CN108531407B

CN108531407B - 一株不产黄曲霉毒素菌株的构建及防治黄曲霉污染的方法

Info

Publication number: CN108531407B
Application number: CN201810393424.7A
Authority: CN
Inventors: 庄振宏; 胡育乐; 汪世华; 袁军; 张峰; 刘亚举; 郭志强
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2018-04-27
Publication date: 2020-03-17
Anticipated expiration: 2038-04-27
Also published as: CN108531407A

Abstract

本发明提供了一株不产黄曲霉毒素菌株的构建及防治黄曲霉污染的方法，所述的无毒株中黄曲霉不表达致病相关基因Aflrum1。该菌株无毒，不产菌核，高产孢，低致病力。基于该菌株的以上特点本发明还公开了一种利用该菌株防治黄曲霉污染的方法。更加具体地，该方法包含，利用该黄曲霉菌株的无毒，不产菌核，高产孢，低致病力的特性，通过该菌株与野生产毒黄曲霉菌株在花生主产区等黄曲霉易感区域争夺有限的生态位，有效降低野生产毒黄曲霉菌株的密度，从而有效控制和降低作物受到的黄曲霉毒素的污染，及其引发的曲霉病感染。

Description

一株不产黄曲霉毒素菌株的构建及防治黄曲霉污染的方法

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体涉及一株不产黄曲霉毒素菌株的构建及防治黄曲霉污染的方法。

背景技术

黄曲霉（Aspergillus flavus）是一种重要的植物病原真菌，广泛分布于自然界。黄曲霉也是一种人畜共患病原菌，可寄生于粮食、食品及饲料中进行生长繁殖，并产生黄曲霉毒素，其中以黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的危害最大，是迄今为止发现的致癌性最强、毒性最强的天然污染物之一。据联合国粮食及农业组织（FOA）报告，全球每年大约25%的农作物受到真菌和真菌毒素的污染，所造成的经济损失达数千亿美元。AFB1的毒性是砒霜的68倍，氰化钾的10倍，因此对人类和动物健康造成巨大危害。在我国，花生和玉米被黄曲霉污染的情况非常普遍，畜禽饲料和水产饲料的黄曲霉污染则更为严重，结果导致黄曲霉毒素通过食物链危害人类健康。由于黄曲霉毒素含有大环共轭体系，理化性质稳定，分解温度为237~299℃，大规模工业加工、日常烹饪条件或者巴氏灭菌等都无法清除污染。因此黄曲霉污染危害极大，研究预防和控制黄曲霉污染具有重大的意义。

黄曲霉产孢、产毒的能力与其生长、扩散、繁殖和毒性密切相关，影响黄曲霉的致病性。随着黄曲霉全基因组测序的完成，对其致病性相关的遗传因素筛查和研究日渐增多，然而目前发现即使完全相同遗传背景下，黄曲霉的产毒量也可能差异极大。这就提示黄曲霉对非遗传因素的影响非常敏感。这其中有关外界环境因子如营养、温度、水活度、pH值、氧化状态以及群体感性等影响黄曲霉形态和产毒的研究已开展多年，而关于体内非遗传因素调控黄曲霉致病性研究则仍处在起步阶段。

黄曲霉的生长、繁殖、侵染和次级代谢，在分子水平上是错综复杂的过程，涉及许许多多的转录因子对各类基因表达的调控。研究发现黄曲霉中各类转录因子在其生命代谢活动中起到非常重要的通，尤其是在黄曲霉分生孢子的形成、次级代谢产物的生物合成以及黄曲霉对宿主的侵染过程中，各类转录调控因子发挥了非常重要的作用，因而深入研究转录因子如何调控这些基本的生命代谢活动，将为科学合理地防治黄曲霉提供更好的思路。黄曲霉中还未见关于Rum1转录因子的研究报道，故而Rum1对黄曲霉的致病性是否有影响也是未知的。

本发明人经过广泛研究，首次在黄曲霉中发现一种黄曲霉致病相关基因，本发明人将之命名为Aflrum1基因。因此，本发明公开了一种黄曲霉不产毒株⊿Aflrum1菌株，该不产毒株中黄曲霉不表达致病相关基因Aflrum1。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不产黄曲霉毒素菌株，菌株中Aflrum1基因基本上不表达。

在一个具体的实施方式中，所述的不产黄曲霉毒素菌株：

(1) Aflrum1基因片段缺失；

(2) 相对于野生型黄曲霉，所述的不产黄曲霉毒素菌株产生的孢子数量显著上升；

(3) 相对于野生型黄曲霉，所述的不产黄曲霉毒素菌株不产菌核。

(4) 相对于野生型黄曲霉，所述的不产黄曲霉毒素菌株未检测到黄曲霉毒素；

(5) 相对于野生型黄曲霉，所述的不产黄曲霉毒素菌株中产毒相关基因的表达显著下降；

(6) 所述的产毒相关基因包括：aflR基因、aflS基因、aflA基因，aflB基因，aflC基因、aflD基因、aflE基因、aflF基因、aflG基因、aflH基因、aflI基因、aflJ基因、aflK基因、aflL基因、aflM基因、aflN基因、aflO基因、aflP基因和aflQ基因。

