3180

tttctgcacg gtctctctct tcgtcgacca tgttcaaact gcaaatctgc tatacaatac 3240

cggctagtgt atgctctaac atatgtgtac gaacgctatt tactcagtct gtatacctca 3300

gagttcaagt cttactcact cacttccttt ggtcaagcta cataagggat acatggattt 3360

agatcgagta gatcattcaa aattacacga gagaattttt cattcgaggt ggctactttc 3420

gagattttca tttcatttat tactcgcaag ggattggttg attgtttcac aggttgcagt 3480

agtgagggcg gtagtaatca cttcagtgtt cttcaaaaag aggagtttgt ctttcaaatg 3540

tagtagatag tatgaattct cagattagta ttagtcagtt ttgtcttcga cgtatgtcgt 3600

ggactaatgt tcagatatct cgtttctaga cgatgagaaa ggatactcat ttcatttgtt 3660

tttagctatt acgagacttc ttccagtcgc ataaatgctt ccaacagaaa tagaataaga 3720

atcatggatt tttatattaa atagaaccga ctaactttac aaatgtgaat cttgtccttg 3780

aagtgatgtg atatgaggtg attcggtttg tgatataaca tatgatgctc acttggaccg 3840

ctaactagac tattccgtca ccatgatgga attcgggaag caaagtaatt tagtatgttc 3900

tagaccaaat gtccagagga agagaaaata acaagggcga ttaaccactc tgcatattta 3960

tactctcatg gcctgacaaa tggagatgga cataaacatt catagtgctt gccatgttat 4020

atgatcttgg gtattgtgat tatttgggcc aacttcgttt agtatcagaa acgaggcata 4080

tttttccatc ccgtgctcgc cagccttttt tccgcctgtc cccaaaacat tattctccat 4140

gtttccatgc acgtgtgaga actctctgat atagatttcg atgcttcggg ggaggtgggg 4200

aggggttctc ttcaaaggaa attatgcagg agatcagaca tgagcataat tggaaacagg 4260

caagcaaata cattacgata cataaggtca gccaacacgt tcctacgaaa gcaagtaaaa 4320

tacacagttc atcgaaaaca aatactccga actgtacaac aatcaaattc aataccatca 4380

atctcctctc cgcccacaac cagaaattcc aaagacctcc tttttttttc gtatgtaact 4440

agttaccctg ggtcaaaacc tccatcactt gagcactgct aattttcaaa ccagtccaca 4500

atccagcgaa ctcaaatatg 4520

Claims

1.Bcdmt2蛋白质在如下1)-7)中任一种应用：

1)防治灰霉病；

2)调控灰霉菌的致病力；

3)调控灰霉菌菌丝的生长；

4)调控灰霉菌分生孢子的产生；

5)调控灰霉菌分生孢子的产量；

6)调控灰霉菌分生孢子的萌发；

7)设计和筛选抗真菌药物；

所述Bcdmt2蛋白质是如下a)或b)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列为序列3所示的蛋白质；

b)在序列3所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1中所述的Bcdmt2蛋白质相关的生物材料在如下1)-7)中任一种应用：

1)防治灰霉病；

2)调控灰霉菌的致病力；

3)调控灰霉菌菌丝的生长；

4)调控灰霉菌分生孢子的产生；

5)调控灰霉菌分生孢子的产量；

6)调控灰霉菌分生孢子的萌发；

7)设计和筛选抗真菌药物；

所述生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：

A1)编码Bcdmt2蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为序列1所示的基因组DNA分子或序列2所示的cDNA分子。

4.权利要求1中所述的Bcdmt2蛋白质作为靶点在设计和筛选抗真菌药物中的应用；

或，权利要求1中所述的Bcdmt2蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在培育致病力降低和/或分生孢子萌发率降低和/或分生孢子产量降低的转基因灰霉菌中的应用。

5.一种培育致病力降低和/或分生孢子萌发率降低和/或分生孢子产量降低的转基因灰霉菌的方法，包括降低受体灰霉菌中权利要求1中所述的Bcdmt2蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因灰霉菌的步骤；所述转基因灰霉菌的致病力和/或分生孢子萌发率和/或分生孢子产量低于所述受体灰霉菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述降低受体灰霉菌中权利要求1中所述的Bcdmt2蛋白质的表达量和/或活性的方法是通过对所述受体灰霉菌中权利要求1中所述的蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或沉默表达来实现的。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：采用同源重组的方法对所述受体灰霉菌中权利要求1中所述的蛋白质的编码基因进行敲除。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述采用同源重组的方法对所述受体灰霉菌中权利要求1中所述的蛋白质的编码基因进行敲除的方法为将用于进行同源重组的同源重组片段导入受体灰霉菌的原生质体中。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述用于进行同源重组的同源重组片段的核苷酸序列为序列4。

10.权利要求5-8任一所述的方法或权利要求9中所述的同源重组片段在防治灰霉病中的应用。