CN105483144B - 一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcAdh1及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcAdh1及其应用属微生物基因工程技术领域，本发明提供的来自灰霉病菌的控制致病性的基因BcAdh1，其DNA序列如SEQ ID No:1所示，由1172个核苷酸组成；提供的BcAdh1基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，由372个氨基酸组成；BcAdh1基因可在植物抗灰霉病基因工程领域中应用；通过对灰霉病菌控制致病性的蛋白质BcAdh1进行缺失、突变或修饰，而使其致病力发生缺陷，可作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中应用。

Description

一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcAdh1及其应用
技术领域
本发明属微生物基因工程技术领域，具体涉及植物保护领域中控制真菌致病性的基因及其编码蛋白质的应用。
背景技术
灰霉病菌(Botrytis cinerea)通常又称作灰葡萄孢，属于子囊菌门(Ascomycota)真菌，是灰霉病的病原菌，可侵染200多种植物，包括几乎所有的蔬菜及果树。寄主从苗期、挂果期到贮存期均可发病，而且，植株各部位均可被灰霉病菌侵染，叶部发病的典型症状表现为“V”形病斑，花部主要表现为腐烂和调萎，果实主要表现为腐烂和脱落。病害的发生和蔓延与环境的湿度、温度存在密切的关系，在20℃-23℃，相对湿度90％以上时发生严重。因此，灰霉病属低温高湿型病害，在多雨季节或者保护地生产中极易发生，世界上每年因该病导致的经济损失高达100-1000亿美元。由于寄主范围广泛，生产上危害严重，再加上相关分子研究技术成熟，灰霉病菌已成为最重要的模式植物病原真菌之一，受到广泛研究。
灰霉病菌是典型的死体营养型病原真菌，可生成多种致病因子参与致病，主要包括细胞壁降解酶类、角质酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反应的酶类、小RNA及小分子物质等，这些因子相互协作使灰霉病菌能够杀死寄主细胞，并分解死亡的寄主组织作为营养。自然条件下，灰霉菌多以分生孢子作为侵染寄主的初侵染和再侵染来源。灰霉病菌常以菌丝体、分生孢子或菌核附着在植物病残体上，或在土壤中越冬和越夏，成为下一生长季的初侵染来源。当条件适宜时，菌核萌发产生菌丝体和分生孢子梗，并产生大量的分生孢子。成熟的分生孢子能够借助风、雨水、灌概水和农事操作等进行传播。在低温高湿条件下，分生孢子萌发形成芽管，芽管末端稍稍膨大发育成附着胞或者进一步形成侵染垫等侵染结构，主要从衰败的花器、伤口以及坏死组织侵入。
当高浓度的灰霉病菌分生孢子侵染寄主时，发病迅速，此时主要通过芽管顶端形成的附着胞侵入；伴随孢子浓度降低，通过芽管顶端侵入的比例降低，发病速度也相应延缓1-4天，此时主要通过由菌丝发育成的附着胞或侵染垫侵入。灰霉病菌侵入寄主细胞后，将会直接面临寄主组织内敌对环境的挑战，病原菌必须迅速做出调整，一方面抑制植物的防御反应，另一方面要积极适应寄主细胞内物理、化学环境，做到这两方面，灰霉病菌才有望成功地寄生植物。在很大程度上，灰霉病菌是通过改变自身的代谢途径，并分泌相关效应因子(如毒素)来实现上述目标的，但参与相应过程的基因、蛋白及代谢产物及其调控的分子机制仍所知甚少。对该领域进行深入研究，鉴定灰霉病菌用以适应寄主内环境的关键因子，不仅有助于揭示灰霉病菌这种死体营养型病原真菌致病的分子机制，还有可能从中发现可以作为杀真菌剂作用靶标的蛋白质，为开发防治灰霉病及其它类似病害的高效药剂奠定理论和技术基础。
灰霉病菌BcAdh1是一种乙醇脱氢酶，通过分析其编码基因的致病功能，评价该基因在灰霉病菌发育及致病过程的作用，有利于鉴定潜在的防治靶标，用于筛选新型杀真菌药剂。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种控制致病性的基因及其编码的蛋白质。
本发明所提供的控制致病性基因来源于灰霉病菌，名称为BcAdh1，其DNA序列如SEQ ID No:1所示。该DNA序列为BcAdh1基因开放阅读框，由1172个核苷酸组成，其中包含2个外显子，分别位于SEQ ID No:1的5’端第1位至316位核苷酸之间和第370位至1172位核苷酸之间，组成的编码区长度合计为1119个核苷酸。
