CN105154454A - 一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcArs2及其应用 - Google Patents

Abstract

一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcArs2及其应用属微生物基因工程技术领域，本发明提供的来自灰霉病菌的控制分生孢子形态和致病性的基因BcArs2，具有序列表中SEQ？ID？No:1所示的由4839个核苷酸组成的DNA序列；提供的BcArs2基因所编码的蛋白质，具有序列表中SEQ？ID？No:2所示的由926个氨基酸组成的氨基酸序列；BcArs2基因可在植物抗灰霉病基因工程领域中应用；通过对灰霉病菌控制分生孢子形态和致病性的蛋白质BcArs2进行缺失、突变或修饰，而使其致病力发生缺陷，可作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中应用。

Description

一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcArs2及其应用

技术领域

本发明属微生物基因工程技术领域，具体涉及植物保护领域中控制真菌分生孢子形态与致病性的基因及其编码蛋白质的应用。

背景技术

灰霉病菌(Botrytiscinerea)通常又称作灰葡萄孢，属于子囊菌门(Ascomycota)真菌，是灰霉病的病原菌，可侵染200多种植物，包括几乎所有的蔬菜及果树作物。寄主从苗期到挂果期均可发病，而且，植株各部位均可被灰霉病菌侵染，叶部发病的典型症状表现为“V”形病斑，花部主要表现为腐烂和调萎，果实主要表现为腐烂和脱落。病害的发生和蔓延与环境的湿度、温度存在密切的关系，在20℃-23℃，相对湿度90％以上时发生严重。因此，灰霉病属低温高湿型病害，在多雨季节或者保护地生产中极易发生，每年因该病导致的经济损失高达100-1000亿美元。由于寄主范围广泛，生产上危害严重，再加上相关分子研究技术成熟，灰霉菌已成为最重要的模式植物病原真菌之一，受到广泛研究。

灰霉病菌是典型的死体营养型病原真菌，可生成多种致病因子参与致病，主要包括细胞壁降解酶类、角质酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反应的酶类、小RNA及小分子物质等，这些因子相互协作使灰霉病菌能够杀死寄主细胞并分解死亡的寄主组织作为营养。自然条件下，灰霉菌多以分生孢子作为侵染寄主的初侵染和再侵染来源。灰霉病菌常以菌丝体、分生孢子或菌核附着在植物病残体上或在土壤中越冬和越夏，成为下一生长季的初侵染来源。当条件适宜时，菌核萌发产生菌丝体和分生孢子梗，并产生大量的分生孢子。成熟的分生孢子能够借助风、雨水、灌概水和农事操作等进行传播。在低温高湿条件下，分生孢子萌发形成芽管，芽管末端稍稍膨大发育成附着胞或者进一步形成侵染垫等侵染结构，主要从衰败的花器、伤口以及坏死组织侵入。

当高浓度的灰霉病菌分生孢子侵染寄主时，发病迅速，此时主要通过芽管顶端形成的附着胞侵入；伴随孢子浓度降低，通过芽管顶端侵入的比例降低，发病速度也相应延缓1-4天，此时主要通过由菌丝发育成的附着胞或侵染垫侵入。附着胞、侵染垫等侵染结构的发育，对于灰霉病菌侵染寄主是至关重要的，如果侵染结构发育受到影响，灰霉病菌将难以侵入寄主，其危害程度会随之受到严重削弱。灰霉病菌侵染结构的发育受到营养、界面等外源条件及发育信号的联合调控，相关分子机制尚不清楚，对该领域进行深入研究不仅有助于揭示灰霉病菌等死体营养型病原真菌致病的分子机制，而且对于研发防治包括灰霉病菌在内的植物病原真菌的药剂具有重要应用价值。

从分生孢子产生、萌发到发育出功能完备的侵染结构，是一个精细的调控过程，鉴定该调控过程的重要组分，并验证相关基因的致病功能，有可能从中发现可以作为杀真菌剂作用靶标的蛋白质，为开发防治灰霉病及其它类似病害的高效药剂奠定理论和技术基础。