(7) 相对于野生型黄曲霉，所述的不产黄曲霉毒素菌株侵染宿主的能力下降；

(8) 所述的宿主包括：粮食及其制品、豆类及其制品、坚果及其制品、植物油及其制品、调味香辛料及其制品和饲料；

(9) 所述的侵染宿主的能力包括：在宿主上定殖并产生菌核，以及产生黄曲霉毒素AFB1和AFB2。

所述的不产黄曲霉毒素菌株通过同源重组的方法从黄曲霉菌株CA14（∆ku70, ∆ pyrG 购自FGSC）的染色体中敲除Aflrum1基因或基因片段获得，所述的Aflrum1基因具有SEQ ID NO: 1 所示的核苷酸序列，所述的Aflrum1基因的表达产物AflRum1蛋白具有SEQID NO: 2 所示的氨基酸序列。

所述的Aflrum1基因在防治黄曲霉污染中的应用。

所述的不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株在防治黄曲霉污染中的应用。

本发明的第二方面，提供一种基于⊿Aflrum1不产毒株防治黄曲霉污染的方法，所述方法包括：

(1) 利用该菌株不产黄曲霉毒素（图3），高产孢的特点，其产孢量是野生型菌株的近2倍（图2），在培养基上人工培养大量的该黄曲霉菌株的孢子；

(2) 将步骤 (1) 中获得的孢子释放到受野生黄曲霉污染的区域（包括上述的花生产区）。

(3) 利用⊿Aflrum1株的无毒（图2），不产菌核（图4），低致病力的特性（图4），通过步骤（2）大量该菌株的分生孢子与野生产毒黄曲霉菌株在花生主产区等黄曲霉易感区域争夺有限的生态位，有效降低野生产毒黄曲霉菌株的密度，从而有效控制和降低作物受到的黄曲霉感染，黄曲霉毒素污染及其引发的曲霉病感染。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

本发明的优点在于：

目前对黄曲霉污染的研究主要集中在黄曲霉毒素致病和产毒机理等的研究，黄曲霉毒素饲料及食品污染的检测方法改进，以及毒素污染后的处理等方面，但是对如何控制黄曲霉对作物的污染方面的研究甚少。本发明能有效控制和降低作物受到的产毒黄曲霉感染，有利于在污染早期从根本上解除黄曲霉毒素的产生，积累，从而有效控制黄曲霉毒素的污染。与黄曲霉毒素污染检测手段和污染后解毒技术相比，从源头上控制黄曲霉的污染，成本显著降低。因此，本研究具有潜在的巨大的经济和社会效益。

附图说明

图1. 在黄曲霉中敲除Aflrum1基因的策略及其染色体上的酶切图谱（图1A）、Southern杂交图谱（图1B）和半定量RT-PCR检测Aflrum1敲除株Aflrum1基因的表达水平（图1C）。

图2. 黄曲霉⊿Aflrum1菌株和对照菌株在PDA培养基上的菌落形态（图2A、2C）和产孢数量统计（图2B、2D）。

图3.黄曲霉⊿Aflrum1菌株和对照菌株在YES培养基中产生AFB1的TLC分析（图3A、3B）和产毒相关基因转录水平分析（图3C）。

图4. 黄曲霉⊿Aflrum1菌株和对照菌株在WKM培养基的菌落形态（图4A）和菌核数量统计（图4B）和菌核相关基因的转录水平分析（图4C）。

图5. 黄曲霉⊿Aflrum1菌株和对照菌株侵染花生和玉米种子5天后的形态（图5A）、产生孢子数量的统计分析（图5B）以及种子中黄曲霉毒素含量的TLC分析（图5C）。

具体实施方式

如本文所用，黄曲霉Aflrum1基因（SEQ ID NO:1）用斜体Aflrum1表示，黄曲霉的不产毒株用⊿Aflrum1表示，或用Aflrum1缺失株表示，黄曲霉的回补菌株用⊿Aflrum1-C表示，黄曲霉的野生型菌株用WT表示。黄曲霉AflRum1蛋白（SEQ ID NO:2）用正体AflRum1表示。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明提供了一种黄曲霉的不产毒株。该不产毒株中Aflrum1基因基本上不表达。所述的“基本上不表达”是指黄曲霉不产毒株中Aflrum1基因不表达或低表达。其中，Aflrum1基因低表达是指该不产毒株中Aflrum1基因的表达量低于野生型黄曲霉的20%；较佳的是低于野生型黄曲霉的10%；更佳的是低于野生型黄曲霉的5%或更低，最佳的低于2%。所述的黄曲霉不产毒株可以用于研究Aflrum1基因基本上不表达对于黄曲霉中其它基因表达情况的影响，以及研究Aflrum1基因基本上不表达后黄曲霉的产孢、产毒和侵染宿主等致病性情况。

