CN115305252A - 一种调控水稻抗性的受体激酶基因OsIFBR1 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控水稻抗性的受体激酶基因OsIFBR1，由1019个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1；由3060个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2；所述基因OsIFBR1和所述类受体激酶OsIFBR1在抗病性中的应用；通过转基因方法在植物中过量表达所述基因。与野生型相比，OsIFBR1过表达(OsIFBR1OX)转基因水稻更抗病，表明OsIFBR1正向调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性；OsIFBR1过表达(OsIFBR1OX)转基因植株对稻瘟病和白叶枯病表现为抗性，可推广实际应用；本发明有利于水稻广谱抗病品种的培育，为后期筛选高抗水稻品种提供依据。

Description

一种调控水稻抗性的受体激酶基因OsIFBR1

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种调控水稻抗性的受体激酶基因OsIFBR1。

背景技术

水稻是我国最重要的粮食作物之一，水稻的高产稳产对保障经济发展和社会稳定具有重要意义。白叶枯病是由黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起的细菌性枯萎病，是世界上对水稻危害最大的一种细菌性病害，一般可致水稻减产20％-30％左右，严重可达50％，发病范围遍及世界各稻区，在亚洲地区尤为严重，在我国华南稻区危害较为严重。稻瘟病是由稻梨孢病菌(Pyricularia oryzae)引起的真菌性病害，可引发大幅度减产，严重时减产40％～50％，甚至颗粒无收。该病为通过气流传播的流行病，对水稻生产威胁极大，危害程度因品种、栽培技术以及气候条件不同有差别，世界各稻区均有发生，其中以叶部、节部发生为多，发生后可造成不同程度减产，尤其穗颈瘟或节瘟发生早而重，可造成白穗以致绝产。目前在农业生产中，防治这两种病害的主要手段是利用抗病品种，然而病原菌毒性的变异，经常造成品种抗性的丧失。因此，培育广谱的抗病品种迫在眉睫。近年来转基因技术因其周期短、效率高而被广泛应用于水稻育种，挖掘水稻稻瘟病和白叶枯病的抗性相关基因，利用转基因育种技术改变抗性相关基因表达，对稻瘟病和白叶枯病的种质资源创制和有效防控具有重要意义。

类受体激酶(Receptor-like kinases，RLKs)是植物中广泛存在的一类跨膜蛋白激酶，影响植物的生长发育、种子萌发、光形态建成，以及对生物胁迫和非生物胁迫的响应。一般RLKs由胞内区(Cytoplasmic domain，CD)、跨膜区(Transmembrane domain，TM)和胞外区(Extracellular domain)三部分组成。往往通过细胞外结构域识别病原物的相关分子模式，激活下游免疫反应，例如活性氧(Reactive oxygen species,ROS)爆发，病程相关基因(Pathogenesis-related gene,PR)表达增强等，来抵御病原物的侵染。水稻基因组中编码RLKs的基因高达1131个，大部分RLKs的功能尚不清楚，其中OsIFBR1的编码基因与水稻稻瘟病和白叶枯病抗性之间的关系尚未见报道。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明的目的在于提供OsIFBR1基因及编码蛋白在调控水稻稻瘟病和白叶枯病抗性中的应用，敲除所述OsIFBR1基因表达得到的突变体更易感病，通过表达所述OsIFBR1基因得到的转基因植株更抗病，因此所述OsIFBR1基因可正向调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。

为了达到上述发明目的，本发明采用的具体方案为：

一种调控水稻抗性的受体激酶基因OsIFBR1，由1019个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1；

由3060个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2；

所述基因OsIFBR1和所述类受体激酶OsIFBR1在抗病性中的应用；

通过转基因方法在植物中过量表达所述基因。

作为改进，通过表达所述基因OsIFBR1的方法包括利用非特异性启动子35S表达OsIFBR1基因的cDNA序列。

作为改进，所述植物为水稻。

作为改进，所述抗病性指抗稻瘟病菌和白叶枯菌引起的植物病害。

作为改进，调控水稻抗性的受体激酶基因OsIFBR1在调控水稻对稻瘟病和白叶枯病抗性中的应用，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除水稻中OsIFBR1基因，获得的突变体植株osifbr1；