Ars2是一种亚砷酸盐抗性蛋白质，广泛存在于动物、植物、细菌、丝状真菌、裂殖酵母等生物，而在酿酒酵母的基因组中却没有编码该蛋白质的基因。Ars2蛋白质具有锌指结构，可以跟RNA结合，在细胞核中发挥作用，主要参与microRNA与mRNA(如组蛋白的mRNA)的加工，进而影响细胞的增殖。在哺乳动物中，Ars2参与了胚胎的早期发育；在植物中，Ars2编码基因缺失会导致发育缺陷并对脱落酸表现敏感。通过对灰霉病菌Ars2编码基因的分析，评价该基因在灰霉病菌发育及致病过程的作用，有利于鉴定潜在的防治靶标，用于筛选新型杀真菌药剂。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种控制分生孢子形态和致病性的基因及其编码的蛋白质。

本发明所提供的控制分生孢子形态和致病性基因来源于灰霉病菌，名称为BcArs2，其具有序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列。该DNA序列由4839个核苷酸组成，包括基因的启动子、开放阅读框及终止子。5’端第1位至1037位核苷酸之间为启动子序列；BcArs2的开放阅读框由2959个核苷酸组成，其中包含3个外显子，分别位于SEQIDNo:1的5’端第1038位至1215位核苷酸之间、第1343位至3363位核苷酸之间和第3415位至3996位核苷酸之间，组成的编码区长度合计为2781个核苷酸；5’端第3997位至4839位核苷酸之间为终止子序列。

本发明提供了BcArs2基因所编码的蛋白质，其具有序列表中SEQIDNo:2所示的氨基酸序列，该序列由926个氨基酸组成。

来自灰霉病菌的控制分生孢子形态和致病性基因BcArs2可应用于植物抗灰霉病基因工程领域。

来自灰霉病菌的控制分生孢子形态和致病性基因BcArs2所编码的蛋白质，对灰霉病菌控制分生孢子形态和致病性蛋白质BcArs2进行缺失、突变或修饰而使其分生孢子形态、致病力发生缺陷，可作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中应用。

本发明证明了BcArs2基因的缺失或突变导致灰霉病菌生长缓慢、分生孢子形态畸形及致病力显著降低，说明BcArs2基因是灰霉病菌引起农作物灰霉病所必需的基因。因此，筛选能够阻止该基因表达与其蛋白质的表达、修饰及定位的化合物，可以有效控制灰霉病的发生，从而有助于开发新型杀菌剂，即本发明所提供的BcArs2基因的一个重要用途是：该基因的表达与其编码的蛋白质产物的表达、修饰及定位，可以作为重要候选靶标位点，用于抗真菌药剂(特别是抗灰霉病菌药剂)的筛选和设计。

附图说明

图1为BcArs2蛋白质的结构域分析示意图

图2为灰霉病菌BcArs2基因的敲除策略(通过同源重组进行基因替换)示意图

其中：WT为野生型菌株B05.10，pArs2-ko为敲除载体，BcArs2-KO为BcArs2基因缺失突变体；

图3为BcArs2基因缺失突变体的PCR验证电泳图

其中：a、b、c、d为所用引物，相应位置见图2；KO1、KO2为两株独立获得的BcArs2基因缺失突变体；

图4为遗传互补菌株的PCR验证电泳图

其中：a、b、c、d为所用引物，相应位置见图2；KO1/Ars2为在突变体KO1基础上转入完整BcArs2基因的互补菌株；

图5为BcArs2基因的缺失突变体与野生型菌株及互补菌株的培养特征比较照片

其中：所用培养基为PDA，WT为野生型，KO1、KO2为两株独立获得的BcArs2基因缺失突变体，KO1/Ars2为在突变体KO1基础上转入完整BcArs2基因的互补菌株，培养四天后进行评价；

图6为BcArs2基因的突变体与野生型菌株及互补菌株的分生孢子形态比较照片

其中：标尺为10μm；

图7为BcArs2基因的突变体与野生型菌株及互补菌株的致病力比较照片

其中：所选择寄主为番茄，采用离体叶片接种菌饼的方法，接种3天后进行评价。

具体实施方式

为了更好地描述本发明，下面通过具体的实施例予以进一步的说明，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1BcArs2基因的相关性分析