Aflrum1基因基本上不表达的菌株可以通过各种基因抑制、基因沉默、基因敲除等技术来构建。例如，可以通过基于同源重组的基因敲除技术来将Aflrum1基因从染色体上敲除，从而使得Aflrum1基因缺失；可以针对Aflrum1基因设计干扰性RNA或反义核苷酸来使Aflrum1基因表达抑制或沉默。

作为本发明的一具体实施方式，一种使得Aflrum1基因缺失的方法是基因敲除技术，所述的Aflrum1基因具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，也包括截短形式的Aflrum1基因（或称为Aflrum1基因片段），AflRum1蛋白具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，也包括截短形式的AflRum1蛋白。只要Aflrum1基因片段在被敲除后可导致AflRum1蛋白不表达或表达异常，或其表达的AflRum1蛋白蛋白片段活性降低或没有活性。

在本发明的一具体实施方式中，本发明人通过搜索Aspergillus ComparativeDatabase数据库，利用生物信息学比较分析，在黄曲霉的基因组序列中发现一个功能未知的新基因，该基因编码的产物与构巢曲霉的Rum1蛋白具有较高的同源性，因此命名为黄曲霉Aflrum1基因。本发明人体外构建Aflrum1基因敲除片段，通过同源重组的方法，把黄曲霉染色体Aflrum1基因中的3.5 kb DNA同源片段用烟曲霉pyrG基因片段替换，从而敲除染色体上的Aflrum1基因。

Aflrum1的缺失使黄曲霉产生的孢子数量增加，但不产生黄曲霉毒素AFB1，而回补Aflrum1基因则能够恢复产孢数量和AFB1的产量。在种子侵染实验中，⊿Aflrum1菌株定殖在种子上产生的孢子明显增多，但不产生AFB1，而回补Aflrum1基因则能够使得黄曲霉定殖的孢子数量减少和AFB1产量也增加。这些结果表明Aflrum1负向调控黄曲霉的产孢，正向调控黄曲霉产毒，同时也影响该菌的致病性表现。

所述的Aflrum1基因可以作为一种黄曲霉致病性鉴定的标志物。例如可通过检测待测黄曲霉中Aflrum1基因的表达情况来确定黄曲霉的致病性；若相对于野生型黄曲霉，待测黄曲霉Aflrum1基因正常表达（即相对于野生型黄曲霉，待测黄曲霉中Aflrum1基因的表达高20%或更高，更佳的高50%或更高），则该黄曲霉具有一般致病性性；若相对于野生型黄曲霉，待测黄曲霉Aflrum1基因低表达或不表达，则该黄曲霉具有无致病性。

在一具体的实施方式中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的黄曲霉产孢、产毒抑制或种子侵染抑制试验，以进一步选择和确定对于抑制黄曲霉致病性有用的物质。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南（New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I.材料和方法

1. 黄曲霉毒素提取及分析

在YES液体培养基中接种黄曲霉孢子至浓度10⁶个/ml，29℃持续黑暗静置培养6天，吸取2 mL液体培养基加入等体积氯仿，振荡混匀，高速离心5 min，吸取有机相液体，干燥后用200 µl氯仿重新溶解并取5 µl点样，进行薄层层析（TLC）分析。

2. 种子侵染实验

花生和玉米种子小心地去掉胚芽，花生去皮，将完好的种子置于0.05﹪次氯酸钠中浸泡3 min，转至无菌水中漂洗30 s，70%乙醇浸泡5 s，再用无菌水中漂洗1 min，沥干水后用20 ml孢子溶液（终浓度10⁵个/ml）浸泡花生子叶，空白对照用无菌水浸泡，50 rpm，30min，每个培养皿放置重量相近的20片子叶，培养皿中铺三层润湿的滤纸，29℃培养5天；将侵染后的花生子叶放入装有10 mL 0.01﹪吐温20的孢子洗脱液中，涡旋振荡1 min，取1 ml用于孢子计数，其余液加入等体积氯仿150 rpm震荡混匀30 min，室温静置10 min，涡旋混匀，2000 rpm离心15 min，收集下层有机相液体，干燥后用500 μl氯仿重溶，取5 μL点TLC板。

II. 实施例

实施例1、黄曲霉中Aflrum1基因的敲除

为了研究黄曲霉Aflrum1基因在黄曲霉形态发生和毒性表现中的功能，首先在黄曲霉中敲除Aflrum1基因。

图1A显示了基因敲除的策略和酶切图。体外构建Aflrum1基因敲除片段，通过同源重组的方法，把染色体Aflrum1基因中的3.5 kb DNA片段用pyrG替换，从而敲除染色体上的Aflrum1基因。