所述CRISPR/Cas9系统包括1个敲除OsIFBR1基因的sgRNA；

OsAC37基因的敲除靶点优选为：靶点(target)核苷酸序列为：GTCAATGATTTGATAGACGG(SEQ ID NO.3，最后三个碱基为PAM位点)。

本发明的有益效果为：

本发明提供了OsIFBR1基因在调控水稻对稻瘟病和白叶枯病抗性中的应用，通过CRISPR/Cas9技术敲除所述基因OsIFBR1，获得敲除突变体osifbr1；通过稻瘟病和白叶枯病抗性鉴定发现，与野生型水稻相比，osifbr1突变体水稻更感病；通过非特异性启动子35S表达OsIFBR1的cDNA序列获得过表达植株，通过稻瘟病和白叶枯病抗性鉴定发现，与野生型相比，OsIFBR1过表达(OsIFBR1OX)转基因水稻更抗病，表明OsIFBR1正向调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性；OsIFBR1过表达(OsIFBR1OX)转基因植株对稻瘟病和白叶枯病表现为抗性，可推广实际应用；本发明有利于水稻广谱抗病品种的培育，为后期筛选高抗水稻品种提供依据。

附图说明

图1为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在水稻日本晴(NIP)背景中敲除所述基因OsIFBR1，制备osifbr1突变体。

图2为osifbr1突变体对稻瘟病的抗性分析，其中A表示野生型日本晴(NIP)和osifbr1突变体接种稻瘟病菌后的表型；B表示野生型日本晴(NIP)和osifbr1突变体接种稻瘟病菌后，叶片中稻瘟病菌的菌量检测结果。

图3为osifbr1突变体对白叶枯病的抗性分析，其中A表示野生型日本晴(NIP)和osifbr1突变体接种白叶枯病菌后的表型；B表示野生型日本晴(NIP)和osifbr1突变体接种白叶枯病菌后的病斑长度测量结果。

图4为过表达转基因植株OsIFBR1OX的制备，其中A表示过表达OsIFBR1基因的载体结构；B表示野生型日本晴(NIP)和过表达转基因植株OsIFBR1OX中OsIFBR1表达水平检测结果。

具体实施方式

下面结合附图来进一步说明发明的具体实施方式，但本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。

一种调控水稻抗性的受体激酶基因OsIFBR1，由1019个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1(MAVYNILILFLLLLLFSLSTAQPSADEQKLLLAIKQDWDNPAPLSSWSSTGNWTGVISSSTGQVTGLSLPSLHIARPIPASVCSLKNLTYIDLSCNNLTGDFPTVLYGCSALEFLDLSNNQLSGRLPDRIDRLSLGMQHLNLSSNAFTGDVPSAIARFSKLKSLVLDTNRFNGNYPGAAIGGLVELETLTLASNPFEPGPVPKEFGKLTKLKMLWLSWMNLTGTIPDDLSSLMELTLLDLSQNKMQGQIPEWVLKHQKLENLYLYASNLSGEIGPNITALNLQELDLSMNKFSGSIPEDIANLKKLRLLYLYYNNLTGPIPAGVGMMPDLTDIRLFNNKLSGPLPAELGKHSELGNFEVSNNNLSGELPDTLCFNKKLFDIVVFNNSFSGVFPTNLGDCKTINNIMAYNNHFVGDFPKKIWSFELLTNVMIYNNNFTGTLPSEISFNISRIEMENNRFSGALPSTAVGLKSFTAENNQFSGELPADMSRLANLTELNLAGNQLSGSIPPSIKSLTSLTSLNLSRNQISGEIPAAVGWMGLYILDLSDNGLTGDIPQDFSNLHLNFLNLSSNQLSGEVPETLQNGAYDRSFLGNHGLCATVNTNMNLPACPHQSHNKSSTNLIIVFSVLTGVVFIGAVAIWLLIIRHQKRQQDLAGWKMTPFRTLHFSECDVLGNLHEENVIGSGGSGKVYRINIGGKGSDGMVVAVKRLWRTAAKSDAKSDKEFDAEVRILGEVSHINIIDLLCCISGDDTKLLVYEYMENGSLDRWLHRRDDGGAPTAPLQWPTRLCIAIDAARGLSYMHHECAQPIMHRDVKSSNILLDPAFRAKIADFGLARILAKSGEPNSISAIGGTFGYMAPEYGCRAKVNEKVDVYAFGVVLLELTTGRVANDGGADWCLAEWAWRRYKAGGELHDVVDEAIQDRAAFLEDAVAVFLLGMICTGDDPASRPTMKEVLEQLVQYDRTSSVAAACRDDSGGAPSLSKGKKDGKGKSSSAGTTAGKMWGAGTGDEESGSFVAHPV)所示；