本发明提供了BcAdh1基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，该序列由372个氨基酸组成。
来自灰霉病菌的控制致病性基因BcAdh1可应用于植物抗灰霉病基因工程领域。
对来自灰霉病菌的控制致病性基因BcAdh1所编码的蛋白质进行缺失、突变或修饰，而使其致病力发生缺陷，可作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中应用。
本发明证明了BcAdh1基因的缺失或突变，导致灰霉病菌致病力显著降低，说明BcAdh1基因是灰霉病菌引起农作物灰霉病所必需的基因。因此，筛选能够阻止该基因表达与其蛋白质的表达、修饰及定位的化合物，可以有效控制灰霉病的发生，从而有助于开发新型杀菌剂，即本发明所提供的BcAdh1基因的一个重要用途是：该基因的表达与其编码的蛋白质产物的表达、修饰及定位，可以作为重要候选靶标位点，用于抗真菌药剂(特别是抗灰霉病菌药剂)的设计和筛选。
附图说明
图1为BcAdh1蛋白质的结构域分析示意图
其中：Alcohol dehydrogenase为乙醇脱氢酶结构域；
图2为灰霉病菌BcAdh1基因的敲除策略(通过同源重组进行基因替换)示意图
其中：WT为野生型菌株B05.10，pAdh1-ko为敲除载体，BcAdh1-KO为BcAdh1基因缺失突变体，a、b、c、d为用于验证突变体及互补菌株的引物；
图3为BcAdh1基因缺失突变体及遗传互补菌株的PCR验证电泳图
其中：a、b、c、d为所用引物，相应位置见图2；M1为BcAdh1基因缺失突变体；M1/Adh1为在突变体M1基础上转入完整BcAdh1基因的互补菌株；
图4为BcAdh1基因的缺失突变体与野生型菌株的培养特征对比照片
其中：所用培养基为PDA，20℃培养三天后拍照。
图5为BcAdh1基因的突变体与野生型菌株的致病力比较照片
其中：所选择寄主为油菜，采用离体叶片接种菌饼的方法，接种3天后进行评价；M1、M2为两株独立获得的BcAdh1基因缺失突变体，M1/Adh1为在突变体M1基础上转入完整BcAdh1基因的互补菌株；
图6为BcAdh1基因的突变体与对照菌株侵染寄主所产生病斑大小的定量分析示意图
其中：接种方法同上，接种3天后对叶片病斑面积进行测量计算，换算成相对大小。**表示在p<0.01水平上差异显著。
具体实施方式
为了更好地描述本发明，下面通过具体的实施例予以进一步的说明，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1 BcAdh1基因的相关性分析
灰霉病菌BcAdh1基因的开放阅读框由1172个核苷酸组成，包含2个外显子，编码区cDNA全长为1119个核苷酸，编码的蛋白质产物由372个氨基酸组成。结构域分析发现，BcAdh1蛋白质包含一个保守的乙醇脱氢酶结构域(见图1)。
实施例2 BcAdh1基因的敲除
1)敲除载体的构建
采用引物Adh1-UP-F(5'-CTCGAGCACAGGAAGTCCCCACAGA-3')与Adh1-UP-R(5'-AGATCTGAAGACACATAGCAGCCCA-3')，以灰霉病菌菌株B05.10的基因组DNA为模板扩增BcAdh1基因上游611bp片段，采用Adh1-DN-F(5'-GGATCCAGCCTCACTTAACATCCACC-3')与Adh1-DN-R(5'-AAGCTTATAACAACTTCAAGCCACGA-3')扩增灰霉病菌BcAdh1基因下游510bp片段，反应体系为：10mmol/L dNTP Mixture，0.5μL；10×PCR buffer，2.5μL；上下游引物各1μL(10μmol/mL)；模板DNA，1μL；Ex-Taq，0.2μL(5U)；ddH2O，18.8μL；扩增程序为：94℃预变性3分钟，然后(1)94℃，变性50秒；(2)58℃，退火50秒；(3)72℃，延伸60秒；(4)循环30次；(5)72℃延伸10分钟。将上述两段DNA扩增产物先后克隆至pXEH载体的Xho I、Bgl II位点之间与BamH I、Hind III位点之间，构建成敲除载体pAdh1-ko(见图2)，并进行测序验证。
2)灰霉病菌的转化
a.农杆菌的培养
挑取含有双元载体pAdh1-ko的根癌农杆菌菌株Agl-1单菌落，接种至含50μg/ml卡那霉素、10μg/ml利福平的MM液体培养基(磷酸氢二钾0.205％，磷酸二氢钾0.145％，氯化钠0.015％，七水硫酸镁0.05％，六水氯化钙0.01％，七水硫酸亚铁0.00025％，硫酸铵0.05％，葡萄糖0.2％)中，250rpm、28℃振荡培养48h；4000rpm，离心5分钟，弃上清，IM液体培养基(磷酸氢二钾0.205％，磷酸二氢钾0.145％，氯化钠0.015％，七水硫酸镁0.05％，六水氯化钙0.01％，七水硫酸亚铁0.00025％，硫酸铵0.05％，葡萄糖0.2％，200μMAS，MES 0.854％，甘油0.5％)重悬，4000rpm离心5分钟，弃上清；IM培养基重悬，28℃，250rpm振荡培养6h，进行预诱导。