具体方法如下：

利用5’引物GGCACGAGCTATTAGTGATATTAGTCGAGTCCGA（SEQ ID NO: 3）；和3’引物CAAGTGAGCCGACCGATTGAGGGAAGTAGT（SEQ ID NO: 4）；从黄曲霉CA14菌株基因组DNA中用PCR的方法扩增约1.2 kb的上游片段；

利用5’引物ACTACTTCCCTCAATCGGTCGGCTCACTT GGCCTCAAACAATGCTCTTCACCC（SEQID NO: 5）；和3’引物GAACCCATGAAGCGCCAATTTGTTGATAGGGAGTCTGAGAGGAGGCACTGATGC（SEQID NO: 6）；从烟曲霉基因组DNA中用PCR的方法扩增约1.9 kb的pyrG基因片段；

利用5’引物TCCCTATCAACAAATTGGCGCTTCATGGGTTC（SEQ ID NO: 7）；和3’引物TGGATTCCTTCGGGGGCTAGTTTGCATC（SEQ ID NO: 8）；从黄曲霉CA14菌株基因组DNA中用PCR的方法扩增约1.4 kb的下游片段；

将上述三个片段用融合PCR法连接到一起构建Aflrum1敲除片段，导入黄曲霉CA14菌株，在不含尿嘧啶和尿苷的培养基上筛选阳性转化子。通过敲除片段上、下游的两个同源片段与染色体上Aflrum1基因的上、下游同源片段的同源重组，把染色体上的Aflrum1基因给替换掉，从而敲除染色体上的Aflrum1基因。正确插入的转化子的基因型用Southern杂交技术检测确定。这些菌株的基因组DNA 用HindⅢ酶切，与探针杂交。杂交结果表明，野生型菌株显示一条约5.3 kb 杂交条带，Aflrum1缺失株显示约2.8 kb的杂交条带。图1B显示了Aflrum1基因敲除过程Southern杂交分析的图谱。同时，还利用半定量qRT-PCR进一步验证了这些菌株中Aflrum1基因的转录水平（图1C）。

实施例2、Aflrum1基因的敲除对黄曲霉菌产孢的影响

通过同源重组的方法在黄曲霉中敲除Aflrum1基因，Southern杂交分析证明敲除是成功的。为了检测Aflrum1基因的缺失是否会影响黄曲霉产孢，在PDA培养基上接种浓度为10⁶个/ml的孢子液1 μl，并分别置于37℃（图2A、2B）、29℃（图2C、2D）的黑暗条件下培养5天，观察以下各个菌株的产孢情况。野生型菌株WT产生了大量绿色的孢子，而Aflrum1缺失株产生的绿色孢子数量比WT多很多，数据统计分析也说明了这一点。

该结果说明，Aflrum1基因的缺失会影响黄曲霉产孢。

实施例3、Aflrum1基因的敲除对黄曲霉菌产毒的影响

为了检测Aflrum1基因的缺失是否会影响黄曲霉产毒，在YES液体培养基内接种孢子至终浓度10⁶个/ml，29℃的持续黑暗条件下静置培养6天，提取毒素，通过TLC分析各菌株的产毒情况情况。结果表明WT菌株产生了大量的黄曲霉毒素AFB1和AFB2，而⊿Aflrum1明显不产生AFB1和AFB2，数据统计分析也说明了这一点（图3A、3B）。

同时利用qRT-PCR检测了黄曲霉毒素生物合成通路调控基因aflR和aflS，以及部分结构基因aflC和aflO的转录水平，并以actin作为转录分析的内参对照。与WT菌株相比，⊿Aflrum1缺失株以上各基因的转录水平都显著下调了，数据趋势与TLC的结果一致（图3C）。

以上结果说明，Aflrum1基因的缺失会影响黄曲霉产毒。

实施例4、Aflrum1基因的敲除对黄曲霉菌产菌核的影响

为了检测Aflrum1基因的缺失是否会影响黄曲霉产菌核，在WKM培养基内接种浓度为10⁶个/ml的孢子液1 μl，37℃的持续黑暗条件下静置培养7天，观察以下各个菌株的产菌核情况。结果表明野生型菌株WT产生了大量的菌核，而Aflrum1缺失株明显没有产生菌核，数据统计分析也说明了这一点。（图4A、4B）。

同时利用qRT-PCR检测了黄曲霉菌核合成相关基因nsdC，nsdD和sclR的转录水平，并以actin作为转录分析的内参对照。与WT菌株相比，⊿Aflrum1菌株以上各基因的转录水平都显著下调了（图4C）。

以上结果说明，Aflrum1基因的缺失会显著影响黄曲霉的产菌核情况。

实施例5、Aflrum1基因的敲除对黄曲霉致病力的影响

产孢、产毒能力与黄曲霉的致病性密切相关，不能产孢或产毒的菌株其致病性会丧失或大幅下降。

构建的⊿Aflrum1缺失株产孢和产毒的能力都有缺陷，于是通过花生和玉米种子侵染试验来检测⊿Aflrum1的致病性。以野生型菌株WT为阳性对照，以无菌水为空白对照，检测⊿Aflrum1的致病性。