由3060个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2(ATGGCTGTCTACAACATCCTCATCCTCTTTCTACTACTATTGCTCTTCTCTCTATCGACTGCGCAGCCCAGCGCCGACGAGCAAAAACTACTCCTAGCAATCAAGCAAGATTGGGACAACCCAGCTCCACTCAGTTCATGGAGCAGCACCGGCAACTGGACTGGTGTTATCAGTAGCAGCACAGGTCAGGTCACTGGCCTCTCCTTGCCAAGTCTCCATATAGCCAGACCAATCCCAGCCTCCGTTTGTAGCCTCAAGAATCTGACCTACATAGACCTCTCTTGCAACAATCTCACCGGTGATTTCCCCACGGTGCTCTACGGTTGCTCAGCTTTGGAGTTCCTTGACCTATCCAACAATCAATTATCCGGCAGACTTCCGGACCGCATTGACAGGCTATCGTTGGGGATGCAACACCTCAACCTGTCCAGCAATGCTTTCACCGGCGATGTGCCGTCGGCTATTGCAAGGTTCTCGAAGCTCAAGTCATTGGTCCTTGACACTAATAGATTCAATGGGAATTACCCGGGTGCCGCCATTGGAGGCCTTGTGGAGCTTGAGACGCTGACGTTGGCATCCAACCCATTCGAGCCGGGTCCAGTCCCAAAGGAGTTTGGCAAGCTGACAAAGCTGAAAATGCTGTGGCTGTCATGGATGAACCTTACTGGGACCATCCCTGATGATCTGTCGTCATTGATGGAGCTCACATTGTTGGACTTGTCACAAAATAAGATGCAGGGACAAATCCCCGAGTGGGTATTGAAGCACCAGAAGCTCGAGAATCTATATCTCTATGCAAGCAATTTGAGTGGCGAGATTGGTCCTAACATCACAGCTCTCAACCTGCAGGAGCTTGACCTGTCCATGAACAAGTTCTCTGGATCAATACCAGAGGACATTGCAAACTTGAAGAAGTTGAGATTACTATATTTGTACTACAACAATCTCACTGGACCCATCCCGGCTGGTGTTGGTATGATGCCGGACCTCACCGACATCCGTCTCTTCAATAACAAGCTCTCTGGGCCCCTACCCGCGGAGCTTGGAAAACATTCAGAATTGGGGAATTTTGAGGTGTCCAACAACAACCTCTCTGGTGAGCTACCGGATACACTTTGCTTCAATAAGAAGCTCTTTGACATTGTGGTGTTCAACAATAGCTTCTCCGGCGTGTTCCCGACGAACCTTGGGGATTGCAAAACCATCAACAACATCATGGCATACAACAACCACTTTGTTGGGGACTTTCCCAAGAAGATATGGTCATTCGAGTTGCTCACCAATGTCATGATTTACAACAACAACTTCACCGGCACTCTACCCAGTGAGATATCATTTAACATCTCGAGGATTGAGATGGAGAACAATCGCTTCTCCGGTGCCCTCCCGTCGACCGCCGTCGGTCTGAAGAGTTTCACGGCGGAGAACAACCAGTTCTCCGGTGAACTGCCAGCTGACATGTCTAGGCTTGCCAACCTCACCGAGTTGAACCTCGCCGGCAACCAGTTATCCGGCTCGATTCCGCCGTCTATCAAATCATTGACAAGTCTGACCTCCCTCAACCTTAGCAGAAACCAGATTTCCGGTGAGATCCCTGCCGCAGTCGGGTGGATGGGCCTCTACATTCTTGACCTCTCCGACAACGGGCTCACCGGCGACATACCTCAAGATTTCAGCAATCTCCATCTCAACTTTCTCAACCTTTCTTCTAACCAGCTCTCCGGCGAGGTCCCGGAGACGCTGCAAAACGGCGCCTACGATCGTAGCTTCCTCGGCAACCATGGCCTCTGTGCCACGGTGAACACGAACATGAACCTTCCGGCTTGCCCCCACCAAAGCCACAACAAATCGTCGACGAACCTGATCATCGTCTTCTCGGTGCTCACCGGCGTCGTGTTCATCGGCGCCGTCGCCATCTGGTTGCTGATCATCCGACACCAGAAGCGTCAGCAAGACCTCGCCGGGTGGAAGATGACGCCGTTCCGTACCCTGCACTTCTCCGAATGCGACGTGCTCGGCAATCTCCACGAGGAGAACGTGATCGGTAGCGGCGGCTCCGGCAAGGTGTACCGCATCAACATCGGCGGCAAGGGCAGCGACGGCATGGTGGTGGCGGTGAAGCGGCTATGGCGGACGGCGGCCAAGTCGGACGCGAAGAGCGACAAGGAGTTCGACGCCGAGGTGAGGATCCTCGGGGAGGTAAGCCACATCAACATCATCGACCTCCTCTGCTGCATCTCCGGCGACGACACCAAGCTGCTCGTCTACGAGTACATGGAGAACGGCAGCCTCGACCGGTGGCTGCACCGCCGCGACGACGGCGGCGCGCCGACGGCGCCGCTCCAGTGGCCGACGCGGCTCTGCATCGCCATCGACGCGGCGAGGGGGCTCAGCTACATGCACCACGAGTGCGCGCAGCCGATCATGCACCGCGACGTCAAGTCCAGCAACATCCTGCTCGACCCGGCCTTCCGCGCCAAGATCGCCGACTTCGGCCTCGCCAGGATCCTCGCCAAGTCCGGCGAGCCGAATTCCATCTCCGCCATCGGTGGCACCTTCGGCTACATGGCTCCAGAGTACGGGTGCAGAGCGAAGGTGAACGAGAAGGTGGACGTGTACGCGTTCGGCGTCGTGCTGCTGGAGCTGACGACGGGGCGGGTGGCGAACGACGGCGGCGCGGACTGGTGCCTGGCGGAGTGGGCGTGGCGGCGGTACAAGGCCGGCGGCGAGCTGCACGACGTCGTCGACGAGGCCATCCAGGACAGGGCGGCGTTCCTGGAGGACGCCGTGGCGGTGTTCCTGCTCGGCATGATCTGCACCGGCGACGACCCGGCGTCGCGGCCGACGATGAAGGAGGTGCTCGAGCAGCTGGTCCAGTACGACCGTACGTCCAGCGTGGCGGCCGCCTGCCGCGATGACTCCGGCGGCGCACCGTCGTTATCGAAGGGGAAGAAAGACGGGAAGGGGAAGAGCTCGTCGGCGGGAACGACGGCCGGGAAAATGTGGGGCGCCGGCACCGGCGACGAGGAAAGCGGCAGTTTCGTGGCGCATCCAGTTTAA)所示；