BcArs2基因位于灰霉病菌II号染色体上，其开放阅读框由2959个核苷酸组成，包含3个外显子，编码区cDNA全长为2781个核苷酸，编码的蛋白质产物由926个氨基酸组成。取BcArs2蛋白质序列进行比对分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，发现Ars2广泛存在于动物、植物、丝状真菌中，裂殖酵母中也有，但在芽殖酵母中，该基因退化掉了。结构域分析发现，BcArs2蛋白质包含三个保守的结构域，其中一个是Ars2(见图1)。

实施例2BcArs2基因的敲除与遗传互补

1)敲除载体的构建

采用引物Ars2-UP-F(5'-CTCGAGCCTCCGACACTGCCCTTTAT-3')与Ars2-UP-R(5'-AGATCTTCCACCTTTGCCCTTCTTTC-3')，以灰霉病菌菌株B05.10的基因组DNA为模板扩增BcArs2基因上游750bp片段，采用Ars2-DN-F(5'-TCTAGACGAGAATGAGGTTAGGGTGTT-3')与Ars2-DN-R(5'-CTGCAGCAATCCAAGGCAATCCAAGTA-3')扩增灰霉病菌BcArs2基因下游841bp片段，反应体系为：10mmol/LdNTPMixture，0.5μL；10×PCRbuffer，2.5μL；上下游引物各1μL(10μmol/mL)；模板DNA，1μL；Ex-Taq，0.2μL(5U)；ddH₂O，18.8μL；扩增程序为：94℃预变性3分钟，然后(1)94℃，变性50秒；(2)59℃，退火50秒；(3)72℃，延伸60秒；(4)循环30次；(5)72℃延伸10分钟。将上述两段DNA扩增产物先后克隆至pXEH载体的XhoI、BglII位点与XbaI、PstI位点，构建成敲除载体pArs2-ko(如图2所示)，并进行测序验证。

2)灰霉病菌的转化

a.农杆菌的培养

挑取含有双元载体pArs2-ko的根癌农杆菌菌株Agl-1单菌落，接种至含50μg/ml卡那霉素、10μg/ml利福平的MM液体培养基(磷酸氢二钾0.205％，磷酸二氢钾0.145％，氯化钠0.015％，七水硫酸镁0.05％，六水氯化钙0.01％，七水硫酸亚铁0.00025％，硫酸铵0.05％，葡萄糖0.2％)中，250rpm、28℃振荡培养48h；4000rpm，离心5分钟，弃上清，IM液体培养基(磷酸氢二钾0.205％，磷酸二氢钾0.145％，氯化钠0.015％，七水硫酸镁0.05％，六水氯化钙0.01％，七水硫酸亚铁0.00025％，硫酸铵0.05％，葡萄糖0.2％，200μMAS，MES0.854％，甘油0.5％)重悬，4000rpm离心5分钟，弃上清；IM培养基重悬，28℃，250rpm振荡培养6h，进行预诱导。

b.灰霉病菌的产孢培养

选用B05.10菌株，取少量孢子涂布于PDA培养基(马铃薯20％煮烂过滤，葡萄糖2％，琼脂1.5％)，置28℃培养8h令孢子快速萌发，然后转移至20℃培养3-5天，待菌体表面被灰色孢子覆盖之后，用IM液体培养基刮取、收集孢子，显微镜观察，利用血球计数器调节孢子浓度为1×10⁶/mL。

c.根癌农杆菌与灰霉病菌分生孢子共培养及转化子筛选

将在IM液体培养基中预先诱导6h的农杆菌菌液和灰霉病菌孢子液等体积混合，加入AS，使终浓度达到500μM，混匀，然后按250～350μL/皿，均匀涂抹至铺有玻璃纸的IM培养基上，22℃黑暗培养48h；共培养完毕后，将玻璃纸转移至含有100μg/mL潮霉素的PDA培养基上，相同条件下继续培养。4～7天后挑取扩展的菌落到含有同样抗生素的筛选培养基上。