将去胚后完好的种子用次氯酸钠和酒精消毒，用20 ml孢子溶液（终浓度10⁵个/ml）浸泡29 ℃后黑暗培养5天；将侵染后的花生洗脱孢子计数，并提取黄曲霉毒素进行TLC检测。WT菌株在侵染5天后能够产生密集的绿色孢子，相比之下，⊿Aflrum1菌株在侵染5天后能产生更加密集的绿色孢子，孢子个数统计也表明其产孢数量明显上升（图5A、5B）。同样的，WT菌株能够正常产毒，而⊿Aflrum1不能产生黄曲霉毒素（图5C、5D）。这些结果都说明⊿Aflrum1菌株的致病性明显低于野生型WT菌株。

因此，AflRum1调控黄曲霉的致病性表现，是一个重要的致病相关因子。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一株不产黄曲霉毒素菌株的构建及防治黄曲霉污染的方法

<130> 8

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3515

<212> DNA

<213> Aflrum1全长基因序列

<400> 1

caactcgact ggcggacagc ctccggcgag ccgtcaaccc acccgatcct ctagcaccca 60

cccgtcgcat tctcacaatg tacccttaag tgctcgacgg tctacacctc tcgacttgtc 120

cacggttgag cgacgtggac agcccaatgc ccctcgagag ccaagtaaac gtatccgacc 180

tcacggttta caagaggcac ctacgtttcg gccgactgag gaggaattca aggatccgga 240

aaaatatatc cgtaagatag cgcccgaagg caagaaatat ggaatctgta ggatcattcc 300

accagaaggc tggcaaccgc cgtttgccat tgacacagag gtatgtacat acttgtgatg 360

atttgttggc ttgtcaggat acatctccat ggctgtctat cagctcggat gggaatccct 420

ttcccccctt ctgccaattc acaataatac aagtgaggta tggaggctga caaaccgtct 480

tacagcgatt ccacttcaaa acccgccgac aggagctcaa ctcggttgaa ggaggtatgc 540

ccccgcgttc agccacgtct gccgccggtg gtgctccgca gcccagttct gacccggacc 600

caggaacccg agcaaatcta aactatctcg atcagctggc caaattccac aaacaacatg 660

ggaccaatct caaccgtttt ccgagcgtcg ataaacgccc tctggatttg tacaagttga 720

aaaaggctgt cgaggttagg ggtggttttg accaagtgtg caagatgaag aaatgggcag 780

agattggccg cgatcttggc tacagtggca aaatcatgtc ttcactttca acatcgctga 840

agaattccta tcagcgatgg ctccaaccat acgaagagta cctccgcgtg gctaagcccg 900

gggtgcagca acaattggag ctagaacatg gtggccctta cacaccatca cctcatcagt 960

cgcctatggc taaaaagccc atgccacttg acaatggcac gtcacacatg ctacccaagg 1020

gaacaatgag tgtcccgccg tcagctccgc agagcactcc tagggaggtt gaagcaaccc 1080

cagataaacc aacacctcca attgagccga cgccttctcg gccaatagct tctgggttca 1140

cacccgtgaa tgctagttcg ggatttactg ctgtcaaccg gtcgccatct tttgtagcag 1200

taaacaacaa tccgaccata aagcgtgaaa ttgagaatgg ctctttgaca ccgaaaagtg 1260

tcgccgagca tccttcaatc tcgactcctg tctctaatgg ccatggccat cacacaaagc 1320

gcgcgattag ccacgaaagt ggttctcaaa ctgaaaatgg agatgacccg aacggtcggc 1380

gtagtaagcg tcttcgcaaa ggtgtgtaaa cattgttgtc atccatcatt ctatgcgaaa 1440

cctaatgatt tcgtagatgc gcctttacct acaattgccg gttcacatat gagtcttctt 1500

cggcccgccc cgccccgggc acggaagagt gacggccgaa agacgggtga tgtaagctga 1560

tatcacgttg ccgatcgtga ttatactgtg ctaactatac ctagaaatgt gagaattgtg 1620

gcaaatccga agacatctcc tcgatcctgg tgtgcgatag ttgcgagcaa ggatatcaca 1680

agtactgtct tgacccccct ctgactacca tccccgaata cgattggcac tgcccaaaat 1740

gcctggtagg cacaggggag tttggcttcg aggaaggagg agtctactcg cttaaacagt 1800

ttcaagaaaa ggcaaataac ttcaaaaaga gttatttcgc ctcaaagatg ccctttgatc 1860

ctgtcctcaa cagtcataga cgggagtctg aggacgacgt ggaacgcgag ttctggagat 1920

tagtggagag cctgacagag accgttgaag tagagtatgg tgctgacata cattcgacta 1980

ctcacggtag tggatttcct actattgaac ggaatcctct tgatccttat tcagttgacc 2040

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tcccggagct tttcgagggt cagcctgatc ttctcttcca actagtaacc ttaatgccgc 2340