所述基因OsIFBR1和所述类受体激酶OsIFBR1在抗病性中的应用；

通过转基因方法在植物中过量表达所述基因。

通过表达所述基因OsIFBR1的方法包括利用非特异性启动子35S表达OsIFBR1基因的cDNA序列。

所述植物为水稻。

所述抗病性指抗稻瘟病菌和白叶枯菌引起的植物病害。

调控水稻抗性的受体激酶基因OsIFBR1在调控水稻对稻瘟病和白叶枯病抗性中的应用，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除水稻中OsIFBR1基因，获得的突变体植株osifbr1；

所述CRISPR/Cas9系统包括1个敲除OsIFBR1基因的sgRNA；

OsAC37基因的敲除靶点优选为：靶点(target)核苷酸序列为：GTCAATGATTTGATAGACGG(SEQ ID NO.3，最后三个碱基为PAM位点)。

下面结合实施例对本发明提供的OsIFBR1基因及编码蛋白在调控水稻直播适宜性中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1：

1、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建OsIFBR1基因突变体：

利用http://skl.scau.edu.cn/网站，对目的基因OsIFBR1进行编辑靶点的设计，靶点位置如图1所示，其中靶点核苷酸序列为：GTCAATGATTTGATAGACGG(SEQ ID NO.3，最后三个碱基为PAM位点)。将候选靶点序列插入中间载体pOs-sgRNA中，随后通过Golden Gate克隆方式，利用BsaI酶切位点将OsU6a-target-sgRNA片段插入到最终载体pH-Ubi-cas9-7中(具体构建步骤参考文献：Miao Jin,Guo Dongshu,Zhang Jinzhe,et al.Targetedmutagenesis in rice using CRISPR-Cas system.Cell Research,23(10):1233–1236.)。将构建成功的CRISPR/Cas9载体，通过农杆菌介导的方法，转化至野生型日本晴的幼胚诱导的愈伤组织中，经潮霉素筛选获得阳性转基因植株。

2、对上述获得的阳性转基因植株编辑形式进行分子鉴定：

以水稻叶片的基因组DNA为模板，用如下鉴定引物进行PCR扩增，对扩增产物进行Sanger测序，解析突变体编辑形式。

osifbr1突变体鉴定引物为：

OsIFBR1-Check-F(SEQ ID NO.4)：ATTGTGGTGTTCAACAATAGCT；

OsIFBR1-Check-R(SEQ ID NO.5)：CACGTTCTCCTCGTGGAGAT。

PCR扩增体系根据2×Es Taq MasterMix(Dye)使用说明书配制，具体为：2×EsTaq MasterMix(Dye)10μL，上游引物(10μM)0.8μL，下游引物(10μM)0.8μL，DNA模板1μg，ddH2O补至20μL。

PCR反应体系为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环32次；72℃延伸2min。

结果如图1所示，获得1个纯合敲除突变体株系osifbr1。在osifbr1中，OsAC37基因起始密码子ATG下游1528bp处插入一个碱基A，产生移码突变，导致了1567-1569bp处提前形成了终止密码子。然后从纯合敲除体的后代中筛选出不含Cas9基因的植株用于后续实验。

3、野生型日本晴(NIP)和敲除突变体osifbr1接种稻瘟病菌后表型观察：采用喷雾接种法进行抗性鉴定。

野生型日本晴(NIP)和敲除突变体osifbr1种植于苗盘中，待其生长至四叶期进行接菌。将保存在滤纸上的稻瘟病菌S5菌株接种于番茄燕麦固体培养基平板上活化。刮取菌丝转至新的番茄燕麦培养基平板上扩大培养。将菌丝进行涂断，放置26℃黑光灯培养箱中诱导产孢。用0.1％吐温涂洗平板，过滤后，将孢子浓度调至1×105个/mL。用喷壶均匀喷洒在水稻苗叶片上，接种后黑暗保湿培养24小时，后撤去遮光布，继续正常光照培养，接种7天后进行拍照记录发病情况。同时利用实时荧光定量PCR检测发病叶片的带菌量，取等量的野生型日本晴(NIP)和敲除突变体osifbr1的叶片，提取基因组DNA，用如下引物进行荧光定量PCR，比较日本晴与突变体osifbr1叶片所携带的稻瘟菌量，从而完成敲除突变体的抗稻瘟病评价。