3)缺失突变体的验证

选用两对引物通过PCR扩增对转化子进行筛选。扩增结果符合如下结果的，确定为BcArs2基因缺失突变体：上游同源臂之外基因组上的引物a(5'-TCCTAGAGCCAATCACGAGC-3')与潮霉素抗性基因的引物b(5'-ACAGACGTCGCGGTGAGTTCA-3')配对可以扩增到预期大小(1.2kb)的重组片段；而编码区引物c(5'-TAGACCGTTATGAACCTGTTG-3')与d(5'-CCGAATCAGGTGCAGGGT-3')无扩增条带(野生型菌株可扩增到0.9kb片段)。结果，从转化子中筛选到2株BcArs2基因缺失突变体：KO1、KO2(如图3所示)，用于后续功能分析。

4)BcArs2基因缺失突变体的遗传互补

采用引物C-F(5'-ACTAGTTCCTAGAGCCAATCACGAGC-3')与C-R(5'-CTGCAGCAATCCAAGGCAATCCAAGTA-3')，扩增灰霉病菌BcArs2基因全长4839bp(包含启动子、开放阅读框与终止子)，先克隆至pMD18-t载体上，然后再亚克隆至pSULFgfp载体(含有氯嘧磺隆抗性基因)的SpeI与PstI位点之间，构建成遗传互补载体pArs2-ko-c。载体经测序验证，确认没有氨基酸突变。采用如前所述的农杆菌介导的转化方法，使用100μg/mL氯嘧磺隆进行筛选，将该互补片段转入BcArs2基因缺失突变体KO1基因组中，获得遗传互补菌株KO1/Ars2。选用突变体验证时曾使用的引物a与b、c与d进行PCR扩增，结果符合预期(如图4所示)：与突变体KO1相同，互补菌株KO1/Ars2中原有的BcArs2基因被替换为潮霉素抗性基因HPH(引物a与b扩增结果为阳性)，但额外拥有一个后续转入的BcArs2基因(编码区引物c与d扩增结果同样为阳性)。

实施例3BcArs2基因在灰霉病菌生长发育过程中的作用

采用平板培养法，评价BcArs2突变体的生长发育等相关表型的变异情况。将待测菌株以菌块方式接种在PDA培养基的中心，20℃黑暗培养。与野生型比较，突变体菌落的扩展速度显著变缓慢，野生型的菌丝体已经长满培养皿，而突变体只有少量扩展，遗传互补菌株生长正常，与野生型没有显著差异(见图5)，表明BcArs2基因在灰霉病菌生长过程中发挥重要作用；虽然BcArs2突变体仍然具有形成分生孢子的能力，但是孢子形态严重畸形，变长或呈角状，转入完整的BcArs2基因可使分生孢子形态恢复到正常的椭圆形(见图6)，该结果表明BcArs2基因参与了灰霉病菌分生孢子的形成过程并决定其形态。

实施例4BcArs2基因在灰霉病菌致病性方面的作用

采用离体叶片接种法，评价BcArs2突变体的致病力变化情况。从温室培养的寄主植株上采集具有一定叶龄的番茄叶片，水平放置容器中，使用打孔器打取待测菌株菌饼，正面朝下反扣至叶片上，20℃保湿黑暗培养，3天后评价待测菌株的致病性。实验结果显示，BcArs2突变体丧失了致病能力，只能在接种点附近发现少量病斑，微小且不扩展。与此形成鲜明对照的是，无论是野生型还是互补菌株，均可成功侵染番茄叶片，并迅速蔓延至几乎整个叶面(见图7)。该研究结果表明，BcArs2是一个关键的致病基因，是灰霉病菌侵染寄主所必需的，如果该基因或其编码的蛋白质丧失活性，灰霉病菌将失去侵染寄主引发病害的能力。

Claims (4)

1.一种来自灰霉病菌(Botrytiscinerea)的控制分生孢子形态和致病性基因BcArs2，其特征在于具有序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列。

2.一种根据权利要求1所述的来自灰霉病菌的控制分生孢子形态和致病性基因BcArs2所编码的蛋白质，其特征在于具有序列表中SEQIDNo:2所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的来自灰霉病菌的控制分生孢子形态和致病性基因BcArs2在植物抗灰霉病基因工程领域中的应用。

4.根据权利要求2所述的来自灰霉病菌的控制分生孢子形态和致病性基因BcArs2所编码的蛋白质，对灰霉病菌控制分生孢子形态和致病性的蛋白质BcArs2进行缺失、突变或修饰而使其致病力发生缺陷，作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中的应用。