b.灰霉病菌的产孢培养
选用B05.10菌株，取少量孢子涂布于PDA培养基(马铃薯20％煮烂过滤，葡萄糖2％，琼脂1.5％)，置28℃培养8h令孢子快速萌发，然后转移至20℃培养3-5天，待菌体表面被灰色孢子覆盖之后，用IM液体培养基刮取、收集孢子，显微镜观察，利用血球计数器调节孢子浓度为1×106/mL。
c.根癌农杆菌与灰霉病菌分生孢子共培养及转化子筛选
将在IM液体培养基中预先诱导6h的农杆菌菌液和灰霉病菌孢子液等体积混合，加入AS，使终浓度达到500μM，混匀，然后按250～350μL/皿，均匀涂抹至铺有玻璃纸的IM培养基上，22℃黑暗培养48h；共培养完毕后，将玻璃纸转移至含有100μg/mL潮霉素的PDA培养基上，相同条件下继续培养。4～7天后挑取扩展的菌落到含有同样抗生素的筛选培养基上。
3)缺失突变体的验证
选用两对引物通过PCR扩增对转化子进行筛选。扩增结果符合如下结果的，确定为BcAdh1基因缺失突变体：上游同源臂之外基因组上的引物a(5'-ACGCCCCATGTTATTTTTCACC-3')与潮霉素抗性基因的引物b(5'-ACAGACGTCGCGGTGAGTTCA-3')配对可以扩增到预期大小(1.3kb)的重组片段；而编码区引物c(5'-CATCGGCACTTCATATGCAG-3')与d(5'-GAAGGAACGAGAAGTCAATG-3')无扩增条带(野生型菌株可扩增到0.5kb片段)。结果，从转化子中筛选到2株BcAdh1基因缺失突变体：M1与M2菌株，用于后续功能分析(见图3)。
实施例3 BcAdh1基因缺失突变体的遗传互补
采用引物C-F(5'-CTGCAGACGCCCCATGTTATTTTTCACC-3')与C-R(5'-GGATCCTTCTTCATCTCTGCGGCCTTCA-3')，扩增灰霉病菌BcAdh1基因全长2889bp(包含启动子、开放阅读框与终止子)，先克隆至pMD18-t载体上，然后再亚克隆至pSULF载体(含有氯嘧磺隆抗性基因)的BamH I与Pst I位点之间，构建成遗传互补载体pAdh1-ko-c。载体经测序验证，确认没有氨基酸突变。采用如前所述的农杆菌介导的转化方法，使用100μg/mL氯嘧磺隆进行筛选，将该互补片段转入BcAdh1基因缺失突变体M1基因组中，获得遗传互补菌株M1/Adh1。选用突变体验证时曾使用的引物a与b、c与d进行PCR扩增，结果符合预期(见图3)：与突变体M1相同，互补菌株M1/Adh1中原有的BcAdh1基因被替换为潮霉素抗性基因HPH(引物a与b扩增结果为阳性)，但额外拥有一个后续转入的BcAdh1基因(编码区引物c与d扩增结果同样为阳性)。
实施例4 BcAdh1基因在灰霉病菌生长及致病性方面的作用
采用平板培养法，评价BcAdh1突变体的生长相关表型的变异情况：吸取2μL待测菌株的孢子悬浮液(5×104mL-1)接种在PDA培养基的中心，20℃黑暗培养。3天后观察发现突变体的菌落形态及生长速度均表现正常，与野生型比较没有显著差别(见图4)。采用离体叶片接种法，评价BcAdh1突变体的致病力变化情况：从温室培养的油菜植株上采集成熟叶片，水平放置容器中，将1/2PDB(马铃薯10％煮烂过滤，葡萄糖1％)孢子悬浮液(5×104mL-1)滴于其上，20℃保湿黑暗培养，3天后评价待测菌株的致病性。实验结果显示，BcAdh1突变体基本丧失了致病能力，只能在接种点附近发现微小病斑，且不扩展。与此形成鲜明对照的是，野生型可成功侵染油菜叶片，并迅速蔓延至大半个叶面，遗传互补菌株M1/Adh1的致病力正常，可恢复到野生型水平(见图5)。对叶片病斑面积进行测量计算，发现BcAdh1突变体侵染引起的病斑面积只能达到野生型引起的10％左右(见图6)，而且病斑并不会随着发病时间的延长而扩展。该研究结果表明，BcAdh1是一个关键的致病基因，是灰霉病菌侵染寄主所必需的，如果该基因或其编码的蛋白质丧失活性，灰霉病菌将失去侵染寄主引发病害的能力。

Claims (1)

1.一种来自灰霉病菌(Botrytis cinerea)的控制致病性基因BcAdh1在植物抗灰霉病基因工程领域中的应用，该基因的DNA序列如SEQ ID No:1所示。
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