实时荧光定量PCR引物为：

MoPot2-F(SEQ ID NO.6)：ACGACCCGTCTTTACTTATTTGG；

MoPot2-F(SEQ ID NO.7)：AAGTAGCGTTGGTTTTGTTGGAT；

OsUbi-F(SEQ ID NO.8)：GCCCAAGAAGAAGATCAAGAAC；

OsUbi-R(SEQ ID NO.9)：AGATAACAACGGAAGCATAAAAGTC。

荧光定量PCR扩增体系根据2×SYBR qPCR Mixture使用说明书配制，具体为：2×SYBR qPCR Mixture10μL，上游引物(10μM)2μL，下游引物(10μM)2μL，DNA模板1μg，ddH2O补至20μL。

荧光定量PCR反应体系为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火1min，循环40次；72℃延伸2min。

结果如图2所示，相较于野生型，osifbr1突变体对稻瘟病的抗性显著降低，表现为osifbr1突变体叶片中的稻瘟菌菌量显著高于野生型。

4、野生型日本晴(NIP)和敲除突变体osifbr1接种白叶枯菌后表型观察：采用剪叶接种法进行抗性鉴定。

野生型日本晴(NIP)和敲除突变体osifbr1种植于桶中，待其生长至抽穗期进行接菌。将白叶枯病菌PXO99A菌株划线于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上活化。挑取单菌落至牛肉膏蛋白胨液体培养基，28℃摇培过夜后，收集菌体，将活化的菌液浓度调至OD600约为0.8，用剪刀蘸取菌液后，选取倒二叶，沿叶片末端剪口接菌，注意对接菌的水稻喷水保湿，每个株系至少接种20个叶片，接种14天后进行拍照记录发病情况并测量病斑长度。

结果如图3所示，相较于野生型，osifbr1突变体对白叶枯病的抗性显著降低，表现为osifbr1突变体株系叶片上的病斑长度显著长于野生型植株。

实施例2：

1、构建OsIFBR1基因过表达植株OsIFBR1OX：

提取水稻品种日本晴的RNA，反转录为cDNA。以此cDNA为模板，用如下引物进行PCR扩增，得到长度为3076bp的PCR产物，两端分别包含XbaI和BamHI的酶切位点。该PCR产物具有SEQ ID NO：2所示序列的1至3060位核苷酸。

OsIFBR1-F(SEQ ID NO.10)：gctctagaATGGCTGTCTACAACATCCT；

OsIFBR1-F(SEQ ID NO.11)：cgggatccAACTGGATGCGCCACGAAA。

(引物中小写碱基为酶切位点以及保护碱基)

PCR扩增体系根据Phusion DNA Polymerase使用说明书配制，具体为：2×PhantaMax Buffer 10μL，dNTP Mix 0.4μL，上游引物(10μM)0.8μL，下游引物(10μM)0.8μL，cDNA模板400ng，Phusion DNA Polymerase 0.4μL，ddH2O补至20μL。

PCR反应体系为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸90s，循环32次；72℃充分延伸5min。

用XbaI和BamHI酶切该PCR产物，得到的酶切产物与经过同样酶切的pCsV1300载体骨架进行连接，使PCR产物插入pCsV1300载体的XbaI和BamHI位点见，得到最终载体。

经过测序，该重组载体为将SEQ ID NO:2所述序列自第1位至3060位核苷酸插入pCsV1300载体的XbaI和BamHI酶切位点间，为OsAC37过表达载体，如图4A所示。