cagatcagct cagaaaggct ggtgttaatg tgtatgcgct tgatcaacga gctgggcaat 2400

tcgtcatcac cttcccccaa gcgtaccacg caggattcaa tcatggcttt aattttaatg 2460

aggctgtcaa ctttgcacct gcagactggg aaccttgggg tgcaatgggt gtggagcgtc 2520

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ggtaccgatt tagtgatgag gctctgaagg ccttggtgca aaaagttcag gaccgtgcca 3000

ggatcccgga agcatggggt gagaagctcg acaagacatt ggaagatgag cctaggccac 3060

agttgaaggt ccttcataac ctattgagtg aaggtgagaa aatcccatac catttgcctg 3120

gtctccaaga tcttgcggcc ttcgtccagc gctgcgataa gtgggttgaa gaagcaacca 3180

actatattac ccggaagcag caaaaccgga ggaaaaatga gaaggcttgg cgaagaagca 3240

gttctaaagc cgcgcagctg gaagaacgtg atcgtgaagt tcgcagagta gaaaatatct 3300

acgcccttct tgcagaggct gataaactgt cgttcgactg tccacagatg gcttctctgg 3360

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cccacattcg atcggtccag gaagttgaag atctggtgga gtccgcacgt aatttcaacg 3480

tggatatccc cgaggttgaa ggactggaac atatt 3515

<210> 2

<211> 1704

<212> PRT

<213> AfRum1全长蛋白序列

<400> 2

Met Val Ala Pro Ala Ser Thr Gly Gly Asn Ser Thr Gly Gly Gln Pro

1 5 10 15

Pro Ala Ser Arg Gln Pro Thr Arg Ser Ser Ser Thr His Pro Ser His

20 25 30

Ser His Asn Val Pro Leu Ser Ala Arg Arg Ser Thr Pro Leu Asp Leu

35 40 45

Ser Thr Val Glu Arg Arg Gly Gln Pro Asn Ala Pro Arg Glu Pro Ser

50 55 60

Lys Arg Ile Arg Pro His Gly Leu Gln Glu Ala Pro Thr Phe Arg Pro

65 70 75 80

Thr Glu Glu Glu Phe Lys Asp Pro Glu Lys Tyr Ile Arg Lys Ile Ala

85 90 95

Pro Glu Gly Lys Lys Tyr Gly Ile Cys Arg Ile Ile Pro Pro Glu Gly

100 105 110

Trp Gln Pro Pro Phe Ala Ile Asp Thr Glu Arg Phe His Phe Lys Thr

115 120 125

Arg Arg Gln Glu Leu Asn Ser Val Glu Gly Gly Thr Arg Ala Asn Leu

130 135 140

Asn Tyr Leu Asp Gln Leu Ala Lys Phe His Lys Gln His Gly Thr Asn

145 150 155 160

Leu Asn Arg Phe Pro Ser Val Asp Lys Arg Pro Leu Asp Leu Tyr Lys

165 170 175

Leu Lys Lys Ala Val Glu Val Arg Gly Gly Phe Asp Gln Val Cys Lys

180 185 190

Met Lys Lys Trp Ala Glu Ile Gly Arg Asp Leu Gly Tyr Ser Gly Lys

195 200 205

Ile Met Ser Ser Leu Ser Thr Ser Leu Lys Asn Ser Tyr Gln Arg Trp

210 215 220

Leu Gln Pro Tyr Glu Glu Tyr Leu Arg Val Ala Lys Pro Gly Val Gln

225 230 235 240

Gln Gln Leu Glu Leu Glu His Gly Gly Pro Tyr Thr Pro Ser Pro His

245 250 255

Gln Ser Pro Met Ala Lys Lys Pro Met Pro Leu Asp Asn Gly Thr Ser

260 265 270

His Met Leu Pro Lys Gly Thr Met Ser Val Pro Pro Ser Ala Pro Gln

275 280 285

Ser Thr Pro Arg Glu Val Glu Ala Thr Pro Asp Lys Pro Thr Pro Pro

290 295 300

Ile Glu Pro Thr Pro Ser Arg Pro Ile Ala Ser Gly Phe Thr Pro Val

305 310 315 320

Asn Ala Ser Ser Gly Phe Thr Ala Val Asn Arg Ser Pro Ser Phe Val

325 330 335

Ala Val Asn Asn Asn Pro Thr Ile Lys Arg Glu Ile Glu Asn Gly Ser

340 345 350