将构建成功的pCsV1300-OsIFBR1载体转化至野生型日本晴的幼胚诱导的愈伤组织中，通过潮霉素筛选获得阳性转基因植株。

2、对上述获得的阳性转基因植株进行分子鉴定

提取野生型日本晴和OsIFBR1过表达转基因植株的RNA，反转录为cDNA。以此cDNA为模板，用如下引物进行实施例1中相同的荧光定量PCR。

qRT-OsIFBR1-F(SEQ ID No.12)：ATGGCTGTCTACAACATCCTCA

TCC；

qRT-OsIFBR1-R：(SEQ ID No.13)：AACTGGATGCGCCACGAAAC；

qRT-OsACT1-F(SEQ ID No.14)：CTCCCCCATGCTATCCTTCG；

qRT-OsACT1-R(SEQ ID No.15)：TGAATGAGTAACCACGCTCCG。

结果如图4B所示，OsIFBR1过表达植株OsIFBR1OX中OsIFBR1的平均相对表达水平明显高于野生型日本晴中OsIFBR1的表达水平。

3、野生型日本晴(NIP)和过表达植物OsIFBR1OX接种稻瘟病菌后表型观察：采用喷雾接种法进行抗性鉴定。

野生型日本晴(NIP)和过表达植物OsIFBR1OX种植于苗盘中，待其生长至四叶期进行接菌。将保存在滤纸上的稻瘟病菌S5菌株接种于番茄燕麦固体培养基平板上活化。刮取菌丝转至新的番茄燕麦培养基平板上扩大培养。将菌丝进行涂断，放置26℃黑光灯培养箱中诱导产孢。用0.1％吐温涂洗平板，过滤后，将孢子浓度调至1×105个/mL。用喷壶均匀喷洒在水稻苗叶片上，接种后黑暗保湿培养24小时，后撤去遮光布，继续正常光照培养，接种7天后进行拍照记录发病情况。同时利用实时荧光定量PCR检测发病叶片的带菌量，取等量的野生型日本晴(NIP)和过表达植物OsIFBR1OX的叶片，提取基因组DNA，以此为模板进行实施例1中相同的荧光定量PCR，比较日本晴与过表达植物OsIFBR1OX叶片所携带的稻瘟菌量，从而完成过表达植物OsIFBR1OX的抗稻瘟病评价。

相较于野生型，过表达植物OsIFBR1OX对稻瘟病的抗性显著增强，表现为过表达植物OsIFBR1OX叶片中的稻瘟菌菌量显著低于野生型。

4、野生型日本晴(NIP)和过表达植物OsIFBR1OX接种白叶枯菌后表型观察：采用剪叶接种法进行抗性鉴定。

野生型日本晴(NIP)和过表达植物OsIFBR1OX种植于桶中，待其生长至抽穗期进行接菌。将白叶枯病菌PXO99A菌株划线于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上活化。挑取单菌落至牛肉膏蛋白胨液体培养基，28℃摇培过夜后，收集菌体，将活化的菌液浓度调至OD600约为0.8，用剪刀蘸取菌液后，选取倒二叶，沿叶片末端剪口接菌，注意对接菌的水稻喷水保湿，每个株系至少接种20个叶片，接种14天后进行拍照记录发病情况并测量病斑长度。

相较于野生型，过表达植物OsIFBR1OX对白叶枯病的抗性显著增强，表现为过表达植物OsIFBR1OX叶片上的病斑长度显著短于野生型植株。

以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种调控水稻抗性的受体激酶基因OsIFBR1，其特征在于，由1019个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1；

由3060个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2；

所述基因OsIFBR1和所述类受体激酶OsIFBR1在抗病性中的应用；

通过转基因方法在植物中过量表达所述基因。

2.根据权利要求1所述的一种调控水稻抗性的受体激酶基因OsIFBR1，其特征在于，通过表达所述基因OsIFBR1的方法包括利用非特异性启动子35S表达OsIFBR1基因的cDNA序列。

3.根据权利要求1所述的一种调控水稻抗性的受体激酶基因OsIFBR1，其特征在于，所述植物为水稻。

4.根据权利要求1所述的一种调控水稻抗性的受体激酶基因OsIFBR1，其特征在于，所述抗病性指抗稻瘟病菌和白叶枯菌引起的植物病害。

5.根据权利要求4所述的一种调控水稻抗性的受体激酶基因OsIFBR1在调控水稻对稻瘟病和白叶枯病抗性中的应用，其特征在于，

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除水稻中OsIFBR1基因，获得的突变体植株osifbr1；

所述CRISPR/Cas9系统包括1个敲除OsIFBR1基因的sgRNA；

OsAC37基因的敲除靶点优选为：靶点(target)核苷酸序列为：GTCAATGATTTGATAGACGG(SEQ ID NO.3，最后三个碱基为PAM位点)。

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