Leu Thr Pro Lys Ser Val Ala Glu His Pro Ser Ile Ser Thr Pro Val

355 360 365

Ser Asn Gly His Gly His His Thr Lys Arg Ala Ile Ser His Glu Ser

370 375 380

Gly Ser Gln Thr Glu Asn Gly Asp Asp Pro Asn Gly Arg Arg Ser Lys

385 390 395 400

Arg Leu Arg Lys Asp Ala Pro Leu Pro Thr Ile Ala Gly Ser His Met

405 410 415

Ser Leu Leu Arg Pro Ala Pro Pro Arg Ala Arg Lys Ser Asp Gly Arg

420 425 430

Lys Thr Gly Asp Lys Cys Glu Asn Cys Gly Lys Ser Glu Asp Ile Ser

435 440 445

Ser Ile Leu Val Cys Asp Ser Cys Glu Gln Gly Tyr His Lys Tyr Cys

450 455 460

Leu Asp Pro Pro Leu Thr Thr Ile Pro Glu Tyr Asp Trp His Cys Pro

465 470 475 480

Lys Cys Leu Val Gly Thr Gly Glu Phe Gly Phe Glu Glu Gly Gly Val

485 490 495

Tyr Ser Leu Lys Gln Phe Gln Glu Lys Ala Asn Asn Phe Lys Lys Ser

500 505 510

Tyr Phe Ala Ser Lys Met Pro Phe Asp Pro Val Leu Asn Ser His Arg

515 520 525

Arg Glu Ser Glu Asp Asp Val Glu Arg Glu Phe Trp Arg Leu Val Glu

530 535 540

Ser Leu Thr Glu Thr Val Glu Val Glu Tyr Gly Ala Asp Ile His Ser

545 550 555 560

Thr Thr His Gly Ser Gly Phe Pro Thr Ile Glu Arg Asn Pro Leu Asp

565 570 575

Pro Tyr Ser Val Asp Pro Trp Asn Leu Asn Val Leu Pro Phe His Gly

580 585 590

Asp Ser Leu Phe Arg His Ile Lys Ser Asp Ile Ser Gly Met Thr Val

595 600 605

Pro Trp Val Tyr Val Gly Met Cys Phe Ser Thr Phe Cys Trp His Asn

610 615 620

Glu Asp His Tyr Ala Tyr Ser Ala Asn Tyr Gln His Phe Gly Ala Thr

625 630 635 640

Lys Thr Trp Tyr Gly Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Ala Phe Glu Glu

645 650 655

Ala Met Arg Gln Ala Val Pro Glu Leu Phe Glu Gly Gln Pro Asp Leu

660 665 670

Leu Phe Gln Leu Val Thr Leu Met Pro Pro Asp Gln Leu Arg Lys Ala

675 680 685

Gly Val Asn Val Tyr Ala Leu Asp Gln Arg Ala Gly Gln Phe Val Ile

690 695 700

Thr Phe Pro Gln Ala Tyr His Ala Gly Phe Asn His Gly Phe Asn Phe

705 710 715 720

Asn Glu Ala Val Asn Phe Ala Pro Ala Asp Trp Glu Pro Trp Gly Ala

725 730 735

Met Gly Val Glu Arg Leu Gln Asp Phe Arg Arg His Pro Cys Phe Ser

740 745 750

His Asp Glu Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Arg Asp Thr Ser Ile Thr

755 760 765

Thr Ala Lys Trp Leu Ser Pro Ala Leu Gln Arg Thr Cys Thr Arg Glu

770 775 780

Leu Ser Glu Arg Ala Ser Phe Phe Ser Arg His Arg Glu Val Ala Pro

785 790 795 800

His His Cys Thr Leu Gly Ser Glu Asp Ala Met Asp Ile Gly Gly Cys

805 810 815

Gln Leu Lys Phe Val Val Glu Asp Glu Asp Leu Pro Glu Glu Asp Tyr

820 825 830

Gln Cys Gln Trp Cys Lys Ala Tyr Ala Tyr Leu Thr Gln Phe Arg Cys

835 840 845

His Lys Thr Gly Lys Thr Val Cys Leu Ser His Ile Asp Met Asn Val

850 855 860

Cys Cys Gly Glu Pro Leu Lys Gln Lys Leu Leu Gly Pro Asp His Thr

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Arg Phe Ser Asp Glu Ala Leu Lys Ala Leu Val Gln Lys

885 890 895

Val Gln Asp Arg Ala Arg Ile Pro Glu Ala Trp Gly Glu Lys Leu Asp

900 905 910

Lys Thr Leu Glu Asp Glu Pro Arg Pro Gln Leu Lys Val Leu His Asn

915 920 925

Leu Leu Ser Glu Gly Glu Lys Ile Pro Tyr His Leu Pro Gly Leu Gln

930 935 940

Asp Leu Ala Ala Phe Val Gln Arg Cys Asp Lys Trp Val Glu Glu Ala

945 950 955 960

Thr Asn Tyr Ile Thr Arg Lys Gln Gln Asn Arg Arg Lys Asn Glu Lys

965 970 975

Ala Trp Arg Arg Ser Ser Ser Lys Ala Ala Gln Leu Glu Glu Arg Asp

980 985 990

Arg Glu Val Arg Arg Val Glu Asn Ile Tyr Ala Leu Leu Ala Glu Ala

995 1000 1005

Asp Lys Leu Ser Phe Asp Cys Pro Gln Met Ala Ser Leu Glu Glu

1010 1015 1020

Lys Thr Arg Glu Ile Glu Lys Phe Arg Gln Asp Val Asn Val Ala

1025 1030 1035

Leu Met Asn Pro His Ile Arg Ser Val Gln Glu Val Glu Asp Leu

1040 1045 1050

Val Glu Ser Ala Arg Asn Phe Asn Val Asp Ile Pro Glu Val Glu

1055 1060 1065

Gly Leu Glu His Ile Leu Arg Gln Met Lys Trp Asn Glu Glu Ala

1070 1075 1080

Arg Arg Lys Arg Asp Gln Tyr Leu Thr Leu Lys Asp Cys Gln Glu

1085 1090 1095

Leu Ile Leu Ala Gly Glu Gln Leu Gly Leu Ser Asp Thr Asn Asp

1100 1105 1110

His Leu Val Tyr Phe Lys Asp Leu Cys Arg His Gly Glu Ala Trp

1115 1120 1125

Glu Ala Lys Ala Lys Glu Leu Met Ser Val Glu Ala Val His Tyr

1130 1135 1140

Gln Gln Leu Glu Ala Leu Ser Ala Gln Ala Ser Arg Phe Pro Val

1145 1150 1155

Ser Pro Glu Thr Leu Ser Ala Val Asp Ala Ile Leu Thr Lys Gln

1160 1165 1170

Arg Glu Ala Gln Lys Lys Ile Gln Ser Leu Tyr Glu Arg Ser Lys

1175 1180 1185

Asp Pro Glu Phe Arg Asn Arg Pro Lys Tyr Lys Glu Val Arg Glu

1190 1195 1200

Leu Met Glu Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ser Arg Pro Thr Gly Ala

1205 1210 1215

Ile Asp Leu Glu Arg Glu Gln Lys Arg His Glu Asp Trp Met Arg

1220 1225 1230

Lys Gly Lys Lys Leu Phe Gly Lys Ala Asn Ala Pro Leu His Ile

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Leu Lys Ser His Met Glu Tyr Val Glu Lys Arg Asn Ser Tyr Cys

1250 1255 1260

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Arg Asp Asn Thr Pro Asp Gly Leu Leu Asp Asn Asn Asn Ile Thr

1280 1285 1290

Pro Ser Met Trp Gly Gly Gly Lys Ser Arg Lys Arg Asp Val Phe

1295 1300 1305

Cys Ile Cys Arg His Ser Glu Ala Gly Met Met Ile Glu Cys Glu

1310 1315 1320

Val Cys His Glu Trp Tyr His Gly Lys Cys Leu Lys Ile Ala Arg

1325 1330 1335

Gly Lys Val Lys Glu Phe Asp Lys Tyr Thr Cys Pro Ile Cys Asp

1340 1345 1350

Trp Arg Gln Lys Ile Pro Arg Asp Ala Ala Arg Pro Lys Leu Glu

1355 1360 1365

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1370 1375 1380

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1385 1390 1395

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1400 1405 1410

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Ser Gly Asp Gly Ser Asn Ser Asp Ser Asn Arg Gly Glu Pro Thr

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Ala Asn Tyr Ser Leu Pro Ala Ser Asp Ser Thr Pro Ala Phe Ala

1550 1555 1560

Pro Ser Ser Ser Ala Phe Leu Pro His Val Ala Ala His Ser Pro

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Ser Phe Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser His Glu Gly Leu Asp

1580 1585 1590

Ala Ser Leu Phe Ser Ser Pro Arg Phe Asn Arg Asp Pro Asp Asp

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Gly Pro Pro Gly Val Asp Val Asp Asn Glu Asn Pro Phe Asp Ser

1610 1615 1620

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Asp Asp Lys Ser Ser Ala Glu Val Asn Gly Ala Val Glu Ala Asp

1685 1690 1695

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1700

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcacgagct attagtgata ttagtcgagt ccga 34

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caagtgagcc gaccgattga gggaagtagt 30

<210> 5

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaacccatga agcgccaatt tgttgatagg gagtctgaga ggaggcactg atgc 54

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tccctatcaa caaattggcg cttcatgggt tc 32

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tggattcctt cgggggctag tttgcatc 28

Claims

1.一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，其特征在于，所述的黄曲霉（Aspergillus flavus）菌株中不表达Aflrum1基因，所述Aflrum1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示；所述的基因编码的AflRum1蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 2 所示；

其制备方法为：通过同源重组的方法从黄曲霉菌株CA14的染色体中敲除Aflrum1基因片段获得。

2.根据权利要求1所述的一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，其特征在于，所述的黄曲霉毒素包括：黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2。

3.根据权利要求1所述的一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，其特征在于，所述的菌株侵染宿主后不产生黄曲霉毒素。

4.如权利要求1所述的不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株在防治黄曲霉污染中的应用。